CN102746173A

CN102746173A - 大黄素衍生物及其制备方法和应用

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Publication number: CN102746173A
Application number: CN2012102092901A
Authority: CN
Inventors: 王建红; 岑娟; 白淑霞; 姬汴生; 赵瑾; 何利华
Original assignee: Henan University
Current assignee: Henan University
Priority date: 2012-06-25
Filing date: 2012-06-25
Publication date: 2012-10-24

Abstract

本发明公开了一种天然大黄素衍生物，为以下通式化合物：

Description

大黄素衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于药物化合物技术领域，涉及一种大黄素衍生物及其制备方法和应用。

背景技术

肿瘤多药耐药性(Multidrug Resistance, MDR) 是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生耐药性的同时，对结构和作用机制完全不同的多种抗肿瘤药物也产生交叉耐药性。临床上常用的抗肿瘤药物常常因MDR造成化疗失败，克服/逆转肿瘤多药耐药机制成为当前肿瘤化疗药物研究的热点。

经典的MDR机制研究表明，细胞膜载体蛋白关联，借助于ATP水解提供能量，转运蛋白能将抗肿瘤药物排出体外，从而降低细胞内药物浓度，使细胞产生耐药，包括P-糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白(MRP)、肺耐药相关蛋白(LRP)、乳腺癌抗药性蛋白(BCRP)等。其中，P-糖蛋白((P-glycoprotein, P-gp)介导的耐药机制MDR机制较为深入，药物扩散进入细胞后，与P-gp结合，ATP水解提供能量，将药物从胞内排出，导致细胞内药物浓度不断下降，其细胞毒作用下降。非经典的MDR机制与谷胱甘肽S转移酶(GST)和谷胱甘肽(GSH)的升高、拓扑异构酶(TOP)活力降低以及膜离子通道、蛋白激酶C (PKC)、磷酸化水平变化等因素相关。

目前，肿瘤多药耐药逆转剂主要针对P-gp进行设计，已发展到第三代。维拉帕米(Verapamil, VRP)第一个用于临床的肿瘤细胞MDR逆转剂，也是第一类MDR逆转剂的代表药物。该类MDR逆转剂本身就是P-gp的底物，可与细胞毒化合物竞争性地与P-gp结合，使细胞毒化合物的外排减少。

目前使用的肿瘤MDR逆转化剂大多毒副作用较大，限制了其临床应用，需要开发大量低毒、高效的新型逆转剂。

发明内容

本发明目的在于提供一种新型的天然大黄素衍生物、制备方法及其在制备抗肿瘤药物多药耐药逆转剂方面的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种大黄素衍生物，为以下通式化合物：

其中，m＝0、1或2，R＝H或氨丙基（aminopropyl），p=2或3；当R＝H时p=2；当R＝氨丙基时p=3。

所述大黄素衍生物在制备抗肿瘤药物多药耐药逆转剂方面的应用。

所述大黄素衍生物在制备P-糖蛋白抑制剂方面的应用。

所述的大黄素衍生物，当R＝H、p=2时，其制备方法包括如下步骤：

（1）以大黄素为原料，丙酮为溶剂，在K₂CO₃作用下，与硫酸二甲酯反应得到化合物1；

（2）将化合物1溶于四氯化碳溶剂中，在过氧化苯甲酰(BPO)作用下与N-溴代丁二甲酰亚胺(NBS)反应得到化合物2。该化合物2的制备方法具体也可参考：王兴波, 徐文芳. 1, 3, 8-三羟基-6-甲酰基-9, 10-蒽醌的合成.精细化工. 2006, 23, 38-40。

（3）化合物2溶于乙腈溶剂中，用K₂CO₃作为缚酸剂，与Boc单侧保护的乙二胺、丙二胺或丁二胺控温至40˚C搅拌反应，产物粗提后，转溶于乙醇溶剂中，经盐酸酸化脱去保护基分别得到化合物3a 、 3b 或 3c ，其合成路线如下所示。

。

所述的大黄素衍生物，当R＝氨丙基、p=3时，其制备方法包括如下步骤：

（1）在乙腈溶剂中，用K₂CO₃作为缚酸剂， N-溴代乙基邻苯二甲酰胺、N-溴代丙基邻苯二甲酰胺或N-溴代丁基邻苯二甲酰胺与Boc单侧保护的丙二胺控温40˚C搅拌反应得淡黄色油状物，将该淡黄色油状物溶于甲醇，与Boc₂O反应得化合物4 ；

（2）化合物4在无水乙醇中肼解得到化合物5；

（3）在乙腈溶剂中，用K₂CO₃作为缚酸剂，化合物2与化合物5控温至40˚C搅拌反应，产物粗提后，转溶于乙醇溶剂中，用盐酸溶液脱去保护基得到化合物6a 、 6b 或 6c ，其合成路线如下所示。

。

本发明基于天然产物大黄素结构，合成一种新型结构的大黄素衍生物，拓宽了大黄素的研究、应用领域。本发明大黄素衍生物对多种肿瘤细胞不产生细胞毒作用，可显著增加耐药细胞株K562/ADM对罗丹明的蓄积。K562/ADM细胞是一种多药耐药细胞株，其耐药作用主要由P-糖蛋白介导，罗丹明是已知的P-糖蛋白作用底物。本发明的大黄素衍生物对罗丹明蓄积的影响表明该类化合物是一种良好的P-糖蛋白抑制剂，并且其抑制作用显著强于经典的P-糖蛋白抑制剂维拉帕米(Ver)，可作为抗肿瘤药物多药耐药逆转剂应用。此外，本发明合成天然多胺衍生物的反应工艺具有操作简便、条件温和、反应收率高的特点。

附图说明

图1是本发明实施例1大黄素衍生物的¹HNMR图谱；

图2是本发明实施例2大黄素衍生物的¹HNMR图谱；

图3是本发明实施例3大黄素衍生物的¹HNMR图谱；

图4是本发明实施例4大黄素衍生物的¹HNMR图谱。

具体实施方式

以下以通过优选实施例对本发明工艺作进一步的详细说明，但本发明的保护范围并不局限于此。

实验仪器名称与型号

Bruker AV-400型核磁共振仪（D₂O做溶剂）；

Esquire 3000型LC-MS 质谱仪。

实施例 1：制备m=0、R=H、p=2时对应的大黄素衍生物3a

1. 制备化合物1：向250 mL圆底烧瓶中加入大黄素1.6 g (6 mmol)、200 mL丙酮和24 g（174 mmol）无水碳酸钾，不断搅拌下加入硫酸二甲酯8 mL (84 mmol)，混合后加热回流24 h，反应液浓缩至原体积一半，加100 mL蒸馏水稀释，过滤收集黄色沉淀。母液蒸除大部分丙酮又可得到一部分产物，合并产物，得1.76 g黄色固体（即化合物1），收率95%。

制备化合物2：取0.2 g (0.9 mmol) 化合物1于50 mL圆底烧瓶中，分别加入10mL四氯化碳、0.18 g (0.99 mmol) N-溴代丁二酰亚胺(NBS)和0.1g过氧化苯甲酰（BPO），保持n(原料):n(NBS)=1:1.1，混合后在光照下搅拌回流12h，蒸除溶剂，然后用硅胶层析柱（V _石油醚:V _丙酮 = 3:1）分离纯化，得化合物2。

制备化合物3a：将2.0mmol化合物2 、6.0 mmol Boc单保护的乙二胺和2.5 g无水K₂CO₃加入到20 mL乙腈中。控温40˚C搅拌反应5小时。过滤除去无机盐，减压蒸除溶剂，得到中间体。由于中间体难于分离提纯，经硅胶层析柱（V _氯仿:V _甲醇= 30:1）粗分离后直接用于下一步反应。

将粗提过的中间体化合物溶于适量乙醇中，冷却至0˚C，加入4mol/l的盐酸乙醇溶液，自然升至室温，搅拌12h至有大量固体生成，过滤，用重蒸无水乙醇洗涤三次，干燥得目标固体化合物3a。

如图1所示，是实施例1产品的¹H NMR图谱，实验数据如下：

yield: 40%; ¹H NMR (400 MHz, D₂O, δ): 3.15 (t, J=7.8Hz, 2H), 3.27 (t, J=8.0Hz, 2H), 3.71 (s, 3H), 3.76 (s, 3H), 3.93 (s, 3H), 4.35 (s, 2H), 6.52 (d, J=7.6Hz, 1H), 6.58~6.61 (m, 1H), 7.55 (t, J=6.0Hz, 2H); C₂₀H₂₄Cl₂N₂O₅∙0.8H₂O 元素分析实测值（计算值）%: C 52.51( 52.48), H 5.08( 5.64), N 5.90( 6.12 ); MS(APCI) m/z: 371.2 [M+1]⁺。

实施例 2 制备m=1、R=H、p=2时对应的大黄素衍生物3b：

将步骤3中原料由Boc单保护的乙二胺变换成Boc单保护的丙二胺，其它同实施例1。

如图2所示，是实施例2产品的¹H NMR图谱，实验数据如下：

yield: 35%; ¹H NMR (400 MHz, D₂O, δ): 2.14~2.22 (m, 2H), 3.15 (t, J=7.8Hz, 2H), 3.27 (t, J=8.0Hz, 2H), 3.71 (s, 3H), 3.76 (s, 3H), 3.93 (s, 3H), 4.35 (s, 2H), 6.52 (d, J=7.6Hz, 1H), 6.58~6.61 (m, 1H), 7.55 (t, J=6.0Hz, 2H); C₂₁H₂₄Cl₂N₂O₅·2.5H₂O元素分析实测值（计算值）%: C 50.43( 50.21), H 5.34( 6.01), N 5.25( 5.58 ); MS(APCI) m/z: 385.3 [M+1]⁺。

实施例 3 制备m=2、R=H、p=2时对应的大黄素衍生物3c

将步骤3中原料由Boc单保护的乙二胺变换成Boc单保护的丁二胺，其它同实施例1。

如图3所示，是实施例3产品的¹H NMR图谱，实验数据如下：

yield: 34.7%; ¹H NMR (400 MHz, D₂O, δ): 1.66~1.80 (m, 4H), 2.97 (t, J=7.6Hz, 2H), 3.10 (t, J=7.8Hz, 2H), 3.71 (s, 3H), 3.76 (s, 3H), 3.93 (s, 3H), 4.18 (s, 2H), 6.22~6.30 (m, 2H), 7.35~7.37 (m, 2H); C₂₂H₂₈Cl₂N₂O₅·0.5H₂O 元素分析实测值（计算值）%: C 55.24( 55.01), H 5.64( 6.08), N 5.64( 5.83 ); MS(APCI) m/z: 399.3 [M+1]⁺。

实施例 4 制备m=1、R=氨丙基、p=3时对应的大黄素衍生物6b ：

1. 制备化合物4：将47.7 mmol Boc单保护的丙二胺溶于180 mL 乙腈中，加入9 g (65.1 mmol) 无水K₂CO₃，室温搅拌15 min，升温到40˚C，分三批加入共40.8 mmol的N-溴代丙基邻苯二甲酰胺，控温40˚C反应过夜。减压蒸出乙腈，残余物溶于30mL氯仿，用10%的Na₂CO₃水溶液洗涤3 次，有机相用无水Na₂SO₄干燥，减压蒸出氯仿，得淡黄色油状物。

将该淡黄色油状物溶于100 mL 甲醇，加入10.42 g(47.7 mmol) Boc₂O，室温搅拌12 小时至有大量白色不溶性固体生成。减压蒸出溶剂，残余物溶于40 mL氯仿，3×40 mL水洗涤，收集有机层，有机相用无水Na₂SO₄干燥，减压蒸出氯仿，硅胶柱分离（V _氯仿:V _甲醇=80:1）提纯得化合物4。yield: 40.6%; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃, δ): 1.26~1.94 (m, 22H), 3.07~3.26 (m, 6H), 3.67 (t, 2H, J = 7.2Hz), 4.89 (b, 1H, -NHCO), 7.69~7.71 (m, 2H), 7.81~7.83 (m, 2H); ESI-MS m/z: 484.4 [M+1]⁺。

制备化合物5：将化合物4溶于30 mL乙醇中，加质量浓度80%的水合肼0.7mL，室温搅拌12小时至有大量白色不溶性固体出现，减压蒸除溶剂，残渣溶于30 mL氯仿中，3×30 mL 10%的Na₂CO₃水溶液洗涤，收集有机层，有机层用无水硫酸钠干燥，减压蒸除氯仿，得化合物5。

制备化合物6b：将2.0 mmol化合物2 、6.0 mmol化合物5和2.5 g无水K₂CO₃加入到20 mL乙腈中。控温40˚C搅拌反应5小时。过滤除去无机盐，减压蒸除溶剂，得到中间体。由于中间体难于分离提纯，经硅胶层析柱（V _氯仿:V _甲醇=30:1）粗分离后直接用于下一步反应。

将粗提的中间体化合物溶于适量乙醇中，冷却至0℃，加入4mol/l的盐酸乙醇溶液，自然升至室温，搅拌12小时至有大量固体生成，过滤，用重蒸无水乙醇洗涤三次，干燥得化合物6b。

如图4所示，是实施例4产品的¹H NMR图谱，实验数据如下：

yield: 28%; ¹H NMR (400 MHz, D₂O, δ): 2.00~2.21 (m, 2H), 3.02~3.24 (m, 2H), 3.02~3.06 (m, 2H), 3.11~3.17 (m, 4H), 3.22 (t, J= 6.4Hz, 2H), 3.71 (s, 3H), 3.76 (s, 3H), 3.93 (s, 3H), 4.35 (s, 2H), 6.52 (d, J=7.6Hz, 1 H), 6.58~6.61 (m, 1H), 7.55 (t, J=6.0Hz, 2H); C₂₄H₃₄Cl₃N₃O₅·2.5H₂O元素分析实测值（计算值）%: C 48.66( 48.37), H 6.50( 6.60), N 7.40( 7.05 ); MS(APCI) m/z: 442.3 [M+1]⁺.

采用本发明方法合成了一类新型结构的天然大黄素衍生物，目前尚未见有文献报道。该类大黄素衍生物在制备抗肿瘤药物多药耐药逆转剂及P-糖蛋白抑制剂方面的应用。

应用实验：

细胞培养条件：取繁殖期细胞，加入含10％小牛血清、2 mM L-谷氨酸、100 U/mL青霉素、50 µg/mL链霉素和2 mM氨基胍培养液中，于37 °C，5% CO₂环境中培养。

细胞毒性测试：取待测的实施例1至4大黄素衍生物分别加入含有K562 Cell（人红白血病细胞）、HepG2 Cell（人体肝癌细胞）、HCT116 Cell（结肠癌细胞）三种癌和QSG7701 Cell (人正常肝细胞)的培养液中，于上述条件下培养48h。用四甲基偶氮唑盐（MTT）染色，用酶标仪测定染色细胞溶液的吸光度值从而计算细胞在10μM浓度下的抑制率，并用米托蒽醌做参照药物。结果见表1。

表1中给出了实施例1至4大黄素衍生物在10μM浓度下对K562、HepG2、HCT116三种癌细胞和QSG7701细胞的体外生长抑制活性。由表1的试验结果可看出，本发明大黄素衍生物对肿瘤细胞及正常细胞均不显示细胞毒性。

耐药细胞培养条件：耐药细胞株K562/ADM用含10%小牛血清的RPMI 1640培养基，在37℃、5%CO₂饱和湿度的条件下培养，耐药株培养基含终浓度为1mg/L的阿霉素。用于实验的耐药细胞需在实验前在无阿霉素的条件下培养14天。

糖蛋白抑制活性测试：取对数生长期细胞，以1×10⁵个/mL密度接种于96孔培养板中，每孔180µL，在37℃、5% CO₂条件下培养。过夜后分组，K562/ADM细胞分为空白对照组、阳性对照组、受试化合物组。空白对照组给予等体积的PBS；阳性对照组给予10µM的维拉帕米；受试组分别加入实施例1至4的大黄素衍生物，同时每组加入终浓度为2µM的Rh123，给药体积为10µL。板式振荡器混匀药物后置于37℃、5%CO₂饱和湿度的孵箱中孵育60 分钟。然后加入终浓度为10µM的Hoechst 33342孵育10 分钟。取出96孔板，用冰PBS洗涤细胞2次，重悬后使用高内涵活细胞成像***检测细胞内Rh123的累积，结果见表2。Hoechst 33342激发波长为350 nm，发射波长为461 nm；Rh123激发波长为480 nm，发射波长为530 nm。

如表2所示，耐药细胞K562/ADM对P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）底物Rh123的累积作用较其亲本敏感株细胞低，阳性对照品P-gp抑制剂维拉帕米以剂量依赖性显著增加细胞内P-gp底物Rh123的累积。实施例4化合物在5、10、20µM浓度下具有相似作用，并且在10、20µM浓度下其作用显著优于相应浓度的维拉帕米组，而其它衍生物对Rh123的细胞内累积也有一定影响。实验数据表明：本发明实施例4衍生物与维拉帕米具有相似的P-gp抑制作用，可以通过增加P-gp底物在耐药细胞中的累积发挥相应的活性。鉴于其在相同浓度下（10、20µM）的作用优于维拉帕米，因此，本发明所述大黄素衍生物，尤其是实施例4衍生物可作为多药耐药逆转剂、P-gp抑制剂的应用。

Claims

1.一种大黄素衍生物，其特征在于，为以下通式化合物：

Figure 2012102092901100001DEST_PATH_IMAGE001

其中，m＝0、1或2，R＝H或氨丙基，p=2或3；当R＝H时p=2；当R＝氨丙基时p=3。

2.权利要求1所述的大黄素衍生物，当R＝H、p=2时，其制备方法如下：

（2）将化合物1溶于四氯化碳溶剂中，在过氧化苯甲酰(BPO)作用下与N-溴代丁二甲酰亚胺(NBS)反应得到化合物2；

（3）化合物2溶于乙腈溶剂中，用K₂CO₃作为缚酸剂，与Boc单侧保护的乙二胺、丙二胺或丁二胺控温至40˚C搅拌反应，产物粗提后，转溶于乙醇溶剂中，经盐酸酸化脱去保护基分别得到化合物3a 、3b 或3c。

3.权利要求1所述的大黄素衍生物，当R＝氨丙基、p=3时，其制备方法如下：

（2）化合物4在无水乙醇中肼解得到化合物5；

（3）在乙腈溶剂中，用K₂CO₃作为缚酸剂，化合物2与化合物5控温至40˚C搅拌反应，产物粗提后，转溶于乙醇溶剂中，用盐酸溶液脱去保护基得到化合物6a 、6b 或6c 。

4.权利要求1所述大黄素衍生物在制备抗肿瘤药物多药耐药逆转剂方面的应用。

5.权利要求1所述大黄素衍生物在制备P-糖蛋白抑制剂方面的应用。