发明内容
针对现有技术存在的上述缺陷,本发明提供一种***HIV抗体抗原检测试纸,具有使用方便、操作简单、便于推广的优点。
本发明的技术方案如下:
本发明提供一种***HIV抗体抗原检测试纸,包括:吸水滤纸、硝酸纤维素膜、胶体金垫、样品垫和反应支持物;在所述反应支持物外表面上依次相互搭接粘帖所述样品垫、所述胶体金垫、所述硝酸纤维素膜和所述吸水滤纸;
并且,所述硝酸纤维素膜上自靠近所述样品垫一侧依次设置有第一条带T1、第二条带T2和质控条带C;所述第一条带T1包被P24抗原单克隆抗体,所述第二条带T2包被GP36、GP41和GP120抗原,所述质控条带C包被羊抗鼠IgG多克隆抗体;所述胶体金垫含有胶体金标记的P24抗原单克隆抗体和胶体金标记的GP36、GP41、GP120抗原混合标记物。
本发明还提供一种制备上述的***HIV抗体抗原检测试纸的方法,包括以下步骤:
(1)分别制备纯度和浓度均符合要求的P24抗原单克隆抗体、GP36抗原、GP41抗原和GP120抗原;
(2)硝酸纤维素膜的制备:将步骤(1)制得的P24抗原单克隆抗体用0.02mol/L pH=7.2的PBS稀释成1.0mg/ml,用喷膜机以1.0μl/cm的速度喷于硝酸纤维素膜上,形成第一条带T1;将步骤(1)制得的GP36抗原、GP41抗原和GP120抗原分别用0.02mol/L pH=7.2的PBS稀释成0.3mg/ml、0.6mg/ml和0.4mg/ml,用喷膜机以1.0μl/cm的速度喷于硝酸纤维素膜上,形成第二条带T2;将羊抗鼠IgG多克隆抗体用0.02mol/LpH=7.2的PBS稀释成1.0mg/ml,用喷膜机以1.0μl/cm的速度喷于硝酸纤维素膜上,形成质控条带C;
(3)胶体金垫的制备:采用最佳标记pH值为7.4至8.0、最佳标记浓度为15至18μg/ml的标记条件制得胶体金标记的P24抗原单克隆抗体;分别采用最佳标记pH值为7.4至8.0、最佳标记浓度为10至12μg/ml的标记条件制得胶体金标记的GP36、GP41和GP120抗原;将本步骤上述得到的胶体金标记的P24抗原单克隆抗体、胶体金标记的GP36、GP41和GP120抗原进行纯化后,喷涂到胶体金垫上,干燥备用;
(4)***HIV抗体抗原检测试纸的制备:在所述反应支持物外表面上依次相互搭接粘帖所述样品垫、所述胶体金垫、所述硝酸纤维素膜和所述吸水滤纸。
优选的,所述制备纯度和浓度均符合要求的P24抗原单克隆抗体的制备方法为:
采用动物体内生产单抗的方法获得P24抗原单克隆抗体腹水,将获得的P24抗原单克隆抗体腹水使用辛酸-饱和硫酸铵沉淀,得到蛋白浓度高于2.0mg/ml、纯度大于90%的P24抗原单克隆抗体。
优选的,所述GP36抗原、GP41抗原或GP120抗原的制备方法为:
将含有GP36、GP41或GP120抗原的细菌培养液用辛酸-饱和硫酸铵沉淀后,再用离子层析柱层析纯化,得到浓度高于2.0mg/ml,纯度大于90%的GP36、GP41或GP120抗原。
本发明还提供了***HIV抗体抗原检测试纸在检测HIV中的应用。
本发明的有益效果如下:
本发明提供一种***HIV抗体抗原检测试纸,不仅具有使用方便、操作简单、便于推广的优点,而且能够在一个检测试纸上同时区分P24抗原阳性结果和HIV抗体阳性结果,通过区分抗体和抗原检测,达到了区分感染阶段的目的,为患者提供更多的信息。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施方式进行详细说明。
实施例1:***HIV抗体抗原检测试纸(参见图1和图2)
(1)P24抗原单克隆抗体的制备
采用通用的动物体内生产单抗的方法获得P24抗原单克隆抗体腹水,然后对该P24抗原单克隆抗体腹水进行纯化,具体的纯化方法为:将含有P24抗原单克隆抗体的腹水使用辛酸-饱和硫酸铵沉淀后,使用紫外分光法测定蛋白浓度、使用SDS-PAGE测定纯度,所得P24抗原单克隆抗体的蛋白浓度高于2.0mg/ml,纯度大于90%为合格。
(2)GP36、GP41和GP120抗原的制备
将含有GP36、GP41或GP120抗原的细菌培养液用辛酸-饱和硫酸铵沉淀后,再用离子层析柱层析纯化,并使用紫外分光光度法测定蛋白浓度、使用SDS-PAGE测定纯度,所得抗原以浓度高于2.0mg/ml,纯度大于90%为合格。
(3)硝酸纤维素膜上第一条带T1包被P24抗原单克隆抗体的方法:
经实验确定,最佳包被条件为:包被缓冲液为0.02mol/L pH=7.2的PBS,包被浓度为1.0mg/ml,喷量选择为1.0μl/cm。即:将P24抗原单克隆抗体用0.02mol/L pH=7.2的PBS稀释成1.0mg/ml,用喷膜机以1.0μl/cm的速度喷于硝酸纤维素膜上,形成第一条带T1。
(4)硝酸纤维素膜上质控条带C包被羊抗鼠IgG多克隆抗体的方法:
经实验确定,最佳包被条件为:包被缓冲液为0.02mol/L pH=7.2的PBS,包被浓度为1.0mg/ml,喷量选择为1.0μl/cm。
(5)硝酸纤维素膜上第二条带T2包被GP36、GP41和GP120抗原的方法:
经实验确定,最佳包被条件为:包被缓冲液为0.02mol/L pH=7.2的PBS,包被浓度为:GP36为0.3mg/ml、GP41为0.6mg/ml、GP120为0.4mg/ml,喷量选择为1.0μl/cm。
(6)胶体金的制备与鉴定:
使用柠檬酸三钠还原法还原氯金酸制备胶体金颗粒,使用紫外分光光度计扫描460~600nm区间的光吸收值,在520至530nm区间有最大吸收峰,且吸收值大于2.0为合格,对应胶体金颗粒直径大约为30~40nm。
(7)胶体金标记P24抗原单克隆抗体的方法:
P24抗原单克隆抗体最佳标记pH值和最佳标记浓度的确定:使用胶体金梯度pH值平行标记该抗体,选择变色边缘的标记pH值,然后将该pH值加上0.5作为P24抗原单克隆抗体进行标记的最佳pH值,大约为7.4至8.0;在该最佳pH值条件下,设定蛋白梯度进行标记,在胶体金中加入P24抗原单克隆抗体后混匀,放置20分钟以上,按每毫升胶体金加入100μl的比例加入10%的NaCl,混匀,观察颜色,选定加入P24抗原单克隆抗体浓度最低且颜色不发生变化的标记量再额外附加10%值作为最佳标记量,大约为15至18μg/ml。
(8)胶体金分别标记GP36、GP41和GP120抗原的方法:
GP36抗原最佳标记pH值和最佳标记浓度的确定:使用胶体金梯度pH值平行标记该抗原,选择变色边缘的标记pH值,然后将该pH值加上0.5作为该GP36抗原进行标记的最佳pH值,大约为7.4至8.0;在该最佳pH值条件下,设定蛋白梯度进行标记,在胶体金中加入GP36抗原后混匀,放置20分钟以上,按每毫升胶体金加入100μl的比例加入10%的NaCl,混匀,观察颜色,选定加入GP36抗原浓度最低且颜色不发生变化的标记量再额外附加10%值作为最佳的标记量,大约为10至12μg/ml。
GP41抗原最佳标记pH值和最佳标记浓度的确定:使用胶体金梯度pH值平行标记该抗原,选择变色边缘的标记pH值,然后将该pH值加上0.5作为该GP41抗原进行标记的最佳pH值,大约为7.4至8.0;在该最佳pH值条件下,设定蛋白梯度进行标记,在胶体金中加入GP41抗原后混匀,放置20分钟以上,按每毫升胶体金加入100μl的比例加入10%的NaCl,混匀,观察颜色,选定加入抗原浓度最低且颜色不发生变化的标记量再额外附加10%值作为最佳的标记量,大约为10至12μg/ml。
GP120抗原最佳标记pH值和最佳标记浓度的确定:使用胶体金梯度pH值平行标记该抗原,选择变色边缘的标记pH值,然后将该pH值加上0.5作为该GP120抗原进行标记的最佳pH值,大约为7.4至8.0;在该最佳pH值条件下,设定蛋白梯度进行标记,在胶体金中加入GP120抗原后混匀,放置20分钟以上,按每毫升胶体金加入100μl的比例加入10%的NaCl,混匀,观察颜色,选定加入GP120抗原浓度最低且颜色不发生变化的标记量再额外附加10%值作为最佳的标记量,大约为10至12μg/ml。
(9)对上述(7)(8)中所得到的四种胶体金标记溶液进行纯化的方法:
将标记好的胶体金溶液,加入BSA和PEG20000至终浓度均为0.2%,混匀,放置15分钟以上,使用高速冷冻离心机12000rpm离心15分钟以上,弃去上清,将沉淀使用胶体金保存液复溶,体积为原标记胶体金体积的1/10。复溶比例的调试:使用胶体金工作液稀释标记胶体金浓缩液进行稀释,稀释比例为10至20倍,喷涂到胶体金垫上进行干燥,最后根据与包被硝酸纤维素膜配对的检测结果确定最佳的稀释比例,一般选择15倍左右。
(10)***HIV抗体抗原检测试纸的制备:在所述反应支持物外表面上依次相互搭接粘帖所述样品垫、所述胶体金垫、所述硝酸纤维素膜和所述吸水滤纸。具体的,搭接粘帖可以为以下方式:包被好的硝酸纤维素膜2粘贴在反应支持物5上,其条带T1、T2线方向硝酸纤维素膜的边缘距离反应支持物5边缘28.0mm(具体数值会根据反应支持物5的尺寸发生变化),条带C线方向硝酸纤维素膜的边缘距离反应支持物5的边缘32.0mm(具体数值会根据反应支持物5的尺寸发生变化);条带C线方向的反应支持物5上粘贴有吸水滤纸1,压住硝酸纤维素膜1mm到2mm;条带T线方向的反应支持物5上首先粘贴4mm到8mm(根据实际生产活性的差异而变化)的胶体金垫3,压住硝酸纤维素膜条带T线的边缘1mm到2mm;在此方向上继续粘贴样品垫4,压住胶体金垫2mm到4mm(依赖于胶体金垫3的宽度)。
实施例2:检测方法(参见图3、4、5)
将待检标本(全血、血清或者血浆)60至100μl直接加入实施例1所得的检测试纸中的样品垫4处(全血样本需要额外加入一些稀释液),样品将沿着反应支持物5的各个附着物向吸水滤纸方向移动,20分钟内读取实验结果。
结果:
参照图3,如果样本中含有P24抗原,则与检测试纸上的胶体金标记的P24抗原的单克隆抗体特异性结合形成复合物,沿着膜区继续上行则与包被在硝酸纤维素膜2上的另一个P24抗原单克隆抗体发生特异性结合,在条带T1处出现红色或者粉红色;如果样本中含有HIV抗体,则与检测试纸上的胶体金标记的GP36、GP41、GP120抗原的单克隆抗体特异性结合形成复合物,沿着膜区继续上行则与包被在硝酸纤维素膜2上的另一个GP36、GP41、GP120抗原单克隆抗体发生特异性结合,在条带T2处出现红色条带,如果同时含有以上两种待检物则在两条线上同时显示红色条带。
参照图4,如果样本中没有P24抗原也没有HIV的抗体,就不能形成上述复合物,条带T1和T2处也就不能出线红色或粉红色,为阴性。
参照图5,无论样本中是否含有P24抗原或者HIV抗体,胶体金标记的单克隆抗体都会继续上行至包被膜的条带C,去此处包被的羊抗鼠IgG结合形成红色或者粉红色条带,即为质控线,如果在检测中此条带不出现,则证明胶体金失效或者操作有失误,结果无效,需要重新检测。
综上所述,通过使用本发明所提供的***HIV抗体抗原检测试纸,不仅具有使用方便、操作简单、便于推广的优点,而且能够在一个检测试纸上同时区分P24抗原阳性结果和HIV抗体阳性结果,通过区分抗体和抗原检测,达到了区分感染阶段的目的,为患者提供更多的信息。
以上所述为本发明的较佳实施例而已,但本发明不应该局限于该实施例和附图所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改,都落入本发明保护的范围。