CN102741286B - 以pae技术开发的抗人rankl单抗及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了高特异性与人RANKL结合的抗体,该抗体具有潜在的用于治疗与老年化、激素治疗和绝经后妇女的骨质疏松症以及骨转移和炎症引起的股侵蚀。本发明还公开了其DNA序列和推测的氨基酸序列。
Description
技术领域
本发明涉及与人核因子κB受体活化因子配体(Receptor Activator for NuclearFactor κB Ligand,RANKL)结合的重组抗体,描述了这类抗体对成骨细胞形成的影响以及在自身免疫疾病、恶性肿瘤以及激素治疗引起的骨质疏松和股侵蚀等骨病治疗中的潜在用途。
背景技术
骨的形成和重建是一个涉及RANK、RANKL和OPG(osteoprotegerin,成骨素)的十分复杂的生物学过程。
破骨细胞和成骨细胞通过各自在骨吸收和骨形成中的作用决定骨量、骨结构和骨强度。骨重建是一个在空间上相关协调的纵贯一生的过程,此间旧的骨质被破骨细胞移走并被具有成骨细胞的成骨过程所取代。在许多病理状态下,再吸收腔的重新填充不完全,这就导致了随着每一个重建循环骨量的净流失。绝经后骨质疏松症和其他情况与重建速率的提高有关,这种提高使得骨丢失加快并增加骨折的风险。RANK,也称为TNF相关激活诱导因子(TRANCE)、成骨素配体(OPG)和ODF(成骨细胞分化分子),是一种功能性受体,主要出现在破骨细胞前体和破骨细胞的表面。许多研究结果证明,RANKL是一个在骨吸收中起重要作用的因子,具有加速破骨细胞分化并引起骨吸收的作用。RANK和RANKL在许多生理功能的调节上起着至关重要的作用,例如骨的动态平衡、免疫功能、血管疾病和乳腺发育[3,5-8]。发现在许多退行性骨病,如类风湿关节炎(RA)和银屑病关节炎中有RANKL的过量表达。RANKL在免疫***中也有重要作用,它在辅助性T淋巴细胞中过量表达,并被认为与树突状细胞成熟有关。详细情况参见:(1)Buckley KA,Fraser WD,2003,Receptoractivator for nuclear factor kappa B ligand and osteoprotegerin:regulators of bonephysiology and immune responses/potential therapeutic agents and biochemicalmarkers.Ann.Clin.Biochem.39(Pt 6):551-6.(2)Whyte MP,Mumm S,2005,Heritabledisorders of the RANKL/OPG/RANK signaling pathway.J.of musculoskeletal & neuronalinteractions 4(3):254-67.
OPG,也称OCIF(破骨细胞形成抑制因子),是一种能抑制破骨细胞生成的细胞因子,为TNFa受体超家族中成员。OPG抑制破骨细胞前体向成骨细胞的分化,并可调节离体和活体中破骨细胞的吸收作用。OPG是一种RANK同源物,通过与成骨细胞/基质细胞结合而起作用,这样就阻断了成骨细胞/基质细胞与破骨细胞前体之间RANKL-RANK配体的相互作用,这样就阻止了破骨细胞前体分化为成熟破骨细胞。//重组人OPG可特异性地作用于骨组织,可提高骨的矿物质密度和骨体积。2001年在航天飞机的微重力条件下测定了OPG对小鼠的影响,发现它可以预防吸收作用的增加,并可保持矿化作用。OPG被用于绝经后骨质疏松症妇女和溶骨性骨转移病人降低骨吸收的试验。详细情况见Khosla S,2001,Minireview:TheOPG/RANKL/RANK System.Endocrinology,142:5050-5055。OPG可以直接与RANK结合,并竞争性抑制RANKL与RANK的结合过程,从而抑制破骨细胞的分化和功能。另一方面,OPG可以与RANKL/RANK形成三聚体复合物,从而直接抑制RANKL/RANK的功能[14]。已发现,在RANKL或RANK缺失的小鼠中存在骨吸收异常和骨硬化。OPG缺失的小鼠会发生骨质疏松,但注射重组OPG后骨密度得到改善。这些结果支持RANKL/RANK/OPG构成了破骨细胞分化和功能的关键调节***[1,2,5,6]。在动物模型进行的研究证明,RANKL阻断剂可预防或改善骨质疏松、慢性炎症和恶性肿瘤引起的骨丢失和骨侵蚀,以绝经后骨质疏松、骨髓瘤、骨病和溶骨性转移的研究为基础,有可能成为人类疾病的治疗方法[Bekker PJ,et al,2005,J Bone and Mineral Res.,202275-2282,and 1,3]。这种因子在成骨细胞/基质细胞以及活化的淋巴细胞中表达。RANKL的抑制因子也具有预防RA和骨转移动物模型中出现的病灶性骨侵蚀。详见Kearns AE,et al,2008,Receptor activator of nuclear factor kappaB ligand and osteoprotegerin regulation of bone remodeling in health and disease.Endocr Rev.29(2):155-92.
在阐明OPG/RANK/RANKL功能及其关系的基础上,骨质疏松、恶性肿瘤骨转移、骨髓瘤和RA病人的骨质疏松、骨丢失和骨侵蚀的机理已经得到基本的阐明。所有这些使我们有可能设计和/或开发治疗由多种疾病引起的股侵蚀和骨质疏松症的新的方法[1,3,6]。Amgen公司开发了Denosumab,这是一种以单克隆抗体技术为基础研制的以RANKL为靶点的新一代治疗骨质疏松和骨侵蚀的药物(详见:US Patent Application No.20040033535)。
骨质缺少症(osteopenia)是指骨的矿物质密度低于正常的情况。这可能是由于骨质合成速率降低或者骨质破坏速率增加或者两者共同造成的,许多医生认为这是骨质疏松症的前兆,也被视为绝经后或老年性骨质疏松症的前兆。但是,并非每一个被诊断为骨质缺少症的人都会发展成骨质疏松症。更准确地说,骨质缺少症的定义是,骨矿物质密度在T值在1.0至2.5的状态(详见:1.Wikipedia,the free encyclopedia online;2.WHOScientific Group on the Prevention and Management of Osteoporosis(2000:Geneva)3.Prevention and management of osteoporosis:report of a WHO scientific group″(pdf)http://whqlibdoc.who.int/trs/WHO_TRS_921.pdf.Retrieved 2007-05-31).)如果身体不能形成足量的新骨,过多的旧骨被吸收,或者两者兼有之,就会发生骨质疏松症。钙和磷酸盐是骨质正常形成所需要的两种必需矿物质。整个青年期,人体利用这些矿物质产生骨质。如果身体不能得到充足的钙,或者不能从食物中吸收足够的钙,骨的生产或骨组织将受到影响。随着年龄变老,钙和磷酸盐将被身体从骨质中吸收回身体,从而使骨组织变脆。这将导致骨质变脆,易碎,即使没有受伤也容易骨折。骨质疏松症的主要原因是绝经期妇女***降低和男性***降低。50岁以上的妇女和70岁以上的男性发生骨质疏松症的风险更大。有许多因素可以引起骨质流失或骨侵蚀。
老龄化和妇女绝经炎症,例如类风关,在许多情况下可引起股侵蚀骨质硬化症。恶性肿瘤骨转移和骨髓瘤,可因如下方面而引起股侵蚀:(1)因吸收导致溶骨性损伤并在骨组织留下微小的空洞;(2)在不正常的位置引发异常的骨生长,并导致骨质硬化症。某些激素疗法,例如每天服用皮质甾类药物(强的松,甲基强的松)超过三个月,或者服用某些抗癫痫药物(antiseizure drugs)。甲状旁腺功能亢进饮食失调,导致钙摄入不足卧床不起已经发现一些与绝经和老年性骨质疏松症相关的因素,包括伴随老年化和钙的摄入量不足而导致的肠道对钙和其他矿物质吸收不足。一些治疗方法包括激素治疗或膳食补充剂可以延迟这种过程。最近,抗吸收制剂如双林酸盐和选择性***受体修饰剂(SERMs)被用于预防和治疗骨量降低。因此,把这些治疗方法与调节RANKL活性的分子结合起来,可能对治疗某些骨质缺少症是有用的。
单抗治疗
单抗治疗就是用抗体单抗(即mAb)与靶标细胞特异性结合的治疗方法。这将刺激患者的免疫***攻击那些细胞。对任何一种细胞外或细胞表面的靶标都有可能开发一种特异性单抗,因此目前正在进行的对各种重大疾病如类风关、多发性硬化和各种恶性肿瘤治疗性单抗的研究开发工作很多。有许多途径可以把单抗用于治疗。例如,单抗治疗可以用来破坏恶性肿瘤细胞,并可通过阻断特异的细胞受体防止肿瘤生长。在这类治疗方法中还有许多变通,例如放射免疫治疗,在此放射性物质定位于靶标细胞系,并释放致死剂量的化学物质。过去十年里,单抗治疗获得两巨大成功,并在许多重大疾病治疗上显示出巨大的潜力和前景,包括但不限于恶性肿瘤、心血管疾病、炎症、黄斑变性(macular degeneration)、移植排斥、多发性硬化和病毒感染,并显示出良好的前景。由于其无与伦比的疗效,安全性和巨量的市场需求,这类产品的种类正以极高的速度膨胀[9,10,11,12].。
至今,获取单抗的主要途径是涉及啮齿类(如小鼠和兔)、灵长类如(如猕猴、猿和猴等)的杂交瘤技术。在医疗应用中遇到的一个问题是,这些获得单抗的标准程序将产生人抗鼠抗体(HAMA)反应。尽管鼠科动物的抗体与人的极为相似,但是仍有差异。因此,人的免疫***把鼠源抗体作为外源物质,很快就把它们从循环***中清除,并引起***性炎症反应。这种情况被称为产生HACA(人抗嵌合)抗体或者HAMA反应。
解决这一问题的方法之一是直接从人或者人的细胞生产抗体。剑桥大学的AbrahamKarpas利用他的人骨髓瘤细胞系Kapas-707H建立了人-人杂交瘤技术,该技术可以用于生产人单抗的研究。这种细胞系具有使人体产生的多数抵抗感染、癌症,艾滋病和其他病原物的抗体永生化的潜力(Karpas A,et al.,2005,Studies of four new human myelomacell lines.Leuk Lymphoma 46(1):101-12)。但是,这在起初并不容易,因为一般来说,用抗原免疫人体以产生抗体被认为是不符合伦理的,即使对非人动物进行免疫也有争论。另外,产生抗人的组织或人的蛋白的人抗体也不是容易的。另一个十分重要且明显的问题是,即使人的免疫***能够产生很大的分泌抗体的细胞群,当用人开发新的单抗时仍然存在这样的瓶颈:在人体内,靶点特异性的前体B细胞的丰度极低,与对人杂交瘤构建的需求相比,人体中靶点特异的阳性前体细胞的比例很低。因此,前体B细胞的分离、纯化和富集成为人杂交瘤中的关键技术之一。
自1980年以来,已经尝试了各种各样的用重组DNA技术解决这一问题的方法。其中一种方法把编码单克隆鼠源抗体的结合区的DNA与人体产生抗体的DNA融合。然后用哺乳动物细胞的培养物来表达这一DNA,产生了半鼠源半人源的抗体。(细菌不能担当此任,因为它们不能产生这类糖基化蛋白)。
过去,科学家仅仅能够制造鼠源单抗,由于会引起HAMA反应,这种抗体在没有进行人源化的情况下不能用于免疫治疗。
基因工程改造过的小鼠,也称之为转基因小鼠,可以用于产生人源抗体[16],这种技术已经被许多商业组织所采用:
1.其UltiMab平台已投放市场[17]。
2.Abgenix-其Xenomouse技术已投放市场。Abgenix已于2006年4月被Amgen兼并[18].
3.公司的VelocImmune技术[19]。
2006年8月,Pharmaceutical Research and Manufacturers of America报道,美国公司有160种不同的单抗在进行临床研究或在等待FDA批准[20]。
正如过去十年许多成功案例证明的,人源化动物是一种有力的且可重复的工具。从发现单抗可以离体产生到现在,科学家已经把目标放在产生“全人源”抗体以避免人源化和嵌合抗体的副作用。已发现两种成功途径-噬菌体展示产生的抗体和基因工程改造过的小鼠以产生更像人的抗体。
剑桥抗体技术公司(CAT)是治疗性单抗最成功的商业组织之一。CAT的科学家证明,噬菌体展示可以用来在线状噬菌体表达抗体可变区。这一结果发表在Nature[10]。其他的重要文献包括参考文献22,CAT把它的展示技术进一步发展成几种已专利的抗体发现/功能基因组学工具,称之为Proximol[12]和ProAb。ProAb技术是1997年11月公开的[13],包括了以带病和不带病组织对抗体库进行高通量筛选,而Proximol则利用了一种自由基酶促反应在临近一个特定蛋白质的位置进行标记[14][15]。
抗体库和噬菌体展示技术已经成为利用非杂交瘤技术开发高质量抗体的有效方法。在过去二十年里,这些技术在开发治疗性单抗方面获得了巨大的进步,例如,美国007175996专利及其他文献公布的定向分子进化技术。这些技术正在成为抗体成熟等的不可缺少的工具[13,14,15].。
RANKL拮抗剂及其在临床上的应用
正如上面所述,RANKL是引起骨质疏松症的关键因子,大量的研究结果证明,它是伴随Ankylosing Spondylitis,Psoriasis,Rhumatoid arthritis的股侵蚀和在全球老年人以及绝经后妇女中非常普遍的骨质疏松症的关键因子[16,17,18,19,20]。
骨质疏松症和股侵蚀发病人群很大,而且致残率很高,正在开发预防和治疗药物的组织如雨后春笋般涌现[21]。至今,已有若干RANKL拮抗剂进入临床前或临床研究,例如配体-Fc融合蛋白和抗人RANKL单抗。其中有一些,例如重组OPG和重组治疗性单抗,获得了极有前景的结果
发明内容
本发明提供了一种轻链,包含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或其片段。
本发明提供了一种重链,包含有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或其片段。
本发明提供了一种轻链,包含有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或其片段。
本发明提供了一种重链,包含有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列或其片段。
本发明提供了一种对人RANKL特异的全长抗体轻链,包含有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列或其一个片段。
本发明提供了一种对人RANKL特异的全长抗体重链,包含有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列或其一个片段。
本发明提供了上述人RANKL特异抗体的一种Fab片段,更佳地,这种Fab是PEG化形式。
本发明提供了上述抗体的全长或Fab形式用于治疗绝经后妇女或老年人骨质疏松或由炎症疾病、恶性肿瘤骨转移、激素治疗或其他原因引起的股侵蚀的方法。
本发明的优点
有多种药物,包括双磷酸盐类和某些中药用于治疗骨质疏松症和股侵蚀,其疗效良好,但仍然有如下一些问题。
双磷酸盐类(也称为二磷酸盐)是一类预防骨质流失的药物,用来治疗骨质疏松症和类似的疾病。骨质处于不断的更新代谢过程中,并由产生骨质的成骨细胞和降解骨质的破骨细胞维持平衡。双磷酸盐能够抑制破骨细胞对骨质的降解。破骨细胞本身也在不断更新,正常情况下可通过凋亡这种细胞的***机制进行自身破坏。双磷酸盐可以促使破骨细胞凋亡。双磷酸盐的应用包括预防和治疗骨质疏松、变形性骨炎(osteitis deformans)(又称Paget骨病或畸形性骨炎)、骨转移(有或没有高血钙症)、多发性骨髓瘤、原发性甲状旁腺功能亢进、骨发生不完全以及其他导致骨质脆弱的情况。
双磷酸盐类有以下副作用(详见:http://en.wikipedia.org/wiki/Bisphosphonate#Side-effects)。
(1)口服双磷酸盐类可引起肠胃不适、食道炎症和损伤,这是口服含氮制剂的主要问题。服药后端坐30至60分钟可防止这种情况发生。
(2)首次静脉注射双磷酸盐类后可出现发热和流感症状,认为这是由于它激活γδT细胞引起的。这些症状在以后施药后不会重复出现。
(3)(3)有轻微破坏电解质平衡的风险,但是不需要特别关注。
(4)在慢性肾衰竭中,这类药物被***很慢,需要调整剂量。
(5)双磷酸盐类与颌骨坏死有关,下颌骨的发生率是上颌骨的两倍,多数病例发生在癌症病人大剂量静脉注射之后。牙科手术(涉及骨的)之后有大约占60%,为此建议,双磷酸盐治疗应当推迟到牙科手术之后,以消除潜在的感染点(可能在任何手术之前使用抗生素).(6)已报道了许多骨、关节、肌(与)骨骼严重疼痛的患者,这促使进行改变标示(labelingchanges)。
(7)最近的研究指出,双磷酸盐(特别是唑来磷酸盐和阿仑磷酸盐)的使用是妇女心室纤维颤动的危险因子。对双磷酸盐的炎症反应或血钙水平的波动揭示了可能的机理。有研究估计,3%的心室纤维颤动病例可能是使用阿仑磷酸盐引起的。但是,直到目前,双磷酸盐的有利效果仍然高于这种可能的危险,尽管严重心室纤维颤动副作用的高危人群(例如心力衰竭、冠状动脉疾病或糖尿病患者)需要特别护理。FDA仍未肯定双磷酸盐和心室纤维颤动之间的因果关系。
(8)基质金属蛋白酶2可能是与双磷酸盐相关的颌骨坏死的候选基因,因为它是抑制与骨质异常和心室纤维颤动相关的唯一已知基因,而这两种情况都是双磷酸盐的副作用。
(9)有观点认为,长期使用双磷酸盐可导致骨转换(bone turnover)的严重抑制或过度抑制,特别是在股骨粗隆区。认为在骨质中存在的微裂缝不能愈合,最终融合放大,导致发生非典型骨折。这种骨折有难以愈合的倾向,并且通常需要某些类型的骨质刺激,例如骨移植,作为次级过程。这种并发症并不多见,总骨折减少的好处仍然存在。
与现有一线药物如福善美(Fosamax,由MERK公司出产的双磷酸盐药物)相比,本发明的产品具有不同的作用机理,具有更好的疗效和安全性。同时,其他药物需要每周一次,但本产品一年仅需要注射两次。
本发明从一个人抗体库中分离了一种全人源抗人RANKL抗体,并用PAE技术对其进行了进一步改造,从而开发了一种具有高亲合力的治疗性单抗,命名为PAE30A。实验结果表明,PAE30A具有中和人RANKL并可在体外和体内抑制破骨细胞的分化、活性和存活。首先,这一产品是一种全人源抗体,其免疫原性显著降低,使其与嵌合或人源化的单抗相比副作用大大减轻。
在医疗中应用的一个问题是,生产单抗的标准方法产生的是鼠源抗体。尽管鼠源抗体与人源的很相似,但是它们之间仍有不同。因此,人的免疫***把鼠源抗体视为外源物质,很快把它们从循环***中清除掉,从而引起***性炎症反应。这种反应被称为产生HACA(人抗嵌合)抗体或HAMA(人抗鼠)抗体。
第二,本发明利用了Fab片段作为这一产品的一种替代形式,这将降低产品的成本而不失去其上述优势。此外,这种结构形式没有可能带来副作用的CDC和ADCC效应。
第三,这种Fab形式采用了PEG化表面修饰技术,使其在血液循环***中的存活期大大延长,使得这种产品成为缓释的。PEG化是把聚乙二醇多聚链共价结合到其他分子(通常是药物或治疗性蛋白)上的过程。PEG化过程通常是把PEG的活性衍生物与目标大分子一起温育来完成。PEG与药物或治疗性蛋白的共价结合可以“掩盖”这种制剂受到宿主免疫***的攻击(降低免疫原性和抗原性),增加流体动力学体积(在溶液中的大小),并通过降低肾脏清除作用而延长其循环时间。PEG化还可以为疏水药物或蛋白提供水溶性。
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附图说明
图1.哺乳动物细胞表达载体结构示意图。抗生素基因AMP和复制起点O来自pUC57,真核启动子Pcmv来自人巨细胞病毒,SV40 Ori和SV40 poly A信号来自SV40病毒,抗生素基因Neo来自pcDNA3.1(Invitrogen)。
图2.HPLC实验结果图,显示纯化后目标单抗的质量。如图所示,产生的蛋白只有一条带,积分结果证明其纯度大约为98%。
图3.本发明的抗体抑制破骨细胞分化实验结果。以具有与IgG2的Fc相同的单抗PAE36为阴性对照,AMG162为阳性对照。单抗浓度为0.00,1.00,5.00,10.00,20.00,40.00,80.00,160.00ng/ml。数据显示,3K7F5/Full(在其他描述中也称为PAE30Full和3K7F5/Fab(也称为PAE30Fab)可中和RANKL对破骨细胞形成的刺激效应,更为重要的是,这种效应具有密切的剂量依赖效应。此外,这一数据还清楚地显示,3K7F5/Full和3K7F5/Fab的这种抑制效应比其阳性对照更有效。
具体实施方式
提供的以下实施例,包括实施的试验和获得的结果仅仅用于说明之目的,而不可解释为对本发明的限制。本发明的基本技术策略包括:(1)从一个全人抗体库分离对人RANKL具有高亲和力的特异性可变区,(2)利用PAE技术进一步改进其亲和力,(3)通过一系列离体和活体试验,评价对骨质疏松和股侵蚀的治疗价值。
实施例1:淘筛对人RANKL特异的可变区片段
用来自不同省份、不同民族供血者的3000多份血样,参照下述文献提供的方法构建了超大规模抗体库。用含7%DMSO的YT培养基把从构建的抗体库制备的噬菌体裂解产物稀释至10E10后,分成1毫升的小份,-80℃保存备后用。
1.Hoogenboom HR,and G Winter,1992,By-passing immunisation:human antibodies fromsynthetic repertoires of germline VH gene segments rearranged in vitro.J MolBiol,227(2):381-388.
2.Griffiths AD,SC Williams,O Hartley,IM Tomlinson,P Waterhouse,WL Crosby,RE Kontermann,PT Jones,NM Low,TJ Allison,TD Prospero,HR Hoogenboom,A Nissim,JPL Cox,JL Harrison,M Zaccolo,E Gherardi,G Winter,1994,Isolation of highaffinity human antibodies directly from large synthetic repertoires.EMBO J,13:3245-3260.
3.Nissim,A,HR Hoogenboom,IM Tomlinson,G Flynn,C Midgley,D Lane,G Winter,1994,Antibody fragments from a‘single pot’phage display library asimmunochemical reagents.EMBO J,13:692-698.
4.Marks JD,HR Hoogenboom,TP Bonnert,J McCafferty,AD Griffiths,G Winter,1991,By-passing immunization:human antibodies from V-gene libraries displayed onphage.J Mol Biol,222:581-597.
5.Haidaris CG,J Malone,LA Sherrill,JM Bliss,AA Gaspari,RA Insel,MA Sullivan,2001,Recombinant human antibody single chain variable fragments reactive withCandida albicans surface antigens.J Immunol Methods.257(1-2):185-202.
(2)对人RANKL进行淘筛
1.解冻1支TG1菌株并转移至50毫升三角瓶中,加入新鲜的LB培养基至15毫升,37℃225转/分钟培养16小时。
2.在40℃培养箱中快速解冻1支上述保存的噬菌体裂解液,加入到上述TG1培养物,37℃225转/分钟培养16小时。
3.12000RPM离心10分钟,转移上清至一灭菌过的50毫升离心管,4℃保存备用。其滴度应达到2×10E11或更高。
4.用重组人sRANKL(Orbigen生产)包被一25毫升细胞培养瓶至少2小时,然后加入至少3×10E10噬菌体颗粒。
5.37℃温育1小时。
6.轻轻倒出上清,用含1%Tween-20的1×PBS洗涤10次。
7.加入1毫升新制备的处于对数期的TG1细菌,37℃培养16小时。
8.重复上述步骤3至7四次。
9.上述细胞稀释至100000细胞/ml,然后均匀涂铺到含1%AMP的1.5%琼脂板上,培养至能分辨出单个菌落。
10.挑选有噬菌班的菌落,接种到10块96孔深孔板进行培养。
11.培养完毕,5000RPM离心深孔板20分钟,然后把上清转移到新的96孔板,封口后4℃保存备用。
12.用浓度为10μg/ml的重组人RANKL包被10块96孔板,每孔10微升。然后加入上述噬菌体上清1微升,37℃温育1小时后,用含1%Tween-20的PBS洗涤10次。
13.每孔加入1μl HRP标记的羊抗M13单抗,37℃温育30分钟后用含1%Tween-20的PBS洗涤10次。
14.每孔加入20微升含0.025%DAB的PBS和1微升1%H2O2,37℃温育20分钟后读取595nm处的光密度。
15.选取颜色反应最强的孔相对应的克隆即为亲和力相对高的阳性克隆。本步骤从876个阳性克隆中鉴定出12个读数相对较高的克隆。如有必要,本步骤可以AMG162作为阳性对照。
16.为了测定亲和力,从上述12个克隆制备了少量蛋白样品。三重复试验的结果证明,6E2和3K7的亲和力最高。用Scatchard方法(Munson et al,1980,Anal.BioChem,107:220)进行的分析证明,其亲和力高达4.27×10E-9和3.56×10E-9nM,相比较而言,后者更好。
(3)用PAE技术进行分子进化
上述结果表明,3K7的亲和力在亚纳摩尔水平。用已在PCT/CN2009/074839和CN200910198282.X中详细描述的程序化分子进化技术对3K7的亲和力进行了改良以满足治疗性抗体的要求。为此,对3K7重链和轻链的CDR2和CDR3进行突变,构建了噬菌体展示的次级抗体库,以AMG162为阳性对照,以人sRANKL为抗原对该库进行了淘筛。经过四轮突变和淘筛,获得了15个亲和力比阳性对照高的克隆。正如亲和力测定结果所示,受检的两个克隆3K7B8和3K7F5的亲和力分别为0.42×和0.17×10E-12nM,明显高于其阳性对照的平行测定结果5.23×10E-12nM。
克隆3K7F5按照实施例6的方法测序后用于后续试验。测序结果如SEQ ID NO.1至SEQID NO 4所示。SEQ ID NO.1是轻链的可变区的DNA序列,SEQ ID NO.2是推测的轻链氨基酸序列。SEQ ID NO.3是重链的可变区的DNA序列,SEQ ID NO.4是推测的重链氨基酸序列。
把目标基因克隆到哺乳动物表达载体
1.用PROMEGA公司的质粒DNA制备试剂盒从100毫升含有3K7F5质粒的细菌培养物制备质粒DNA。
2.用适合的内切酶酶切上述质粒,在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳分离片段,重链为360bp,轻链为320bp。然后用Promega公司或等效的DNA回收试剂盒从胶中回收DNA片段。
3.用重叠PCR方法把上述获得的可变区片段与相应的重链和轻链的恒定区编码片段拼接成全长的重链和轻链基因。
重叠PCR方法在以下文献中有详细描述:(1)Young L and Dong Q,2004,Two-step totalgene synthesis method,NAR,32(7)e59 DOI:10.1093/nar/gnh058;(2)Roman Rydzanicz,X.Sharon Zhao and Philip E.Johnson,2005,Assembly PCR oligo maker:a tool fordesigning oligo deoxynucleotides for constructing long DNA molecules for RNAproduction,NAR,V33,W521-W525doi:10.1093/nar/gki380.
恒定区DNA序列以大写字母示于SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。这些DNA序列已经事先克隆到了pBluescript II SK的SmaI位点,分别记作pLightCon和pHeavyCon。序列已经通过测序验证,并在后续的重叠PCR中用作模板以与上述获得的可变区片段构成全长的重链和轻链。恒定区与可变区片段之间的重叠区域应当达到20±1~6bps,其Tm值应当为60±1℃。PCR循环为:95℃预变性2分钟,然后进入20个循环:95℃10秒-56℃35秒-72℃45秒,最后72℃后延伸5分钟。
连接到恒定区后形成的重链和轻链的全长序列示于SEQ ID NO.5和SEQ ID No.6。
把上述全长重链和轻链***到哺乳动物细胞表达载体phCMV-II(示于图1,其他哺乳动物表达载体如Invitrogen的pcDNA3.1,Promega的pCi-Neo也可使用)的相应位点。在5’-和3’-分别带有NheI和NotI位点的重链和轻链用NheI/NotI酶切后分别连接到用该酶组合预切过的phCMVII上,然后,分离单克隆并进行测序验证。
转化DH5α菌株并测序验证。获得的正确质粒记作phCMV-II/3K7F5L和phCMV-II/3K7F5H。这个克隆用于后续的试验。
实施例2:重组单抗蛋白的制备
1.无内毒素质粒DNA的制备:用带有phCMV-II/3K7F5L和phCMV-II/3K7F5H质粒的细菌接种100ml LB培养基,用Qiagen公司的Ultrapure Plasmid DNA Purification Kit制备质粒DNA。
2.转染和培养CHO细胞:用上述制备的质粒DNA、Invitrogen公司的LipoFamine2000转染哺乳动物细胞,转染过程采用厂家提供的方法进行。也可使用PEI35000等替代物。
3.转染条件:(1)向5ml新配制的Ex302培养基(购自Sigma-Aldrich)加入CHO DHFR(-)细胞(ATCC No.CRL-9096)至终密度2×10E5细胞/ml。37℃培养48小时后,450×g离心10分钟收集细胞。(2)加入1ml新鲜的DMEM培养基,轻轻敲打管底以重悬细胞。然后,用上述准备的质粒DNA转染细胞。(3)48小时后取样,取50ul用ELISA检测表达情况。如果表达比较好,则进入下一步。(4)加入45ml新鲜EX302培养基,并加入G418至终浓度50ug/ml,37℃培养96小时。
4.抗体的纯化。2000RPM离心10分钟,收集上清。然后,上清顺序通过HiTrap Protein AHP、Capto S和Capto Q柱。用SDS-PAGE电泳检定洗脱物的纯度。纯度应达到95%以上。
5.洗脱物抛光:用HP Superdex 200,10/300层析对洗脱物进行最后的“抛光”,获得的产物的纯度应能达到>98%(见图2)。最后抛光过的高纯度洗脱物可以在-80℃备用。
实施例3:Fab形式的表达和重组蛋白的制备
(1)构建表达载体
带有上述SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的DNA片段克隆到pCOM3H载体(Wu SC,Lin YJ,Chou JW,Lin CW.2004,Construction and characterization of a Fab recombinant proteinfor Japanese encephalitis virus neutralization.Vaccine.25,23(2):163-71)。在5’-带有NheI和NotI位点的轻链用NheI/NotI酶切后连接到用相同的酶组合预切过的pCOM3H。然后带有XhoI和SpeI的重链用同样的酶组合酶切后连接到其XhoI/SpeI位点。转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后,在含IPTG/X-gal和氨苄青霉素的琼脂平板上检定和分离单克隆,经酶切确认选中的克隆。把一个正确克隆接种到500ml含氨苄青霉素的的LB培养基培养6小时,然后用1mM IPTG诱导产生Fab。诱导2小时候收取上清。
(2)纯化Fab和PEG化
用KappaSelect(GE公司)/离子交换层析/分子筛根据厂家说明书纯化Fab,获得的产物按AP Champman et al(1999)[Therapeutic antibody fragments with prolonged in vivohalf life.Nature Biotech.17:780-783]的方法进行PEG化和纯化,获得的纯化后的PEG化抗人RANKL单抗,即3K7F5Fab-PEG,-80℃储藏备用。
实施例4:抗体中和能力和亲和力的体外研究
1.重组3K7F5及其Fab形式的中和能力
(1)对离体破骨细胞的抑制作用
RAW264.7(ATCC No.TIB-71,Manassas,Va.)是一种啮齿类巨噬细胞系,经RANKL诱导可分化成破骨细胞样细胞。Simonet et al.(1997,Cell 89:309)和Lacey et al.(1998,Cell 93:165)描述了详细的实验方法。
TRAP试验:破骨细胞是多核的TRAP阳性细胞。RAW 264.7是一种通用的检测骨质疏松症治疗效果的细胞系。本试验中,在24孔板上按照每孔1×10E4接种RAW细胞,培养24小时后加入50ng/ml RANKL以及从10至500ng/ml系列浓度的本发明的抗体。此后,没三天更换一次培养基。第六天用上述的TRAP试验方法进行TRAP检测。显色反应后,用Citrate/acetone固定1分钟,然后用AS-BI作为底物37C处理1小时,然后用Mayer’s苏木精(Sigma Chemical Co.,St.Louis,Mo.)染色两分钟后进行干燥、二甲苯透明,中性树脂封片后显微观察,计数TRAP阳性细胞(≥3核/细胞的多核破骨细胞)的数量。为了检测本发明抗体对破骨细胞形成的抑制功能,向培养物中加入不同剂量的纯化抗体,AMG162作为阳性对照,Rituxan作为阴性对照。培养过程中,每三天更换一次培养基。
如图3所示,本发明的人RANKL特异性单抗能够中和RANKL的作用,并可次级破骨细胞的生成。重要的是,这一结果说明,本发明所述抗体的加入抑制了RAW(破骨细胞样细胞的前体)细胞分化成破骨细胞,而这种抑制作用具有量效关系。这说明,本发明的抗体具有抗破骨细胞生成的特性。
亲和力分析
用Scatchard法(Munson et al,1980,Anal.BioChem,107:220)对3K7F5/Full和3K7F5/Fab的亲和力进行了分析,结果表明,其亲和力达到了8.7×and 6.5×10-12M,而在平行试验中AMG162大约为0.37×10M。这说明,3K7F5/Full和3K7F5/Fab的亲和力不但比广泛接受的0.1nM的治疗性单抗标准高,也高于阳性对照。
实施例5:模式动物试验
试验设计:72只体重在120至180克的3月龄雌性SD大鼠去卵巢后依体重随机分成12组,每组6只。E30PAFull和PAE30Fab(受试组)用来检测抑制作用,AMG162(一种抗人RANKL IgG2单抗)为阳性对照,PAE36为阴性对照。PAE36是一种人CD20特异性的IgG2单抗,与RANKL不结合。
所有组的动物均在手术后第三天接受一个剂量的抗体注射,剂量分别为0.8,1.6 or2.4mg/kg。阴性和阳性对照组分别以相同的方式接受PAE36 and AMG162。第84天处死动物,取右侧股骨105℃干燥至恒重后称重,并测定骨密度和骨钙含量。
腿骨密度:用双能X射线吸收仪(DEXA;Piximus Mouse Densitometer,GE MedicalSystems)测定腿骨密度(g/cm2)。测定了整个股骨和每个股骨的三个亚区,即近端1/3、中部1/3和远端1/3的BMD,即单位投影骨面积的矿物质含量(g/cm2)。
股骨钙含量:用TRACE 1200(Aurora Biomed Co.)原子吸收光谱仪测定了股骨的钙含量(mg/g)。
统计分析:除特别注明的外,所有数值均以平均数±标准差表示。采用Student T检验(SPSS for Windows 11.0.1,SPSS Inc.,Chicago,IL)对处理组与阳性或阴性对照组数据进行了比较。对处理组其他变量比较的显著性检验采用多变量分析(一般性线性模型)方法进行。当主效应达到显著水平(p<0.05)时,用处理组Tukey post-hoc比较法(p<0.05)进行。为了检验鼠体质量和子宫质量是否与骨质特性有混淆效应,所有数据均以鼠体质量和子宫质量作为协变量进行了多变量分析。
实验结果:
实验结果示于下表。
表。抗体对去卵巢大鼠骨密度和骨钙含量的影响(±S,n=6)
*与阴性对照比较;+与阳性对照比较;*或+指p<0.05,**或++指p<0.01.
结果指出,与阴性对照相比,3K7F5/Full,3K7F5/Fab及阳性对照能够显著增加骨密度和骨钙含量(p<0.01);与阳性对照相比,3K7F5/Full和3K7F5/Fab增加骨密度和骨钙含量的潜力更高(p<0.01)。另外,3K7F5/Full和3K7F5/Fab见未发现统计学差异。
统计分析表明,(1)去卵巢可显著降低骨密度和骨钙含量,说明去卵巢是一种有效而合理的建模方法;(2)与阳性对照相比,3K7F5/Full和3K7F5/Fab都可以更有效地增加骨密度和骨钙;(3)所有三种抗RANKL抗体,即阳性对照、3K7F5/Full和3K7F5/Fab均有明显的剂量依赖性,即存在量效关系。
上述离体和活体试验均证明,3K7F5/Full和3K7F5/Fab两者都能以良好的量效关系提高模型动物的骨密度和骨钙含量,所有这些都是其在其他实验中潜力的反映。
实施例6:抗人RANKL单抗3K7F5的DNA测序
用BigDye测序试剂盒(PE公司产品)对上述抗人RANKL单抗的可变区进行了测序。序列SEQ ID No.1至4是轻链和重链可变区的核苷酸序列以及推测的氨基酸序列。在推测的氨基酸序列中,主要由根据Kabat方法确定的CDR区组成的与抗原结合的区域示于以下序列:
推测的轻链氨基酸序列中的CDR区氨基酸序列(108氨基酸残基)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRVSQSARGRYFGWYQQKPGQAPRLLIYGGSSRPTGIPDRFSGSGSGTDFTLTLSRLEPEDFAVFYCQQYLSSPKTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:2)。
推测的轻重链氨基酸序列中的CDR区氨基酸序列(122氨基酸残基)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYVMSWLRQAPGKGLEWVSGLTGSVGSTYYLDSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSVRIEDTPLYYCVKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:4)。
下划线部分为重链和轻链的CDR区。
Claims (4)
1.一种抗RANKL单抗或其片段,其轻链可变区含有SEQ ID NO:7-9所示的CDR区为抗原结合位,其重链可变区含有SEQ ID NO:10-12所示的CDR区为抗原结合位。
2.如权利要求1所述的抗RANKL单抗或其片段,其特征在于,所述片段是scFv,Fab,Fab’,或抗体片段,或包含所述CDR区的全长抗体。
3.如权利要求1所述的抗RANKL单抗或其片段,其特征在于,所述轻链包含SEQ ID NO:2所示的轻链氨基酸序列,所述重链包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的抗RANKL单抗或其片段,其特征在于,所述单抗或其抗原结合片段是PEG化的或非PEG化的,以与多聚物链接。
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