CN102706843A - 一种具有光谱增强功能的透明生物基片的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有光谱增强功能的透明生物基片的制备方法，包括清洗、刻蚀、在玻璃基底上沉积氧化铟锡纳米薄膜三个步骤，本发明把具有优越表面等离子体性质的ITO膜材料引入到普通的光学载/盖玻片上，得到了整体透明，具有拉曼和荧光增强功能的新型生物基片，相比于不透明、易氧化失效的金属表面等离子体材料，玻璃基氧化铟锡薄膜具有整体高度透明、热稳定性好、化学惰性等优点，能从正反两面激发和采集拉曼/荧光光谱信号，对吸附的痕量有机分子探针的拉曼信号有极大的增强，对分子荧光信号也能有显著的增强。

Description

一种具有光谱增强功能的透明生物基片的制备方法
技术领域
本发明属于光谱传感技术领域，具体的说，是一种具有光谱增强功能的透明生物基片的制备方法。 
背景技术
1974年Fleischmann及其合作者最早观察到吸附在粗糙银电极表面的单层吡啶分子的高质量拉曼光谱，其中每个吸附分子的拉曼信号强度比溶液相中的吡啶分子高出6个数量级。这是一种与粗糙表面相关的表面增强效应，称为表面增强拉曼散射（SERS）。
粗糙金属表面对附近的有机分子的荧光发射也有2个数量级左右的增强，称为表面增强荧光（SEF）。金属材料的表面增强光谱功能主要来源于光激发下纳米结构金属表面形成的表面等离子体（SPs）共振。SPs本质上是由光波能量转化而来的一种电磁波，它的电磁能量高度集中在距金属表面数十纳米的空间。这种高密度的光电场使得吸附分子拉曼散射截面和非直接吸附分子荧光发射效率等显著增大。SPs的频率依赖于金属的介电函数、特定表面微结构的尺度、形状和空间配置等。金、银和铜等贵金属材料是SPs频率在可见光区的常用材料。
当前，SERS技术已经发展成为一种单分子技术，用于研究表面吸附分子详细结构和分子取向的超灵敏原位诊断。由于高灵敏度、无损及无需标记等优点，SERS技术在生物医学检测、食品安全检测以及生命科学领域得到了长足的发展。除了用于痕量检测和提高荧光器件效率外，SEF还被用于荧光显微成像技术中，突出显示生物组织细胞膜附近的信息。
迄今，生物基片的光谱增强功能层都采用贵金属金和银的纳米结构来做，其中银由于带间吸收小，其光谱增强能力比金高许多。但银表面在空气中很容易氧化，在溶液中氧化得更快，从而其光谱增强功能衰退得很快，基本上是一次性使用。而且用金和银做功能层成本高，难以大规模生产和推广。另一方面，当表面增强光谱材料用于活细胞/组织的原位观察分析时，迫切需要生物基片能是透明的，从而能采用从样品上方进行实验/光照、从样品下方显微观察的“倒置”方式，适应多数荧光显微镜的“倒置”型结构。但是金属材料都不透光，不能满足这种急需。
发明内容
发明目的：本发明的目的是利用ITO材料具有的透明和稳定性来克服SPs应用中金属材料不透光和表面易被氧化腐蚀的缺点，提出一种具有高表面增强光谱功能的透明生物基片的制作方法，该方法得到的透明生物基片可对吸附的痕量有机分子探针的拉曼信号有极大的增强，对分子荧光信号也能有显著的增强。
为了达到上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：
一种具有光谱增强功能的透明生物基片的制备方法，包括以下步骤：（1）对玻璃基底进行化学清洗：首先使用无水丙酮对光学载/盖玻片进行超声清洗8～15分钟，去除光学载/盖玻片表面上的油脂和吸附杂质；再将光学载/盖玻片放入碱性混合溶液中煮沸8～15分钟，所述的碱性混合溶液是由浓度为25%的氨水、30%的双氧水和去离子水按体积比1：1：6配制而成；煮完后用去离子水冲洗掉载/盖玻片上残留的碱性混合液；然后再将光学载/盖玻片放入酸性混合溶液中煮沸8～15分钟，酸性混合溶液是由浓度为36%的盐酸、30%的双氧水和去离子水按体积比1：1：6配制而成，煮完后用去离子水冲洗掉载/盖玻片上残留的酸性混合液并晾干；（2）在玻璃基底上沉积氧化铟锡纳米薄膜：使用脉冲激光沉积***在光学载/盖玻片的表面上沉积10～50 纳米厚的氧化铟锡薄膜，然后将光学载/盖玻片置入真空退火炉中，在温度440～470℃、真空度2×10-3～5×10-3Pa条件下退火25～35分钟使氧化铟锡薄膜结晶。
其中，在所述步骤（1）、步骤（2）之间增加刻蚀步骤：将晾干的光学载/盖玻片置于加热台上，用氟化氢蒸汽对光学载/盖玻片进行表面刻蚀并晾干。
其中，所述加热台温度为0～100℃，表面刻蚀持续时间为30秒～120秒。
其中，所述氟化氢蒸汽由浓度为40%的饱和氢氟酸在45～55℃水浴环境下自然挥发产生，氟化氢蒸汽通过PV材料管引导到加热台上的光学载/盖玻片的表面。
氧化铟锡（ITO）是一种已得到广泛应用的光电功能材料，其高导电性来自Sn原子取代In原子位置而形成的非配比氧化物结构。资料显示SnO2质量百分含量在10%左右的ITO材料电导率最高。ITO的SPs性质与贵金属材料相似并可以通过制备工艺进行大范围调节。ITO材料具有对可见光高度透明、良好的热稳定性和化学稳定性，在SPs应用方面可以克服金属材料不透光和表面易被氧化腐蚀的缺点，可望用于溶液环境下的生物实验中，实现透射式激发/照明的光谱检测、活细胞的观察与成像增强。
有益效果：（1）本发明把具有优越表面等离子体性质的ITO膜材料引入到普通的光学载/盖玻片上，得到了整体透明，具有拉曼和荧光增强功能的新型生物基片，相比于不透明、易氧化失效的金属表面等离子体材料，玻璃基氧化铟锡薄膜具有整体高度透明、热稳定性好、化学惰性等优点，能从正反两面激发和采集拉曼/荧光光谱信号，对吸附的痕量有机分子探针的拉曼信号有极大的增强，对分子荧光信号也能有显著的增强；（2）本发明提供的制备方法简单可控、原料成本低、易于工业化推广；（3）通过本发明制成的透明生物基片的光谱增强条件范围比较宽，具有普适性，可以实现对封闭或流动液体表面增强光谱信息的实时检测，以及溶液环境下活细胞荧光显微实验，实现对细胞膜附近信息的原位观察和成像；（4）通过本发明制成的透明生物基片的可重复性好，在清洗掉有机分子探针后可重复利用，适合作生物传感器。
附图说明
图1为采用氟化氢蒸汽刻蚀玻璃表面的示意图。
图2为没有刻蚀的玻璃基底上20纳米厚ITO膜对不同浓度有机分子探针拉曼谱的影响示例，与之比较的是在没有ITO膜的空白玻璃片上得到的有机分子探针拉曼谱。
图3为不同温度刻蚀后的玻璃基底上20纳米厚ITO膜对有机分子探针拉曼光谱的影响示例。
图4为不同刻蚀时间下的玻璃基底上20纳米厚ITO膜对有机分子探针拉曼光谱的影响示例。
具体实施方式：
本发明把具有优越表面等离子体性质的ITO膜材料引入到普通的光学载/盖玻片上，实现了整体透明、具有拉曼和荧光增强功能的新型生物基片。该生物基片可以从玻璃基底没有ITO膜的一侧激发和采集光谱信号或荧光图像，可用于透射式的痕量检测和荧光显微成像增强。
实施例一：
（1）对玻璃基底进行化学清洗：首先使用无水丙酮对光学载/盖玻片（国产品牌--帆船牌，型号7101）进行超声清洗10分钟，去除光学载/盖玻片表面上的油脂和吸附杂质。所有市售的无水丙酮均可在本发明中使用，下同。
再将光学载/盖玻片放入氨水、双氧水和水的碱性混合溶液中煮沸10分钟，该碱性混合溶液由浓度为25%的氨水、30%的双氧水和去离子水按体积比1：1：6配制，煮完后用去离子水冲洗掉载/盖玻片上残留的碱性清洗液。
然后再将光学载/盖玻片放入盐酸、双氧水和水的酸性混合溶液中煮沸10分钟，该酸性混合溶液由浓度为36%的盐酸、30%的双氧水和去离子水按体积比1：1：6配制，煮完后用去离子水冲洗掉载/盖玻片上残留的酸性清洗液并晾干。
（2）在玻璃基底上沉积氧化铟锡纳米薄膜：将晾干后的光学载/盖玻片装入脉冲激光沉积***的样品台上，用氟化氪激光烧蚀ITO靶在光学载/盖玻片的表面上沉积20纳米厚的ITO膜，然后将光学载/盖玻片置入真空退火炉中，在450℃、2×10-3Pa左右的真空状态下退火30分钟使氧化铟锡膜结晶。
为了检测该生物基片的光谱增强功能，用微量注射器将8 μL低浓度有机分子探针溶液滴加到ITO膜上，待溶剂挥发后检测该生物基片对分子探针的拉曼/荧光光谱信号的影响。
图2为通过实施例一得到的生物基片ITO膜对四种不同浓度的有机分子探针拉曼谱的影响示例，与之比较的是在没有ITO膜的空白载玻片上得到的有机分子探针的拉曼谱。图中所示，曲线1、2、3、4分别为是浓度为3.3×10-7M、1.0×10-6M、3.3×10-6M、1.0×10-5M的有机分子探针在实施例一所得的生物基片上的拉曼谱，M即mol/L；曲线5是浓度为1.0×10-5M有机分子探针在没有ITO膜的空白载玻片上得到的拉曼谱，为便于比较，曲线5的显示强度只有原来的1/15。拉曼谱均采用从玻璃基底没有ITO膜的一侧激发和采集信号。
图2显示，在沉积有20纳米ITO膜的载玻片上，3.3×10-7M浓度下已经可以检测到有机分子探针的拉曼信号，并且拉曼信号随分子浓度提高而增强（插图是位于612cm-1的拉曼线强度随浓度的变化）。相比之下，空白载玻片上1.0×10-5M浓度下仍然检测不到有机分子探针拉曼信号。和粗糙金属表面相似，ITO膜引起的拉曼信号的极大增强主要来自于局域化表面等离子体的近场效应。ITO膜的表面粗糙度由普通商用光学载玻片表面自然存在的亚微米级以下的表面粗糙度提供。从图2还可以看出，这种较低表面粗糙度的ITO膜对有机分子探针的荧光信号有很大程度的淬灭，淬灭的原因在于直接吸附的有机分子与ITO膜之间存在超快非辐射复合通道，这和金属对直接吸附分子的荧光淬灭作用是相同的。
实施例二：
（1）对玻璃基底进行化学清洗：首先使用无水丙酮对光学载/盖玻片（国产品牌--帆船牌，型号7101）进行超声清洗15分钟，去除光学载/盖玻片表面上的油脂和吸附杂质。
再将光学载/盖玻片放入氨水、双氧水和水的碱性混合溶液中煮沸14分钟，该碱性混合溶液由浓度为25%的氨水、30%的双氧水和去离子水按体积比1：1：6配制，煮完后用去离子水冲洗掉载/盖玻片上残留的碱性清洗液。
然后再将光学载/盖玻片放入盐酸、双氧水和水的酸性混合溶液中煮沸9分钟，该酸性混合溶液由浓度为36%的盐酸、30%的双氧水和去离子水按体积比1：1：6配制，煮完后用去离子水冲洗掉载/盖玻片上残留的酸性清洗液并晾干。
（2）刻蚀步骤：对玻璃基底进行表面刻蚀：将晾干的光学载/盖玻片置于加热台上，用氟化氢蒸汽对光学载/盖玻片进行表面刻蚀并晾干。所用氟化氢蒸汽由浓度为40%的饱和氢氟酸在55℃水浴环境下自然挥发产生，并通过PV材料管引导到加热台上的光学载/盖玻片的表面。加热台温度为10℃，表面刻蚀持续时间为100秒。
图1为采用氟化氢蒸汽刻蚀光学载/盖玻片表面的示意图。
（3）在玻璃基底上沉积氧化铟锡纳米薄膜：将晾干后的光学载/盖玻片装入脉冲激光沉积***的样品台上，用氟化氪激光烧蚀ITO靶在光学载/盖玻片的表面上沉积40纳米厚的ITO膜，然后将光学载/盖玻片置入真空退火炉中，在470℃、4×10-3Pa左右的真空状态下退火35分钟使氧化铟锡膜结晶。
实施例三：
（1）对玻璃基底进行化学清洗：首先使用无水丙酮对光学载/盖玻片（国产品牌--帆船牌，型号7101）进行超声清洗8分钟，去除光学载/盖玻片表面上的油脂和吸附杂质。
再将光学载/盖玻片放入氨水、双氧水和水的碱性混合溶液中煮沸15分钟，该碱性混合溶液由浓度为25%的氨水、30%的双氧水和去离子水按体积比1：1：6配制，煮完后用去离子水冲洗掉载/盖玻片上残留的碱性清洗液。
然后再将光学载/盖玻片放入盐酸、双氧水和水的酸性混合溶液中煮沸15分钟，该酸性混合溶液由浓度为36%的盐酸、30%的双氧水和去离子水按体积比1：1：6配制，煮完后用去离子水冲洗掉载/盖玻片上残留的酸性清洗液并晾干。
（2）刻蚀步骤：对玻璃基底进行表面刻蚀：将晾干的光学载/盖玻片置于加热台上，用氟化氢蒸汽对光学载/盖玻片进行表面刻蚀并晾干。所用氟化氢蒸汽由浓度为40%的饱和氢氟酸在45℃水浴环境下自然挥发产生，并通过PV材料管引导到加热台上的光学载/盖玻片的表面。加热台温度为100℃，表面刻蚀持续时间为30秒。
（3）在玻璃基底上沉积氧化铟锡纳米薄膜：将晾干后的光学载/盖玻片装入脉冲激光沉积***的样品台上，用氟化氪激光烧蚀ITO靶在光学载/盖玻片的表面上沉积10纳米厚的ITO膜，然后将光学载/盖玻片置入真空退火炉中，在450℃、5×10-3Pa左右的真空状态下退火25分钟使氧化铟锡膜结晶。
实施例四
（1）对玻璃基底进行化学清洗：首先使用无水丙酮对光学载/盖玻片（国产品牌--帆船牌，型号7101）进行超声清洗10分钟，去除光学载/盖玻片表面上的油脂和吸附杂质。
再将光学载/盖玻片放入氨水、双氧水和水的碱性混合溶液中煮沸10分钟，该碱性混合溶液由浓度为25%的氨水、30%的双氧水和去离子水按体积比1：1：6配制，煮完后用去离子水冲洗掉载/盖玻片上残留的碱性清洗液。
然后再将光学载/盖玻片放入盐酸、双氧水和水的酸性混合溶液中煮沸10分钟，该酸性混合溶液由浓度为36%的盐酸、30%的双氧水和去离子水按体积比1：1：6配制，煮完后用去离子水冲洗掉载/盖玻片上残留的酸性清洗液并晾干。
（2）刻蚀：对玻璃基底进行表面刻蚀：将晾干的光学载/盖玻片置于加热台上，用氟化氢蒸汽对光学载/盖玻片进行表面刻蚀并晾干。所用氟化氢蒸汽由浓度为40%的饱和氢氟酸在50℃水浴环境下自然挥发产生，并通过PV材料管引导到加热台上的光学载/盖玻片的表面。加热台温度为3℃，表面刻蚀持续时间为1分钟。
（3）在玻璃基底上沉积氧化铟锡纳米薄膜：将晾干后的光学载/盖玻片装入脉冲激光沉积***的样品台上，用氟化氪激光烧蚀ITO靶在光学载/盖玻片的表面上沉积20纳米厚的ITO膜，然后将光学载/盖玻片置入真空退火炉中，在450℃、2×10-3Pa左右的真空状态下退火30分钟使氧化铟锡膜结晶。
实施例五
该实施例与实施例四的唯一区别在于：加热台温度为30℃。
实施例六
该实施例与实施例四的唯一区别在于：加热台温度为60℃。
实施例七
该实施例与实施例四的唯一区别在于：加热台温度为90℃。
为了检测通过实施例四、五、六和七得到的四种生物基片的光谱增强功能，分别用微量注射器将8 μL浓度为3.3×10-6M的有机分子探针溶液滴加到四种生物基片的ITO膜上，待溶剂挥发后分别检测四种生物基片对分子探针的拉曼/荧光信号的影响。如图3所示，拉曼光谱均采用从玻璃基底没有ITO膜的一侧激发和采集信号。实施例四、五、六和七利用氟化氢蒸汽对光学载/盖玻片进行表面刻蚀，获得了比较大的表面粗糙度，从而影响到ITO膜的表面结构。
图3中，曲线1、2、3、4分别表示刻蚀温度为3℃、30℃、60℃和90℃时，制作出来的基片，滴加了浓度为3.3×10-6M的有机分子探针以后的拉曼/荧光信号图。
从图3来看，当刻蚀时间在1分钟时，不同刻蚀温度下，有机分子探针的拉曼信号强度与实施例一未刻蚀的样品相差不多，但分子探针的荧光已经没有淬灭。低温刻蚀的样品，分子荧光信号略强。拉曼信号增强的机制，仍在于局域化表面等离子体的近场效应。荧光无淬灭，说明有一部分有机分子不是直接吸附ITO膜上的。由于所沉积的ITO膜只有20纳米，当玻璃基底表面粗糙度较大时，ITO膜开始变得不连续，有一部分有机分子沉积在ITO膜裂开的空隙中。当空隙较小时，表面等离子体的近场效应仍然起作用，但分子与ITO膜之间的非辐射复合通道受到抑制，表现出荧光不淬灭。
实施例八
该实施例与实施例四的唯一区别在于：表面刻蚀持续时间为30秒。
实施例九
该实施例与实施例四的唯一区别在于：表面刻蚀持续时间为60秒。
实施例十
该实施例与实施例四的唯一区别在于：表面刻蚀持续时间为90秒。
实施例十一
该实施例与实施例四的唯一区别在于：表面刻蚀持续时间为120秒。
为了检测通过实施例八、九、十和十一得到的四种生物基片的光谱增强功能，分别用微量注射器将8 μL浓度为3.3×10-6M的有机分子探针溶液滴加到四种生物基片的ITO膜上，待溶剂挥发后分别检测四种生物基片对分子探针的拉曼光谱信号的影响。图4中，曲线1、2、3、4分别表示刻蚀时间为30秒、60秒、90秒和120秒时，制造出来的基片，滴加了浓度为3.3×10-6M的有机分子探针溶液以后的拉曼光谱；曲线5是空白玻璃片上滴加相同浓度有机分子探针溶液后的拉曼光谱。
如图4所示，实施例八、九、十和十一利用氟化氢蒸汽对光学载/盖玻片在3℃下进行不同时间的表面刻蚀，沉积的ITO膜对有机分子探针的荧光相比于空白载玻片有所增强，并且在所考察的时间范围内，刻蚀时间越长，相应的分子探针荧光信号越强。拉曼信号仍然存在，不过对于刻蚀时间长的样品，拉曼信号已经淹没在强的荧光背景下。刻蚀时间越长，表面粗糙度越大，厚度只有20纳米的ITO膜会变得更加不连续，形成相对孤立的ITO岛屿，有更多的有机分子沉积在岛屿之间的空隙里，分子和ITO岛屿之间的非辐射复合通道受到进一步抑制，空隙中的有机分子的激发态电子只能以辐射复合（即荧光）的形式回到基态，在ITO局域表面等离子体近场效应作用下表现出荧光增强。
综上所述，本发明利用普通光学载/盖玻片表面自然的起伏实现了氧化铟锡薄膜拉曼散射增强所需要的表面粗糙度，对吸附的痕量有机分子探针拉曼信号产生了极大的增强。而且本发明还利用氟化氢蒸汽对载/盖玻片进行表面刻蚀，进而获得氧化铟锡薄膜产生荧光增强所需要的具有较大粗糙度的表面结构，检测到有机分子探针荧光信号有显著增强，拉曼信号仍有大的增强。光学载/盖玻片的表面粗糙度可以通过刻蚀温度和刻蚀时间来控制。在本发明所提供的条件范围内，刻蚀温度低、刻蚀时间长时表面粗糙度较大，获得的分子探针荧光信号也越强。

Claims (4)

1. 一种具有光谱增强功能的透明生物基片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）对玻璃基底进行化学清洗：首先使用无水丙酮对光学载/盖玻片进行超声清洗8～15分钟，去除光学载/盖玻片表面上的油脂和吸附杂质；再将光学载/盖玻片放入碱性混合溶液中煮沸8～15分钟，所述的碱性混合溶液是由浓度为25%的氨水、30%的双氧水和去离子水按体积比1：1：6配制而成；煮完后用去离子水冲洗掉载/盖玻片上残留的碱性混合液；然后再将光学载/盖玻片放入酸性混合溶液中煮沸8～15分钟，酸性混合溶液是由浓度为36%的盐酸、30%的双氧水和去离子水按体积比1：1：6配制而成，煮完后用去离子水冲洗掉载/盖玻片上残留的酸性混合液并晾干；
（2）在玻璃基底上沉积氧化铟锡纳米薄膜：使用脉冲激光沉积***在光学载/盖玻片的表面上沉积10～50 纳米厚的氧化铟锡薄膜，然后将光学载/盖玻片置入真空退火炉中，在温度440～470℃、真空度2×10-3～5×10-3Pa条件下退火25～35分钟使氧化铟锡薄膜结晶。
2. 根据权利要求1所述的一种具有光谱增强功能的透明生物基片的制备方法，其特征在于：在所述步骤（1）、步骤（2）之间增加刻蚀步骤：将晾干的光学载/盖玻片置于加热台上，用氟化氢蒸汽对光学载/盖玻片进行表面刻蚀并晾干。
3. 根据权利要求2所述的一种具有光谱增强功能的透明生物基片的制备方法，其特征在于：所述加热台温度为0～100℃，表面刻蚀持续时间为30秒～120秒。
4. 根据权利要求2或3所述的一种具有光谱增强功能的透明生物基片的制备方法，其特征在于：所述氟化氢蒸汽由浓度为40%的饱和氢氟酸在45～55℃水浴环境下自然挥发产生，氟化氢蒸汽通过PV材料管引导到加热台上的光学载/盖玻片的表面。
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