CN102712937A - 在碱预处理后改善木质纤维质的生物质释放单糖的方法 - Google Patents

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CN102712937A CN2010800462157A CN201080046215A CN102712937A CN 102712937 A CN102712937 A CN 102712937A CN 2010800462157 A CN2010800462157 A CN 2010800462157A CN 201080046215 A CN201080046215 A CN 201080046215A CN 102712937 A CN102712937 A CN 102712937A
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Abstract

本发明提供了用于改善碱预处理过的生物质释放单糖的方法。所述方法包括进一步加工预处理过的生物质并且将化学制品加入到糖化反应中，它们共同提供意料不到的高含量单糖释放，所述单糖可发酵成目标产物。

Description

在碱预处理后改善木质纤维质的生物质释放单糖的方法
本专利申请要求2009年10月12日提交的现在悬而未决的美国临时申请61/250596的权益，将所述文献全文以引用方式并入本文。
发明领域
本公开涉及由木质纤维质的生物质制备糖的一般领域。具体地讲，本公开提供了对生物质的预处理后和糖化以增进单糖释放的方法。所制得的可发酵糖可用于制备目标产物。
发明背景
纤维质和木质纤维质的生物质以及垃圾，例如农业残余物、木材、林业垃圾、来自造纸业的淤渣和市政及工业固体垃圾，提供了潜力巨大的可再生原料以用于生产有价值的产品例如燃料和其它化学品。纤维质和木质纤维质的原料和垃圾由包含纤维素、半纤维素和木质素的碳水化合物聚合物(多糖)组成，并且一般通过多种化学方法、机械方法和酶法处理以释放出己糖和戊糖单糖，所述单糖随后可通过生物催化剂发酵而制成可用的产品。
预处理的方法通常用于使木质纤维质的生物质的多糖更容易地被纤维素分解酶处理。多糖纤维素分解处理的一个主要障碍是存在限制酶作用于它们的底物以及用作酶非生产性结合的表面的木质素障碍物。由于糖化过程中酶的高成本，希望通过钝化木质素对酶的吸附或者通过萃取移除木质素以使载酶量最小化。另一个挑战是由于半纤维素和木质素对纤维素的保护或由于纤维素的结晶度导致的酶水解对纤维素的难以接近性。试图克服这些挑战的预处理方法包括：蒸汽***、热水、稀酸、氨纤维***、碱解(包括氨回收渗滤)、氧化去木质素和使用有机溶剂。
氨预处理的实例包括稀释氨水(DAA；共同持有并且共同未决的美国专利申请公布US20070031918A1)、氨回收渗滤(ARP；Kim T.H.等人，“Bioresource Technol.”，90：39-47，2003；Kim，T.，和Lee，Y.Y.，“Bioresource Technol.”，96：2007-2013，2005；Kim.T.H.等人，“Appl.Biochem.Biotechnol.”，133：41-57，2006)和在氨水中浸泡(SAA，Kim，T.H.，和Lee，Y.Y.，“Appl.Biochem.Biotechnol.”，136-140：81-92，2007)。
在预处理步骤之后，生物质在糖化酶的存在下进一步水解以由生物质释放低聚糖和/或单糖，其可用于制备目标产物，例如通过发酵产生乙醇。糖化酶和生物质处理方法已由Lynd，L.R.等人综述(“Microbiol.Mol.Biol.Rev.”，66：506-577，2002)。生物质的预处理和糖化应获得包含高浓度可发酵糖的生物质水解产物以提供用于生产目标化学制品的经济型方法的基础。在准备糖化时预处理木质纤维质的生物质的一个主要挑战是使碳水化合物(纤维素和半纤维素)损失最小化，同时使其酶水解可达性最大化。而且，在氨水预处理过程期间，除了半纤维素和纤维素以外，还可释放多种其它组分，这可影响糖化酶的作用，从而降低糖化后生成的单糖的收率。
因此，待解决的问题是研发处理生物质的高性价比方法，所述方法保留碳水化合物并且减少糖化中的干扰以制备富含可发酵糖的水解产物，同时使糖化酶的用量最小化。
发明概述
本发明提供了处理生物质以制备可发酵糖的方法，所述方法涉及首先用碱处理生物质，然后是洗涤和/或干燥步骤中的一个或两个，以及与至少一种化学添加剂存在下的酶糖化相结合。这些步骤的组合改善了得自生物质的可发酵单糖的收率。
因此，本发明提供了由预处理过的生物质制备可发酵糖的方法，所述方法包括：
a)提供预处理过的生物质，其中所述预处理过的生物质已经经受碱预处理过程；
b)使所述预处理过的生物质经受预处理后的过程，所述过程选自洗涤、干燥以及它们的组合，从而制得预处理后的生物质；以及
c)在适当的反应条件下，使步骤(b)中的所述预处理后的生物质接触至少一种糖化酶以及一种或多种化学添加剂以制得可发酵糖，所述化学添加剂选自烷撑二醇、天然油和非离子表面活性剂。
附图简述
图1A和1B图1A是示出了稀氨水预处理过的玉米芯的木糖和葡萄糖收率的图，所述玉米芯未被洗涤且未被干燥，但是在存在或不存在2％重量/重量的PEG8000的情况下，使用不同的糖化酶载量来糖化。图1B是示出了稀氨水预处理过的玉米芯的木糖和葡萄糖收率的图，所述玉米芯被洗涤过但是未被干燥，并且在存在或不存在2％重量/重量的PEG8000的情况下，使用不同的糖化酶载量来糖化。收率以占原玉米芯中的葡聚糖或木聚糖的百分比表示。
图2A和2B图2A是示出了稀氨水预处理过的玉米芯的木糖和葡萄糖收率的图，所述玉米芯未被洗涤但是被干燥，然后在存在或不存在2％重量/重量的PEG8000的情况下，使用不同的糖化酶载量来糖化。图2B是示出了稀氨水预处理过的玉米芯的木糖和葡萄糖收率的图，所述玉米芯被洗涤且被干燥，然后在存在或不存在2％重量/重量的PEG8000情况下，使用不同的糖化酶载量来糖化。收率以占原玉米芯中的葡聚糖或木聚糖的百分比表示。
图3是示出了氨悬浮液预处理过的玉米芯的木糖和葡萄糖收率的图，所述玉米芯被洗涤过，然后在存在或不存在2％重量/重量的PEG8000情况下，使用不同的糖化酶载量来糖化。收率以占原玉米芯中的葡聚糖或木聚糖的百分比表示。
图4A和4B图4A是示出了氨悬浮液预处理过的玉米芯的木糖和葡萄糖收率的图，所述玉米芯未被洗涤但是被干燥，然后在存在或不存在2％重量/重量的PEG8000情况下，使用不同的糖化酶载量来糖化。图4B是示出了氨悬浮液预处理过的玉米芯的木糖和葡萄糖收率的图，所述玉米芯被洗涤、干燥，然后在存在或不存在2％重量/重量的PEG8000情况下，使用不同的糖化酶载量来糖化。收率以占原玉米芯中的葡聚糖或木聚糖的百分比表示。
发明详述
申请人特别地在该公开中并入了所有引用的参考文献的全部内容。除非另行指出，所有百分数、份数、比率等均按重量计。商标以大写体标示。此外，当数量、浓度或其它数值或参数以范围、优选的范围或优选的上限数值和优选的下限数值的列表形式给出时，其应被理解为具体地公开由任何范围上限或优选的数值和任何范围下限或优选的数值的任何一对所构成的所有范围，而不管所述范围是否被单独地公开。除非另行指出，凡在本文中给出某一数值范围之处，该范围均旨在包含其端点，以及位于该范围内的所有整数和分数。当定义一个范围时，不旨在将本发明的范围限定于所列举的具体值。
本发明方法提供了应用于碱预处理过的木质纤维质的生物质同时在糖化中包括化学添加剂的过程，以改善得自预处理过的生物质的可发酵糖的收率。本发明方法还提供了低浓度的糖化酶用于由预处理后的生物质制得高收率的易于发酵的单糖的用途。此类易发酵的糖可用于制备多种目标化学制品或产品。
定义
本文采用下列定义：
“生物质”和“木质纤维质的生物质”互换使用，并且如本文所用，是指任何木质纤维质材料，包括纤维质的和半纤维质的材料，例如生物能作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、庭院垃圾、木材、林业垃圾以及它们的组合，并且进一步描述于下文中。生物质具有包括多糖和低聚糖在内的碳水化合物成分并且还可包含附加组分，例如蛋白质和/或类脂。
如本文所用，“碱预处理过的生物质”是指已经经受碱预处理过程的任何生物质。任何已知的碱预处理过程均是适宜的，包括在用于准备酶糖化以制得可发酵单糖时，将木质纤维质的生物质悬浮于碱水或碱的水溶液/溶剂溶液中以释放纤维素材料的过程。
如本文所用，“预处理过的生物质”是指糖化之前已经经受处理以改善糖化效果的生物质。预处理过的生物质可包含碎裂的木质素、氨水或其它预处理化学制品、附加的碱、半纤维素、纤维素、糖、蛋白质、碳水化合物和/或其它组分。
“基本上保留下来”旨在涉及预处理后的加工期间没有损失的碳水化合物的量，并且是预处理过的生物质中碳水化合物的原有量的至少约50％，60％，70％，80％，或90％。
与用于糖化预处理后的生物质的酶载量相关的“显著减少”是指达到一定可发酵单糖收率所需的糖化酶聚生体的量或浓度，通常表示为每单位质量碳水化合物的酶质量，或每单位生物质干质量的酶质量。例如，就碱预处理后经受本发明方法的生物质而言，与没有经受本文所述工序的预处理过而糖化的生物质相比，释放一定单糖收率所需的糖化酶聚生体载量可减少至少约2％，4％，6％，8％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，或60％。
“预处理后的加工”是指任何初始碱预处理过程后进行的工序并且包括洗涤、干燥和/或它们的组合，从而制得预处理后的生物质。
如本文所用，“预处理后的生物质”是指经受上文所定义的预处理后加工的预处理过的生物质。
与糖化相关的“在适当的反应条件下”是指在一定的pH范围、温度和反应混合物离子强度下使预处理后的生物质与糖化酶接触，以及糖化酶将至多100％的可转化的预处理后的生物质转化成可发酵糖所需的时间。适当的反应条件可包括通过槽罐反应器(如竖式槽罐反应器)内搅拌器***(包括但不限于叶轮)的作用进行的混合或搅拌。混合或搅拌可为连续的或不连续的，例如由加入附加组分或温度和pH评估引起的中断。
“糖化”是指通过水解酶的作用由生物质多糖制得可发酵糖。通过经由纤维素酶和半纤维素酶作用的酶糖化而由预处理后的生物质制得可发酵糖。
“糖化酶聚生体”是指能够作用于生物质混合物以制得可发酵糖的酶的组合。通常，糖化酶聚生体可包括一种或多种糖苷酶，其选自纤维素-水解糖苷酶、半纤维素-水解糖苷酶和淀粉-水解糖苷酶。糖化酶聚生体中的其它酶可包括肽酶、脂肪酶、木素酶和阿魏酸酯酶。
“可发酵糖”是指发酵过程中能够被微生物用作碳源以制得目标产物的糖，尤其是单糖和二糖。
如本文所用，“指定的可发酵糖收率”是指特定的目标可发酵糖收率，例如酶糖化后获得至少约40％(按生物质干重计)的可发酵单糖。
“木质纤维质”是指包含木质素和纤维素的组合物。木质纤维质的材料也可包含半纤维素。
“纤维质”是指包含纤维素的组合物。
生物质“干重”是指移除全部或基本上全部水分后的生物质的重量。干重通常依照美国材料与试验协会(ASTM)标准E1756-01(Standard TestMethod for Determination of Total Solids in Biomass)或纸浆与造纸工业技术协会，Inc.(TAPPI)标准T-412 om-02(Moisture in Pulp，Paper andPaperboard)进行测量。
“目标产物”和“目标化学制品”互换使用，并且是指通过发酵制得的化学制品、燃料、或化学构建单元。此外，目标产物被广义地使用并且可包括分子例如蛋白质、肽、酶和抗体。目标产物和目标化学制品的定义中还设想的是乙醇、丁醇和其它化合物。
“碱性”是指pH大于7.0。
“天然油”是指天然存在的任何纯的或不纯的油，例如植物油、大豆油、玉米油、或作为生物食品副产物或农业加工副产物而留下来的任何油。
“单糖”包括具有单个戊糖或己糖单元的糖，例如葡萄糖、木糖和***糖。
如本文所用，“协同改善”是指当将因素组合时获得大于预期改善的改善度，所述预期改善是每个单独因素的单独改善之和。
如本文所用，“发酵”是指通过选定的微生物将由预处理后的并且糖化的生物质释放的单糖转化成目标化学制品。
如本文所用，“洗涤”是指使用水或有机/含水混合物来洗涤预处理过的碱性生物质。
如本文所用，“干燥”是指在糖化之前，将可能已经洗涤过的预处理过的生物质悬浮液干燥至60-99.9％干固体。可将生物质风干，或在烘箱中采用高达110℃的温度干燥。
如本文所用，“发酵微生物”或“生物催化剂”是指适于通过糖的发酵制得期望的目标产物的任何有氧或厌氧原核或真核微生物。根据本发明，适宜的微生物将糖例如木糖和/或葡萄糖直接地或间接地转化成所需的产物。微生物可自然而然地制得产物，或可被转基因以制得所需的产物。此类微生物的实例包括但不限于真菌例如酵母和细菌。优选的酵母包括下列菌株：糖酵母属物种，具体地讲为啤酒糖酵母或葡萄汁酵母；或毕赤酵母属，优选树干毕赤酵母例如树干毕赤酵母CBS 5773；或假丝酵母属，具体地讲为产朊假丝酵母、迪丹假丝酵母、或博伊丁假丝酵母，其能够将葡萄糖和木糖发酵成乙醇。其它设想的微生物包括但不限于下列属种的成员：发酵单胞菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、红球菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属、肠球菌属、足球菌属、产碱杆菌属、克雷伯氏菌属、类芽胞杆菌属、节杆菌属、棒状杆菌属、短杆菌属和汉逊酵母属。
提供了用于预处理后加工碱性预处理过的木质纤维质的生物质以及糖化所述生物质的方法。本文所述方法使糖化所需的糖化酶的浓度最小化并且同时改善了所述方法的单糖收率。
木质纤维质的生物质
适用于本文的木质纤维质的生物质包括但不限于：生物能作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸业的淤渣、庭院垃圾、木材和林业垃圾。生物质实例包括但不限于玉米芯、作物残余例如玉米壳、玉米秸秆、草、小麦、小麦秸秆、大麦、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、蔗渣、高粱植物材料、大豆植物材料、藻类、获取自下列研磨物的组分：谷物、树、枝、根、叶、木屑、锯末、灌木及矮树丛、蔬菜、水果、花和动物粪肥。
在一个实施方案中，可用于本发明的生物质包括具有相对高碳水化合物含量的生物质，它们相对密集，和/或相对易于收集、运输、贮存和/或处理。
在另一个实施方案中，木质纤维质的生物质包括农业残余物例如玉米秸秆、小麦秸秆、大麦秸秆、燕麦秸秆、稻秆、卡诺拉秸秆和大豆秸秆，草例如柳枝稷、芒草、米草和草芦，纤维加工残余如玉米纤维、甜菜浆、纸浆厂残渣和废弃物以及蔗渣，高粱秸秆，林业垃圾例如白杨木、其它硬木、软木和锯屑，和消费者用过的纸制品垃圾，以及其它作物材料或足够丰富的木质纤维质材料。
在本发明的另一个实施方案中，可用的生物质包括玉米芯、玉米秸秆、蔗渣和柳枝稷。
木质纤维质的生物质可来源于单一来源，或者生物质可包括来源于一种以上来源的混合物；例如生物质可包括玉米芯和玉米秸秆的混合物，或茎或杆和叶的混合物。
当得自所述来源时，生物质可直接使用，或者可经过一些预加工，例如可向生物质施能以降低尺寸、增加暴露的表面积、和/或提高生物质中存在的木质素和纤维素、半纤维素和/或低聚糖对碱预处理以及方法第三步中所用糖化酶的可达性。可用于降低尺寸、增加暴露的表面积、和/或提高生物质中存在的木质素和纤维素、半纤维素、和/或低聚糖对预处理方法以及糖化酶的可达性的方法包括但不限于粉碎、压碎、碾磨、撕碎、切剁、盘磨、超声和微波。这些方法的施用可发生于预处理之前或期间，预处理后加工和糖化之前或期间，或它们的任何组合。
就本发明目的而言，除了如上所述的降低尺寸以外，在预处理之前，可通过常规方法来干燥生物质，例如在环境温度下暴露于真空，或在大气压下接触流动的空气，和/或在烘箱或真空炉中加热。作为另外一种选择，预加工过的生物质可无需干燥而用于预处理。
碱预处理
在生物质中，晶状纤维素原纤埋于半纤维素基质中，所述半纤维素基质继而被木质素外层包围。通常需要生物质预处理来移除木质素障碍物以用于随后更有效的酶糖化过程。一种生物质预处理方法是碱预处理。碱性是指大于7.0的pH。
多种类型的化合物可用于生物质的碱预处理，例如使用氢氧化铵(氨水)、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化钙和氢氧化钠。在一个实施方案中，碱预处理是指在含水介质中使用氨气(NH3)、包含铵离子(NH4 +)的化合物如氢氧化铵或硫酸铵、当降解时释放氨的化合物例如尿素、以及它们的组合。在本发明方法中，含氨的水溶液还任选包含至少一种附加的碱，例如氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾、碳酸钾、氢氧化钙和碳酸钙。氨预处理生物质的方法公开于共同持有、共同未决的美国专利申请公布US20070031918A1、US20070031919A1；和US20070031953A1中，将所述文献以引用方式并入本文。
在本发明方法中，可使用任何碱预处理方法来制备预处理过的生物质。例如，本文使用的制备预处理过的生物质的氨水预处理方法包含12-20％干固体重量/重量(wt/wt)总预处理悬浮液和15-80％氨重量/重量生物质干固体，其中反应温度在20-200℃的范围内并且反应时间在0.5-96小时内变化。当使用玉米作为木质纤维质的生物质时，典型条件为约15％干固体重量/重量的总预处理悬浮液，30％氨重量/重量的生物质干固体、23℃和96小时。当使用柳枝稷或蔗渣作为木质纤维质的生物质时，典型条件为约12％干固体重量/重量的总预处理悬浮液，60％氨重量/重量的生物质干固体、以及140℃和1小时。注意到，该段中所述的条件用于含水浆液的氨预处理，对于高固体的氨预处理过程而言是不必要的，用于该处理过程的条件更典型地为约50％干固体重量/重量的总预处理悬浮液和4-10％氨重量/重量的生物质干固体，其中反应温度在20-200℃的范围内，并且反应时间在5-120分钟内变化。
预处理后的加工
如上所述形成的预处理过的生物质包含多种物质，例如碱以及可用作酶糖化和/或发酵抑制剂进而阻碍由生物质水解产物高性价比制备目标化学制品的许多可溶性和不溶性化合物。在本发明方法中，提供了其它步骤即预处理后的加工来制备预处理过的生物质以使得如下所述的酶糖化后的可发酵糖的收率最大化。
本发明方法中的预处理后的加工包括洗涤或干燥，或洗涤和干燥。用溶液洗涤预处理过的生物质，所述溶液包括例如水溶液或水与有机溶剂比率不同的有机/含水混合物。典型的洗涤溶液包括水、水和乙醇混合物、以及水和异丙醇混合物。洗涤可在室温下，或在高温下例如在83℃下进行。
可使用相同或不同的溶液重复洗涤若干次。洗涤条件可取决于向其实施预处理后洗涤的预处理过的生物质类型。例如，玉米生物质的典型洗涤条件为3×3体积的23℃的水。柳枝稷或蔗渣生物质的典型洗涤条件为2×3体积的95％EtOH，2×3体积的50％EtOH，以及2×3体积的水。可如本领域技术人员所熟知的那样进行洗涤。例如，加入洗涤溶液并且将所述溶液与预处理过的生物质浆液混合。可在例如过滤、离心或沉淀后，通过重力流、倾倒或抽吸来移除洗涤溶液。
洗涤可包括置换或稀释洗涤过程，其可用于替代上述那些，或与前述预处理后的加工组合。可使用可商购获得的过滤器和离心机实施置换过程。这些过程与洗涤和脱水组合于一个单元操作中。在过滤情况下，置换洗涤可用如下设备例如带式过滤器、鼓式过滤器、盘式过滤器、压滤器、或大规模滤过器(Pfaudler Reactor System，Rochester，NY)来实施。可使用的离心机包括卧式和立式滚筒离心机。在洗涤液体消耗方面，置换洗涤过程是高效的。稀释洗涤通过将固体重新悬浮于洗涤液体中而最有效地移除最后痕量的杂质。这可在简单的槽罐中或在将过滤和再悬浮组合于一个单元操作中的滤过器中完成。洗涤操作可包括置换洗涤过程和稀释洗涤过程以充分利用二者的有益效果。
在本发明方法中，可使预处理过的生物质干燥。干燥可通过常规方法进行，如在环境温度(19-25℃)下，接触真空或在大气压下接触流动空气，和/或在烘箱或真空炉中加热。干燥可单独进行，或与洗涤组合，或在洗涤一次或多次后进行。干燥所用温度可为20-110℃，优选35-75℃，并且更优选40-65℃。预处理过的生物质可干燥至50％-99％固体。所述生物质可优选干燥至＞80％固体。
预处理后洗涤和/或干燥步骤可重复一次或多次以获得更高的糖收率。
用于糖化的预处理后的生物质调节预处理后的生物质的pH应适于糖化酶的最佳表现。碱预处理后，预处理过的生物质悬浮液的pH高于pH 7.0。如果预处理后的产物的pH超过使糖化酶活化的pH，则可使用酸来降低pH。可通过加入固体或液体形式的酸来改变pH。作为另外一种选择，可使用可从发酵中回收的二氧化碳(CO2)来降低pH。例如，如果存在足够液体，可从发酵罐中收集CO2并且将其通入闪蒸槽内的预处理后的产物顶部空间中，或起泡通过预处理后的生物质，同时监控pH直至达到所需的pH。
加入用于达到所需pH的酸可生成盐，在一定浓度下，所述盐在单糖发酵成目标产物期间抑制糖化酶或微生物生长。为了降低达到期望pH所需要的酸的量并且降低预处理后加工前的预处理期间所用氨的原材料成本，可从预处理反应器中排出氨气并且回收。
预处理后的生物质可用于糖化中，或用于同时发生的糖化和发酵(SSF)中，其中pH已经如上所述调节至适于最佳糖化酶的期望的范围内。可改变温度以与糖化酶活性所需温度相协调。可加入糖化过程中使用的酶活性所需的任何辅因子。
化学添加剂
根据本发明方法，可在预处理后的加工之后的糖化期间加入一种或多种化学添加剂，例如烷撑二醇、天然油、或非离子表面活性剂。在预处理后的加工之后的糖化期间，可加入化学添加剂，例如增塑剂、软化剂、或它们的组合，例如多元醇(例如甘油、乙二醇)、多元醇的酯(例如单乙酸甘油酯)、二醇醚(例如二甘醇)、乙酰胺、乙醇、胆胺、聚氧乙烯(例如PEG 400、1000、2000、3000、4000或8000)和/或天然存在的油，例如植物油、大豆油、玉米油)或作为生物食品副产物或农业加工副产物而留下来的任何油(参见例如美国专利7,354,743，将所述文献以引用方式并入本文)。
可用于本发明的其它化学添加剂包括但不限于非离子表面活性剂例如胺乙氧基化物、葡糖苷、葡糖酰胺、聚乙二醇、芦布若尔、全氟烷基聚烷氧基化酰胺、N，N-双[3D-葡糖酰氨基丙基]胆酰胺、癸酰基-N-甲基-葡糖酰胺、n-癸基β-D-吡喃葡萄糖苷、n-癸基β-D-吡喃葡萄糖苷、n-癸基β-D-吡喃麦芽糖苷、n-十二烷基β-D-吡喃葡萄糖苷、n-十一烷基β-D-吡喃葡萄糖苷、n-庚基β-D-吡喃葡萄糖苷、n-庚基β-D-硫代吡喃葡萄糖苷、n-己基β-D-吡喃葡萄糖苷、n-壬酰基β-吡喃葡萄糖苷、1-单油酸-rac-甘油酯、壬酰基-N-甲基葡糖酰胺、十二烷基β-D-麦芽糖苷、N，N-双[3-葡糖酰氨基丙基]脱氧胆酰胺、二甘醇单戊醚、洋地黄皂苷、庚酰基-N-甲基葡糖酰胺、辛酰基-N-甲基葡糖酰胺、n-辛基β-D-吡喃葡萄糖苷、n-辛基β-D-吡喃葡萄糖苷，n-辛基β-D-硫代吡喃半乳糖苷、n-辛基β-D-硫代吡喃葡萄糖苷；三油酸脱水山梨糖醇酯、单油酸脱水山梨糖醇酯、一月桂酸脱水山梨糖醇酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯、天然卵磷脂、合成卵磷脂、二油酸二甘醇酯、油酸四氢糠酯、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、单油酸甘油酯、一硬脂酸甘油、一蓖麻油酸甘油酯、鲸蜡醇、硬脂醇、或一月桂酸甘油酯。表面活性剂的其它实例包括合成磷脂，例如二硬脂酰基磷脂酰胆碱或文献中提供的其它表面活性剂[McCutcheon的“Emulsifiers and Detergents”北美版，2000年由Manufacturers Confectioners Publishing Co.(Glen Rock，N.J)公布]。
可在糖化前将一种或多种化学添加剂加入到预处理后的生物质中，总化学添加剂的量相对于生物质干重小于约20重量％。总化学添加剂的量相对于生物质干重优选小于约16重量％，并且可为约0.05％，2％，4％，6％，8％，10％，12％，14％或16％。
可发酵糖生产改进
在由木质纤维质的生物质生产可发酵糖的本发明方法中，将碱预处理过的生物质如上所述进行预处理后加工，并且在糖化(糖化描述于下文中)期间加入如上所述的化学添加剂。这些步骤中的每一个独立改善了糖的生产。当组合时，这些步骤共同提供协同的改善效应：当在方法中将所述步骤组合时，获得的改善大于基于单独效应加和的预期效果。例如，本文实施例6中示出，洗涤在木糖产量方面单独提供110％的改善度，并且加入PEG8000，在木糖产量方面提供5％的改善度。就洗涤和加入PEG而言，这两个改善度之和为115％的木糖收率改善度。然而，包括洗涤和加入PEG的方法在实验获得的木糖产量方面的改善度为250％，为协同增高的改善度。
糖化
用于生物质处理的糖化酶和酶组以及方法综述于Lynd，L.R.等人文章中(“Microbiol.Mol.Biol.Rev.”，66：506-577，2002)。糖化酶和酶组可包含一种或多种糖苷酶，所述糖苷酶由纤维素-水解糖苷酶、半纤维素-水解糖苷酶和淀粉-水解糖苷酶组成。糖化酶聚生体中的其它酶可包括肽酶、脂肪酶、木素酶和酯酶。
糖苷酶类别主要选自但不限于：水解二糖、低聚糖和多糖的醚键的酶，并且其存在于广义“水解酶”(EC 3.)的酶分类EC 3.2.1.x中(“Enzyme Nomenclature”，1992，Academic Press，San Diego，CA，以及增补1，1993；增补2，1994；增补3，1995；增补4，1997；和增补5[分别在“Eur.J.Biochem.”，223：1-5，1994；“Eur.J.Biochem.”，232：1-6，1995；“Eur.J.Biochem.”，237：1-5，1996；“Eur.J.Biochem.”，250：1-6，1997；和“Eur.J.Biochem.”，264：610-650，1999中])。本发明的方法中可用的糖苷酶能够根据它们水解的生物质组分进行分类。可用于本发明方法中的糖苷酶包括纤维素水解糖苷酶(例如，纤维素酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶)、半纤维素水解糖苷酶(例如木聚糖酶、内木聚糖酶、外木聚糖酶、β-木聚糖苷酶、***糖基木聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳糖酶、果胶酶、葡糖苷酸酶)和淀粉水解糖苷酶(例如淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、异淀粉酶)。此外，它可用于将其它活性加入糖化酶聚生体中，例如肽酶(EC3.4.x.y)、脂肪酶(EC 3.1.1.x和3.1.4.x)、木素酶(EC 1.11.1.x)和阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)，以有助于从生物质的其它组分中释放多糖。本领域熟知生产多糖水解酶的微生物常常表现出某种活性，例如纤维素降解，该活性由若干种酶或一组具有不同底物特异性的酶催化。因此，来自微生物的“纤维素酶”可包括一组酶，所有酶可有助于纤维素降解活性。取决于获取酶时利用的纯化方案，商业或非商业酶制剂，例如纤维素酶，可包括多种酶。因此，本发明方法的糖化酶聚生体可包括酶活性，例如“纤维素酶”，然而人们认识到该活性可被一种以上的酶催化。
糖化酶可按分离形式商购获得，例如SPEZYME
Figure BPA00001542482800131
CP纤维素酶(Genencor International，Rochester，NY)和MULTIFECT木聚糖酶(Genencor)。此外，糖化酶可按宿主微生物表达，包括重组体微生物
本领域的技术人员将懂得如何测定在糖化酶聚生体中使用的酶的有效量，以及如何调节条件以获得最佳酶活性。本领域的技术人员也将懂得如何优化在复合酶中的此类酶的所需活性以在选择条件下获得给定预处理后的产物的最佳糖化效果。例如参见美国专利NO：7354743；美国专利公布2009/0004692以及Zhang等人(“Biotech Advances”，24：452-481，2006)。适宜的反应条件包括下列条件，如对糖化酶活性有效的pH、温度和时间。优选地，糖化反应在糖化酶的最佳温度和pH下或接近此最佳pH和温度的条件下进行。本发明方法中与糖化酶聚生体一起使用的最佳温度在约15℃至约100℃的范围内。在另一个实施方案中，最佳温度在约20℃至约80℃的范围内，并且最典型为45-50℃。最佳pH可在约2至约11的范围内。另一个实施方案中，在本发明的方法中糖化酶聚生体使用的最佳pH在约4至约5.5的范围内。
糖化可进行约若干分钟至约120h，优选约若干分钟至约48h。反应时间将取决于酶浓度和比活性，以及使用的底物、其浓度(即固体载量)和环境条件例如温度和pH。本领域的技术人员能够容易地决定特定底物和糖化酶聚生体使用的温度、pH和时间的最佳条件。
糖化可按间歇式或连续的方法进行，并且也可在一个步骤或在多个步骤中进行。例如，糖化所需的不同酶可表现出不同的最佳pH或温度。可用酶在某个温度和pH下进行首次处理，随后使用不同酶在不同温度和/或pH下进行第二次或第三次(或更多次)处理。此外，用不同酶在连续步骤中进行的处理可以在相同pH和/或温度下进行，或在不同pH和温度下进行，例如使用在更高pH和温度下稳定的和活性更高的半纤维素酶处理，随后用在更低pH和温度下用活性的纤维素酶处理。
糖化后得自预处理后的生物质的糖的溶解度可通过测定单糖和低聚糖的释放进行监控。测量单糖和低聚糖的方法是本领域熟知的。例如，还原糖的浓度可使用1，3-二硝基水杨酸(DNS)检测分析法(Miller，G.L.，Anal.Chem.，31：426-428，1959)测定。作为另外一种选择，可使用适当的柱，通过HPLC测定糖，如下文所述。为了评定本发明方法的性能，可计算出得自起始生物质的糖的理论收率并且与所测收率比较。
发酵生成目标产物
如本文所述制得的预处理后的且糖化的生物质可接触一种或多种能够将可发酵糖转化成目标产物的发酵微生物。此类发酵微生物包括但不限于如上所述的糖酵母属、毕赤酵母属、发酵单胞菌属和大肠杆菌属。目标产物包括但不限于醇(例如***糖醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1，3-丙二醇、山梨醇和木糖醇)；有机酸(例如乙酸、乙酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2，5-二酮-D-葡萄糖酸、甲酸、富马酸、葡糖二酸、葡萄糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、丙酸、琥珀酸和木质酸)；酮(例如丙酮)；氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸)；气体(例如甲烷、氢(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO))。参见例如美国专利申请序列号12/410501和美国专利公布No.US20080187973A1，将两篇文献以引用方式并入本文中。
发酵方法还包括在酒精消费品工业(例如，啤酒和酒)、乳品工业(例如，发酵的乳制品)、皮革工业和烟草工业中所使用的方法。
本领域已知的可用的糖化和发酵方法包括但不限于分步水解和发酵(SHF)、同步糖化和发酵(SSF)、同步糖化和共发酵(SSCF)、混合水解和发酵(HHF)、以及直接微生物转化(DMC)。
SHF采用分别的工序来首先将纤维素酶解为糖例如葡萄糖和木糖，然后将所述糖发酵为乙醇。在SSF中，将纤维素的酶水解和将葡萄糖发酵成乙醇被合并为一个步骤(Philippidis，G.P.，in Handbook on Bioethanol：Production and Utilization，Wyman，C.E.，ed.，Taylor&Francis，Washington，D.C.，179-212，1996)。SSCF包括多种糖的共发酵(Sheehan，J.，和Himmel，M.，“Biotechnol.Prog.”，15：817-827，1999)。HHF包括在同一反应器但在不同温度进行的两个独立的步骤，即在高温下进行酶解糖化，然后在发酵菌株能够耐受的较低温度下进行SSF。DMC将全部三个过程(纤维素酶生产、纤维素水解和发酵)合并为一个步骤(Lynd，L.R.，Weimer，P.J.，van Zyl，W.H.，和Pretorius，I.S.，“Microbiol.Mol.Biol.Rev.”，66：506-577，2002)。上述方法可用于由可发酵糖生产目标产物，所述可发酵糖由本文所述方法制得。
本发明的方法的优点
已经使用了多种木质纤维质的生物质的氨预处理方法例如DAA、ARP和SAA(Kim等人，同上)。然而，这些方法具有某些缺点，其致使糖化后可发酵糖例如单糖的收率差。例如，DAA技术不包括预处理后进行干燥以移除可能存在于预处理后混合物中的酶糖化或发酵的抑制剂。在ARP和SAA方法中，采用极高含量的氨水来预处理生物质，所述生物质在酶糖化之前将进一步被洗涤。然而，任一种处理后，没有公开量化的单糖收率。
如上所述，预处理过的生物质在糖化酶的存在下进一步水解以释放水解产物中的低聚糖和/或单糖(Lynd，L.R.等人，同上)。若干报导(Alkasrawi，M.等人，“Enzyme Microbial Technol.”，33：71-78，2003；“Borjesson.J.”等人，“Enzyme Microbial Technol.”，40：754-762，2007；Zheng，Y.等人，“Appl.Biochem.Biotechnol.”，146：231-248，2008)已经指出，将增塑剂或烷撑二醇例如聚乙二醇(PEG)加入到脱木素的生物质中，对于提高糖化期间的糖收率是无效的。此外，Jeoh等人(“Biotechnol.Bioeng.”，98：112-122，2007)指出，向预处理过的生物质施加干燥过程降低了随后糖化以将木质纤维质材料转化成可发酵糖的功效。最后，Zhang，Y.-H.P.和Lynd，L.R.(“Biotechnol.Bioeng.”，88：797-824，2004)得出结论，基底干燥对于纤维质基底的分解是不利的。
如共同持有的、悬而未决的专利申请WO2006/110900(A2)(US20070031953A1)中所述的那样，当使用15mg/g糖化酶固体时，就葡萄糖和木糖而言，得自氨预处理过的玉米芯的葡萄糖和木糖收率分别为47.78％和30.63％，所述文献不包括在糖化前干燥生物质，将所述文献以引用方式并入本文。
令人惊奇的是，申请人已示出预处理后用水或有机/水溶剂洗涤预处理过的生物质，和/或干燥预处理过的生物质，与随后糖化中加入至少一种选自烷撑二醇、天然油和非离子表面活性剂的化学添加剂相组合使得酶糖化后单糖的释放高度地改善。这些步骤对糖收率具有协同效应并且降低糖化酶载量，同时提供高收率的可发酵糖。
一般方法
分析方法
采用本领域熟知的方法来测定每种起始生物质样品中葡萄糖和木糖的量。将糖化反应样品离心后获得的澄清的上清液过滤并且在蒸馏水中稀释13.3倍。由具有适当保护柱的HPLC(Waters Millenium 2795***，Grace-Davison Prevail糖分析柱，4.6×250mm，0.5μm，流动相75％乙腈的水溶液，Waters 2420折射率检测器)，测定糖化液中的可溶性糖(葡萄糖、纤维二糖、木糖)。使用Grace-Davison Prevail糖分析柱和10μL注射体积，实施HPLC分析。流动相为75％HPLC级乙腈的HPLC级水溶液，0.2μm过滤并且脱气，流量为1.0mL/min，柱温为35℃，并且保护柱温度为35℃。检测器为Waters 2420折射率检测器，运行时间为12分钟，注射体积为10μL稀释样品，并且流动相为0.01N硫酸，0.2μm过滤并且脱气。
作为另外一种选择，使用Sluiter，A.等人的方法(“Determination ofsugars，byproducts and degradation products in liquid fraction processsamples”，National Renewable Energy Laboratory Analytical Procedure，2006)。在该方法中，柱子为Biorad Aminex HPX-87H，检测器为Waters2410折射率检测器，分析时间为20分钟，注射体积为10μl稀释样品，流动相为0.01N硫酸，0.2μm过滤并且脱气，流量为0.6mL/mim并且柱温为60℃。分析后，采用外标曲线测定样品中期望的化合物的浓度。
材料
除非另外指明，化合物均得自Sigma Aldrich；SPEZYMECP和MULTIFECT
Figure BPA00001542482800172
CX 12L得自Genencor(Genencor International，Palo Alto，CA)并且Novozyme 188得自Novozymes(Novozymes，2880 Bagsvaerd，Denmark)。NH4OH得自EMD(Gibbatown，N.J.)；Accellerase
Figure BPA00001542482800173
1000纤维素酶得自Genencor International，n-辛基吡喃葡萄糖苷和n-辛基-β-O-硫糖苷得自A.G.Scientific chemicals(San Diego，CA)；壬酰基甲基葡糖酰胺得自Lab Express International Inc(Fairfield，NJ)；三甲基鲸蜡基溴化铵得自USB Co(Cleveland，OH)。
下列缩写用于下列实施例中：
“HPLC”为高效液相色谱；“℃”为摄氏度或摄氏；“kPa”为千帕；“m”为米；“mm”为毫米；“μm”为微米；“μl”为微升；“mL”为毫升；“L”为升；“min”为分钟；“mM”为毫摩尔每升，“cm”为厘米；“g”为克；“kg”为千克，“wt”为重量，“h”为小时；“PEG”为聚乙二醇；“mg”为毫克；“mg/mL”为毫克每毫升；“rpm”为转每分钟；“w/w”为重量/重量；“mmHg”为毫米汞柱；“DWB”为生物质干重；“ASME”为美国机械工程师协会；“wt％”为重量百分比；“％”为百分比；“psig”是指磅每平方英寸(压力计)。
实施例
预处理后加工生物质以移除抑制剂并且改善糖化后的单糖收率
下述实验工作的目的是开发经济型预处理后的加工，所述加工移除木质纤维质的生物质氨水预处理期间形成的抑制剂以使单糖产量最大化并且使此类糖的损失最小化，以用于发酵成期望的一种或多种目标产物。
本发明将在下面的实施例中得到进一步阐述。应当理解，尽管这些实施例说明了本发明的优选实施方案，但仅是以例证的方式给出的。根据上面的论述和这些实施例，本领域的技术人员可以确定本发明的基本特征，并在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对本发明做出多种改变和修改以使其适用于多种用法和条件。
实施例1
洗涤氨水预处理过的两种粒度的生物质并且加入PEG，增加酶糖化后 单糖的释放
该实验的目的是研究洗涤预处理过的生物质并且加入PEG以及多种玉米芯生物质粒度对糖化后单糖的释放的影响。
将锤磨过的玉米芯生物质(通过1.9mm筛网)加入到5L水平犁式搅拌机(Littleford Day，M-5型)压力容器中压至50％的初始填充体积。然后使用真空泵将容器抽空至约75mmHg压力。然后将氨水溶液加入到所述容器中以便使初始固体浓度为约50％重量/重量，并且氨浓度为6％重量/重量干燥生物质。然后采用间接加热将容器内容物预热至100℃温度，接着将过热蒸汽直接加入到所述容器中以使温度升至140℃。然后将反应器在140℃下保持20分钟，然后通过打开排气管线上的阀门，使压力降至大气压。在反应器温度达到100℃时，使用真空泵使压力进一步降至约100mmHg。当反应器温度达到约60℃时，从反应器中取出预处理过的生物质。生物质的最终固体浓度为约58％。
然后将预处理过的材料按原样使用，或用蒸馏水、50％乙醇的水溶液或95％乙醇的水溶液进一步洗涤。通过真空过滤，从残余固体中移除每一种洗涤液体。然后将预处理过的洗涤过的固体在90℃烘箱中干燥，之后备用于酶糖化。
将每种预处理过的材料批料的一半进一步锤磨至通过1.1mm筛网的更小尺寸以测定粒度对糖化的影响。然后将所有预处理过的材料再次悬浮于蒸馏水中至18.6％固体。用硫酸水溶液将所有预处理过的生物质的pH调节至5.0。将每种悬浮液(3g)加入到20mL玻璃闪烁小瓶中。然后所选小瓶加入按干固体计2.68％的PEG8000。向每种生物质悬浮液中加入SPEZYME
Figure BPA00001542482800181
CP纤维素酶与MULTIFECT
Figure BPA00001542482800182
CX12L半纤维素酶的混合物(每种蛋白质的比率为1∶1)，使得酶总载量为3.7mg酶蛋白质/g干固体。使酶糖化反应在55℃下进行至多96h，以237rpm速率旋摇。96h时，取出150μL等分试样并且在微量离心管中以14,000rpm速率离心。如上所述，由HLPC测定葡萄糖和木糖单糖的浓度。数据(表1)示出，洗涤氨预处理过的生物质，增加了随后糖化中木糖和葡萄糖的释放，所述释放在PEG8000的存在下通过糖化进一步提高。1.9和1.1mm粒度的预处理过的生物质均发生所述提高。
表1
采用不同的洗涤方案、PEG和预处理过的生物质粒度，由6％氨水预处 理过的玉米芯生物质释放的木糖和葡萄糖
Figure BPA00001542482800191
实施例2
连续洗涤氨水预处理过的生物质增强酶糖化后单糖的释放
将如实施例1中所述的氨水预处理过的材料按原样使用，或用83℃蒸馏水洗涤，或连续洗涤(2体积水，2体积50％乙醇，2体积95％乙醇)，同时从残余固体中分离出洗涤溶液。通过将550g氨水预处理过的生物质加入到1000g水中形成悬浮液，然后将所述悬浮液加热至83℃温度并且混合30分钟，完成83℃下的水洗。然后使用布氏漏斗过滤悬浮液。用1000g 83℃的水置换洗涤所得滤饼。所得生物质滤饼的最终固体浓度为32.7％重量/重量。
将所有预处理过的生物质样品进一步锤磨并且通过1.1mm筛网。将所有预处理过的生物质再悬浮于蒸馏水中以获得18.6％固体的溶液，并且将所有预处理过的生物质的pH调节至5.0。将每种悬浮液(3g)称至20mL玻璃闪烁小瓶中。然后所选小瓶加入按干固体计2.68％的PEG8000。然后将预处理过的生物质糖化，并且如上所述对糖进行分析。数据示出，与仅用水洗涤一次相比，首先使用水，然后用乙醇/水溶液的连续洗涤大大增强了糖化期间糖的释放(表2)。
表2
由6％氨水预处理过的玉米芯生物质释放的木糖和葡萄糖：83℃水洗与 连续洗涤，并且加入2.68重量％PEG8000的效果比较
Figure BPA00001542482800201
实施例3
化学添加剂对酶糖化后单糖释放增加的影响
如实施例1所述研磨玉米芯生物质并且预处理，然后一部分用83℃水洗处理。如实施例2中所述糖化水洗或未洗过的样品，不同的是在糖化反应中加入不同的化学添加剂。在一组测试中加入0.27％干固体(表3)的表3中所列的化学添加剂，并且在另一组测试中加入2.68％干固体(表4)的化学添加剂。列出了作为表面活性剂特征的临界胶束浓度。表3中的数据示出，在卵磷脂和PEG8000的存在下，以低剂量增强了糖化后单糖的释放。当糖化前洗涤预处理过的生物质时，改善更大。
表3
6％氨水-预处理过的未洗或水洗过的玉米芯在0.27％干固体载量的多种 化学添加剂存在下糖化后木糖和葡萄糖的释放
Figure BPA00001542482800211
表4中的数据表明，在相对于固体干重2.68％的添加剂含量下，非离子表面活性剂、植物油和PEG尤其有效地在糖化后从洗过的预处理过的生物质中释放出葡萄糖和木糖。
表4
6％氨水预处理过的未洗过或水洗过的玉米芯在2.68％干固体载量的不 同化学添加剂存在下糖化后木糖和葡萄糖的释放
Figure BPA00001542482800221
实施例4
洗涤氨水预处理过的生物质改善高固体反应中使用PEG8000糖化后单 糖的释放
该实施例的目的是研究糖化前预处理后洗涤氨水预处理过的生物质对高固体反应中加入PEG8000糖化后单糖释放的影响。
如实施例1中所述，用氨水溶液预处理锤磨的玉米芯生物质，然后如实施例2中所述用水洗涤并且过滤以获得具有32.7％重量/重量的最终固体浓度的所得预处理过的生物质滤饼。
将所有预处理过的生物质进一步锤磨至颗粒能够通过1.1mm筛网，并且将其再悬浮于1L容量无菌塑性三角烧瓶内的蒸馏水中至270g，其具有18.6％的固体。用硫酸水溶液将所有预处理过的生物质的pH调节至5.0。然后每个烧瓶加入2.68％干固体的PEG8000，将其充分混合。向每种生物质悬浮液中加入ACCELLERASE
Figure BPA00001542482800231
1000纤维素酶与MULTIFECT
Figure BPA00001542482800232
CX12L半纤维素酶的组合混合物(纤维素∶半纤维素酶蛋白质比率为72∶28)，使得时间零点时酶总载量为3.7或11.7mg酶蛋白质/g最终悬浮液干固体。随后在4h和10h处加入额外的固体，使每个振荡烧瓶达到25干重％的最终悬浮液浓度以及300g的悬浮液总重。使糖化在55℃下进行96h，以137rpm速率旋摇。在不同的时间间隔处，取出等分试样(1mL)并且在微量离心管中以14,000rpm速率离心。如上所述测定葡萄糖和木糖单糖的浓度。结果表明，在包含高含量(25％)固体的反应中，与缺乏洗涤或缺乏PEG的样品相比，与PEG组合糖化洗涤过的氨预处理过的生物质以获得最高的木糖和葡萄糖释放(表5)。
表5
6％氨水-预处理过的未洗或水洗过的玉米芯在存在或不存在PEG8000 的情况下，以25％固体反应形式在振荡烧瓶糖化后的木糖和葡萄糖释放
  预处理过的生物质   木糖mg/mL   葡萄糖mg/mL
  氨预处理过的，120℃水洗的   19   44
  对照物，氨预处理过的   16   40
  氨预处理过的，120℃水洗+PEG   23   50
  对照物，氨预处理过的+PEG   18   43
实施例5
酶糖化前通过预处理后洗涤预处理过的生物质增加单糖的释放
如实施例1中所述，预处理锤磨的玉米芯生物质(通过3.18mm筛网)。生物质的最终固体浓度为约48％。然后将预处理过的材料按原样使用，或用两体积95％乙醇、两体积50％乙醇和两体积蒸馏水洗涤。将洗涤过的所得生物质滤饼的最终固体浓度调节至50％重量/重量。
将所有预处理过的生物质再悬浮于蒸馏水中至18.6％固体并且将pH调节至5.0。然后如实施例1中所述将预处理过的生物质糖化并且对糖进行分析，不同的是一些反应小瓶包含2.0重量％PEG8000/玉米芯干重。反应的酶载量在4-20mg总酶/g固体内变化。不同酶载量的糖化单体收率数据示于图1A和1B中。达到55％单体木糖或葡萄糖收率所需的酶载量总结于表6中。数据示出，当预处理后首先洗涤预处理过的生物质，然后在2％重量/重量PEG8000的存在下糖化时，达到55％单体木糖或葡萄糖转化率所需的酶载量降低。如果在不存在PEG8000的情况下进行预处理过的生物质的糖化，或如果在PEG8000的存在下糖化未洗涤的预处理过的生物质，则酶载量的这种降低不是那么显著。与文献中的教导相反，洗涤预处理过的生物质与PEG8000存在下糖化的组合使得单糖的释放出乎意料地高度增加。
表6
当存在或不存在PEG8000的情况下，由稀氨水预处理过的未干燥的玉 米芯获得55％收率的木糖或葡萄糖所需的糖化酶载量
Figure BPA00001542482800241
*注释-收率表示为原玉米芯中葡聚糖或木聚糖的百分比
实施例6
预处理后干燥预处理过的生物质，在较低糖化酶载量下释放出更多的 单糖
如实施例5中所述，将玉米芯生物质锤磨、预处理并且糖化。然后如实施例5中所述洗涤预处理过的材料，或不洗涤。然后将洗涤过的和未洗涤的预处理过的材料均单独地干燥至全干。然后如实施例1中所述，将所述材料糖化。不同酶载量下糖化单糖释放数据示于图2A和2B中。释放55％的单体木糖或葡萄糖所需的酶载量总结于表7中。数据表明，当预处理后干燥预处理过的生物质，然后在2％重量/重量PEG8000的存在下糖化时，达到55％的木糖或葡萄糖释放所需的酶载量显著降低。数据还示出，当将预处理过的生物质洗涤并且干燥，然后在2％重量/重量PEG8000的存在下糖化，该目的所需的酶载量进一步降低。在不存在PEG的情况下糖化洗涤过的预处理过的生物质，或在PEG的存在下糖化之前没有干燥未洗涤的预处理过的生物质，则酶载量的降低不是那么显著。与文献中的教导相反，洗涤并且干燥预处理过的生物质与PEG8000存在下糖化的组合，致使单糖的释放出乎意料地高度增加。
表7
洗涤或不洗涤情况下，由干燥过的预处理过的玉米芯达到55％单糖释 放所需的糖化酶载量
Figure BPA00001542482800251
*收率表示为原玉米芯中葡聚糖或木聚糖的百分比。
实施例5和6中示出的数据展显示，采用预处理后洗涤并且干燥与糖化期间加入表面活性剂的组合，在由氨水预处理过的生物质获得较高的单糖释放方面具有协同效应。上文所述的步骤组合使用获得的单糖释放远远超过单独实施每一步时的单糖释放。
表8示出了木糖百分比收率和葡萄糖百分比收率的改善超过基准情形，所述基准情形是在不存在PEG8000的情况下糖化的预处理过的生物质(未洗涤或干燥)。
表9示出了木糖百分比收率和葡萄糖百分比收率的改善超过相同的基准情形，所述改善通过将组合中每个单独步骤(洗涤、干燥、PEG)的改善度百分比加和计算出来，或通过提供组合的实际结果获得。所用数据来自表8。就每个组合而言，实际结果大于计算结果，从而表明三个步骤之间存在协同效应。当组合所有3个附加的洗涤、干燥和加入PEG8000步骤时，可观察到最显著的改善(木糖％改善了700％)。
值得注意的是，与葡萄糖相比，获得了较高的木糖收率，然而在上述方法后，两种单糖收率均观测到显著的改善。这些发现是非常重要的，因为这种协同效应显著降低了所需的糖化酶载量，从而允许以经济型方法从生物质获得单糖。
表8
55％木糖或葡萄糖转化率下，生物质的预处理后木糖和葡萄糖释放的改 善
Figure BPA00001542482800261
表9
各种预处理后的过程后观察到的改善。改善基于超出基线的木糖％或葡 萄糖％
 预处理后加工的方法   木糖改善％   葡萄糖改善％
 改善％加和洗涤+PEG   115.0   47.5
 实际观测的改善％洗涤+PEG   250.0   69.2
 改善％加和洗涤+干燥   390.0   214.9
 实际观测的改善％洗涤+干燥   420.0   220.0
 改善％加和干燥+PEG   285.0   187.4
  实际观测的干燥+PEG改善％   338.7   200.0
  洗涤+干燥+PEG的加和改善％   395.0   224.9
  实际观测的洗涤+干燥+PEG改善％   700.0   275.0
实施例7
采用预处理后干燥，由氨水预处理过的玉米芯生物质获得的单糖释放
在带夹套、具有气动马达搅拌、采用蒸汽和水加热与冷却的450mL不锈钢PARR
Figure BPA00001542482800271
反应器(Parr Instrument Co.，Moline，IL)中，用氨水预处理通过0.63mm筛网的锤磨玉米芯生物质，所述生物质包含35.4％的纤维素，31.1％的木聚糖，15.7％的木质素和7％的水分。反应器包含下列成分：玉米芯(46.7g)，去离子水(40.3g)和氨(8.9g)。将反应器速率调节至500rpm，并且使用下列流程：
1.载入生物质；
2.开始搅拌；
3.抽真空至约-4psig；
4.载入水；
5.载入氨；
6.加热至140℃；
7.进行20分钟；
8.冷却至约60-65℃；
9.抽真空；
10.关闭。
用1mm筛网切碎预处理过的玉米芯，并且在氮气扫气流下，在457mmHg真空和105℃的真空炉中干燥至恒重。研磨过的玉米芯示出为具有约37.1％至37.6％的重量损失。将该生物质样品(3.0g)加入到闪烁小瓶中，并且在干箱操作手套箱中与水混合至18.6重量％干燥生物质。稀释水溶液的pH为5.0。然后使用两种不同的酶浓度，糖化这些样品：
a)2.5mg SPEZYME
Figure BPA00001542482800272
/g固体和2.5mg MULTIFECT
Figure BPA00001542482800273
CX12L/g固体，共5mg/g固体
b)7.5mg SPEZYME
Figure BPA00001542482800274
/g固体和7.5mg MULTIFECT
Figure BPA00001542482800275
CX12L/g固体，共15mg/g固体。
使糖化样品在237rpm速率的55℃旋转摇动器中培养48h。在48h结束时，取出约1mL等分试样，以14,000rpm速率离心，过滤通过0.2μm过滤器，并且如上所述，采用HPLC测定它们中糖的浓度。
所得结果显示，在5mg酶/g固体的酶浓度下，干燥样品A1和A2释放出40％的葡萄糖和57％的木糖。在15mg酶/g固体的酶浓度下，样品B1和B2释放出的糖量分别为76％的葡萄糖和66％的木糖。表10示出了一式两份实施的两种酶含量下，糖化样品中葡萄糖和木糖浓度的平均值和标准偏差。该实验中所用生物质浓度的最大理论糖释放量为73mg/mL的葡萄糖和64mg/mL的木糖。这些实验期间观测到的平均糖收率示出于表11中，其示出了至多接近理论水平的糖释放量。
表10
预处理后加工和糖化后由玉米芯释放的葡萄糖、纤维二糖和木糖
Figure BPA00001542482800281
表11
两种酶含量下观测到的葡萄糖和木糖释放的平均值％
  酶含量(mg/g固体)   葡萄糖   木糖
  5   36.47％   56.56％
  15   75.97％   65.57％
实施例8
当在氨水预处理之后，酶糖化之前，干燥蔗渣时单糖释放增加
切碎通过0.3mm筛网的蔗渣具有约40重量％干燥生物质的含水量。向实施例1中的反应器中加入13.06g该生物质。实施氮气加压吹扫以移除生物质中夹带的任何空气并且使反应器以220rpm速率搅拌。然后将去离子水(14.33g)加入到反应器中，接着加入3.0g氨。在109分钟预处理过程期间，使用流动通过反应器夹套的蒸汽而将反应器加热至120℃恒温。预处理结束时，使反应器冷却，抽空几分钟并且用氮气吹扫约一分钟。所得的预处理过的生物质产量为26.24g。
在纯氮气下，在105℃和457mmHg真空压力的真空炉中，将预处理过的生物质样品(10.0g)干燥至恒重。该生物质的含水量为31.44％。如实施例7中所述进行糖化，不同的是使用不同量的SPEZYME
Figure BPA00001542482800291
、MULTIFECTCX12L和Novozyme 188酶混合物，如表12中所列。表12列出了该实验的结果。根据上文所述方法干燥样品EX8-A1和EX8-A2，而样品EX8-B1未干燥。与两种干燥样品相比，尽管湿样品(EX8-B1)具有较高的以mg/g干固体表示的酶总载量，但是获得的葡萄糖和木糖浓度较低。
表12
在干燥或不干燥预处理过的生物质情况下，蔗渣在糖化后的单糖释放
Figure BPA00001542482800293
实施例9
酶糖化前干燥预处理过的蔗渣增加了释放出的单糖量
在该预处理后的实验中使用与实施例8相同的蔗渣样品。向PARR
Figure BPA00001542482800294
反应器中加入13.02g蔗渣生物质、14.5g去离子水和3.0g氢氧化铵溶液，同时以220rpm速率搅拌。用流过夹套的蒸汽将反应器温度升至145℃，并且将预处理实施20分钟。在反应结束时，使反应器冷却，抽空几分钟并且用氮气吹扫约一分钟。该预处理方法生成26.05g预处理过的生物质。在纯氮气下，在105℃和457mmHg真空压力的真空炉中，将预处理过的生物质样品(10.24g)干燥至恒重。含水量为32.48％。如实施例8中所示，用SPEZYME
Figure BPA00001542482800301
、MULTIFECT
Figure BPA00001542482800302
CX12L和Novozyme188实施糖化反应。表13示出了糖化结果。根据上文所述方法干燥样品EX9-A1和EX9-A2，而样品EX9-B1未干燥。与两种干燥样品相比，尽管湿样品(EX9-B1)具有较高的以mg/g固体(干燥的)表示的酶总载量，但是获得的葡萄糖和木糖浓度较低。
表13
预处理和糖化后葡萄糖和木糖的收率
Figure BPA00001542482800303
实施例10
预处理过的玉米芯糖化后达到55％单糖释放所需的酶载量
通过与氨水混合生成包含30％氨每单位玉米芯干重和15％玉米芯干固体的悬浮液，将锤磨通过3.18mm筛网的玉米芯生物质预处理。将悬浮液充分混合，然后在23℃下静置保持96h。通过在布氏漏斗上真空过滤，使所得黑色液态上清液与潮湿固体分离。在23℃下用2体积95％含水乙醇、2体积50％乙醇，然后用2体积水悬浮洗涤潮湿的固体。洗涤过的所得滤饼的最终固体浓度为35％重量/重量。然后将洗涤过的滤饼和未洗涤的预处理过的生物质样品如下糖化。
将所有预处理过的材料再悬浮于蒸馏水中至18.6％固体。将所有预处理过的生物质的pH调节至5.0。然后如实施例1中所述将预处理过的生物质糖化并且对糖进行分析，不同的是一些反应小瓶包含2.0重量％PEG8000/玉米芯干重。反应的酶载量在4-20mg总酶/g固体内变化。数据示于图3中，其示出了不同酶载量下糖化后单糖的释放。达到55％单体木糖或葡萄糖收率所需的酶载量总结于表14中。即使在2％重量/重量PEG8000存在下，达到55％的木糖或葡萄糖释放度所需的酶载量为＞20mg/g固体。然而，即使没有干燥，洗涤氨预处理过的玉米芯并且糖化期间存在2％重量/重量的PEG8000，仍增加单体糖的释放。
表14
洗涤过的未干燥的预处理过的玉米芯达到55％单糖转化率所需的酶载 量(mg总酶/g固体)
Figure BPA00001542482800311
实施例11
预处理后干燥生物质显著降低释放55％单糖所需的糖化酶浓度
如实施例10中所述，将锤磨通过3.18mm筛网的玉米芯生物质预处理并且过滤。潮湿固体以它们未洗涤的状态被干燥并且按原样糖化，或在23℃下用2体积95％含水乙醇、2体积50％乙醇，然后用2体积水洗涤预处理过的生物质悬浮液。洗涤过的所得生物质滤饼的最终固体浓度为35％重量/重量。将未洗涤过的或洗涤过的生物质滤饼干燥至98％固体。
将所有预处理过的材料再悬浮于蒸馏水中至18.6％固体。将所有预处理过的生物质的pH调节至5.0。然后如实施例1中所述将预处理过的生物质糖化并且对糖进行分析，不同的是一些反应小瓶包含2.0重量％PEG8000/玉米芯干重。反应的酶载量在4-20mg总酶/g固体生物质内变化。不同酶载量下的单糖收率示于图4A和4B中。达到55％单体木糖或葡萄糖收率所需的酶载量总结于表15中。数据显示，预处理后干燥玉米芯生物质使得在2％重量/重量PEG8000存在下达到55％的木糖或葡萄糖释放所需的糖化酶载量显著降低。数据还显示，当通过洗涤和干燥预处理后的预处理过的玉米芯生物质，然后在2％重量/重量PEG8000的存在下糖化时，达到该程度的糖释放所需的糖化酶载量进一步降低。
表15
糖化前干燥的洗涤或未洗涤的预处理后的玉米芯生物质的酶需求量
Figure BPA00001542482800321

Claims (11)

1.用于由预处理过的生物质制得可发酵糖的方法，包括：
a)提供预处理过的生物质，其中所述预处理过的生物质已经经受碱预处理过程；
b)使所述预处理过的生物质经受预处理后的过程，所述过程选自洗涤、干燥以及它们的组合，从而制得预处理后的生物质；以及
c)在适当的反应条件下，使步骤(b)中的预处理后的生物质接触至少一种糖化酶以及至少一种化学添加剂以制得可发酵糖，所述化学添加剂选自烷撑二醇、天然油和非离子表面活性剂。
2.权利要求1的方法，其中在步骤(c)之前，将步骤(b)重复至少一次或多次。
3.权利要求1的方法，其中所述预处理后的过程包括洗涤，然后进行干燥。
4.权利要求3的方法，其中所述干燥通过风干或通过真空炉干燥来进行。
5.权利要求3的方法，其中重复所述洗涤然后进行干燥的过程。
6.权利要求1的方法，其中所述糖化酶是酶聚生体的一部分。
7.权利要求1的方法，其中与没有步骤(b)的预处理后的过程以及步骤(c)中的与所述一种或多种化学添加剂的接触而达到指定可发酵糖收率所需的糖化酶的量相比，达到相同可发酵糖收率所需的所述至少一种糖化酶的量显著降低。
8.权利要求1的方法，其中所述步骤(b)与(c)的组合在可发酵糖的生产中提供协同效应。
9.权利要求1的方法，其中所述烷撑二醇是具有约1000至约8000平均分子量的聚乙二醇。
10.权利要求1的方法，其中所述天然油是大豆油。
11.权利要求1或3的方法，还包括使步骤(c)中的可发酵糖与发酵性微生物接触，从而所述微生物将所述糖转化成目标产物。
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