CN102746376A

CN102746376A - 一类环肽抗生素及其制备方法和在制备抗菌药物中的应用

Info

Publication number: CN102746376A
Application number: CN2012102501960A
Authority: CN
Inventors: 鞠建华; 周潇; 黄洪波; 刘静
Original assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2012-07-18
Filing date: 2012-07-18
Publication date: 2012-10-24

Abstract

本发明公开了一类环肽抗生素及其制备方法和应用。该类环肽抗生素结构式如式（Ⅰ）所示。本发明从链霉菌Streptomyces drozdowiczii SCSIO10141中分离得到四种具有抗菌活性的环肽类抗生素（化合物1-4），这些化合物具有抗藤黄微球菌Micrococcus luteus活性，有望研发成为抗菌新药，在抗感染药物研发领域具有广阔的应用前景。

Description

一类环肽抗生素及其制备方法和在制备抗菌药物中的应用

技术领域：

本发明属于工业微生物领域，具体涉及四个新的环肽类抗生素及其制备方法和在制备抗菌药物中的应用。

背景技术：

多肽类化合物具有广泛的生物学活性，以抗菌化合物居多，例如著名的抗菌药物万古霉素，具有极强的抗菌作用。藤黄微球菌Micrococcus luteus为微球菌科、微球菌属细菌，为革兰氏染色阳性菌，分布于空气、土壤、水及动植物体表，为条件致病菌，在某些条件下可引起伤口等局部组织感染，也能引起严重感染，如心内膜炎等疾病。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供四种新的、具有专一性抗藤黄微球菌Micrococcus luteus活性的环肽类抗生素。

本发明的四种新的环肽类抗生素化合物1-4，或其盐，其结构如式（Ⅰ）所示：

本发明的第二个目的是提供环肽类抗生素化合物1-4的制备方法，其特征在于，所述的环肽类抗生素化合物1-4是从链霉菌Streptomyces drozdowiczii SCSIO10141的发酵培养物中制备分离得到的。

本发明优选通过以下方法从链霉菌Streptomyces drozdowiczii SCSIO 10141的发酵培养物中制备分离得到四个环肽类抗生素化合物1-4，具体步骤如下：

a）制备链霉菌Streptomyces drozdowiczii SCSIO10141的发酵培养物，将发酵培养物的发酵液和菌丝体分离开，发酵液经丁酮萃取，丁酮层浓缩后得到浸膏A，菌丝体用丙酮浸提，浸提液回收丙酮后剩余水混合液用丁酮萃取，丁酮层浓缩后得到浸膏B；

b）将浸膏A和浸膏B合并后的粗提物，经硅胶柱层析，用氯仿/甲醇作为洗脱剂，从体积比100：0~8：2进行梯度洗脱，收集氯仿/甲醇体积比96：4梯度洗脱下来的馏分Fr.3，收集氯仿/甲醇体积比94：6梯度洗脱下来的馏分Fr.4；

馏分Fr.3经硅胶柱层析，用氯仿/甲醇作为洗脱剂，从体积比100：0~96：4进行梯度洗脱，收集氯仿/甲醇体积比97：3~96：4梯度洗脱下来的馏分，再经硅胶柱层析，用石油醚/乙酸乙酯作为洗脱剂，从体积比6：4~1：9进行梯度洗脱，收集石油醚/乙酸乙酯体积比4：6~2：8梯度洗脱下来的馏分，经纯化后得到化合物1和化合物2；

馏分Fr.4经硅胶柱层析，用氯仿/甲醇作为洗脱剂，从体积比100：0~95：5进行梯度洗脱，收集氯仿/甲醇体积比98：2~95：5梯度洗脱下来的馏分，再经硅胶柱层析，用石油醚/乙酸乙酯作为洗脱剂，从体积比5：5~1：9进行梯度洗脱，收集石油醚/乙酸乙酯体积比4：6~2：8梯度洗脱下来的馏分，再经ODS反相中压液相色谱，以体积分数从0%~100%的甲醇/水梯度洗脱，收集体积分数70~90%的甲醇/水梯度洗脱下来的馏分，再经纯化后得到化合物3和化合物4。

所述的步骤a）的制备链霉菌Streptomyces drozdowiczii SCSIO10141的发酵培养物优选通过以下方法制备：将活化的链霉菌Streptomyces drozdowiczii SCSIO10141接入种子培养基中，28℃，200rpm，培养48h制得种子液，将种子液以10%的接种量接入到发酵培养基中，28℃，200rpm，振荡培养120h，而制得发酵培养物，所述的种子培养基和发酵培养基的配方都为每升培养基中含有：淀粉20g，大豆粉5g，酵母粉5g，蛋白胨2g，CaCO₃2g，粗海盐30g，余量为水，pH7.4。经本方法制备的链霉菌Streptomyces drozdowiczii SCSIO10141的发酵培养物中Marformycin A,B,E,F的含量比较高。

所述的步骤b）中的纯化是用高效液相色谱纯化。

本发明通过实验发现，环肽类抗生素化合物1-4对藤黄微球菌Micrococcus luteus具有专一性抗菌活力，MIC值在0.63~2.5μg/ml之间，由此可见环肽类抗生素化合物1-4具有较好的专一性抑制藤黄微球菌Micrococcus luteus的活性，有望研发成为抗菌新药。

因此，本发明的第三个目的是提供环肽类抗生素化合物1-4，或其盐，在制备抗菌药物中的应用。

所述的抗菌药物优选为抗藤黄微球菌的药物。

本发明从链霉菌Streptomyces drozdowiczii SCSIO10141中分离得到四种具有抗菌活性的环肽类抗生素化合物1-4，这些化合物具有抗藤黄微球菌Micrococcus luteus活性，有望研发成为抗菌新药，在抗感染药物研发领域具有广阔的应用前景。

本发明使用到的链霉菌Streptomyces drozdowiczii SCSIO 10141，该菌株保存中国科学院应用微生物研究网络海洋微生物研究中心，地址：中国广东省广州市海珠区新港西路164号，邮编：510301，该菌株是对外销售的，公众可以从该保藏中心购买到该菌株。

附图说明

图1是化合物1的X-单晶衍射图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

一、环肽类抗生素化合物1-4的分离和制备

1、培养基

种子及发酵培养基：每升培养基中含有淀粉20g，大豆粉5g，酵母粉5g，蛋白胨2g，CaCO₃2g，粗海盐30g，余量为水，pH7.4。121℃，灭菌30min；

2、发酵

2.1、种子培养：将培养皿上活化的链霉菌Streptomyces drozdowiczii SCSIO 10141的单菌落分别接入30瓶，每瓶含有50mL种子培养基的250mL的锥形培养瓶中，28℃，200r·min^-1，培养48h，制得种子液。

2.2、发酵培养：将种子液以10%的接种量（体积百分比）接入到6L发酵培养基（置于1L的锥形培养瓶，每瓶含有200ml发酵培养基，共30瓶）中，28℃，200r·min^-1，振荡培养120h，得到发酵培养物。

3、萃取

发酵培养物先进行离心分离（4000r·min^-1，10min），得到6L体积的上清液（发酵液）和菌丝体。发酵液用2倍体积的丁酮萃取4次，合并萃取液，丁酮层减压蒸馏得上清液提取物—浸膏A（12.1g）；菌丝体用2L丙酮在室温下浸提3次，每次3小时，合并浸提液，减压回收丙酮后剩余水混合液用6L丁酮萃取，丁酮层减压蒸馏浓缩得菌丝体提取物—浸膏B（2.1g）。

4、化合物1-4的提取分离和鉴定

将浸膏A和浸膏B合并的粗提物经硅胶柱（200~300目）层析，用氯仿/甲醇作为洗脱剂，从体积比100：0~8：2进行梯度洗脱，共得到8个组分Fr1~Fr.8，收集氯仿/甲醇体积比96：4梯度洗脱下来的馏分Fr.3，馏分Fr.3再经硅胶柱（200~300目）层析，用氯仿/甲醇作为洗脱剂，从体积比100：0~96：4进行梯度洗脱，共得到六个组分，收集氯仿/甲醇体积比97：3~96：4梯度洗脱下来的馏分Fr.3-3~Fr.3-5，合并后再经硅胶柱（200~300目）层析，用石油醚/乙酸乙酯作为洗脱剂，从体积比6：4~1：9进行梯度洗脱，共得到19个组分，收集石油醚/乙酸乙酯体积比4：6~2：8梯度洗脱下来的馏分A-13~A-17，合并后经高效液相色谱（YMC*GEL ODS-A球型填料，120A孔径，50um粒径，40×2.5cm I.D.），流速为2.5ml/min，以体积分数从70%~100%的乙腈/水梯度洗脱30min，分别在25和24min处制备分离得到化合物1（3.5mg），化合物2（2.8mg）；收集氯仿/甲醇体积比94：6梯度洗脱下来的馏分Fr.4，馏分Fr.4再经硅胶柱（200~300目）层析，用氯仿/甲醇作为洗脱剂，从体积比100：0~95：5进行梯度洗脱，共得到六个组分，收集氯仿/甲醇体积比98：2~95：5梯度洗脱下来的馏分Fr.4-1~Fr.4-5，合并后再经硅胶柱（200~300目）层析，用石油醚/乙酸乙酯作为洗脱剂，从体积比5：5~1：9进行梯度洗脱，共得到40个组分，收集石油醚/乙酸乙酯体积比4：6~2：8梯度洗脱下来的馏分B-18~B-35，合并后再经ODS反相中压液相色谱（YMC*GEL ODS-A球型填料，120A孔径，50um粒径，40×2.5cm I.D.），流速为15ml/min，以体积分数从0%~100%的甲醇/水梯度洗脱60min，收集体积分数70~90%的甲醇/水梯度洗脱下来的馏分，最后经高效液相色谱（YMC*GEL ODS-A球型填料，120A孔径，50um粒径，40×2.5cm I.D.），流速为2.5ml/min，以体积分数从70%~100%的乙腈/水梯度洗脱30min，分别在20和19min处制备分离得到化合物3（3.0mg），化合物4（1mg）。

从链霉菌Streptomyces drozdowiczii SCSIO 10141的发酵培养物中制备得到的4个化合物—化合物1、化合物2、化合物3和化合物4的理化性质和波谱数据（¹³C-NMR谱和¹H-NMR谱数据如表1和表2所示）如下：

化合物1：无色晶体;m.p.261-262℃;UV(MeOH)λ_max(logε)205(0.93),227(1.02),277(0.44),461(0.48)nm;IR(KBr)v_max3307,1743,1514cm¹;¹H NMR(500MHz,CDCl₃)及¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)见Table1和Table2;HR-ESI-MS m/z857.5145([M+H]⁺,calcd for C₄₃H₆₈N₈O₁₀,857.5131).由此鉴定化合物1的结构式如式（Ⅰ）所示，其R₁=H，R₂=CH₃，R₃=H。

化合物2：无色晶体;m.p.257-258℃;

(c0.1,MeOH);UV(MeOH)λ_max(logε)209(1.27),226(1.31),277(0.56),283(0.53),447(0.45)nm;IR(KBr)v_max3307,1747,1645,1525cm¹;¹H NMR(500MHz,CDCl₃)及¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)见Table1和Table2;HRESIMSm/z871.5289([M+H]⁺,calcd for C₄₄H₇₀N₈O₁₀,871.5288).由此鉴定化合物2的结构式如式（Ⅰ）所示，其R₁=H，R₂=CH₃，R₃=CH₃。

化合物3：白色固体;

(c0.2,MeOH);UV(MeOH)λ_max(logε)205(0.92),227(1.03),277(0.50),447(0.55);IR(KBr)v_max3298,1743,1537,1469cm¹;¹H NMR(500MHz,CDCl₃)及¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)见Table1和Table2;HRESIMS m/z859.4934([M+H]⁺,calcd for C₄₂H₆₆N₈O₁₁，859.4924).由此鉴定化合物3的结构式如式（Ⅰ）所示，其R₁=OH，R₂=H，R₃=H。

化合物4：白色固体;(c0.06,MeOH);UV(MeOH)λ_max(logε)204(1.68),276(0.29);¹H NMR(500MHz,CDCl₃)及¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)见Table1及Table2;HRESIMSm/z843.4921([M+H]⁺,calcd for C₄₂H₆₆N₈O₁₀,843.4975).由此鉴定化合物4的结构式如式（Ⅰ）所示，其R₁=H，R₂=H，R₃=H。

表1：化合物1-4的¹H-NMR(500MHz)核磁数据（溶剂：CD₃OD）

表2：化合物1-4的¹³C-NMR(125MHz)核磁数据（溶剂：CD₃OD）

实施例2：环肽类抗生素化合物1-4的抗菌活性测定

通过采用多种革兰氏阳性菌和阴性菌测试，环肽类抗生素化合物1-4表现出对藤黄微球菌Micrococcus luteus专一性抑制，并以其为指示菌株，进行最小抑菌浓度（MIC）值的测定。

以藤黄微球菌Micrococcus luteus为指示菌，在Mueller-Hinton（MH）肉汤培养基中进行MIC测定，MIC的测定参照《National Committee for Clinical Laboratory Standards》方法，使用微量肉汤稀释法（Broth Microdilution Method）测定化合物对藤黄微球菌Micrococcus luteus的MIC值。

样品稀释

称取600μg样品（样品为环肽类抗生素化合物1-4）溶于470μl DMSO中，制备1280μg/ml母液。取200μl母液作等比稀释，稀释后样品的浓度分别为1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25μg/ml。

MIC板的制备

将稀释后不同浓度的样品溶液加入到96孔板中，第1~11孔每孔加入样品10μl，第12孔不加作为空白对照。

藤黄微球菌Micrococcus luteus的制备

取3~5个藤黄微球菌Micrococcus luteus的单菌落接种至4ml LB中，培养2~5h用分光光度计调整菌液OD₆₂₅约为0.1左右，然后用LB培养基1:1000倍稀释，向每个孔内加入菌液90μl。37℃培养16~20h小时观察结果。同时制备氨苄霉素作为对照，以用肉眼观察，在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC，结果见表3。其结果明确的显示环肽类抗生素化合物1-4具有抗菌活力，其MIC值分别为2.50，0.63，2.50，0.63μg/ml。

表3：环肽类抗生素化合物1-4对藤黄微球菌Micrococcus luteus生长抑制作用

Claims

1.四个环肽类抗生素，或其盐，其结构如式（Ⅰ）所示：

2.权利要求1所述的环肽类抗生素的制备方法，其特征在于，所述的环肽类抗生素化合物1-4是从链霉菌Streptomyces drozdowiczii SCSIO10141的发酵培养物中制备分离得到的。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的从链霉菌Streptomyces drozdowicziiSCSIO10141的发酵培养物中制备分离得到环肽类抗生素化合物1-4，具体步骤如下：

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤a）的制备链霉菌Streptomycesdrozdowiczii SCSIO 10141的发酵培养物是通过以下方法制备：将活化的链霉菌Streptomyces drozdowiczii SCSIO 10141接入种子培养基中，28℃，200rpm，培养48h制得种子液，将种子液以10%的接种量接入到发酵培养基中，28℃，200rpm，振荡培养120h，而制得发酵培养物，所述的种子培养基和发酵培养基的配方都为每升培养基中含有：淀粉20g，大豆粉5g，酵母粉5g，蛋白胨2g，CaCO₃2g，粗海盐30g，余量为水，pH7.4。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤b）中的纯化是用高效液相色谱纯化。

6.权利要求1所述的环肽类抗生素化合物1-4，或其盐，在制备抗菌药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的抗菌药物为抗藤黄微球菌的药物。