CN102702283B - 一种快速分离制备高纯度脱氧土大黄苷和土大黄苷的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种快速分离制备高纯度脱氧土大黄苷和土大黄苷的方法，该方法包括以下步骤：⑴取野生或栽培大黄植物的干燥根或根茎经切割或粉碎后，得到提取原料；⑵对提取原料进行醇提、干燥得到提取物；⑶将甲醇、水、正丁醇、氯仿四种溶剂混合经振摇、静置分层，收集上相溶剂和下相溶剂；上相溶剂和下相溶剂经超声得到固定相、流动相；⑷在流动相中溶解提取物，得到进样溶液；⑸向高速逆流色谱仪器的分离管中依次泵入固定相、流动相，并将进样溶液注入高速逆流色谱仪器的进样圈中；⑹收集70~100min时间段的流出液A，并将其干燥即得脱氧土大黄苷；⑺分离管反向转动；⑻收集400~450min时间段的流出液B，并将其干燥即得土大黄苷。本发明操作简单、易于工业化生产。

Description

一种快速分离制备高纯度脱氧土大黄苷和土大黄苷的方法

技术领域

本发明涉及一种从植物中分离制备高纯度药效成分的方法，尤其涉及一种快速分离制备高纯度脱氧土大黄苷和土大黄苷的方法。

背景技术

大黄作为我国著名的传统中药材，其药用记载始见于《神农本草经》，列为下品，具有“泻下通便，破积滞”之功效。在传统的中医药应用中，大黄植物的药用范围非常单一，主要偏重其泻下的功效。现代研究证明了大黄泻下功效作用的主要物质基础成分是蒽醌类成分。因此，蒽醌类化合物被认定为是大黄药材的传统成药化合物，是世界各国用于评价大黄药材品质优劣及其相关产品质量的主要指标。（许义杵,大黄的应用及其机理研究进展,中国医院药学杂志,1992,12(9): 421-422。）

然而，多年来对于大黄植物的研究与开发利用更多的集中在了对于药典收载的“正品”大黄及其所含的蒽醌类成分和其相应的药效活性功能上；但是药典收载之外的大黄属的其它40余种“非正品”大黄并未得到充分的重视和合理的利用。“非正品”大黄由于不含或仅含痕量的蒽醌类成分，因此其泻下药效作用很弱或全无，但是这些资源丰富的“非正品”大黄在民间医疗中通常与“正品”大黄混淆使用，并且在药材市场中掺杂或冒充“正品”大黄混乱销售的现象十分严重(李秀才,大黄的研究进展,中国药学杂志,1998,33(10):581-584。)

近几年研究新发现，“非正品”大黄中的主含成分——土大黄苷和脱氧土大黄苷，具有多种显著的药效活性，例如降血糖（Li JM,脱氧土大黄苷抑制肠道和肾脏的葡萄糖摄取:在体外和体内研究,药理实验疗法(美国), 2007,320:38-46。）；降血脂（Tadashi K,从大黄植物中发现的天然脂多糖抑制剂,生物有机与药物化学(美国),2001,9:1887-1893。）；抗肿瘤(Lee SH,脱氧土大黄苷对人白血病HL-60细胞凋亡的诱导,植物药(德国),2002.68: 123-127。)等。由于脱氧土大黄苷土大黄苷和相关药理临床研究及其制剂产品开发的逐渐兴起，使得对于高纯度脱氧土大黄苷和土大黄苷的需求迅速增大，因此，研究确定从大黄植物中快速分离制备高纯度脱氧土大黄苷和土大黄苷的方法具有重要的现实意义。

经检索发现，公开号为CN101244129A的中国专利公开了应用聚酰胺树脂分离制备脱氧土大黄苷的方法。又如，公开号为CN101475613A的中国专利公开了应用大孔吸附树脂分离制备土大黄苷的方法。但是，由于无法避免的树脂残留物、树脂原料安全性隐患等问题，国家药监局已经对应用于保健食品的利用吸附树脂分离纯化的生产工艺作出了相应的限制和规定(国食药监注[2005]202号)。因此，上述专利方法和文献中的传统柱层析等方法在医药及保健食品工业中的实际生产应用方面具有一定的局限性；并且，现有的专利和文献方法还存在着步骤繁琐、效率较低、操作复杂、产品纯度不高等诸多缺陷。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单、易于工业化生产的快速分离制备高纯度脱氧土大黄苷和土大黄苷的方法。

为解决上述问题，本发明所述的一种快速分离制备高纯度脱氧土大黄苷和土大黄苷的方法，包括以下步骤：

⑴取野生或栽培大黄植物的干燥根或根茎经切割或粉碎后，得到提取原料；

⑵按1：1~1：30的料液质量体积比向所述提取原料中加入质量浓度为40%~98%的乙醇溶液，并置于10~90℃温度下提取0.5~24小时，提取次数为1~4次，收集合并提取液得到粗提液；所述粗提液经减压浓缩干燥或喷雾干燥至恒重，得到提取物；

⑶将甲醇、水、正丁醇、氯仿四种溶剂按1~2.7：1~4.3：0.5~1.5：1~3.8的体积比混合并充分振摇后，在室温下静置至混合溶液自然分层，然后分别收集上相溶剂和下相溶剂；所述上相溶剂和下相溶剂分别超声5~20分钟，分别得到上相溶剂作为固定相，下相溶剂作为流动相；

⑷以50~200mL所述流动相溶解0.5~5g所述提取物，得到进样溶液；

⑸向高速逆流色谱仪器的分离管中泵入所述固定相，同时使所述分离管按正向转动并保持转速为350~550 rpm，至所述分离管出口端有所述固定相溢出时，替换成用所述流动相以10~30mL/min的流速泵入所述分离管，至所述分离管出口端有所述流动相溢出时，将所述进样溶液注入所述高速逆流色谱仪器的进样圈中，同时保持所述流动相泵入的流速持续不变；

⑹当所述高速逆流色谱仪器按所述步骤⑸所述方法运转到70~100min时，收集此时间段的流出液A；将该流出液A按常规方法干燥至恒重，即得脱氧土大黄苷；

⑺当所述高速逆流色谱仪器按所述步骤⑸所述方法运转到120~320min时，替换成使所述分离管以相同转速按反向转动，并保持所述流动相泵入的流速持续不变；

⑻当所述高速逆流色谱仪器按所述步骤⑺所述方法运转到400~450min时，收集此时间段的流出液B；将该流出液B按常规方法干燥至恒重，即得土大黄苷。

所述步骤⑴中大黄是指属于“非正品”大黄的天山大黄、波叶大黄、河套大黄、拉萨大黄、华北大黄、圆叶大黄、藏边大黄中的一种。

所述步骤⑴中干燥根或根茎采用切割方式获得的提取原料为2~5 mm的切片。

所述步骤⑴中干燥根或根茎采用破碎方式获得的提取原料为10~80目的粉末。

所述步骤⑵中减压浓缩干燥的条件是指温度为30~50℃、抽真空到负压为0.01~0.1MPa。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明应用高速逆流色谱仪器从大黄中分离制备的两种物质分别经全波长扫描分析（Agilent DAD检测器，200~400nm），结果表明，所得两种物质均具有二苯乙烯骨架结构的特征性紫外吸收峰，脱氧土大黄苷的最大吸收波长为320 nm和217 nm（参见图1）；土大黄苷的最大吸收波长为323 nm和221 nm（参见图2）。同时，本发明所得两种物质分别经¹H-NMR and ¹³C-NMR（INOVA 400MHz核磁共振仪）进一步分析鉴定表明，这两种物质化学结构明确（参见表1、表2）。

表1 脱氧土大黄苷的化学结构核磁共振数据

表2  土大黄苷的化学结构核磁共振数据

2、本发明从大黄中分离制备的两种物质分别经HPLC分析检测（Agilent1200高效液相色谱仪；C₁₈反相色谱柱；甲醇-乙腈-水三元梯度洗脱；检测波长320 nm），结果表明，脱氧土大黄苷（参见图3，色谱保留时间28.2 min）的纯度可达到98.2%；土大黄苷（参见图4，色谱保留时间10.3 min）的纯度可达到95.3%。由此可知，按本发明的分离制备方法从大黄中所得两种物质的纯度高，并且分析检测方法成熟，有利于产品的质量控制，符合天然药物及保健食品制剂的发展方向及要求。

3、本发明应用高速逆流色谱设备从大黄中分离制备脱氧土大黄苷和土大黄苷的方法操作简便、自动化程度高；分离制备过程无任何固相载体基质作为柱材料，因而避免了柱材料钝化、样品死吸附、柱材料残留污染等问题；制备生产过程可实现在线监控并根据需要收集不同纯度的产品、产品最高纯度可大于98%；生产周期缩短至450分钟（参见图5）、每个生产周期制备量较高；完全能适用于规模化批量生产。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为本发明分离制备的脱氧土大黄苷的全波长扫描图（320nm处的最大吸收峰特征性的表明所制备的物质具有脱氧土大黄苷的骨架结构）。

图2为本发明分离制备的土大黄苷的全波长扫描图（323nm处的最大吸收峰特征性的表明所制备的物质具有土大黄苷的骨架结构）。

图3为本发明分离制备的脱氧土大黄苷的高效液相色谱分析图（保留时间28.2 min，纯度98.2%）。

图4为本发明分离制备的土大黄苷的高效液相色谱分析图（保留时间10.3 min，纯度95.3%）。

图5为本发明应用高速逆流色谱设备从大黄中分离制备脱氧土大黄苷和土大黄苷的一个生产周期的分离制备图谱（峰1为脱氧土大黄苷，峰2为土大黄苷，生产周期为450分钟）。

具体实施方式

实施例1   一种快速分离制备高纯度脱氧土大黄苷和土大黄苷的方法，包括以下步骤：

⑴称取栽培华北大黄的干燥根50g，切割成5 mm的切片，得到提取原料。

⑵向提取原料中加入250mL的质量浓度为80%的乙醇溶液，并置于国华电器有限公司生产的HH-4型恒温水浴锅中经40℃加热回流提取4小时，提取次数为2次，收集合并提取液得到粗提液；粗提液采用瑞士步琪BUCHI实验室技术有限公司生产的R-114型旋转蒸发仪于50℃、抽真空到负压为0.01MPa条件下减压浓缩干燥至恒重，得到16g提取物。

⑶将甲醇、水、正丁醇、氯仿四种溶剂按2.7：1：1.5：2.6的体积比（mL/mL）混合并充分振摇后，在室温下静置至混合溶液自然分层，然后分别收集上相溶剂和下相溶剂；上相溶剂和下相溶剂分别用昆山市超声仪器公司生产的KQ-100DE型数控超声器超声10分钟，分别得到上相溶剂作为固定相，下相溶剂作为流动相。

⑷以200mL流动相溶解5g提取物，得到进样溶液。

⑸向上海同田生物技术有限公司生产的TBE-5000A高速逆流色谱仪器的分离管中泵入固定相，同时使分离管按正向转动并保持转速为500 rpm，至分离管出口端有固定相溢出时，替换成用流动相以30mL/min的流速泵入分离管，至分离管出口端有流动相溢出时，将进样溶液注入高速逆流色谱仪器的进样圈中，同时保持流动相泵入的流速持续不变。

⑹当高速逆流色谱仪器按步骤⑸方法运转到80~90min时，收集此时间段的流出液A；将该流出液A按常规方法干燥至恒重，即得80mg脱氧土大黄苷，其纯度经高效液相色谱检验达到98%。

⑺当高速逆流色谱仪器按步骤⑸方法运转到250min时，替换成使分离管以相同转速按反向转动，并保持流动相泵入的流速持续不变。

⑻当高速逆流色谱仪器按步骤⑺方法运转到425~435min时，收集此时间段的流出液B；将该流出液B按常规方法干燥至恒重，即得140mg土大黄苷，其纯度经高效液相色谱检验达到95%。

实施例2   一种快速分离制备高纯度脱氧土大黄苷和土大黄苷的方法，包括以下步骤：

⑴称取栽培河套大黄的干燥根50g，应用北京科伟永兴仪器有限公司生产的高速万能粉碎机粉碎成80目的粉末，得到提取原料。

⑵向提取原料中加入750mL的质量浓度为40%的乙醇溶液，并置于天津华延园机械有限公司生产的HYR型自动煎药机中经90℃加热回流提取3小时，提取次数为3次，收集合并提取液得到粗提液；粗提液采用瑞士步琪BUCHI实验室技术有限公司生产的R-114型旋转蒸发仪于30℃、抽真空到负压为0.1MPa条件下减压浓缩干燥至恒重，得到21g提取物。

⑶将甲醇、水、正丁醇、氯仿四种溶剂按1：4.0：0.8：3.0的体积比（mL/mL）混合并充分振摇后，在室温下静置至混合溶液自然分层，然后分别收集上相溶剂和下相溶剂；上相溶剂和下相溶剂分别用昆山市超声仪器公司生产的KQ-100DE型数控超声器超声5分钟，分别得到上相溶剂作为固定相，下相溶剂作为流动相。

⑷以180mL流动相溶解2.5g提取物，得到进样溶液。

⑸向上海同田生物技术有限公司生产的TBE-5000A高速逆流色谱仪器的分离管中泵入固定相，同时使分离管按正向转动并保持转速为550 rpm，至分离管出口端有固定相溢出时，替换成用流动相以25mL/min的流速泵入分离管，至分离管出口端有流动相溢出时，将进样溶液注入高速逆流色谱仪器的进样圈中，同时保持流动相泵入的流速持续不变。

⑹当高速逆流色谱仪器按步骤⑸方法运转到70~80min时，收集此时间段的流出液A；将该流出液A按常规方法干燥至恒重，即得95mg脱氧土大黄苷，其纯度经高效液相色谱检验达到80%。

⑺当高速逆流色谱仪器按步骤⑸方法运转到120min时，替换成使分离管以相同转速按反向转动，并保持流动相泵入的流速持续不变。

⑻当高速逆流色谱仪器按步骤⑺方法运转到410~420min时，收集此时间段的流出液B；将该流出液B按常规方法干燥至恒重，即得152mg土大黄苷，其纯度经高效液相色谱检验达到90%。

实施例3   一种快速分离制备高纯度脱氧土大黄苷和土大黄苷的方法，包括以下步骤：

⑴称取野生藏边大黄的干燥根50g，应用北京科伟永兴仪器有限公司生产的高速万能粉碎机粉碎成10目的粉末，得到提取原料。

⑵向提取原料中加入550mL的质量浓度为50%的乙醇溶液，并置于天津华延园机械有限公司生产的HYR型自动煎药机中经70℃加热回流提取0.5小时，提取次数为4次，收集合并提取液得到粗提液；粗提液采用瑞士步琪BUCHI实验室技术有限公司生产的R-114型旋转蒸发仪于45℃、抽真空到负压为0.05MPa条件下减压浓缩干燥至恒重，得到20g提取物。

⑶将甲醇、水、正丁醇、氯仿四种溶剂按1.5：3.5：0.5：3.8的体积比（mL/mL）混合并充分振摇后，在室温下静置至混合溶液自然分层，然后分别收集上相溶剂和下相溶剂；上相溶剂和下相溶剂分别用昆山市超声仪器公司生产的KQ-100DE型数控超声器超声15分钟，分别得到上相溶剂作为固定相，下相溶剂作为流动相。

⑷以150mL流动相溶解1.0g提取物，得到进样溶液。

⑸向上海同田生物技术有限公司生产的TBE-5000A高速逆流色谱仪器的分离管中泵入固定相，同时使分离管按正向转动并保持转速为400 rpm，至分离管出口端有固定相溢出时，替换成用流动相以10mL/min的流速泵入分离管，至分离管出口端有流动相溢出时，将进样溶液注入高速逆流色谱仪器的进样圈中，同时保持流动相泵入的流速持续不变。

⑹当高速逆流色谱仪器按步骤⑸方法运转到75~85min时，收集此时间段的流出液A；将该流出液A按常规方法干燥至恒重，即得90mg脱氧土大黄苷，其纯度经高效液相色谱检验达到90%。

⑺当高速逆流色谱仪器按步骤⑸方法运转到200min时，替换成使分离管以相同转速按反向转动，并保持流动相泵入的流速持续不变。

⑻当高速逆流色谱仪器按步骤⑺方法运转到400~410min时，收集此时间段的流出液B；将该流出液B按常规方法干燥至恒重，即得150mg土大黄苷，其纯度经高效液相色谱检验达到85%。

实施例4   一种快速分离制备高纯度脱氧土大黄苷和土大黄苷的方法，包括以下步骤：

⑴称取栽培圆叶大黄的干燥根50g，切割成2mm的切片，得到提取原料。

⑵向提取原料中加入50mL的质量浓度为98%的乙醇溶液，并置于国华电器有限公司生产的HH-4型恒温水浴锅中经60℃加热回流提取10小时，提取次数为1，收集提取液得到粗提液；粗提液采用瑞士步琪BUCHI实验室技术有限公司生产的R-114型旋转蒸发仪于50℃、抽真空到负压为0.01MPa条件下减压浓缩干燥至恒重，得到18g提取物。

⑶将甲醇、水、正丁醇、氯仿四种溶剂按1：4.3：1.0：1.5的体积比（mL/mL）混合并充分振摇后，在室温下静置至混合溶液自然分层，然后分别收集上相溶剂和下相溶剂；上相溶剂和下相溶剂分别用昆山市超声仪器公司生产的KQ-100DE型数控超声器超声20分钟，分别得到上相溶剂作为固定相，下相溶剂作为流动相。

⑷以50mL流动相溶解0.5g提取物，得到进样溶液。

⑸向上海同田生物技术有限公司生产的TBE-5000A高速逆流色谱仪器的分离管中泵入固定相，同时使分离管按正向转动并保持转速为350 rpm，至分离管出口端有固定相溢出时，替换成用流动相以15mL/min的流速泵入分离管，至分离管出口端有流动相溢出时，将进样溶液注入高速逆流色谱仪器的进样圈中，同时保持流动相泵入的流速持续不变。

⑹当高速逆流色谱仪器按步骤⑸方法运转到90~100min时，收集此时间段的流出液A；将该流出液A按常规方法干燥至恒重，即得72mg脱氧土大黄苷，其纯度经高效液相色谱检验达到85%。

⑺当高速逆流色谱仪器按步骤⑸方法运转到300min时，替换成使分离管以相同转速按反向转动，并保持流动相泵入的流速持续不变。

⑻当高速逆流色谱仪器按步骤⑺方法运转到425~430min时，收集此时间段的流出液B；将该流出液B按常规方法干燥至恒重，即得121mg土大黄苷，其纯度经高效液相色谱检验达到98%。

实施例5  一种快速分离制备高纯度脱氧土大黄苷和土大黄苷的方法，包括以下步骤：

⑴称取野生波叶大黄的干燥根50g，应用北京科伟永兴仪器有限公司生产的高速万能粉碎机粉碎成60目的粉末，得到提取原料。

⑵向提取原料中加入1500mL的质量浓度为70%的乙醇溶液，并置于天津华延园机械有限公司生产的HYR型自动煎药机中经10℃加热回流提取24小时，提取次数为1次，收集提取液得到粗提液；粗提液采用瑞士步琪BUCHI实验室技术有限公司生产的R-114型旋转蒸发仪于35℃、抽真空到负压为0.1MPa条件下减压浓缩干燥至恒重，得到19g提取物。

⑶将甲醇、水、正丁醇、氯仿四种溶剂按2.0：2.3：1.2：1.0的体积比（mL/mL）混合并充分振摇后，在室温下静置至混合溶液自然分层，然后分别收集上相溶剂和下相溶剂；上相溶剂和下相溶剂分别用昆山市超声仪器公司生产的KQ-100DE型数控超声器超声10分钟，分别得到上相溶剂作为固定相，下相溶剂作为流动相。

⑷以100mL流动相溶解1.5g提取物，得到进样溶液。

⑸向上海同田生物技术有限公司生产的TBE-5000A高速逆流色谱仪器的分离管中泵入固定相，同时使分离管按正向转动并保持转速为450 rpm，至分离管出口端有固定相溢出时，替换成用流动相以20mL/min的流速泵入分离管，至分离管出口端有流动相溢出时，将进样溶液注入高速逆流色谱仪器的进样圈中，同时保持流动相泵入的流速持续不变。

⑹当高速逆流色谱仪器按步骤⑸方法运转到85~95min时，收集此时间段的流出液A；将该流出液A按常规方法干燥至恒重，即得89mg脱氧土大黄苷，其纯度经高效液相色谱检验达到95%。

⑺当高速逆流色谱仪器按步骤⑸方法运转到120min时，替换成使分离管以相同转速按反向转动，并保持流动相泵入的流速持续不变。

⑻当高速逆流色谱仪器按步骤⑺方法运转到430~440min时，收集此时间段的流出液B；将该流出液B按常规方法干燥至恒重，即得150mg土大黄苷，其纯度经高效液相色谱检验达到98%。

实施例6   一种快速分离制备高纯度脱氧土大黄苷和土大黄苷的方法，包括以下步骤：

⑴称取野生华北大黄的干燥根50g，切割成4mm的切片，得到提取原料。

⑵向提取原料中加入1000mL的质量浓度为60%的乙醇溶液，并置于国华电器有限公司生产的HH-4型恒温水浴锅中经50℃加热回流提取5小时，提取次数为1次，收集提取液得到粗提液；粗提液采用瑞士步琪BUCHI实验室技术有限公司生产的R-114型旋转蒸发仪于40℃、抽真空到负压为0.1MPa条件下减压浓缩干燥至恒重，得到20g提取物。

⑶将甲醇、水、正丁醇、氯仿四种溶剂按2.5：1.8：0.9：3.2的体积比（mL/mL）混合并充分振摇后，在室温下静置至混合溶液自然分层，然后分别收集上相溶剂和下相溶剂；上相溶剂和下相溶剂分别用昆山市超声仪器公司生产的KQ-100DE型数控超声器超声20分钟，分别得到上相溶剂作为固定相，下相溶剂作为流动相。

⑷以100mL流动相溶解2.0g提取物，得到进样溶液。

⑸向上海同田生物技术有限公司生产的TBE-5000A高速逆流色谱仪器的分离管中泵入固定相，同时使分离管按正向转动并保持转速为500 rpm，至分离管出口端有固定相溢出时，替换成用流动相以30mL/min的流速泵入分离管，至分离管出口端有流动相溢出时，将进样溶液注入高速逆流色谱仪器的进样圈中，同时保持流动相泵入的流速持续不变。

⑹当高速逆流色谱仪器按步骤⑸方法运转到95~100min时，收集此时间段的流出液A；将该流出液A按常规方法干燥至恒重，即得100mg脱氧土大黄苷，其纯度经高效液相色谱检验达到80%。

⑺当高速逆流色谱仪器按步骤⑸方法运转到280min时，替换成使分离管以相同转速按反向转动，并保持流动相泵入的流速持续不变。

⑻当高速逆流色谱仪器按步骤⑺方法运转到440~450min时，收集此时间段的流出液B；将该流出液B按常规方法干燥至恒重，即得150mg土大黄苷，其纯度经高效液相色谱检验达到80%。

实施例7   一种快速分离制备高纯度脱氧土大黄苷和土大黄苷的方法，包括以下步骤：

⑴称取野生天山大黄的干燥根茎50g，切割成5mm的切片，得到提取原料。

⑵向提取原料中加入400mL的质量浓度为65%的乙醇溶液，并置于国华电器有限公司生产的HH-4型恒温水浴锅中经60℃加热回流提取4小时，提取次数为2次，收集合并提取液得到粗提液；粗提液采用汇和堂生物工程设备有限公司生产的Bioq-8000型小型喷雾干燥仪干燥至恒重，得到25g提取物。

⑶将甲醇、水、正丁醇、氯仿四种溶剂按2：4：1：3的体积比（mL/mL）混合并充分振摇后，在室温下静置至混合溶液自然分层，然后分别收集上相溶剂和下相溶剂；上相溶剂和下相溶剂分别用昆山市超声仪器公司生产的KQ-100DE型数控超声器超声10分钟，分别得到上相溶剂作为固定相，下相溶剂作为流动相。

⑷以180mL流动相溶解4g提取物，得到进样溶液。

⑸向上海同田生物技术有限公司生产的TBE-5000A高速逆流色谱仪器的分离管中泵入固定相，同时使分离管按正向转动并保持转速为450 rpm，至分离管出口端有固定相溢出时，替换成用流动相以20mL/min的流速泵入分离管，至分离管出口端有流动相溢出时，将进样溶液注入高速逆流色谱仪器的进样圈中，同时保持流动相泵入的流速持续不变。

⑹当高速逆流色谱仪器按步骤⑸方法运转到75~90 min时，收集此时间段的流出液A；将该流出液A按常规方法干燥至恒重，即得100mg脱氧土大黄苷，其纯度经高效液相色谱检验达到98%。

⑺当高速逆流色谱仪器按步骤⑸方法运转到300min时，替换成使分离管以相同转速按反向转动，并保持流动相泵入的流速持续不变。

⑻当高速逆流色谱仪器按步骤⑺方法运转到420~450min时，收集此时间段的流出液B；将该流出液B按常规方法干燥至恒重，即得149mg土大黄苷，其纯度经高效液相色谱检验达到95%。

实施例8   一种快速分离制备高纯度脱氧土大黄苷和土大黄苷的方法，包括以下步骤：

⑴称取野生拉萨大黄的干燥根茎50g粉碎成40目，得到提取原料。

⑵向提取原料中加入500mL的质量浓度为75%的乙醇溶液，并置于国华电器有限公司生产的HH-4型恒温水浴锅中经55℃加热回流提取2小时，提取次数为2次，收集合并提取液得到粗提液；粗提液采用瑞士步琪BUCHI实验室技术有限公司生产的R-114型旋转蒸发仪于45℃、抽真空到负压为0.1MPa条件下减压浓缩干燥至恒重，得到19g提取物。

⑶将甲醇、水、正丁醇、氯仿四种溶剂按1：3：1：3的体积比（mL/mL）混合并充分振摇后，在室温下静置至混合溶液自然分层，然后分别收集上相溶剂和下相溶剂；上相溶剂和下相溶剂分别用昆山市超声仪器公司生产的KQ-100DE型数控超声器超声5分钟，分别得到上相溶剂作为固定相，下相溶剂作为流动相。

⑷以150mL流动相溶解5g提取物，得到进样溶液。

⑸向上海同田生物技术有限公司生产的TBE-5000A高速逆流色谱仪器的分离管中泵入固定相，同时使分离管按正向转动并保持转速为500 rpm，至分离管出口端有固定相溢出时，替换成用流动相以23mL/min的流速泵入分离管，至分离管出口端有流动相溢出时，将进样溶液注入高速逆流色谱仪器的进样圈中，同时保持流动相泵入的流速持续不变。

⑹当高速逆流色谱仪器按步骤⑸方法运转到80~95min时，收集此时间段的流出液A；将该流出液A按常规方法干燥至恒重，即得86mg脱氧土大黄苷，其纯度经高效液相色谱检验达到98%。

⑺当高速逆流色谱仪器按步骤⑸方法运转到320min时，替换成使分离管以相同转速按反向转动，并保持流动相泵入的流速持续不变。

⑻当高速逆流色谱仪器按步骤⑺方法运转到420~440min时，收集此时间段的流出液B；将该流出液B按常规方法干燥至恒重，即得143mg土大黄苷，其纯度经高效液相色谱检验达到95%。

上述实施例1~8是对本发明的进一步详细说明，但不意味着对本发明的任何限制。在不脱离本发明上述思想的情况下，根据本领域普通技术知识和常规手段作出的各种替换方式或变更，均包含在本发明之内。

Claims (1)

1.一种快速分离制备高纯度脱氧土大黄苷和土大黄苷的方法，包括以下步骤：

⑴取野生或栽培大黄植物的干燥根或根茎经切割或粉碎后，得到提取原料；

所述大黄是指属于“非正品”大黄的天山大黄、波叶大黄、河套大黄、拉萨大黄、华北大黄、圆叶大黄、藏边大黄中的一种；所述干燥根或根茎采用切割方式获得的提取原料为2~5 mm的切片；

或者所述干燥根或根茎采用破碎方式获得的提取原料为10~80目的粉末；

⑵按1：1~1：30的料液质量体积比向所述提取原料中加入质量浓度为40%~98%的乙醇溶液，并置于10~90℃温度下提取0.5~24小时，提取次数为1~4次，收集合并提取液得到粗提液；所述粗提液经减压浓缩干燥或喷雾干燥至恒重，得到提取物；所述减压浓缩干燥的条件是指温度为30~50℃、抽真空到负压为0.01~0.1MPa；

⑶将甲醇、水、正丁醇、氯仿四种溶剂按1~2.7：1~4.3：0.5~1.5：1~3.8的体积比混合并充分振摇后，在室温下静置至混合溶液自然分层，然后分别收集上相溶剂和下相溶剂；所述上相溶剂和下相溶剂分别超声5~20分钟，分别得到上相溶剂作为固定相，下相溶剂作为流动相；

⑷以50~200mL所述流动相溶解0.5~5g所述提取物，得到进样溶液；

⑸向高速逆流色谱仪器的分离管中泵入所述固定相，同时使所述分离管按正向转动并保持转速为350~550 rpm，至所述分离管出口端有所述固定相溢出时，替换成用所述流动相以10~30mL/min的流速泵入所述分离管，至所述分离管出口端有所述流动相溢出时，将所述进样溶液注入所述高速逆流色谱仪器的进样圈中，同时保持所述流动相泵入的流速持续不变；

⑹当所述高速逆流色谱仪器按所述步骤⑸所述方法运转到70~100min时，收集此时间段的流出液A；将该流出液A按常规方法干燥至恒重，即得脱氧土大黄苷；

⑺当所述高速逆流色谱仪器按所述步骤⑸所述方法运转到120~320min时，替换成使所述分离管以相同转速按反向转动，并保持所述流动相泵入的流速持续不变；

⑻当所述高速逆流色谱仪器按所述步骤⑺所述方法运转到400~450min时，收集此时间段的流出液B；将该流出液B按常规方法干燥至恒重，即得土大黄苷。