CN102716515A - 一种修复半月板撕裂的生物材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种修复半月板撕裂的生物材料及其制备方法。该材料由内层的脱细胞基质膜、中间层的多孔结构胶原基质膜、外层的软骨细胞形成的细胞层及细胞膜片构成。该修复材料，具有一定的弹性、韧性和良好的生物活性，软骨细胞可以自行分泌细胞因子，并可通过关节腔滑液直接获得营养成分，加快半月板撕裂过程中与撕裂两端组织细胞间通讯连接的建立，促进材料中细胞与自体组织细胞迁入融合，缩短组织再生及功能重建时间，为临床修复半月板撕裂（包括血供区）损伤中特别是无血区及低血区的组织再生及功能重建提供了一种理想的新材料和材料的制备方法。
Description
技术领域
本发明属于组织工程学的生物材料技术，涉及一种修复半月板撕裂的生物材料及其制备方法。
背景技术
半月板位于膝关节股骨髁与胫骨平台之间，其功能在于稳定膝关节，传递膝关节负荷力，吸收振荡，减少应力，改善关节润滑，并有助于关节软骨的营养。正是由于半月板起到了稳定载荷作用，才保证了膝关节能够长年负重运动而不致损伤。然而，由于膝半屈、重力挤压、旋转及剪切力量等原因，常造成半月板损伤，其发病率约占所有膝关节紊乱疾病的75%左右。半月板损伤后常引起股四头肌萎缩，关节疼痛、弹力、绞锁、活动受限，导致膝关节退变加速，严重影响患者的生活质量。
Arnoczky等依据半月板血液供应情况，提出三区分类：半月板外周的红区，中央的白区，和两者之间的红白区。其中红区及红白区有血供，而白区仅靠关节腔滑液提供营养。临床研究发现，采用现有的治疗及修复技术，仅能对位于红区的半月板进行修复，红白区仅有部分愈合能力，而对白区完全没有愈合能力。若不对撕裂部位尤其是白区（无血供区）进行治疗，会导致撕裂和损伤的扩大甚至半月板的退化、关节软骨损伤。因此，如何有效修复半月板撕裂损伤，防止后期膝关节骨性关节炎的发生，是诸多医生及学者们一直在致力探寻的课题。
目前，半月板损伤治疗常用的外科手术，包括完全或者部分半月板切除术、撕裂后缝合术以及半月板置换术等。对于红区及红白区撕裂，临床一般采用缝合法；而对于白区的损伤则采用切除术。这种手术能够使患者迅速缓解痛苦，恢复膝关节的功能。对半月板全部切除术后长期随访结果表明：手术侧膝关节骨性关节炎的发生率明显升高，少数病例出现韧带松弛，而导致关节软骨的退行性改变，以至发生骨性关节炎。为此，许多半月板支架或植入物被用来替代或者修复半月板切除术中被切除的组织。专利200780042802.7、PCT/US2010/047852、US5984858、US4880429、US5735903、US5108438、US6042610、US5913900等，提供了采用人工合成、自体、同种异体、异种材料等来替代全切除的半月板的支架及植入物的制备方法。这些材料能够延缓膝关节骨性关节炎的发生，但半月板假体的柔软性、蠕变性、相关的免疫排斥反应及生理功能等，尚难达到人体半月板的要求，无法满足临床要求，尤其是对于白区损伤，一直缺乏有效的治疗手段。
发明专利200680031664.8、US20090186062，提供了一种用于半月板撕裂的方法，包括一种胶原膜材料（ChondroGide）。该胶原膜材料由猪或牛的胶原膜制备而成，通过引导滑膜细胞、间充质细胞、细胞因子等，从不同部位迁移修复半月板撕裂，达到修复撕裂组织的目的。这些技术经组织学证实：虽然有滑膜细胞的迁入，但未发现这种胶原膜在半月板红区、红白区及白区撕裂修复中具有明显效果，其应用于半月板撕裂具有一定的局限性。发明专利200580013082.2公开了一种用于无血管半月板修复和再生的支架，该发明仅仅提供了一种用于血液及其成分、细胞、药物从组织血管区到无血区的通道，其本身并不具有生物活性，材料本身在撕裂修复中，同时也增加了半月板本身的组成成分；此外，支架材料的降解会产生不同于机体的微环境，不利于半月板组织的重建。
研究发现，理想的半月板损伤修复材料，应具有：良好的生物活性，能够产生生物活性因子及基质成分；细胞参与半月板重建过程中，能够与周围正常半月板组织形成胞间联系；能够在撕裂部位自我稳定，并通过关节腔滑液进行营养吸收，可通过诱导其间充质干细胞的迁入，加快半月板愈合及白区的修复。
由于软骨细胞可直接在关节镜下从自体获取，并且移植后不引起免疫排斥反应，因而成为目前组织工程研究中应用广泛的一种细胞来源。由动物来源组织（皮肤、跟腱、鼠尾等）提取的胶原具有降解速度快，细胞黏附性好的特点，是一种天然的生物材料，最适合于半月板组织工程学重建。该类型胶原经过重构、交联以及酶切处理后，不仅不会改变其天然的三螺旋结构，而且可以降低其抗原性，并能增强其对抗胶原酶消化的能力。而具有天然来源的脱细胞基质膜材料，能够保持其特有的生物活性成分及活性因子，在降解过程中，可释放促进机体组织再生及功能重建的细胞因子，提高损伤组织的愈合能力。
发明内容
针对修复半月板撕裂损伤临床治疗的现状及存在的问题，本发明的目的是提供一种组织工程半月板撕裂修复的新生物材料及其制备方法。
本发明是这样实现的：
一．本发明修复半月板撕裂的生物材料，由多层结构组成，即，依次由内层的脱细胞基质膜、中间层多孔胶原结构的胶原基质膜、外层的软骨细胞形成的细胞层及细胞膜片构成。中间层与内层之间，通过注模、流延或刮板复合，中间层与外层之间，通过软骨细胞接种胶原基质膜复合。
内层的脱细胞基质膜，其在该材料中起“支架”作用，同时保留细胞基质的活性成分，含有特殊的蛋白分子（如纤维粘连素、层粘连素、胶原、EGF、bFGF等），可促进损伤愈合及细胞增殖、表型维持。
外层的软骨细胞形成的细胞层及细胞膜片，可使细胞在移植后存活时间更长并具有半月板组织结构功能特点。软骨细胞形成的细胞层，可通过细胞间及细胞与周围半月板基质间建立联系；软骨细胞形成的细胞膜片，方便临床治疗半月板撕裂过程中与撕裂两端组织细胞间通讯连接的建立，促进材料中细胞与自体组织细胞迁入融合。
中间层的多孔胶原结构的胶原基质膜，提供了细胞迁入及细胞因子复合的空间，有利于诱导间充质干细胞的迁入，发挥在半月板损伤修复中软骨细胞及周围环境中干细胞的生物活性作用，促进损伤组织再生及功能重建。
该生物材料，以内层为“支架”，通过注模、流延或刮板等，与中间层的多孔胶原涂层复合，构建具有多孔结构的胶原基质膜。通过细胞双面接种以及旋转培养，构建具有诱导细胞迁入，实现半月板撕裂重建。由于具有附合双层多孔结构的脱细胞基质膜，以及细胞因子和具有半月板组织特征的软骨细胞膜片，可促进半月板撕裂部位尤其是白区的组织愈合及其组织再生。
二．本发明之修复半月板撕裂生物材料的制备方法，依下述步骤完成：
步骤一、脱细胞基质膜的制备:该脱细胞基质膜可选用动物源性脱细胞基质膜或人源性的脱细胞羊膜等，如，脱细胞小肠粘膜下层、脱细胞心包膜、脱细胞腹膜等。此脱细胞基质膜采用现有工艺方法即可制备。
步骤二：具有多孔结构的胶原基质膜的制备：配置浓度为3～15mg/mL、pH值为3～6的胶原溶液在脱细胞基质膜致密面，通过注模、流延或刮板制备多孔胶原涂层；通过预冻温度设定、冷冻速度和冻干工艺来调节胶原层孔径大小，使其孔径大小可控制在50～600μm之间，更优在200～400μm之间，制备并获得具有附合多孔结构的胶原基质膜。
所述的胶原溶液，是用牛跟腱、皮肤、鼠尾等动物源性材料制备而成的。
步骤三、软骨细胞形成的细胞层及细胞膜片的制备：
细胞层软骨细胞接种：用软骨细胞培养液浸润步骤二制备的胶原基质膜后，按1×104～2×106/cm2密度接种软骨细胞于胶原涂层多孔表面，静置0.5～4小时，加入软骨细胞培养液2～4mL，液面下培养2～4天，待细胞在多孔胶原基质膜内胶原纤维束贴附后，去除培养基。后期旋转培养参照步骤四完成制备。
细胞膜片制备：待完成细胞层接种后，翻转胶原基质膜，置于细胞培养用孔板。采用同样方法将软骨细胞接种脱细胞基质材料疏松面表层，液面下培养2～7天。后期旋转培养参照步骤四完成制备。
所述软骨细胞培养液,其组成为：在商用低糖型DMEM培养液中含有胎牛血清100ml/L、非必需氨基酸10ml/L、丙酮酸钠1mmol/L、L-谷氨酰胺10～500μg/mL、维生素c（Vc）为50～100μg/mL、转化生长因子（TGF-β1）为5pg/mL～20ng/mL、碱性成纤维生长因子-2（bFGF-2）为5～50ng/mL，血小板源性生长因子（PDGF-bb）为1～10ng/mL、***（IGF-1）1～50ng/mL。
所述的软骨细胞，可选择软骨细胞或可向软骨细胞分化的间充质干细胞。该间充质干细胞可为骨髓间充质干细胞、脂肪源性间充质干细胞、牙龈间充质干细胞、牙髓干细胞、脐带、脐带血间充质干细胞或者胚胎干细胞等的任何一种。
步骤四、旋转培养：将接种软骨细胞的胶原基质膜加入旋转细胞维持培养液中，该旋转细胞维持培养液为软骨细胞培养液进行旋转培养：转速10～25转/分；每2天排空在旋转培养过程中产生的气泡；每2～3天换液一次，培养5～10天后，更换维持培养液，继续旋转培养5～15天，完成半月板损伤修复材料的制备。
所述旋转细胞维持培养液，其组成为：在商用低糖型DMEM培养液中含有胎牛血清100ml/L、非必需氨基酸10ml/L、L-谷氨酰胺10～300μg/mL、Vc为75～150μg/mL、TGF-β为1ng～20ng/mL、bFGF-2为1～50ng/mL，血小板源性PDGF-bb为5pg～5ng/mL。
前面步骤二所述制备多孔结构胶原涂层的方法是：对复合后材料采用物理交联或化学交联，或者二者结合的方式；
物理交联——采用紫外光照射交联(4～15小时)或者重度脱水交联（如乙醇、丙酮、异丙醇）；
化学交联——采用异氰酸盐类（HDI）、酰基叠氮类（DPPA）、醌类（NDGA）、碳化二亚胺（EDC）、环氧化合物（EC）及其低聚物、聚乙二醇等化学交联剂，也可以采用葡萄糖、核糖等生物交联剂；交联材料采用PBS缓冲液、生理盐水、纯水清洗后，冻干，环氧乙烷灭菌后备用。
该修复半月板撕裂的生物材料，由脱细胞基质膜、具有细胞因子及软骨细胞复合的多孔结构胶原基质膜以及表层软骨细胞膜片构成：内层为含有生物活性蛋白并能够保存细胞基质成分的脱细胞基质膜；中间层为脱细胞基质膜致密面复合胶原并交联，形成具有一定孔隙率及孔径的特异性多孔支架结构，复合具有诱导关节腔间充质细胞定向迁入并促进细胞基质分泌的细胞因子，并接种软骨细胞，形成细胞、因子、胶原复层结构；采用细胞旋转培养***，在材料双面结构外层诱导形成软骨细胞及其分泌基质构建的膜片，细胞密度更大，存活能力更强，组织结构更好的生物材料，从而诱导该复合材料在半月板撕裂损伤修复过程中，实现损伤组织（特别是无血供区的组织）再生及功能重建。本发明之组织工程材料，为组织工程技术在半月板损伤功能重建中的应用提供了新的方向。该发明的特点如下：
（1）采用脱细胞基质膜作为该产品的“支架”，提供了胶原材料及细胞接种的材料。脱细胞基质膜，其保留了细胞基质活性成分，含有特殊的蛋白分子如纤维粘连素、层粘连素、胶原、EGF、bFGF等，可促进损伤愈合及细胞增殖、表型维持的重要影响因素，其良好的韧性，能够方便临床操作。
（2）通过预冻温度设定、冷冻速度和冻干工艺等技术制备出具有多孔结构的胶原基质膜，提供了细胞迁入及细胞因子复合的空间，有利于诱导关节腔间充质干细胞的迁入，发挥在半月板损伤修复中细胞的生物活性作用。
（3）双层软骨细胞的接种培养，方便临床治疗半月板撕裂过程中与撕裂两端组织细胞间通讯连接的建立，促进材料中细胞与自体组织细胞迁入融合。同时，提高采用旋转培养***，促进了细胞因子在材料中的复合及细胞在支架材料中的增殖速率及其基质分泌能力，细胞膜片在材料表面的形成，可明显促进细胞间隙连接及组织形成，提高撕裂组织间建立联系的能力，缩短重建时间，适用于半月板撕裂损伤特别是白区及红白区损伤的治疗和修复。
附图说明
图1、采用外科手术制备的兔半月板白区撕裂动物模型；
图2、本发明实施例制备之修复半月板撕裂用生物材料示意图；
图3、本发明实施例制备之生物材料的有效性示意图。
图中,1为半月板红区；2为半月板撕裂区域；3为半月板白区；4为正常半月板组织；5为再生半月板组织；6为正常半月板组织；7为软骨细胞；8为正常半月板组织与新生半月板融合部位（胶原纤维连接）；9为新生半月板组织。
具体实施方式
实例1、一种修复兔半月板撕裂的生物材料及其制备方法
本实施例之半月板撕裂的生物材料，由内层的脱细胞基质膜、中间层的的多孔结构的胶原基质膜、外层的软骨细胞形成的细胞层及细胞膜片构成。中间层与内层之间，通过注模、流延或刮板复合，中间层与外层之间，通过软骨细胞接种胶原基质膜复合。
该修复兔半月板撕裂的生物材料的制备方法，依下述步骤进行：
步骤一、脱细胞基质膜的制备:脱细胞人羊膜基质的制备方法可参考文献：宋永周，崔慧先，王振显，等.羊膜脱细胞基质的制备及其生物相容性[J].中国组织工程研究与临床康复,2008，12(01):51～55。
羊膜脱细胞基质的制备：无菌操作下取胎膜，钝性分离去除绒毛膜组织，保留羊膜层。生理盐水反复冲洗干净后置于1%TritonX-100溶液中，置于恒温水浴振荡器中振荡24小时，PBS漂洗后于0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA中37℃振荡4小时，PBS充分漂洗，纯水漂洗，冷冻干燥，环氧乙烷消毒备用。取部分制备好的羊膜进行小时E染色检测。
步骤二：具有多孔结构的胶原基质膜制备：配置浓度为8mg/mL、pH值为3的胶原溶液所述的胶原溶液，用牛跟腱制备而成；将复水的脱细胞基质材料（致密面向上）平整地平铺固定于大小合适的医用不锈钢模具上，盖上上盖，脱细胞基质材料与上盖间有一定的空隙，形成可注入胶原溶液的毫米级薄层空腔，用注射器向空腔中注入上述胶原溶液，待胶原溶液充满空腔后，将模具迅速放入可抽真空的容器中，抽真空脱气。脱气完全后，取出模具至于-80℃环境下，预冷3小时，卸去模具上盖。然后用真空冷冻干燥机于-22℃条件下冻干24小时，再升温至-2℃冻干16小时，最后升温至20℃冻干10小时至材料完全干燥，控制使其孔径300～600μm之间。该材料致密面多孔结构成型，结合脱细胞基质材料自身所具有的疏松面结构，双面多孔结构得以实现。
为了增加材料的强度及降解时间，该步骤对复合后材料采用化学交联的方法：以EDC为交联剂，40%的酒精/NHS溶液为媒介，4℃条件下交联处理24小时。然后用PBS缓冲液、生理盐水、纯水逐次清洗后，材料再次预冻，冻干，环氧乙烷灭菌后备用。
步骤三、软骨细胞形成的细胞层及细胞膜片制备：分离培养兔软骨细胞，获取5代以内软骨细胞作为种子细胞，制备细胞悬液，备用。
细胞层软骨细胞接种制备：按2×105/cm2密度接种于复合胶原涂层多孔结构的胶原基质膜表面，静置4小时，加入软骨细胞培养液3mL，液面下培养2天，待细胞在多孔胶原膜内胶原纤维束贴附后，去除培养基
细胞膜片制备：待完成细胞层接种后，翻转胶原基质膜，置于细胞培养用孔板。采用同样方法将软骨细胞接种脱细胞基质材料疏松面表层，液面下培养3天。后期旋转培养参照步骤四完成制备。
所述软骨细胞培养液,其组成为：在商用低糖型DMEM培养液中含有胎牛血清100ml/L、非必需氨基酸10ml/L、丙酮酸钠1mmol/L、L-谷氨酰胺10μg/mL、维Vc为50μg/mL、TGF-β1为5pg/mL、bFGF-2为5ng/mL、PDGF-bb为1ng/mL、IGF-1为1ng/mL。
步骤四、旋转培养：将接种软骨细胞的胶原材料加入旋转细胞培养***中，培养液为软骨细胞培养液；开始旋转培养，转速15转/分；每2天排空在旋转培养过程中产生的气泡；每2天换液一次，培养7天后，更换维持培养液，继续旋转培养10天，完成半月板损伤修复材料的制备。
所述维持培养液，其组成为：在商用低糖型DMEM培养液中含有胎牛血清100ml/L、非必需氨基酸10ml/L、L-谷氨酰胺100μg/mL、Vc为75μg/mL、TGF-β1为5ng/mL、bFGF-2为10ng/mL，PDGF-bb为5pg/mL。
该材料完成制备后植入兔关节半月板撕裂模型，缝合创口。12周取材标本结果显示：损伤缺损部位有较多类半月板组织形成，撕裂区域组织出现融合封闭，色泽与周围正常的半月板组织相似。动物生理活动正常。
实例2、一种修复兔半月板撕裂的生物材料及其制备方法
本实施例之生物材料，依次由内层的脱细胞基质膜、中间层的多孔结构的胶原基质膜、外层的软骨细胞形成的细胞层及细胞膜片构成。中间层与内层之间，通过注模、流延或刮板复合，中间层与外层之间，通过软骨细胞接种胶原基质膜复合。
该修复半月板撕裂的生物材料的制备方法，依下述步骤完成：
步骤一、脱细胞基质膜的制备:该脱细胞基质膜选用脱细胞猪小肠黏膜下层，其制备方法参考上述实施例1。
步骤二：具有多孔结构的胶原基质膜制备：配置浓度为3mg/mL、pH值为6的胶原溶液所述的胶原溶液，用牛皮制备而成；在脱细胞基质材料致密面通过注模、流延或刮板制备多孔胶原涂层；通过预冻温度设定、冷冻速度和冻干工艺来调节胶原层孔径大小，使其孔径大小控制在200～400μm之间，制备并获得具有附合多孔结构的胶原基质膜；
该步骤对复合后材料采用物理+化学交联的方法，即紫外交联4小时后采用异氰酸盐类化学交联剂；交联材料采用PBS缓冲液、生理盐水、纯水清洗后，冻干，环氧乙烷灭菌后备用。
步骤三、软骨细胞形成的细胞层及细胞膜片制备：分离培养兔软骨细胞，获取5代以内软骨细胞作为种子细胞，制备细胞悬液，备用。
细胞层制备：按1×104/cm2密度接种于复合胶原涂层多孔结构的胶原基质膜表面，静置4小时，加入软骨细胞培养液2mL，液面下培养4天，待细胞在多孔胶原基质膜内胶原纤维束贴附后，去除培养基后期旋转培养参照步骤四完成制备。
细胞膜片制备：待完成细胞层接种后，翻转胶原基质膜，置于细胞培养用孔板。采用同样方法将软骨细胞接种脱细胞基质材料疏松面表层，液面下培养7天。后期旋转培养参照步骤四完成制备。
所述软骨细胞培养液,其组成为：在商用低糖型DMEM培养液中含有胎牛血清100ml/L、非必需氨基酸10ml/L、丙酮酸钠1mmol/L、L-谷氨酰胺100μg/mL、Vc为50μg/mL、TGF-β1为1ng/mL、bFGF-2为50ng/mL、PDGF-bb为1ng/mL、IGF-1为1ng/mL。
步骤四、旋转培养：将接种软骨细胞的胶原材料加入旋转细胞培养***中，培养液为软骨细胞培养液；开始旋转培养，转速20转/分；每2天排空在旋转培养过程中产生的气泡；每2天换液一次，培养7天后，更换维持培养液，继续旋转培养15天，完成半月板损伤修复材料的制备。
所述维持培养液，其组成为：在商用低糖型DMEM培养液中含有胎牛血清100ml/L、非必需氨基酸10ml/L、L-谷氨酰胺100μg/mL、Vc为50μg/mL、TGF-β1为10ng/mL、bFGF-2为25ng/mL，PDGF-bb为1ng/mL。
完成材料制备后，采用手术法植入制备的兔半月板红白区（低血供区）撕裂部位。缝合创口后12周取材观察修复效果。手术后动物无死亡发生，3-4周兔步态恢复正常。12周时动物生理活动正常，行动自如。取材标本显示，在半月板撕裂部位有新生组织形成，其质地、色泽与周围正常半月板组织相似，可见缺损处愈合良好；损伤部位相对应的股骨及胫骨关节面光滑，该材料实现了半月板撕裂的组织再生及功能重建。
实例3、一种修复兔半月板撕裂的生物材料及其制备方法
本实施例之生物材料，依次由内层的脱细胞基质膜、中间层的多孔结构的胶原基质膜、外层的软骨细胞形成的细胞层及细胞膜片构成。中间层与内层之间，通过注模、流延或刮板复合，中间层与外层之间，通过软骨细胞接种胶原基质膜复合。
该修复半月板撕裂的生物材料的制备方法，依下述步骤完成：
步骤一、脱细胞基质膜的制备:该脱细胞基质膜选用人源性的脱细胞羊膜；制备方法同实施例1；
步骤二：具有多孔结构的胶原基质膜制备：配置浓度为15mg/mL、pH值为3的胶原溶液，此胶原溶液，用鼠尾制备而成；在脱细胞基质材料致密面通过注模、流延或刮板制备多孔胶原涂层；通过预冻温度设定、冷冻速度和冻干工艺来调节胶原层孔径大小，其孔径大小可控制在50～300μm之间，制备并获得具有附合多孔结构的胶原基质膜；
该步骤对复合后材料采用物理交联——采用紫外光照射交联8小时，采用PBS缓冲液、生理盐水、纯水清洗后，冻干，环氧乙烷灭菌后备用。
步骤三、软骨细胞形成的细胞层及细胞膜片制备：分离培养兔软骨细胞，获取5代以内软骨细胞作为种子细胞，制备细胞悬液，备用。
细胞层软骨细胞接种制备：按1×106/cm2密度接种于复合胶原涂层多孔结构的胶原基质膜表面，静置0.5小时，加入软骨细胞培养液3mL，液面下培养2天，待细胞在多孔胶原基质膜内胶原纤维束贴附后，去除培养基后期旋转培养参照步骤四完成制备。
细胞膜片制备：待完成细胞层接种后，翻转胶原基质膜，置于细胞培养用孔板。采用同样方法将软骨细胞接种脱细胞基质材料疏松面表层，液面下培养2天。后期旋转培养参照步骤四完成制备。
所述软骨细胞培养液,其组成为：在商用低糖型DMEM培养液中含有胎牛血清100ml/L、非必需氨基酸10ml/L、丙酮酸钠1mmol/L、L-谷氨酰胺100μg/mL、Vc为75μg/mL、TGF-β1为1ng/mL、bF0000000000000GF-2为50ng/mL，PDGF-bb为10ng/mL、IGF-1为50ng/mL。
步骤四、旋转培养：将接种软骨细胞的胶原材料加入旋转细胞培养***中，培养液为软骨细胞培养液；开始旋转培养，转速25转/分；每2天排空在旋转培养过程中产生的气泡；每3天换液一次，培养5天后，更换维持培养液，继续旋转培养5天，完成半月板损伤修复材料的制备。
所述维持培养液，其组成为：在商用低糖型DMEM培养液中含有胎牛血清100ml/L、非必需氨基酸10ml/L、L-谷氨酰胺100μg/mL、Vc为75μg/mL、TGF-β1为10ng/mL、bFGF-2为1ng/mL，PDGF-bb为5ng/mL。
本实施例选用的软骨细胞，为可向软骨细胞分化的骨髓间充质干细胞，其诱导培养方法可参考：Hyun Jung Yoo et al.Gene Expression Profile duringChondrogenesis in Human Bone Marrow der ived Mesenchymal Stem Cells us inga cDNA Microarray.J Korean Med Sci.2011;26(7):851-858.。
完成材料制备后，采用手术法植入制备的兔半月板白区（无血供区）撕裂部位。在观察期内，新西兰大白兔未出现术后感染，术侧膝关节无红肿。术后2周步态基本恢复正常。实验组6周可见缺损处愈合良好，为白色新生组织所替代，质地较坚硬，相应股骨和胫骨关节面光滑；12周可见缺损处已被半月板样组织所替代，质地、弹性和光泽度与周围正常半月板几乎无明显差别，对应股骨和胫骨关节面光滑，无明显的摩擦征象。
图1为验证本发明制备的用于修复半月板撕裂的生物材料的有效性，采用外科手术制备的兔半月板白区撕裂动物模型。图中1为半月板红区；2为半月板撕裂区域；3为半月板白区。在进行动物有效性验证实验中，将用本发明制备的修复半月板撕裂用生物材料，植入半月板撕裂区。
图2为采用本发明方法制备的修复半月板撕裂用生物材料，植入兔半月板撕裂区域后12周取材结果。图中4为正常半月板组织；5为再生半月板组织。大体照结果显示在兔半月板撕裂损伤部位有新生组织形成，撕裂缝隙基本消失，两侧半月板组织融合，表面平整度良好。该结果显示采用本发明制备的用于修复半月板撕裂的生物材料具有良好的组织损伤再生及功能恢复能力，可实现半月板撕裂的再生修复；
图3为采用本发明方法制备的生物材料有效性验证12周取材组织学检测图片，图中6为正常半月板组织；7为软骨细胞；8为正常半月板组织与新生半月板融合部位（胶原纤维连接）；9为新生半月板组织。可以看出，实验组撕裂部位有较多类似半月板组织形成，胶原纤维排列不规则，可见大量软骨细胞，愈合组织与正常组织之间以胶原纤维相连，新生组织与正常组织融合，色泽与周围正常半月板组织相似但有分界。该组织学检测结果表明采用本发明制备的用于修复半月板撕裂的生物材料能够在体内环境下，对半月板撕裂损伤进行有效的修复及组织再生。
下面是采用本发明之修复半月板撕裂的生物材料进行动物有效性试验的简况：
选取约2.5-3kg重新西兰白兔，麻醉后双侧膝关节部位剪毛，活动兔膝关节扪及兔膝关节后方股骨与与胫骨成角的顶点，据此扪及关节间歇，在膝关节后外侧缘沿关节间歇向前约3mm标记进针位置。常规消毒铺巾，用小针刀垂直刺入关节间隙皮肤上的标记点，刺入深度约4mm，刺入过程中初入时有比较韧的阻力感，随后阻力感降低消失。针刀刃在与半月板长轴垂直的方向上下划动切割外侧半月板体部，刀刃上下划动抵至胫骨与股骨骨质完全横断白区半月板。植入所制备的兔半月板撕裂修复生物材料，缝合，另一只兔膝半月板造白区撕裂，缝合后为空白对照；手术后动物不作固定，笼中饲养自由活动。12周后取材进行大体观察：移植半月板撕裂部位有新生组织生成，裂口被线状白色纤维瘢痕完全连接愈合，局部微凹陷，有光泽其颜色、质地、平整度均与自体半月板组织趋于一致，与周围正常半月板几乎无明显差别，对应股骨和胫骨关节面光滑，无明显的摩擦征象。
Claims (10)
1.一种修复半月板撕裂的生物材料，其特征在于：由多层结构组成，即，依次由内层的脱细胞基质膜、中间层的多孔结构的胶原基质膜、外层的软骨细胞形成的细胞层及细胞膜片构成；中间层与内层通过注模、流延或刮板工艺方法复合，外层通过软骨细胞接种胶原基质膜制备复合结构，完成生物材料制备。
2.根据权利要求1所述修复半月板撕裂的生物材料的制备方法，其特征在于，依下述步骤完成：
步骤一、脱细胞基质膜的制备:该脱细胞基质膜选用动物源性脱细胞基质膜或人源性的脱细胞羊膜，以传统工艺制备而成；
步骤二、具有多孔结构的胶原基质膜的制备：配置浓度为3～15mg/mL、pH值为3～6的胶原溶液，在脱细胞基质材料致密面通过注模、流延或刮板制备多孔胶原涂层；通过预冻温度设定、冷冻速度和冻干工艺来调节胶原层孔径大小，控制其孔径大小在50～600μm之间；
步骤三、软骨细胞形成的细胞层及细胞膜片的制备：
细胞层软骨细胞接种：用软骨细胞培养液浸润步骤二制备的胶原基质膜后，按1×104～2×106/cm2密度接种软骨细胞于胶原涂层多孔表面，静置0.5～4小时，加入软骨细胞培养液2～4mL，液面下培养2～4天，待细胞在多孔胶原基质膜内胶原纤维束贴附后，去除培养基；随后，将接种软骨细胞的胶原基质膜加入旋转细胞维持培养液中，该旋转细胞维持培养液为软骨细胞培养液，进行旋转培养，完成半月板损伤修复材料的制备：
细胞膜片制备：待完成细胞层接种后，翻转胶原基质膜，置于细胞培养用孔板。采用同样方法将软骨细胞接种脱细胞基质材料疏松面表层，液面下培养 2～7天；后期旋转培养参照步骤四完成制备。
3.根据权利要求2所述修复半月板撕裂的生物材料的制备方法，其特征在于：步骤1所述的动物源性脱细胞基质膜或人源性的脱细胞羊膜，是脱细胞小肠粘膜下层、脱细胞心包膜、脱细胞腹膜。
4.根据权利要求2所述修复半月板撕裂的生物材料的制备方法，其特征在于：步骤二所述调节胶原层孔径，控制孔径大小更优在200～400μm之间。
5.根据权利要求2所述修复半月板撕裂的生物材料的制备方法，其特征在于：步骤二所述的胶原溶液，是用牛跟腱、皮肤、鼠尾的动物源性材料制备而成。
6.根据权利要求2所述修复半月板撕裂的生物材料的制备方法，其特征在于：步骤二所述制备多孔胶原涂层的方法是：对复合后材料采用物理交联或化学交联，或者二者结合的方式；
所述物理交联——采用紫外光照射交联(4～15小时)或者重度脱水交联（如乙醇、丙酮、异丙醇）；
所述化学交联——采用异氰酸盐类（HDI）、酰基叠氮类（DPPA）、醌类（NDGA）、碳化二亚胺（EDC）、环氧化合物（EC）及其低聚物、聚乙二醇等化学交联剂，也可以采用葡萄糖、核糖等生物交联剂；交联材料采用PBS缓冲液、生理盐水、纯水清洗后，冻干，环氧乙烷灭菌后备用。
7.根据权利要求2所述修复半月板撕裂的生物材料的制备方法，其特征在于：步骤三所述软骨细胞培养液,其组成为：在商用低糖型DMEM培养液中含有胎牛血清100ml/L、非必需氨基酸10ml/L、丙酮酸钠1mmol/L、L-谷氨酰胺10-500μg/mL、维生素c（Vc）为50～100μg/mL、转化生长因子（TGF-β1）为5pg/mL～20ng/mL、碱性成纤维生长因子-2（bFGF-2）为5～50ng/mL，血小 板源性生长因子（PDGF-bb）为1～10ng/mL、***（IGF-1）1～50ng/mL。
8.根据权利要求2所述修复半月板撕裂的生物材料的制备方法，其特征在于：步骤三所述的软骨细胞，是软骨细胞或可向软骨细胞分化的间充质干细胞。
9.根据权利要求2所述修复半月板撕裂的生物材料的制备方法，其特征在于：步骤三所述进行旋转培养，其旋转的转速为10-25转/分；每2天排空在旋转培养过程中产生的气泡；每2-3天换液一次，培养5～10天后，更换维持培养液，继续旋转培养5～15天；
步骤三所述旋转细胞维持培养液为软骨细胞培养液，其组成为：在商用低糖型DMEM培养液中含有胎牛血清100ml/L、非必需氨基酸10ml/L、L-谷氨酰胺10～300μg/mL、Vc为75～150μg/mL、TGF-β为1ng～20ng/mL、bFGF-2为1～50ng/mL，血小板源性PDGF-bb为5pg～5ng/mL。
10.根据权利要求8所述修复半月板撕裂的生物材料的制备方法，其特征在于：步骤三所述的间充质干细胞为骨髓间充质干细胞、脂肪源性间充质干细胞、牙龈间充质干细胞、牙髓干细胞、脐带、脐带血间充质干细胞或者胚胎干细胞的任何一种。
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