CN103394126B - 一种软骨修复材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种软骨修复材料及其制备方法。该材料主要由保护层、支架层及富集层组成，保护层粘合在支架层的表面上，支架层另一表面为富集层。保护层由丝素蛋白构成；支架层为动物源性心包膜或腹膜制备的具备天然的粗糙面和光滑面的膜状结构；富集层为Ⅱ型胶原制备的凝胶，且层上有若干贯穿整个富集层的多孔通道。与现有技术相比，本发明所制备的软骨修复材料配合软骨下骨骨髓刺激用于软骨损伤修复，能够应用于较大面积的软骨损伤，单次手术即可完成软骨损伤修复，解决了自体软骨细胞移植技术的二次手术和避免供区并发症问题；该材料配合骨髓刺激技术应用能显著提高疗效，使软骨损伤能够以类透明样软骨组织修复。
Description
技术领域
本发明属于组织工程学生物材料技术，具体涉及一种与软骨下骨骨髓刺激联合应用的软骨修复材料及其制备方法。
背景技术
关节表面覆盖着一层透明软骨，其中95％以上是软骨基质成分，具有分散和缓冲垂直压力和剪切力的作用，仅有5％的软骨细胞分散在基质中，维持着基质成分平衡。由于关节表面透明软骨组织具有无神经、无血管的解剖结构特征以及缓冲承受人体压力的功能特征，所以其自我修复和再生能力很差。而关节软骨缺损是一类常见疾病，创伤、炎症、肿瘤、退变等原因导致的软骨损伤、缺失极为常见，常表现为顽固性疼痛、关节活动障碍，严重者可丧失关节功能，已成为导致肢体残废和劳动能力丧失的主要原因之一。
目前临床应用的治疗方法主要包括软骨下骨骨髓刺激(一般多采用微骨折术)、自体软骨块移植、自体软骨细胞移植及自体基质诱导的软骨再生技术等。微骨折术是利用关节透镜将软骨受损部位清创，在暴露的软骨下骨上打孔，使骨髓间充质干细胞能够到达损伤部位并起修复损伤部位的作用。其效果迅速而显著，但有效持续时间短暂。自体软骨块移植需要取自身非负重部位健康软骨块，适用于软骨缺损面积较小(＜2cm2)的损伤治疗，但存在供区关节疼痛、退化、关节不稳等供区继发症。自1994年Brittberg等首次报道自体软骨细胞移植应用于临床以来，经过十多年的发展，自体软骨细胞移植技术已经经历了多次技术改进。自体软骨细胞第一代移植技术在将软骨细胞悬液移植到损伤部位后需要采用患者自体骨膜封闭缺损位置，技术相对复杂，手术时间较长，且存在骨膜增生、骨膜脱落、细胞流失等风险；第二代技术采用胶原/透明质酸膜代替自体骨膜封闭缺损表面，但仍无法避免细胞流失的风险；第三代技术是在胶原膜上直接种植软骨细胞，通过纤维蛋白胶固定在软骨缺损部位，但仍无法解决自体软骨细胞移植技术存在的以下问题：1)、需二次手术，增加了患者承受的痛苦及负担；2)、自体健康组织取材会造成供区疼痛、供区软骨退化等并发症；3)、由于软骨细胞寿命短、采集的健康软骨组织有限，许多患者由于在体外培养过程没有达到移植所需的细胞数量而无法完成治疗。
目前第三代软骨移植治疗技术费用高昂，不利于临床推广。自体基质诱导的软骨再生技术于2003年由Behrens首先应用，其是在微骨折术的基础上覆盖一层胶原膜，用以提供细胞贴附支架及保护屏障。
专利98811734.7公开了一种用于体内骨或软骨组织的重建的薄膜，该薄膜包括一层主要为Ⅱ型胶原并具有开放的海绵状构造的基质层及至少一层具有封闭、相对不透性构造的阻挡层，基质层厚度2～10mm，阻挡层0.2～2mm。该胶原膜植入软骨损伤部位后依靠自身软骨细胞向基质层生长来逐步完成修复，但由于软骨内缺乏血管组织，而且软骨细胞被包裹在基质成分中，因此软骨细胞迁移困难，导致薄膜用于软骨损伤修复时的康复期延长，甚至不能完成修复。另外，由于该膜临床应用时厚度不可调节，应用于软骨缺损较深或包含软骨下骨缺损的患者会导致缺损填充不充分，生长速度较快的纤维***先长入凹陷的缺损部位，造成损伤部位新生软骨组织厚度不足而影响长期效果；而应用于软骨损伤较浅的患者会导致填充过度，造成损伤部位新生组织肥大。
专利200680031664.8公开了一种用于半月板撕裂的胶原膜材料片，其一侧具有平滑屏障面，该屏障面抑制细胞粘附在其上和抑制细胞从其中通过，而与平滑屏障面相对的纤维面允许细胞在其上生长。该胶原膜材料片主要成分为I型胶原，用于半月板撕裂，而关节软骨细胞外基质主要为Ⅱ型胶原，因此该胶原膜材料片植入会造成局部微环境的不同，不利于软骨细胞生长，影响修复效果，不适用于软骨损伤修复。
综上，软骨下骨骨髓刺激是临床治疗中应用最为广泛的方法。但该方法疗效持续时间短，影响了其在临床上的继续应用。自体基质诱导的软骨再生技术极大的改善了软骨下骨骨髓刺激的疗效。该方法与软骨下骨骨髓刺激一样，手术操作简便，无需体外细胞培养，有利于其在临床的广泛应用。但由于现有膜产品存在的问题，导致该方法的疗效不尽人意，有待于进一步改善。
发明内容
针对现有治疗技术存在的问题，本发明的目的是提供一种软骨修复材料及其制备方法，其配合软骨下骨骨髓刺激技术应用能显著提高疗效，使软骨损伤能够以类似透明样软骨组织修复。
本发明所制备的软骨修复材料，包括保护层、支架层及富集层；保护层通过纤维蛋白胶或胶原凝胶或透明质酸凝胶粘合在支架层的光滑面上，富集层通过胶原溶液的凝固与支架层的粗糙面复合在一起。
所述保护层，由丝素蛋白构成，厚度50～150μm；
所述支架层，为动物源性的脱细胞心包膜或腹膜，具备天然的粗糙面和光滑面，厚度0.1～0.5mm；
所述富集层，为Ⅱ型胶原制备的凝胶，厚度1～4mm；有贯穿整个富集层的多孔通道，多孔通道孔径50～100μm，孔间距100～150μm。
本发明之软骨修复材料的制备方法，其特征在于，动物源性心包膜或腹膜经过脱细胞后，用于制备软骨修复材料的支架层；丝素蛋白溶液与环氧化合物及NaCI在特定温度下形成丝素蛋白薄膜，采用如纤维蛋白胶、胶原凝胶、透明质酸凝胶将丝素蛋白薄膜粘合在软骨修复材料支架层的光滑面上制备软骨修复材料保护层；Ⅱ型胶原溶解后添加转化生长因子β1(TGF-β1)、***、***I(IFG-I)及神经生长因子，采用如注浆、流延、刮板、注射、注模成型技术，在软骨修复材料支架层粗糙面上制备凝胶层，凝固后采用打孔技术在凝胶层制备多孔通道，从而获得软骨修复材料富集层。具体步骤包括：
步骤一、软骨修复材料支架层制备：将动物源性心包膜或腹膜按文献介绍的方法脱细胞，冻干，获得具有天然光滑面和粗糙面的脱细胞生物膜，厚度0.1～0.5mm；环氧乙烷(EO)或辐照灭菌后获得软骨修复材料支架层。
采用此步骤之方法分别对小肠粘膜下层、心包膜、腹膜及羊膜进行处理，并分别进行兔软骨损伤修复效果对比试验，结果发现：小肠粘膜下层及羊膜材料单层厚度过薄，复水后应用于软骨损伤部位时容易卷曲，不能平整地填充损伤部位，且材料过薄，无法提供有效的支架及机械保护作用，无法完成损伤修复。而用多层小肠粘膜下层或羊膜材料修复软骨损伤，由于材料的致密性大大增加，不利于细胞向损伤部位的迁入，不利于损伤修复。多层材料复水后，层与层之间易出现局部分离的现象，导致修复的软骨组织出现裂隙，大大影响修复效果。通过本步骤的初步验证，心包膜、腹膜脱细胞后能够用于软骨损伤修复。采用脱细胞心包膜或腹膜制备的软骨修复材料具有天然的双层结构，一侧纤维排列较为致密，形成光滑面，能够为损伤部位提供屏障保护，一侧纤维排列相对疏松，形成粗糙面，能够为细胞生长提供支架。但应用制备的软骨修复材料支架层修复软骨损伤效果并不令人满意。后续步骤针对有效性初步验证过程中出现的问题对软骨修复材料支架层的两面分别进行合理改造，以制备更适合本应用的软骨修复材料。
步骤二、软骨修复材料保护层的制备：按照文献方法制备重量体积比为6％～10％的丝素蛋白溶液中，加入1％～5％的环氧化合物和1％～3％的氯化钠(NaCI)，混合均匀后得到丝素蛋白溶胶；采用如流延、刮板或注模成型技术，制备厚度50～150μm的膜，于60～80℃反应得到丝素蛋白薄膜；将丝素蛋白薄膜在蒸馏水中浸洗至完全除去未反应的环氧化合物，获得软骨修复材料的保护层；
采用纤维蛋白胶、胶原溶胶、透明质酸溶胶将保护层粘合到支架层的光滑面，获得软骨修复材料的保护层和支架层的复合物。
本步骤是针对生物膜材料机械性能差的改进。丝素蛋白有良好的生物相容性，无毒，无刺激性，其降解产物本身对组织无毒副作用。丝素蛋白与环氧化合物在60～80℃反应而成的柔韧性丝素凝胶压缩强度超过100g/mm2，证明其压缩强度良好，能够承受关节活动造成的压力，可为关节软骨移植物提供机械保护，避免其受到机械损伤。所制备的保护层具有良好的柔韧性，能够为关节软骨移植物内的间充质干细胞传递压力刺激，有利于其向软骨方向分化并分泌大量的细胞外基质，提高修复效果。
步骤三、软骨修复材料富集层的制备：将Ⅱ型胶原配制成4～8mg/mL的溶液，添加5～20ng/mL的TGFβ1、10-8～10-6mol/L的***、5～50ng/mL的***I及7～12ng/mL的神经生长因子，混合均匀，在上述制备的复合物的支架层粗糙面上制备厚度为1～4mm的胶原层，37℃放置使胶原溶液凝固；采用如机械打孔、激光打孔(Laser)、电火花高速打孔(EDM)或电化学打孔(ECM)技术在胶原层打孔，孔径50～100μm，孔间距100～150μm，多孔通道贯穿胶原层，完成富集层的制备。富集层胶原的凝固使富集层与上述制备的复合物粘合在一起。
本步骤是针对损伤部位间充质干细胞量不足的改进，软骨下骨骨髓刺激结合现有生物膜材料治疗软骨损伤时，常因为移行到损伤部位的间充质干细胞数量有限而最终以耐磨性较差的纤维软骨修复。本步骤通过富集层的制备，在进行骨髓刺激术后将材料覆盖在损伤部位，释放出来的骨髓血可将富集层的微孔填充充分，大大提高了材料对骨髓血的容纳量，从而能够获得更多的间充质干细胞，同时添加的细胞因子也有利于后期间充质干细胞自主向损伤部位移行，有利于改善修复效果。所用Ⅱ型胶原与正常软骨细胞外基质的主要成分一致，从而提供损伤部位具有与周围正常软骨一致的微环境，有利于间充质干细胞向软骨方向分化。
与现有产品相比，本发明制备的软骨修复材料的优点体现在：
(1)通过对脱细胞羊膜、小肠粘膜下层、心包膜及腹膜进行动物有效性验证，结果表明，脱细胞心包膜、腹膜能够为损伤部位并提供机械保护，并能作为损伤部位的间充质干细胞生长的支架，有利于促进间充质干细胞对损伤部位的修复，提高修复效果。其厚度适中，能够较好的填充软骨缺损部位，使损伤部位新生软骨厚度与周围正常软骨厚度基本一致，从而使缺损部位获得较为平整的修复效果，更适合用于制备软骨修复材料支架层；
(2)采用生物相容性良好的丝素蛋白制备保护层，能够有效的为关节软骨移植物提供机械保护，避免其在关节活动时受到机械损伤；并且所制备的保护层具有良好的柔韧性，能够为关节软骨移植物内的间充质干细胞传递力学刺激，有利于其向软骨细胞分化及细胞外基质的分泌；
(3)具有较厚的富集层，大大提高了对骨髓血的容纳量，有利于获得更多的间充质干细胞。富集层所用的Ⅱ型胶原与正常软骨细胞外基质的主要成分一致，从而提供损伤部位具有与周围正常软骨接近的微环境，有利于间充质干细胞向软骨方向分化，从而获得较好的修复效果。
与现有技术相比，本发明所制备的软骨修复材料配合软骨下骨骨髓刺激用于软骨损伤修复，能够应用于较大面积(例如2～8cm2)的软骨损伤，单次手术即可完成软骨损伤修复，解决了自体软骨细胞移植技术的二次手术问题，也避免了供区并发症问题；无需体外细胞培养步骤，避免由于细胞体外培养过程失败导致无法完成后续治疗，同时能够避免将细胞培养过程中血清、细胞因子、培养基等外源因素引入体内引发过敏等副反应。配合骨髓刺激技术应用能显著提高疗效，使软骨损伤能够以类透明样软骨组织修复。
附图说明
图1是软骨修复材料支架层选用不同原材料效果试验的比较图片。
图2是兔软骨损伤3d取材试验结果的图片。
图3是本实施例制备的软骨修复材料结合骨髓刺激术修复兔软骨损伤组织学试验的切片图片。
图4是猪软骨损伤试验的12m取材结果图片。
具体实施方式
实例中使用的LYJ-350型小型试验流延机(单层用)购自北京东方泰阳科技有限公司；XH-B200型激光打孔机购自深圳市永盛发自动化设备行；NK-CK153型数控冲孔机购自上海杰韦弗机电设备有限公司。
本实施例所制备的软骨修复材料，有保护层、支架层及富集层；保护层粘合在支架层的光滑面上，富集层通过胶原溶液的凝固与支架层的粗糙面复合在一起。
所述保护层，由丝素蛋白构成，厚度50～150μm；
支架层，为动物源性的脱细胞心包膜或腹膜，具备天然的粗糙面和光滑面，厚度0.1～0.5mm；
富集层，为Ⅱ型胶原制备的凝胶，厚度1～4mm；有贯穿整个富集层的多孔通道，多孔通道孔径50～100μm，孔间距100～150μm。
实施例1、软骨修复材料支架层原材料的选择
脱细胞猪小肠粘膜下层的制备参照Badylak SF,Lantz GC,Coffey A,Geddes LA.Small intestinal submucosa as a large diameter vascular graft in thedog.J Surg Res，1989；47:74–80进行，获得的小肠粘膜下层单层及4层叠加铺板，冻干，EO灭菌后备用；
人羊膜脱细胞的制备方法可参考文献：宋永周，崔慧先，王振显等.羊膜脱细胞基质的制备及其生物相容性[J].中国组织工程研究与临床康复,2008，12(01):51～55。脱细胞后羊膜单层及8层重叠铺板，冻干，EO灭菌后备用；
脱细胞牛心包及猪腹膜参照文献：顾汉卿，邓飞，郑建明等.天然细胞外基质的制备研究[J].中国科技论文在线。制备的脱细胞牛心包膜及猪腹膜分别单层铺板，冻干，Co6025kGry灭菌后备用。
选取约2kg重新西兰兔，分为4组，每组10只，分别进行脱细胞羊膜、小肠粘膜下层、腹膜及心包膜兔软骨损伤修复效果对比试验。动物取仰卧位，麻醉后备皮，碘伏消毒手术部位。取膝关节内侧2cm纵行切口，暴露股骨内髁及滑车面，在滑车面造直径3mm左右，深约1mm的软骨缺损。用克氏针在缺损部位暴露的软骨下骨环形打孔，孔间距0.9mm左右，孔深以渗出骨髓血为宜。充分止血后，将上述制备的脱细胞羊膜、小肠粘膜下层、腹膜及心包膜修剪成直径3mm的圆形，粗糙面朝下分别覆盖在缺损部位，纤维蛋白胶固定。闭合关节腔，活动关节，确认材料未移位、脱落后逐层缝合各层组织。8w取材，比较脱细胞羊膜、小肠粘膜下层、腹膜及心包膜配合微骨折术用于软骨损伤修复的效果。
图1显示本实施例之8w取材试验的切片结果：常规脱细胞方法制备的脱细胞羊膜(1A)或小肠粘膜下层(1B)用于软骨损伤修复时，单层应用时由于厚度太薄不能完成软骨损伤修复，对软骨缺损部位填充效果差，复水后不易铺平，力学性能不佳，未完成软骨损伤修复；而8层叠加应用时，由于材料的致密程度大大增加，影响了细胞迁入，对修复效果造成不良影响(1C)。同时多层材料叠加应用时材料层与层之间结合不紧密，新生的软骨组织内部产生了裂隙，严重影响修复效果(1D)。而脱细胞猪腹膜(1E)、牛心包膜(1F)脱细胞后用于软骨损伤修复，能够获得相对较好的效果，修复表面基本光滑平整。
实施例2、软骨修复材料修复兔软骨损伤
步骤一、软骨修复材料支架层制备：将猪腹膜按照文献方法脱细胞，刘鹤莉.天然细胞外基质的制备与改性的研究[D].天津：天津医科大学，2007.获得具有天然光滑面和粗糙面的脱细胞猪腹膜，厚度为0.1mm。将脱细胞猪腹膜冻干，辐照灭菌后获得软骨修复材料支架层。
步骤二、软骨修复材料保护层的制备：参照文献方法(闵思佳，姚菊明，朱良均，阿部康次，寺本彰.具有交联结构的丝素蛋白质凝胶的理化特性.蚕业科学，1999，25(2):108-112)制备重量体积比为6％的丝素蛋白溶液；加入1％的山梨醇聚缩水甘油醚和1％的NaCI，混合均匀后，根据流延成型技术采用LYJ-350型小型试验流延机(单层用)制备厚度50μm的薄膜，在流延机温度设定为60℃的条件下反应后得到丝素蛋白薄膜；将丝素蛋白薄膜在蒸馏水中浸洗2天，除去未反应的山梨醇聚缩水甘油醚。获得软骨修复材料的保护层。用纤维蛋白胶将保护层粘合到支架层的光滑面，获得软骨修复材料的保护层和支架层的复合物。
步骤三、软骨修复材料富集层的制备：将Ⅱ型胶原配制成4mg/mL的溶液，添加5ng/mL的TGFβ1、10-8mol/L的***、5ng/mL的***I及7ng/mL的神经生长因子，混合均匀。将上述制备的复合物支架层向上放在6孔板内，加入0.95mL胶原溶液，使支架层粗糙面与胶原溶液接触。轻晃平皿使胶原溶液平铺在支架层粗糙面上，37℃放置使胶原溶液凝固，则凝固后的胶原厚度为1mm。采用XH-B200型激光打孔机在胶原层打孔，孔径50μm，孔间距100μm，孔深1mm，完成富集层的制备。富集层的胶原凝固使富集层与上述制备的复合物粘合在一起。
兔关节软骨损伤部位清创，克氏针环形打孔，孔间距约0.9mm，孔深度以溢出骨髓血为宜。将制备好的软骨修复材料按照损伤部位性状塑形，并根据损伤部位深度对其富集层进行消切，使软骨移植物形状厚度与损伤部位一致。塑形后的软骨移植物富集层朝下覆盖在缺损部位，纤维蛋白胶固定。闭合关节腔，活动关节，确认材料未移位、脱落后逐层缝合各层组织。4w后取材，大体观察及组织学切片结果显示，损伤部位新生软骨填充高度与周围正常软骨一致，损伤部位有大量细胞迁入，有利于获得较好的长期修复效果(图3A)。
本实施例软骨移植物的支架层采用脱细胞猪腹膜基质，其结构相对疏松，有利于细胞迁入，同时采用Co6025kGy进行灭菌，使其降解相对较快。用于损伤面积较小、损伤深度较浅、恢复较快的急性损伤时，软骨移植物的降解时间能够与软骨新生时间相匹配，有助于获得较好的修复效果。同时由于损伤的面积较小或深度较浅，富集层容纳的骨髓间充质干细胞数量相对较少，添加较低浓度的细胞因子可达到促进间充质干细胞向软骨移植物内迁移以及向软骨细胞分化的作用。
图2显示了本实施例兔软骨损伤3d取材试验结果的图片
结果表明，本发明制备软骨修复材料能很好的承受关节活动产生的压力，未出现软骨修复材料被压塌或出现褶皱的现象，且损伤部位表面光滑平整，与周围正常软骨结合紧密，证明所制备的关节软骨修复材料具有良好的压缩强度及柔韧性，有利于避免后期活动导致的脱落(2A)，而常规方法制备的脱细胞猪腹膜3d取材时，与周围组织分界明显，并且受关节早期活动影响，局部有鼓起现象，易导致修复材料的脱落，影响修复效果(2B)。
图3显示了本实施例制备的软骨修复材料结合骨髓刺激术修复兔软骨损伤组织学试验的切片图片
兔软骨损伤4w取材结果(3A)表明，通过对本发明制备的软骨修复材料进行消切，使其达到良好的填充，避免纤维***想缺损部位长入，修复的缺损表面平整。取材时可见材料并未完全降解，损伤部位已有大量细胞迁移进入，有助于获得良好的长期修复效果。常规脱细胞腹膜结合骨髓刺激术修复兔软骨损伤组织学切片，兔软骨损伤4w取材结果表明(3B)，软骨损伤部位基本修复，但损伤部位细胞迁移进入的细胞量明显较少，不利于获得理想的修复效果。
实施例3、软骨修复材料修复猪软骨损伤
步骤一、软骨修复材料支架层的制备：支架层采用脱细胞牛心包制备，牛心包脱细胞参考文献进行：张文斌，吴汉江，胡广伟，姚本栈，周艺群.牛心包衍生膜材料的制备及理化性能检测[J].口腔医学研究，2005，21(1)：27-30.脱细胞牛心包具有天然的光滑面和粗糙面，厚度0.4mm。将脱细胞牛心包冻干，EO灭菌后获得软骨修复材料支架层。
步骤二、软骨修复材料保护层的制备：参照文献方法制备10％的丝素蛋白溶液(闵思佳，姚菊明，朱良均，阿部康次，寺本彰.具有交联结构的丝素蛋白质凝胶的理化特性.蚕业科学，1999，25(2):108-112)。加入5％的二缩水甘油基***(PGDE)和3％的NaCI，混合均匀后采用注模的方法，加到特制内高为150μm不锈钢模具中，盖上上盖后置于80℃烘箱反应得到丝素蛋白薄膜。将其在蒸馏水中浸洗5d，除去未反应的PGDE，获得软骨修复材料的保护层。将保护层按照步骤一制备获得的支架层的形状塑形，用8mg/mL的胶原溶胶将丝素蛋白凝胶粘合到脱细胞基质膜的光滑面，获得软骨修复材料的保护层和支架层的复合物。
步骤三、软骨修复材料富集层的制备：用1‰的醋酸将Ⅱ型胶原配制成8mg/mL的溶液，添加20ng/mL的TGFβ1、10-6mol/L的***、50ng/mL的***I及12ng/mL的神经生长因子，混合均匀。将上述制备的复合物支架层向上放在直径90mm的玻璃平皿内，加入25.434mL胶原溶液，使复合物支架层的粗糙面与胶原溶液接触。轻晃平皿使胶原溶液平铺在支架层粗糙面上，37℃放置使胶原溶液凝固，则凝固后的胶原厚度为4mm。根据机械打孔技术，采用NK-CK153型数控冲孔机在凝固的胶原层打孔，孔径100μm，孔间距150μm，打孔深度4mm，完成富集层的制备。富集层胶原的凝固使富集层与上述制备的复合物粘合在一起。
猪关节损伤部位清创后用克氏针环形打孔，孔间距2～3mm，孔深度以溢出骨髓血为宜。将制备好的软骨移植物按照损伤部位性状塑形，并根据损伤部位深度对其富集层进行消切，使软骨移植物形状厚度与损伤部位一致。塑形后的软骨移植物富集层朝下覆盖在缺损部位，纤维蛋白胶固定。闭合关节腔，活动关节，确认材料未移位、脱落后逐层缝合各层组织。12m后取材，大体观察损伤表面修复光滑平整，与周围正常软骨整合良好，无明显分界。组织学切片甲苯胺蓝结果显示损伤部位新生软骨蓝紫色着色明显，完成类透明软骨样修复(图4A)。
本实施例软骨移植物采用脱细胞牛心包基质，并且制备的保护层和富集层均较厚，使软骨移植物机械性能更好，体内降解时间更长，对较深的软骨损伤也能实现完全填充，并有更充分的空间容纳更多的间充质干细胞，更适于软骨损伤面积大、损伤深度较深、负重部位及康复时间更长的陈旧性损伤的软骨损伤。
图4显示了本实施例之猪软骨损伤试验的12m取材结果图片
结果表明，本发明制备的软骨修复材料，通过添加TGFβ1、***、***I，使间充质干细胞分化为软骨细胞，并且适当地机械刺激使软骨细胞分泌了大量的透明软骨细胞特异性的Ⅱ型胶原，使损伤部位完成透明样软骨修复(图4A)。而采用骨髓刺激术修复软骨损伤部位(4B)甲苯胺蓝染色结果显示局部修复组织有裂缝，效果欠佳，且Ⅱ型胶原特异性的蓝紫色并不明显，说明该修复并未完成透明样软骨修复，抗压耐磨性较差，长期效果不好。
Claims (2)
1.一种软骨修复材料，其特征在于，包括保护层、支架层及富集层；保护层通过纤维蛋白胶或胶原凝胶或透明质酸凝胶粘合在支架层的光滑面上，富集层通过胶原溶液的凝固与支架层的粗糙面复合在一起；
所述保护层，由丝素蛋白构成，厚度50～150μm；
所述支架层，为动物源性的脱细胞心包膜或腹膜，具备天然的粗糙面和光滑面，厚度0.1～0.5mm；
所述富集层，为Ⅱ型胶原制备的凝胶，含有5～20ng/mL的转化生长因子β1、10-8～10-6mol/L的***、5～50ng/mL的***Ⅰ及7～12ng/mL的神经生长因子；厚度1～4mm，具有贯穿整个富集层的多孔通道，多孔通道孔径50～100μm，孔间距100～150μm。
2.根据权利要求1所述软骨修复材料的制备方法，其特征在于，具体步骤、方法包括：
步骤一、软骨修复材料支架层制备：将动物源性心包膜或腹膜进行脱细胞，冻干，获得具有天然光滑面和粗糙面的脱细胞生物膜，厚度0.1～0.5mm；环氧乙烷或辐照灭菌后获得软骨修复材料支架层；
步骤二、软骨修复材料保护层的制备：在重量体积比为6～10％的丝素蛋白溶液中加入1～5％的环氧化合物和1～3％的氯化钠，混合均匀后得到丝素蛋白溶胶；采用流延、刮板或注模成型技术，制备厚度50～150μm的膜，于60～80℃反应得到丝素蛋白薄膜；将丝素蛋白薄膜在蒸馏水中浸洗至完全除去未反应的环氧化合物，获得软骨修复材料的保护层；
采用纤维蛋白胶、胶原溶胶、透明质酸溶胶将保护层粘合到支架层的光滑面，获得软骨修复材料的保护层和支架层的复合物；
步骤三、软骨修复材料富集层的制备：将Ⅱ型胶原配制成4～8mg/mL的溶液，添加5～20ng/mL的TGFβ1、10‐8～10‐6mol/L的***、5～50ng/mL的***Ⅰ及7～12ng/ml的神经生长因子，混合均匀，在上述制备的复合物的支架层粗糙面上制备厚度为1～4mm的胶原层，37℃放置使胶原溶液凝固；采用机械打孔、激光打孔(Laser)、电火花高速打孔(EDM)、电化学打孔(ECM)中的任何一种,在胶原层打孔，孔径50～100μm，孔间距100～150μm，多孔通道贯穿胶原层，完成富集层的制备；富集层胶原的凝固，使富集层与上述制备的复合物粘合在一起。
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