CN102680637A - 一种生姜酚类提取物质量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生姜酚类提取物及其软胶囊剂的质量检测方法，具体讲，包括性状检查、鉴别、含量测定等项；其中含量测定包括总酚类的测定和6-姜酚的测定，总酚类的测定采用紫外分光光度法，6-姜酚的测定采用高效液相色谱法。本发明通过对含量测定方法的改进，从而可保证企业的生产质量水平，保证药效。

Description

一种生姜酚类提取物质量检测方法

技术领域

本发明涉及一种生姜酚类提取物及其软胶囊剂的质量检测方法。

背景技术

现代交通工具和航天事业的迅速发展对人类的经济、文化和社会生活发挥了重要的促进作用，但同时也使一部分人发生运动病。运动病是受运动环境中的不习惯条件作用后引起的神经***功能失调，主要表现为植物神经***功能紊乱。症状通常呈进行性发展，由胃区不适、恶心、唾液分泌增加、面色苍白、出冷汗、眩晕、头痛，进而发展到干呕、呕吐、嗜睡、淡漠。呕吐严重者甚至可脱水、衰竭。它发生于人们乘坐车、船、飞机、游乐设施或航海、航空、航天模拟和实际作业时。

根据多年来许多中外学者对运动病发病机制的研究认识，可以认为异常运动刺激在中枢神经***内产生感觉冲突，引起许多中枢递质***功能失平衡，内分泌功能、大脑皮质功能失调，对脑干植物神经中枢的调控作用失常，导致前庭感觉异常及植物神经功能紊乱。目前临床应用的抗运动病药物主要有如下几类：抗胆碱药、抗组胺药、多巴胺受体拮抗剂、5-羟色胺受体拮抗剂、拟交感药等。但这些药物的副作用都很大，抗胆碱药会抑制中枢神经***，引起嗜睡，还会使视觉模糊、口干，损害记忆力等，不宜用于正在进行作业的人员。抗组胺药种类较多，以茶苯海明（一般称晕海宁，乘晕宁）最为常用，也有中枢抑制的副作用，会引起嗜睡，尤其是为加强效果而增加用量时，因而也不能用于正在进行作业的人员。总之，目前临床应用的抗运动病药物多为抗胆碱和抗组胺类药物，作用较强，但副作用也较多，迫切需要毒副作用小，不影响正常作业、旅游观光，特别是渡海等作战、航天作业等的抗运动病药物。

中药生姜为姜科植物姜(Zingiber officinale Rosc)的鲜根茎，性味辛、温，归肺、脾、胃经，具有解表散寒、温中止吐、化痰止咳等功效，主治风寒感冒、胃寒呕吐、寒痰咳嗽。

研究显示，生姜具有确切而显著的抗运动病作用且无明显的毒副作用，是较理想的抗运动病药物。用生姜酚类提取物制备的软胶囊制剂是较为理想的剂型，然而由于生姜酚类提取为中药提取成份制备，不同的分离提取方法制备得到的生姜提取物在成份组成上会有很大差别，从而造成药物疗效的差异，为了进一步规范生姜酚类提取物软胶囊制剂的质量方法，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提出一种生姜酚类提取物软胶囊剂的质量检测方法。

本发明的又一目的在于提出一种生姜酚类提取物的质量检测方法。

为了完成本发明的目的，采用的技术方案为：

一种生姜酚类提取物软胶囊剂的质量检测方法，该生姜酚类提取物软胶囊的配方为：生姜酚类提取物3克，玉米油27克，制成100粒；该生姜酚类提取物软胶囊的质量检测方法为：

（1）性状检查：内容物为黄色或橙黄色的油状液体，有姜的香气，味辛辣；

（2）鉴别：取本品内容物0.5ml，加乙酸乙酯10ml溶解，作为供试品溶液；另取6-姜酚对照品，加乙酸乙酯制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述二种溶液各3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以沸点为60～90℃的石油醚－乙酸乙酯－冰醋酸为展开剂，体积比为8～10∶3～5∶0.2～1，优选为9∶4∶0.5；展开，取出，晾干，喷以质量百分比浓度为0.5～2％、优选1%的香草醛浓硫酸溶液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

（3）检查：

相对密度不低于0.90；

酸值不高于3.0；

皂化值为170～195；

碘值为108~130；

（4）含量测定：

（4.1）总酚类的测定：

制备0.086mg/ml的6-姜酚对照品溶液；精密量取对照品溶液4.0ml、5.0m1、6.0m1、7.0m1、8.0ml，分别置10ml量瓶中，加乙酸乙酯至刻度，摇匀，照紫外分光光度法，在281nm的波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；

精密称重生姜酚类提取物软胶囊内容物0.86g，置25ml量瓶中，加乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，精密吸取2ml，置100ml量瓶中，加乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，以玉米油平行对照作空白，照紫外分光光度法在281nm的波长处测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中总酚类成分的重量，计算，得到每粒含总酚类成分不得少于15mg；

（4.2）6-姜酚的测定：

对照品溶液的制备：精密称取6-姜酚对照品，以甲醇为溶剂，制备成0.1mg/ml的溶液；

供试品溶液的制备：取装量差异项下的生姜酚类提取物软胶囊内容物1ml，精密称定，照柱色谱法试验，置硅胶柱上，采用干法装柱，柱内径为1.5cm，填装硅胶10g，以沸点为60～90℃的石油醚-乙酸乙酯150ml洗脱，石油醚：乙酸乙酯的体积比为4～6∶1，优选为5∶1；弃去洗脱液，再用沸点为60～90℃的石油醚－醋酸乙酯80ml洗脱，石油醚：醋酸乙酯的体积比为0.5～2∶1，优选为1∶1；收集洗脱液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至25ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，再精密吸取1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；

色谱条件：

色谱柱：采用Phenomenex BONDCLONE10C₁₈柱；300×3.9mm；

流动相：体积比为70∶36∶15：0~4的甲醇-水-异丙醇-冰醋酸；

检测波长：280nm；

理论板数按6-姜酚峰计算应不低于1800；

进样量：20μl；

温度：室温；

流速：0.8ml/min；

保留时间：6分钟；

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，计算，每粒含6-姜酚不得低于4.80mg。

本发明的第一优选技术方案为：所述的生姜酚类提取物软胶囊剂的崩解时限为小于30分钟。

本发明的第二优选技术方案为：，所述的生姜酚类提取物软胶囊剂的装量差异为0.2700～0.3300。

本发明还涉及一种生姜酚类提取物的质量检测方法，所述的生姜酚类提取物为生姜经加工制成的半固体，该检测方法为：

（1）性状：所述生姜酚类提取物为棕色或棕褐色的半固体，有姜的香气，味辛辣；极易溶于乙醇、醋酸乙酯、***，不溶于水；

（2）鉴别：

(i)取所述生姜酚类提取物10mg，置试管内，加乙醇6ml使溶解，加铁***－三氯化铁试剂1滴，即显蓝绿色；

(ii)取所述生姜酚类提取物12mg，加醋酸乙酯10ml溶解，作为供试品溶液；另取6-姜酚对照品，加醋酸乙酯制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述二种溶液各3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以熔点为60～90℃的石油醚-醋酸乙酯-冰醋酸为展开剂，体积比为8～10∶3～5∶0.1～1，优选为9∶4∶0.5；展开，取出，晾干，喷以质量百分比浓度为0.5～2%、优选为1％的香草醛浓硫酸溶液；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

（3）检查：

(i)相对密度：不低于0.95；

(ii)炽灼残渣：不超过1.0％；

(iii)重金属：含重金属不超过百万分之二十；

(iv)砷盐：取本品1.0g，加氢氧化钙1g，混合，加少量水，搅匀，干燥后，先用小火烧灼使炭火，再在500～600℃炽灼使完全灰化，放冷，加盐酸5ml与水2ml，检查，含砷盐不得过百万分之二；

（4）含量测定：

(i)总酚类

制备0.08mg/ml的对照品溶液；精密量取对照品溶液2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml、7.0ml、8.0ml、10ml，分别置10ml量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，照紫外分光光度法在281nm的波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；

精密称取所述生姜酚类提取物0.08g，置25ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取2ml，置10ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，再精密吸取1ml，置10ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，照紫外分光光度法在281nm的波长处测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中总酚类成分的重量，计算，得所述生姜酚类提取物中总酚类成分不少于69.0%；

（ii）6-姜酚的测定：

对照品溶液的制备：精密称取6-姜酚对照品，以甲醇为溶剂，制备成0.1mg/ml的溶液；

供试品溶液的制备：取装量差异项下的生姜酚类提取物软胶囊内容物1ml，精密称定，照柱色谱法试验，置硅胶柱上，采用干法装柱，柱内径为1.5cm，填装硅胶10g，以沸点为60～90℃的石油醚-乙酸乙酯150ml洗脱，石油醚∶乙酸乙酯的体积比为4～6∶1，优选为5∶1；弃去洗脱液，再用沸点为60～90℃的石油醚－醋酸乙酯80ml洗脱，石油醚∶醋酸乙酯的体积比为0.5～2∶1，优选为1∶1；收集洗脱液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，再精密吸取1ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；

色谱条件：

色谱柱：采用Phenomenex BONDCLONE10C₁₈柱；300×3.9mm；

流动相：体积比为70∶36∶15：0~4的甲醇－水－异丙醇－冰醋酸；

检测波长：280nm；

理论板数按6-姜酚峰计算应不低于1800；

进样量：20μl；

温度：室温；

流速：0.8ml/min；

保留时间：6分钟；

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，计算，所述生姜酚类提取物含6-姜酚不低于17.0％。

下面对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。

本发明公开了一种生姜酚类提取物及其软胶囊剂的质量检测方法，本发明的生姜酚类提取物的制备方法为：将生姜切成2～5mm薄片，40～45℃通风干燥至含水量小于10%，粉碎过40目筛，得生姜粉；将生姜粉装入超临界CO₂萃取装置中，在温度为40～55℃、压力为20～30Mpa、CO₂流速为10kg/h.kg原料的条件下进行萃取，并进一步优选温度为55℃、压力为30Mpa；萃取时间为1～3小时，然后于压力为10Mpa的分离釜收集生姜酚类提取物。本发明对制备得到的6-姜酚的性状、鉴别、检查、含量的检测方法和指标进行了规定，从而使该制剂从原料上就保证了疗效。

本发明的生姜提取物软胶囊是由生姜中脂溶性成分姜酚类化合物和玉米油制备而成，其剂型为软胶囊剂。其功效为温中和胃、祛痰止呕。用于预防晕车、晕船等晕动病。服药方式为口服，一次2粒（共60mg），乘车船前30分钟服用。规格为0.3g/粒。

本发明公开的质量检测方法对生姜酚类提取物物的性状、鉴别、检查、含量等各项的检测方法和指标进行了规定，其一般检查项的检测方法参考中国药典2000版一部附录；

酸值、皂化值、碘值测定方法为：

酸值：按照药典一部附录IX N的方法，精密称取生姜酚类提取物软胶囊内容物约0.5g，测定其酸值。以下式计算：

A:为供试品消耗的氢氧化钠滴定液的容积(ml)；

G:供试品的重量(g)；

本发明的标准规定酸值不高于3.0。

皂化值：按照药典一部附录IX N的方法，精密称取生姜酚类提取物软胶囊内容物约13g，测定其皂化值。以下式计算：

A:为供试品消耗的盐酸滴定液的容积(m1)；

B:空白试验消耗的容积（ml）；

G:供试品的重量(g)；

本发明的标准规定皂化值为170~195。

碘值：按照药典一部附录IXN的方法，精密称取生姜酚类提取物软胶囊内容物约0.2g，测定其碘值。以下式计算：

A:为供试品消耗的硫代硫酸钠滴定液的容积(ml)

B:空白试验消耗的容积(ml)

G:供试品的重量(g)。

本发明的标准规定碘值为108~130。

玉米油的酸值、皂化值、碘值标准分别为酸值≤1、皂化值为187~195、碘值为108~128；从生姜酚类提取物软胶囊测定的酸值、皂化值、碘值来看，皂化值和碘值与玉米油相近，而酸值相差较大，这是由于生姜酚类提取物软胶囊中的主要有效成分为姜酚类化合物，它们所含的酚羟基均具有一定的酸性，能与滴定液氢氧化钠反应生成相应的钠盐，因此使测得的生姜酚类提取物软胶囊的酸值比玉米油高，根据以上测定三批生姜酚类提取物软胶囊的酸值、皂化值、碘值的结果，确定为生姜酚类提取物软胶囊的酸值不得高于3.0，碘值为108~130、皂化值为170~195。

并进一步规定了：

本发明软胶囊内容物的相对密度不低于0.90；

本发明软胶囊崩解时限为小于30分钟；

本发明软胶囊剂的装量差异为0.2700～0.3300。

其他：应符合胶囊剂项下有关的各项规定；

本发明的鉴别采用了薄层色谱法，并对含量测定方法及标准作了改进。总酚类的测定采用紫外分光光度法，6-姜酚的测定采用了高效液相色谱法；从而使对生姜酚类提取物软胶囊中的6-姜酚的检测更加精确，并通过各项指标的综合控制，并且能够更加合理的控制产品的质量。

生姜酚类提取物软胶囊的主要有效成分为姜酚类化合物，在原料药中采用紫外分光光度法对总酚类成分进行了测定。采用紫外分光光度法，以6-姜酚为对照品来测定总有效成分的含量。由于玉米油对测定有干扰，因此以玉米油作空白，采用双波长来测定总有效成分的含量。在稀释剂的选择上，经过对氯仿、丙酮、乙酸乙酯等试剂进行紫外扫描，发现氯仿、丙酮在280nm附近均有吸收，而乙酸乙酯在280nm处无干扰，因此选择乙酸乙酯作为软胶囊内容物的稀释溶剂。

本发明的生姜酚类提取物软胶囊具有温中止呕，防治晕车等运动病的功效。在生姜酚类成分中，6-姜酚含量最高，因此本发明的检测方法中，通过对色谱条件的选择，通过对6-姜酚进行含量测定，建立了一种对本发明的生姜酚类提取物软胶囊的专属可靠的HPLC法，对来控制生姜酚类提取物软胶囊的质量。

首先，需要分离玉米油和生姜酚类提取物。由于玉米油和挥发油对6-姜酚的测定干扰很大，必需去除，由于它们很难分离，利用吸附于硅胶柱上，用洗脱，除去各种杂质，再用一定量的石油醚(60～90℃)-醋酸乙酯（v∶v=1∶1）溶液洗脱、收集、测定，经薄层试验结果表明，石油醚(60～90℃)-醋酸乙酯（v∶v=5∶1）溶液能除去干扰测定的杂质，而6-姜酚不被洗脱，石油醚(60～90℃)-醋酸乙酯（v∶v=1∶1）溶液能将6-姜酚定量洗脱下来；然后再采用高效液相色谱法对6-姜酚的含量进行测定。采用本发明的高效液相色谱条件，在制作对照品标准曲线时发现，其标准曲线在0.80～2.82μg范围内具有良好的线性关系，且通过坐标原点，因此采用外标一点法计算含量。本发明的高效液相色谱法不仅准确，并且方便操作。

附图说明：

图1为生姜酚类提取物软胶囊薄层色谱图；

图2为6-姜酚对照品紫外标准曲线；

图3为乙酸乙酯空白紫外图谱；

图4为玉米油紫外图谱；

图5为6-姜酚对照品紫外图谱；

图6为生姜酚类提取物软胶囊内容物的紫外图谱（批号1001）；

图7为生姜酚类提取物软胶囊内容物的紫外图谱（批号1002）；

图8为生姜酚类提取物软胶囊内容物的紫外图谱（批号1003）；

图9为6-姜酚对照品高效液相色谱标准曲线；

图10为甲醇空白HPLC图；

图11为6-姜酚对照品HPLC；

图12为生姜酚类提取物软胶囊的HPLC图（批号1001）；

图13为生姜酚类提取物软胶囊的HPLC图（批号1002）；

图14为生姜酚类提取物软胶囊的HPLC图（批号1003）；

图15为6-姜酚标准品的制备的流程图；

图16为生姜酚类提取物薄层色谱图：1、对照品；2、供试品：批号011108；3、供试品：批号011109；4、供试品：批号011110；

图17为6-姜酚对照品紫外图谱；

图18为姜素酚类提取物中6-姜酚的紫外图谱；

图19为6-姜酚对照品紫外图谱；

图20为6-姜酚对照品高效液相色谱标准曲线。

本发明的具体实施方式仅用于进一步解释本发明的内容，并不对本发明构成限制。

具体实施方式

实施例1

（一）制备生姜酚类提取物软胶囊制剂：

配方：生姜酚类提取物3克，玉米油27克，制成100粒；

制备方法：

1、超临界二氧化碳萃取生姜酚类提取物：

（1）将生姜切成2～5mm薄片，45℃通风干燥至含水量小于10%，粉碎过40目筛，得生姜粉；

（2）将生姜粉装入超临界CO₂萃取装置中，在温度为55℃、压力为30Mpa、CO₂流速为10kg/h.kg原料的条件下进行萃取，萃取时间为2小时，然后于压力为10Mpa的分离釜收集得到生姜酚类提取物，其高效液相色谱图如图1所示。

2、溶液配制

内容物溶液的配制：准确称取生姜酚类提取物600g，加药用玉米油5400g，于60℃充分搅拌使全部溶解；置布氏漏斗中普通滤纸减压过滤，滤液再经G3垂熔玻璃漏斗过滤，得澄明溶液。

胶液的制备：按配方重量，称取明胶、甘油和水，先甘油和水混合后加热至70～80℃，按配方加入明胶，搅拌，熔融，保温1～2小时，静置，待泡沫上浮后除去，过滤，保温待用。

3、软胶囊制备

采用RJWJ-1型软软胶囊制囊机制备生姜酚类提取物软胶囊；将制成的软胶囊铺摊于浅盘内，放入干燥隧道中，在20～30％相对湿度，温度21～24℃，鼓风条件下进行干燥，使胶壳含水量在6～10％范围内；每丸软胶囊重0.3克，内含30mg生姜酚类提取物。

（二）采用本发明的质量检测标准对本发明制备得到的软胶囊进行检测：

取上述软胶囊的三个批次1001、1002、1003：

【性状】本品为黄色或橙黄色，味辛辣。

【鉴别】取本品内容物0.5ml，加乙酸乙酯10ml溶解，作为供试品溶液；另取6-姜酚对照品，加乙酸乙酯制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述二种溶液各3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以沸点为60～90℃的石油醚－乙酸乙酯－冰醋酸为展开剂，体积比为9：4：0.5；展开，取出，晾干，喷以1％香草醛浓硫酸溶液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；如图1所示。

【检查】

（1）崩解时限、装量差异检查：

依照中国药典2000年版一部附录I L胶囊剂项下有关规定，对三批样品的装量差异、崩解时限进行了检查，结果列于下表：

表1：生姜酚类提取物软胶囊崩解时限、装量差异检查结果

检查结果表明，三批样品均符合规定。

（2）相对密度测定：相对密度称定法（中国药典2000年版附录VIIA）测定，结果如下：

表2：相对密度测定结果

批号	1001	1002	1003
				相对密度	0.9236	0.9212	0.9241

检查结果表明，三批样品均符合规定。

（3）酸值、皂化值、碘值：

测定结果如表3所示：

表3：酸值、皂化值、碘值测定结果

名称	批号	酸值	皂化值	碘值
					生姜酚类提取物软胶囊	1001	2.03	176.98	123.47
生姜酚类提取物软胶囊	1002	2.06	176.82	120.88
					生姜酚类提取物软胶囊	1003	2.04	176.10	122.59
玉米油		0.87	191.23	117.49

【含量测定】

(1)总酚类成分

(11)仪器：岛津UV-2501PC紫外分光光度计；检测波长：280nm；

(1.2)标准曲线的制备：

取6-姜酚对照品4.30mg，精密称定，置50ml量瓶中，加乙酸乙酯溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含6-姜酚0.086mg)。

精密量取对照品溶液4.0ml、5.0ml、6.0ml、7.0ml、8.0ml，分别置10ml量瓶中，加乙酸乙酯至刻度，摇匀，照分光光度法（中国药典2000年版一部附录V B），在281nm的波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，如附图2。

计算得回归方程为Y＝0.018+10.628X r＝0.9998。表明：6-姜酚在0.03～0.08mg范围内具有良好的线性关系。

表4紫外光谱标准曲线测定结果

序号	吸取量(ml)	浓度(mg/ml)	吸收度(A)
				1	4	0.0344	0.385
2	5	0.043	0.475
				3	6	0.0516	0.562
4	7	0.0602	0.661
				5	8	0.0688	0.749

(1.3)测定：

取软胶囊的内容物0.86g，精密称重，置25ml量瓶中，加乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，精密吸取2ml，置100ml量瓶中，加乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，以玉米油平行对照作空白，在281nm的波长处测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中总酚类成分的重量（mg），计算，即得。生姜酚类提取物软胶囊中总姜酚含量测定结果如表5，附图3-8。

表5生姜酚类提取物软胶囊中总姜酚含量测定结果

批号	总姜酚含量(mg/粒)	RSD〈%〉
			1001	19.01	0.22
1002	19.85	0.31
			1003	18.31	1.24

结果显示：本发明制备的生姜酚类提取物软胶囊每粒中含总酚类成分不少于15mg。

(1.4)测定精密度试验:精密称取6-姜酚对照品2.02mg，置5ml量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，在281nm处测定吸收度，连续读取吸收度5次，结果如下：

表6测定精密度试验结果

(1.5)回收率测定:精密称取已知含量的生姜酚类提取物软胶囊，精密加入等量的6-姜酚对照品，测定吸收度，从标准曲线读出总姜酚的含量，按下式计算回收率:

表7回收率测定结果

(1.6)日内稳定性试验：将6-姜酚对照品（浓度＝0.0428mg），分别在不同时间测定吸收度（A），计算RSD，结果如下：

表8日内稳定性试验结果

从以上结果6-姜酚放置5小时是稳定的。

(1.7)日间稳定性试验：将6-姜酚对照品（浓度＝0.0428mg），分别在不同天测定吸收度（A），计算RSD，结果如下：

表9日间稳定性试验结果

从以上结果6-姜酚在乙醇中放置五天是稳定的。

(2)6-姜酚的测定

(2.1)仪器与试药

高压液相色谱仪，Waters 600泵，996二级管列阵检测器，717自动进样器，2010色谱工作站。

6-姜酚对照品:自制。

所用试剂：均为色谱纯、分析纯。

色谱条件：

色谱柱：Phenomenex BONDCLONE10C₁₈300×3.9mm；

流动相：甲醇-水-异丙醇-冰醋酸（70∶36∶15∶0~4）；

波长：280nm；

柱温：室温；

流速：0.8ml/min；

6-姜酚于280nm附近为最大吸收，故选为测定波长，此条件下6-姜酚与姜原料药中其它组分达到基线分离。

(2.2)供试品溶液的制备

分离玉米油和生姜酚类提取物：取装量差异项下的生姜酚类提取物软胶囊内容物1ml，精密称定，照柱色谱法试验，置硅胶柱上，采用干法装柱，柱内径为1.5cm，填装硅胶10g，以沸点为60～90℃的石油醚-乙酸乙酯150ml洗脱，石油醚：乙酸乙酯的体积比为5∶1；弃去洗脱液，再用沸点为60～90℃的石油醚-醋酸乙酯80ml洗脱，石油醚：醋酸乙酯的体积比为1∶1；收集洗脱液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，再精密吸取1ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；

(2.3)线性关系考察

配制浓度为0.1006mg/ml的6-姜酚甲醇溶液，精密吸取此溶液8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28μl，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积的积分值为纵坐标，6-姜酚进样量（μg）为横坐标，绘制标准曲线（见图9），计算得回归方程为Y＝-906.081＋713332.49Xr＝0.9999。

表明：6-姜酚在0.80～2.82μg范围内具有良好的线性关系。

(2.4)精密度试验

精密吸取正文所述对照品溶液10μl，重复进样5次，6-姜酚峰面积积分值的相对标准偏差小于1.5％，结果列于表10。

表10精密度试验结果

实验次数	峰面积	RSD（％）
			1	31172
2	31142
			3	30930	0.38
4	31211
			5	31002

(2.5)方法稳定性试验：

精密吸取正文所述对照品供试品溶液12μl，每隔一定时间进样1次，结果列于表11。试验结果表明，本法具有良好的稳定性。

表11方法稳定性试验结果

时间	峰面积	RSD（％）
			即时	31835
20min	32108
			40min	32414
1h	31932
			4h	31800	0.81
9h	31834
			24h	31656

48h	32304
			72h	31759

(2.6)重现性试验：

取同批样品5份,按上述方法测定,结果列于表12。样品的相对标准偏差小于5％。

表12重现性试验结果

取样次数	取样量（g）	样品含量（mg）	RSD（％）
				1	0.6882	1.501
2	0.6022	1.517
				3	0.6022	1.560	1.73
4	0.6022	1.534
				5	0.6882	1.562

(2.7)回收率试验：

采用加样回收法，取已知含量的本品，分别加入不同量的对照品，余同供试品制备法，按上述色谱条件测定，以下式计算回收率，结果列于表13。结果表明本法具有良好的回收率。

表13回收率测定结果

(2.8)样品测定：

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液20μl，按上述色谱条件测定，以外标一点法计算样品中6-姜酚的含量，三批样品测定结果如表14，附图10-14；

表14样品测定结果

批号	6-姜酚含量(mg/粒)	RSD(%)
			011128	5.93	1.46
011129	6.11	0.94
			011130	6.08	0.96

结果显示：本发明制备的生姜酚类提取物软胶囊每粒中含6-姜酚不少于4.80mg。

其中，本发明中6-姜酚标准品的制备方法为：其流程图为图15所示：

1．6-姜酚提取工艺

1.1溶剂提取：生姜300克，切成碎块，加2倍量醋酸乙酯，于水浴回流3小时，倾出醋酸乙酯，再加适量的醋酸乙酯提取3次，合并醋酸乙酯提取液，减压回收醋酸乙酯，得到深棕色油状提取物2克；

1.2低压硅胶柱层析分离姜酚粗品

采用200～300目层析硅胶干法装柱，将上步提取的粗提物加少量醋酸乙酯溶解，与适量硅胶拌均，挥发去醋酸乙酯，装于柱上端，再加少量纯硅胶于其上，用石油醚(60-90℃)－醋酸乙酯(v∶v=6∶4)洗脱，洗脱液以薄层色谱鉴别，用6-姜酚标准品对照，将相同部位合并，减压浓缩回收醋酸乙酯，得淡黄色油状物(约400毫克)，为姜酚粗品。

1.3高效液相色谱纯化

将上步制备的姜酚粗品溶解于4毫升甲醇中，用制备型高效液相色谱仪分离纯化姜酚。

色谱条件：

色谱柱：制备型十八烷基键合硅胶柱；

流动相：80%甲醇水溶液，70%甲醇水溶液；

流速：1.2～2.2ml/min；

检测：紫外检测（280nm）灵敏度0.5或示差析光检测；

纸速：20cm/min；

采用6-姜酚为标准品标定目标化合物的保留时间，将上步制备的姜酚粗品0.4克溶于4毫克甲醇中，每次进样15μl，按峰收集样品，合并后回收溶剂，得到淡黄色油状物0.2克，此样品中含有杂质，需要改变流动相进一步纯化；

将上步的0.2克样品溶于2毫升甲醇中，改用70％甲醇水溶液为流动相，流速1.8ml/min，其它条件不变，再进行HPLC分离，按峰收集样品，得到淡黄色油状物的6-姜酚0.12克。

1.4重结晶

将HPLC纯化的6-姜酚油状物加80毫升正已烷回流20分钟，将溶液转移至100毫升锥形瓶中，密闭，放置于20℃水箱中过夜，即可析出絮状结晶，挥去溶剂后，此结晶在室温下（19℃）不融化。

实施例2：生姜酚类提取物的检测

采用实施例1中的方法制备生姜酚类提取物，从生姜中采用超临界二氧化碳萃取得到的半固体有效部位，主要成分为酚类化合物。取3个批次进行试验：011108、011109、011110。

【溶解度试验】

照中国药典2010年版一部凡例项下测定。

表15：原料药溶解度试验结果

溶剂	溶解度测定结果	判断标准	结论
				乙醇	0.1012g在0.9ml中全部溶解	1g溶质在不到1ml中溶解	极易溶解
醋酸乙酯	0.1014g在0.9ml中全部溶解	1g溶质在不到1ml中溶解	极易溶解
				***	0.1014g在0.9ml中全部溶解	1g溶质在不到1ml中溶解	极易溶解
水	0.1018g在1000ml水中不溶	1g溶质在1000ml中不能溶解	几乎或不溶

从以上结果可以看出，本品极易溶于乙醇、醋酸乙酯、***，不溶于水。

【鉴别】

(1)铁***－三氯化铁试液的制备：首先制备铁***溶液，取铁***1g，加水使成100ml，即得；然后制备三氯化铁溶液：取三氯化铁2g，加水使成100ml，即得；将铁***溶液和三氯化铁溶液等容积混合，即为铁***－三氯化铁试液，临用新配。

铁***溶液和三氯化铁溶液混合生成铁氰化铁，其能与酚类化合物还原反应生成普鲁士蓝而产生兰绿色，用于鉴别姜酚类化合物。

(2)薄层色谱鉴别：取所述生姜酚类提取物12mg，加醋酸乙酯10ml溶解，作为供试品溶液；另取6-姜酚对照品，加醋酸乙酯制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述二种溶液各3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以熔点为60～90℃的石油醚-醋酸乙酯-冰醋酸为展开剂，体积比为9∶4∶0.5；展开，取出，晾干，喷以质量百分比浓度为1％的香草醛浓硫酸溶液；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；如图16所示。1、对照品；2、3、4为供试品。

【检查】

按照2000年版第一部药典附录的方法，对生姜原料药的相对密度、炽灼残渣、重金属、砷盐进行了测定，结果如下：

表16：相当密度、炽灼残渣、重金属、砷盐测定结果

批号	相对密度	炽灼残渣(%)	重金属(ppm)	砷盐(ppm)
					011108	1.0040	<0.07	<20	<1
011109	1.0042	<0.07	<10	<1
					011110	0.9914	<0.08	<10	<1

根据以上三批检查结果，暂定本原料药相对密度不得低于0.95，炽灼残渣不得过1.0%，重金属不得过百万分之二十，砷盐不得过百万分之二。

【含量测定】

(1)总酚类成分的测定：

本原料药中的主要有效成分为含有酚羟基的化合物，它们的总含量达到了50%以上，由于它们均含有3-甲氧基-4-羟基苯基结构单元，因此均在280nm附近有最大吸收峰，且吸收系数基本相等，而原料药中另外的成分如一些倍半萜类的化合物，它们在280nm处没有吸收峰，因此采用紫外分光光度法来测定姜原料药中姜酚类成分的总含量。紫外分光光度法的计算公司为A＝ε·c·l，当吸收系数ε和液层的厚度固定时，系数度A与浓度c成正比，浓度可以看出，与化合物的分子量成反比。从气－质谱联用仪上得到姜酚类的平均分子量为300左右，6-姜酚的分子量为294，因此选用6-姜酚作为对照品，图17为6-姜酚对照品紫外图谱，图18为原料药中6-姜酚紫外图。

紫外分光光度计：岛津UV-2501PC；测定波长λ＝281nm；狭缝为2。

标准曲线的测定：精密称取6-姜酚对照品3.57mg，加乙醇定容于50ml量瓶中，分别吸取2、3、4、5、6、7、8ml，定容于10ml量瓶中，分别在281nm处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，作图，如图19所示，并计算回归方程为Y＝－0.00114＋10.7443X，r＝0.9998，说明6-姜酚在0.1428～0.5712mg内具有良好的线性关系。

表17：紫外光谱标准曲线测定结果

序号	吸取量(ml)	浓度(mg/ml)	吸收度(A)
				1	2	0.01428	0.15
2	3	0.02142	0.229
				3	4	0.02856	0.304
4	5	0.03570	0.380
				5	6	0.04284	0.456
6	7	0.04998	0.534
				7	8	0.05712	0.618

精密度试验：精密称取6-姜酚对照品2.02mg，置5ml量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，在281nm处测定吸收度，连续读取吸收度5次，结果如下：

表18：

	1	2	3	4	5	RSD（％）
							吸收度（A）	0.308	0.380	0.381	0.381	0.380	0.14

回收率试验：精密称取已知含量的姜原料药，精密加入等量的6-姜酚对照品，测定吸收度，从标准曲读出总姜酚的含量，按下式计算回收率：

表19：姜原料药总姜酚回收率测定结果

日内稳定性试验：将6-姜粉对照品（浓度＝0.0428mg），分别在不同时间测定吸收度（A），计算RSD，结果如下：

表20：日内稳定性试验结果

从以上结果6-姜粉放置5小时是稳定的。

日间稳定性试验：将6-姜粉对照品（浓度＝0.0428mg），分别在不同天测定吸收度（A），计算RSD，结果如下：

表21：日间稳定性试验结果

从以上结果6-姜粉在乙醇中放置五天是稳定的。

生姜酚类提取物总酚含量测定：

取制备得到的生姜酚类提取物0.08g，精密称重，置25ml量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，精密吸取2ml，置10ml量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，再精密吸取1ml，加乙醇至刻度，摇匀，在281nm的波长处测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中姜酚类成分的浓度（mg/ml），计算，即得。

表22：三批姜原料药总姜酚类成分测定结果

批号	总姜酚含量(%)	RSD(%)
			011108	74.19	0.08
011109	71.27	0.05
			011110	86.25	0.39

根据以上结果，暂定本品酚类成分含量不得低于62.0%。

(2)6-姜酚含量测定

采用高效液相色谱法对姜原料药中的主要有效成分之一6-姜酚进行了含量测定。

①仪器与试药

高压液相色谱仪，Waters 600泵，996二级管列阵检测器，717自动进样器，2010色谱工作站；

6-姜酚对照品（自制）；

所用试剂均为色谱纯、分析纯。

②色谱条件

色谱柱：Phenomenex BONDCLONE10C₁₈300×3.9mm

流动相：甲醇－水－异丙醇－冰醋酸（70∶36∶15∶4）

波长：280nm

柱温：室温

流速：0.8ml/min

6-姜酚于280nm附近为最大吸收，故选为测定波长此条件下6-姜酚与姜原料药中其它组分达到基线分离。

③供试品溶液的制备

倍半萜类成分为极性很小的化合物，对6-姜酚的测定干扰很大，必需去除，利用吸附于硅胶柱上，用洗脱，除去各种杂质，再用一定量的石油醚(60～90℃)－醋酸乙酯（1∶1）溶液洗脱、收集、测定，经薄层试验结果表明，石油醚(60～90℃)－醋酸乙酯（5∶1）溶液能除去干扰测定的杂质，而6-姜酚不被洗脱，石油醚(60～90℃)－醋酸乙酯（1∶1）溶液则能确保6-姜酚定量洗脱下来。

④线性关系考察

配制浓度为0.1006mg/ml的6－姜酚甲醇溶液，精密吸取此溶液8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28μl，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积的积分值为纵坐标，6－姜酚进样量（μg）为横坐标，绘制标准曲线（见图20），计算得回归方程为Y＝-906.081+713332.49X  r＝0.9999。

表明：6-姜酚在0.80～2.82μg范围内具有良好的线性关系。

⑤精密度试验

精密吸取正文所述对照品溶液10μl，重复进样5次，6-姜酚峰面积积分值的相对标准偏差小于1.5％，结果列于表23。

表23：精密度试验结果

实验次数

峰面积

RSD（％）

1	31172
			2	31142
3	30930	0.38
			4	31211
5	31002

⑥方法稳定性试验

精密吸取正文所述对照品供试品溶液12μl，每隔一定时间进样1次，结果列于表9。试验结果表明，本法具有良好的稳定性。

表24：方法稳定性试验结果

时间	峰面积	RSD（％）
			即时	31835
20min	32108
			40min	32414
1h	31932
			4h	31800	0.81
9h	31834
			24h	31656
48h	32304
			72h	31759

⑦回收率试验

采用加样回收法，取已知含量的本品(批号：011109)，分别加入不同量的对照品，余同供试品制备法，按上述色谱条件测定，以下式计算回收率，结果列于表10。结果表明本法具有良柒好的回收率。

表25：回收率测定结果

⑧样品测定

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液20μl，按上述色谱条件测定，以外标一点法计算样品中6－姜酚的含量，三批样品测定结果列于表26。

表26：样品测定结果

批号	6-姜酚含量(%)	RSD(%)
			011108	22.66	0.39
011109	19.62	0.35
			011110	29.97	1.14

根据以上结果，暂定本品6-姜酚含量不得低于17.00%。

Claims (4)

1.一种生姜酚类提取物软胶囊剂的质量检测方法，所述的生姜酚类提取物软胶囊的配方为：

生姜酚类提取物3克，玉米油27克，制成100粒；其特征在于，所述生姜酚类提取物软胶囊的质量检测方法为：

（1）性状检查：内容物为黄色或橙黄色的油状液体，有姜的香气，味辛辣；

（2）鉴别：取本品内容物0.5ml，加乙酸乙酯10ml溶解，作为供试品溶液；另取6-姜酚对照品，加乙酸乙酯制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述二种溶液各3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以沸点为60～90℃的石油醚－乙酸乙酯－冰醋酸为展开剂，体积比为8～10：3～5：0.2～1，优选为9：4：0.5；展开，取出，晾干，喷以质量百分比浓度为0.5～2％、优选1%的香草醛浓硫酸溶液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

（3）检查：

相对密度不低于0.90；

酸值不高于3.0；

皂化值为170~195；

碘值为108~130；

（4）含量测定：

（4.1）总酚类的测定：

制备0.086mg/ml的6-姜酚对照品溶液；精密量取对照品溶液4.0ml、5.0ml、6.0ml、7.0ml、8.0ml，分别置10ml量瓶中，加乙酸乙酯至刻度，摇匀，照紫外分光光度法，在281nm的波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；

精密称重生姜酚类提取物软胶囊内容物0.86g，置25ml量瓶中，加乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，精密吸取2ml，置100ml量瓶中，加乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，以玉米油平行对照作空白，照紫外分光光度法在281nm的波长处测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中总酚类成分的重量，计算，得到每粒含总酚类成分不得少于15mg；

（4.2）6-姜酚的测定：

对照品溶液的制备：精密称取6-姜酚对照品，以甲醇为溶剂，制备成0.1mg/ml的溶液；

供试品溶液的制备：取装量差异项下的生姜酚类提取物软胶囊内容物1ml，精密称定，照柱色谱法试验，置硅胶柱上，采用干法装柱，柱内径为1.5cm，填装硅胶10g，以沸点为60～90℃的石油醚-乙酸乙酯150ml洗脱，石油醚：乙酸乙酯的体积比为4～6∶1，优选为5∶1；弃去洗脱液，再用沸点为60～90℃的石油醚－醋酸乙酯80ml洗脱，石油醚：醋酸乙酯的体积比为0.5～2∶1，优选为1∶1；收集洗脱液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至25ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，再精密吸取1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；

色谱条件：

色谱柱：采用Phenomenex BONDCLONE10C₁₈柱；300×3.9mm；

流动相：体积比为70∶36∶15：0~4的甲醇-水-异丙醇-冰醋酸；

检测波长：280nm；

理论板数按6-姜酚峰计算应不低于1800；

进样量：20μl；

温度：室温；

流速：0.8ml/min；

保留时间：6分钟；

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，计算，每粒含6-姜酚不得低于4.80mg。

2.根据权利要求1所述的生姜酚类提取物软胶囊剂的质量检测方法，其特征在于，所述的生姜酚类提取物软胶囊剂的崩解时限为4~30分钟。

3.根据权利要求1所述的生姜酚类提取物软胶囊剂的质量检测方法，其特征在于，所述的生姜酚类提取物软胶囊剂的装量差异为0.2700～0.3300。

4.一种生姜酚类提取物的质量检测方法，所述的生姜酚类提取物为生姜经加工制成的半固体，其特征在于，所述的检测方法为：

（1）性状：所述生姜酚类提取物为棕色或棕褐色的半固体，有姜的香气，味辛辣；极易溶于乙醇、醋酸乙酯、***，不溶于水；

（2）鉴别：

(i)取所述生姜酚类提取物10mg，置试管内，加乙醇6ml使溶解，加铁***－三氯化铁试剂1滴，即显蓝绿色；

(ii)取所述生姜酚类提取物12mg，加醋酸乙酯10ml溶解，作为供试品溶液；另取6-姜酚对照品，加醋酸乙酯制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述二种溶液各3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以熔点为60～90℃的石油醚-醋酸乙酯-冰醋酸为展开剂，体积比为8～10∶3～5∶0.1～1，优选为9∶4∶0.5；展开，取出，晾干，喷以质量百分比浓度为0.5～2%、优选为1％的香草醛浓硫酸溶液；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

（3）检查：

(i)相对密度：不低于0.95；

(ii)炽灼残渣：不超过1.0％；

(iii)重金属：含重金属不超过百万分之二十；

(iv)砷盐：取本品1.0g，加氢氧化钙1g，混合，加少量水，搅匀，干燥后，先用小火烧灼使炭火，再在500～600℃炽灼使完全灰化，放冷，加盐酸5ml与水2ml，检查，含砷盐不得过百万分之二；

（4）含量测定：

(i)总酚类

制备0.08mg/ml的对照品溶液；精密量取对照品溶液2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml、7.0ml、8.0ml、10ml，分别置10ml量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，照紫外分光光度法在281nm的波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；

精密称取所述生姜酚类提取物0.08g，置25ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取2ml，置10ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，再精密吸取1ml，置10ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，照紫外分光光度法在281nm的波长处测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中总酚类成分的重量，计算，得所述生姜酚类提取物中总酚类成分不少于69.0%；

（ii）6-姜酚的测定：

对照品溶液的制备：精密称取6-姜酚对照品，以甲醇为溶剂，制备成0.1mg/ml的溶液；

供试品溶液的制备：取装量差异项下的生姜酚类提取物软胶囊内容物1ml，精密称定，照柱色谱法试验，置硅胶柱上，采用干法装柱，柱内径为1.5cm，填装硅胶10g，以沸点为60～90℃的石油醚-乙酸乙酯150ml洗脱，石油醚：乙酸乙酯的体积比为4～6∶1，优选为5∶1；弃去洗脱液，再用沸点为60～90℃的石油醚－醋酸乙酯80ml洗脱，石油醚∶醋酸乙酯的体积比为0.5～2∶1，优选为1∶1；收集洗脱液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，再精密吸取1ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；

色谱条件：

色谱柱：采用Phenomenex BONDCLONE10C₁₈柱；300×3.9mm；

流动相：体积比为70∶36∶15：0~4的甲醇－水－异丙醇－冰醋酸；

检测波长：280nm；

理论板数按6-姜酚峰计算应不低于1800；

进样量：20μl；

温度：室温；

流速：0.8ml/min；

保留时间：6分钟；

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，计算，所述生姜酚类提取物含6-姜酚不低于17.0％。

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