CN102660642A - 一种筛选锌指蛋白的筛选*** - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种筛选锌指蛋白的筛选***，包括两个报告载体pReport-N1-LacZ、pReport-N2-EGFP和一个激活载体pAD-RNAP-alpha-GAL4。通过构建三种元件的配合，构建两套筛选***，利用三种元件的配合，从而实现锌指蛋白与锌指核酸酶识别序列特异性识别与报告基因表达指示的相关，再通过这两套***的交互筛选提高锌指蛋白筛选的活性。两套***交互验证，提高了筛选锌指蛋白的特异性。
Description
技术领域
本发明属于锌指蛋白的筛选技术领域，涉及一种筛选锌指蛋白的筛选***。
背景技术
转基因动物有着广泛的应用前景，通过基因打靶技术可以实现外源基因的定点整合，其表达可以实现精确调控并不影响宿主细菌自身基因表达调控。基因打靶主要依赖于同源重组，自然条件下同源重组发生的几率很低，约为百万之一，这就大大的限制了这一技术的广泛应用。如何提高基因打靶效率已经成为目前研究的重点和热点。
锌指蛋白是一类具有手指状结构域的转录因子，在基因表达调控、细胞分化、胚胎发育、增强植物抗逆性等方面具有重要的作用。1996年Kim等发现，将已知的识别特异DNA序列的锌指结构与限制性内切酶FokI中无特异性识别作用的切割结构域通过一个“linker”融合表达，可以组合成一个新的限制性内切酶-锌指核酸酶(zinc finger nuclease，ZFN)，识别和切割位点由其中的锌指结构决定。
ZFN是由两部分组成，包括一个DNA结合域和一个非特异性核酸内切酶。其工作原理是DNA结合域与特定DNA结构结合，与之相连的非特异性核酸内切酶随之发挥剪切作用，在结合位点产生断裂，促进同源重组，提高定点突变和置换频率。研究表明，通过特异性锌指核酸酶可以提高基因打靶效率。锌指核酸酶的关键在于筛选高特异性、高亲和力的锌指蛋白。
锌指蛋白的获取方法主要有筛选法和模块组装法。模块组装法的优点在于简易快速：简单将各锌指模块连接用于识别目标序列。缺点在于设计出的联体锌指亲和力较低或者没有亲和力。随着锌指结合DNA机制深入研究，该方法将会成为一种高效的方法；筛选法可信度较高，但比模块组装法耗时。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种筛选锌指蛋白的筛选***，利用报告载体替代现有的细菌筛选***必须将序列整合进细菌基因组里进行筛选的方法，筛选过程高效简洁。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种筛选锌指蛋白的筛选***，包括两个报告载体pReport-N1-LacZ、pReport-N2-EGFP和一个激活载体pAD-RNAP-alpha-GAL4；
所述的报告载体pReport-N1-LacZ包括锌指核酸酶识别序列***位点、核糖体结合位点和启动子，在启动子的下游设有报告基因LacZ和抗生素筛选基因；
所述的报告载体pReport-N2-EGFP包括锌指核酸酶识别序列***位点、核糖体结合位点和启动子，在启动子的下游设有报告基因EGFP和抗生素筛选基因；
所述的激活载体pAD-RNAP-alpha-GAL4包括RNA聚合酶α和激活元件GAL4。
所述的报告载体pReport-N1-LacZ的锌指核酸酶识别序列***位点、核糖体结合位点和启动子的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；
所述的报告载体pReport-N2-EGFP的锌指核酸酶识别序列***位点、核糖体结合位点和启动子的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。
所述的报告载体pReport-N1-LacZ和pReport-N2-EGFP上均设有单拷贝控制元件。
所述的报告载体pReport-N1-LacZ中的抗生素筛选基因为aada基因，报告基因LacZ和aada基因通过串联表达序列相连接；
所述的报告载体pReport-N2-EGFP中的抗生素筛选基因为aada基因，报告基因EGFP和aada基因通过串联表达序列相连接；
串联表达序列的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。
所述的激活载体pAD-RNAP-alpha-GAL4中的RNA聚合酶α和激活元件GAL4通过表达五个氨基酸残基的linker序列连接。
所述的五个氨基酸残基为Gly-Ser-Ala-Ala-Ala。
所述的报告载体pReport-N1-LacZ、报告载体pReport-N2-EGFP中还通过锌指核酸酶识别序列***位点***锌指核酸酶识别序列。
所述的锌指蛋白识别序列为SEQ.ID.NO.4～SEQ.ID.NO.9所示的一种。
所述的报告载体pReport-N1-LacZ和激活载体pAD-RNAP-alpha-GAL4共转染于宿主细菌，构成LacZ报告***；
所述的报告载体pReport-N2-EGFP和激活载体pAD-RNAP-alpha-GAL4共转染于宿主细菌，构成EGFP报告***。
分别在LacZ报告***和EGFP报告***中转染待筛选的设有随机锌指蛋白和GAL11P元件的随机锌指库质粒；然后添加抗生素进行筛选阳性克隆，并根据报告基因的表达筛选出锌指蛋白质粒；再将LacZ报告***筛选到的锌指蛋白质粒通过EGFP报告***筛选，将EGFP报告***筛选到的锌指蛋白质粒通过LacZ报告***筛选。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明提供的筛选锌指蛋白的筛选***，是一种适用于从随机锌指质粒库中与锌指核酸酶识别序列相配合、识别的锌指蛋白，通过构建三种元件的配合，构建两套筛选***，再通过这两套***的交互筛选提高锌指蛋白筛选的活性。
巧妙利用三种元件的配合，从而实现锌指蛋白与锌指核酸酶识别序列特异性识别与报告基因表达指示的相关：
报告***中的启动子包括***位点和启动后续报告基因的启动子，在被激活的情况下启动后续的Laz报告基因和EGFP报告基因，实现不同的报告；
激活***中的RNAP-alpha GAL4，其中GAL4为激活元件，RNAP为启动报告***中的启动子；
而待筛选的随机锌指库质粒中，锌指蛋白主要是与锌指核酸酶识别序列的结合，Gal11p也是激活元件；
当将设有的随机锌指库质粒转染到含有报告载体与激活载体都转染到宿主细菌中，如果位于报告载体的待筛选锌指蛋白结合位点能与随机锌指质粒中的某个锌指蛋白相互作用，则激活载体上GAL4与随机锌指库质粒上的与该锌指蛋白序列结合的GAL11P元件靠近并结合，GAL4与GAL11P结合后促使RNA聚合酶α结合在报告载体的启动子区从而激活报告基因LacZ或EGFP的表达；如果待筛选的识别位点与锌指蛋白无相互作用则不能激活报告基因表达。
而两套***的相互验证是通过LacZ报告***筛选得到的单克隆，提取质粒转入EGFP***中鉴定EGFP活性；指通过EGFP报告***筛选得到的单克隆，提取质粒转入LacZ***中鉴定LacZ活性；通过两种***的报告提高了筛选锌指蛋白的特异性。
本发明提供的筛选锌指蛋白的筛选***，筛选容量大，效率高，毒性小的特点：首先筛选***利用报告载体的单拷贝性，替代过去细菌筛选***必须将序列整合进细菌基因组里进行筛选的方法，筛选过程高效简洁，细菌生长快，转化效率高所以可以简单且快速的检测大量的相互作用；其次，应用细菌作为宿主避免了酵母等作为宿主，其宿主蛋白影响目的蛋白之间的相互作用；同时真核蛋白转入酵母会对宿主产生毒性，转入细菌就减少了细胞毒性的产生。
本发明提供的筛选锌指蛋白的筛选***，以牛β酪蛋白基因上的锌指核酸酶识别位点为靶标，设计酪蛋白基因上的锌指核酸酶识别半位点，从随机锌指质粒库中筛选锌指蛋白，同时通过链霉素筛选与LacZ和链霉素与EGFP两个报告***得到高特异性的锌指蛋白，并且筛选得到的锌指蛋白已经在牛成纤维细胞上进行了验证，其效果良好。
附图说明
图1为pRport-LacZ质粒图谱；
图2为HindIII与AvrII双酶切pMD19T-T-A与pRport-N1电泳图谱；
图3为pRport-EGFP质粒图谱；
图4为HindIII和AvrII双酶切pReport-N2和PMD19T-T-E-A电泳图谱；
图5为pAD-R-G质粒图谱；
图6为pAD-R-G酶切鉴定电泳图谱；
图7为NheI与ASCI双酶切报告载体pReport-N1-T-L-A电泳图谱；
图8为PCR鉴定***牛酪蛋白半结合位点的报告载体pReport-N1-T-L-A-CN鉴定图谱；
图9为Bsu36I酶切切报告载体pReport-N2-T-E-A电泳图谱；
图10为PCR鉴定***牛酪蛋白半结合位点的报告载体pReport-N2-T-E-A-CN鉴定图谱；
图11-1～11-2为报告载体、激活载体与随机锌指质粒结合筛选***的原理图；
图12为PCR鉴定筛选得到的锌指蛋白。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
1、报告载体pReport-N1-LacZ的构建
1.1设计重叠引物LWP1，LWP2，LWP3，LWP4，通过重叠PCR获得包含Asc I和Nhe I两个酶切位点(通过这两个酶切位点将锌指核酸酶识别序列***)及-35、-10(弱启动子)、lac operator(乳糖启动子操纵子)和RBS(核糖体结合位点)基本元件的序列；所述的引物具体为：
LWP-1：gtacatgcat gctgtggaag ggcgcgcctg gctcgtaggc cgctagc；
LWP-2：cggaagcata aagtgtaaag cccggggtgc ctaatgctag cggcctacg；
LWP-3：ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtcg aattgtgagc ggataac；
LWP-4：cggcctaggc ataagctttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcac。
第一轮分别扩增LWP12和LWP34片段；其扩增条件分别为：
LWP14ul；LWP24ul；pfu Mix(2x)25ul；ddH2O 17ul；
LWP34ul；LWP2/LWP44ul；pfu Mix(2x)25ul；ddH2O 17ul；
扩增程序均为：95℃3min；95℃30s、50℃30s、72℃30s，10cycle；72℃10min；
第二轮扩增LWP1234片段；其扩增条件为：
LWP1212.5ul；LWP3412.5ul；pfu Mix(2x)12.5ul；ddH2O 12.5ul；
扩增程序均为：95℃3min；95℃30s、55℃30s、72℃30s，10cycle；72℃10min；
第三轮扩增LWP片段；其扩增条件为：
LWP12341ul；LWP15ul；LWP45ul；pfu Mix 12.5ul；ddH2O 12.5ul；
扩增程序均为：95℃3min；95℃30s、60℃30s、72℃30s，30cycle；72℃10min；
LWP片段PCR产物用2.5％琼脂糖电泳后，用胶回收试剂盒回收149bpDNA片段。
将载体pReport和LWP片段分别用AvrII和SphI双酶切后，用T4连接酶连接(16℃水浴过夜连接)后得到载体pReport-N1。其中N1表示所构建的启动子，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，通过其实现锌指核酸酶识别序列的***(Asc I和Nhe I两个酶切位点)以及lacz报告基因的启动。
将pReport-N1载体转化DH5α感受态细胞。将转化产物均匀涂布在含有100ug/ml amp的LB固体培养基的平板中，37℃倒置培养12h后，挑去单菌落，通过菌落PCR鉴定后，选取正确单菌落测序。选取测序正确单菌落，培养100ml菌液，用OMGA中提试剂盒提取质粒。
1.2以载体pMD19T为基本骨架串联aada基因和lacz基因构建pMD19T-T-L-A载体
1.2.1设计引物TES-1、TES-2通过重叠PCR扩增TES序列；TES-1、TES-2具体为：
TES-15′GCCGTCGACTAACCGGGCAGGCCATGTCTGCCCGTATTTCG 3′
TES-25′CGCGGATCCTTTCCTTACGCGAAATACGGGCAGACATGG 3′
TES序列的扩增体系为：pfu Mix 25ul；TES-15ul；TES-25ul；ddH2O15ul；
扩增程序为：95℃3min；95℃30s、57℃30s、72℃15s，10cycle；72℃4min；最终得到的TES序列如SEQ.ID.NO.3所示；
回收扩增的TES序列后，分别用BamH I和Sal I双酶切载体PMD-19T和TES序列，用Solution I(Takara code D6022A)连接(16℃水浴过夜连接)后得到载体PMD19T-T；
将PMD19T-T载体转化DH5α感受态细胞，将转化产物均匀涂布在含有100ug/ml amp的LB固体培养基的平板中，37℃倒置培养12h后，挑去单菌落，通过菌落PCR鉴定后，选取正确单菌落测序。选取测序正确单菌落，培养100ml菌液，用OMGA中提试剂盒提取质粒。
1.2.2设计引物Sm-F、Sm-R，以载体pCDFDuet-1为模板扩增aada片段，Sm-F、Sm-R具体为：
Sm-F：ggggatccat gagggaagcg gtgat；
Sm-R：gctgaattcc taggtcaggc atttgagaag c；
扩增程序为：95℃3min；95℃45s、53℃30s、72℃90s，30cycle；72℃4min；
回收扩增的aada片段后，分别用EcoR I和BamH I双切载体pMD19T-T和aada片段，以在TES片段下游***链霉素表达基因(aada)，用Solution I连接(Takara code D6022A)(16℃水浴过夜连接)后得到载体PMD19T-T-A；
将PMD19T-T-A载体转化DH5α感受态细胞，将转化产物均匀涂布在含有100ug/ml amp的LB固体培养基的平板中，37℃倒置培养12h后，挑去单菌落，通过菌落PCR鉴定后，选取正确单菌落测序。选取测序正确单菌落，摇菌，提试剂盒提取质粒。
1.2.3设计引物对LacZ-F、LacZ-R，以载体pLenti6/V5-GW/lacZ为模板扩增LacZ基因，LacZ-F、LacZ-R具体为：
LacZ-F：gggcagcga agcttatgat agatcccgtc g；
LacZ-R：cgcggtcgac ttattatttt tgacaccaga cca；
扩增程序为：95℃3min；95℃45s、60℃30s、72℃5min，30cycle；72℃10min；
回收扩增的LacZ，分别用Sal I和Sph I双切载体pMD19T-T-A和LacZ，以在TES序列上游***LacZ基因的读码框，用Solution I(Takara codeD6022A)连接(16℃水浴过夜连接)后得到载体PMD19T-T-L-A；
将PMD19T-T-L-A载体转化DH5α感受态细胞，将转化产物均匀涂布在含有100ug/ml amp的LB固体培养基的平板中，37℃倒置培养12h后，挑去单菌落，通过菌落PCR鉴定后，选取正确单菌落测序。选取测序正确单菌落，摇菌，提试剂盒提取质粒。
1.2.3通过HindIII和AvrII双酶切pReport-N1和pMD19T-T-L-A载体，回收相应片段，连接两片段用Solution I(Takara code D6022A)连接(16℃水浴过夜连接)得到基本报告载体pReport-N1-LacZ(pReport-N1-T-L-A)。其质粒图谱如图1所示，可以看到上述构建的元件的排列如下：N1启动子(RBS、Asc I/Nhe I酶切位点及-35、-10、lac operator、)lacZ、TES、Aada。
所构建的pReport-N1和pMD19T-T-L-A双酶切图谱如图2所示，其中M为Trans15K。泳道1为pMD19T-T-L-A载体质粒；泳道2，3为HindIII与AvrII双酶切pMD19T-T-L-A载体结果，大小为4071bp；泳道4，5为HindIII与AvrII双酶切pReport-N1结果，大小为12309bp；泳道6为pReport-N1质粒条带.
将pReport-LacZ载体转化DH5α感受态细胞，将转化产物均匀涂布在含有100ug/ml amp的LB固体培养基的平板中，37℃倒置培养12h后，挑去单菌落，通过菌落PCR鉴定后，选取正确单菌落测序。选取测序正确单菌落，摇菌，提试剂盒提取质粒。
2、载体pReport-N2-EGFP的构建
2.1设计重叠引物EWP-1、EWP-2、EWP-3、EWP-4，通过重叠PCR获得连续两个Bsu36I酶切位点及-35、-10、lac operator和RBS基本元件的序列，所述的引物具体为：
EWP-1：gccatcgatt gtggaagggc gcgcctggct cgtaggccgc atgc；
EWP-2：cggaagcata aagtgtaaag cccggggtgc ctaatcctaa ggggcctac；
EWP-3：ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtcg aattgtgagc ggataac；
EWP-4：cggcctaggc ataagctttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcac；
第一轮分别扩增EWP12和EWP34片段；其扩增条件分别为：
EWP14ul；EWP24ul；pfu Mix(2x)25ul；ddH2O 17ul；
EWP34ul；EWP2/LWP44ul；pfu Mix(2x)25ul；ddH2O 17ul；
扩增程序均为：95℃3min；95℃30s、50℃30s、72℃30s，10cycle；72℃10min；
第二轮扩增EWP1234片段；其扩增条件为：
EWP1212.5ul；EWP3412.5ul；pfu Mix(2x)12.5ul；ddH2O 12.5ul；
扩增程序均为：95℃3min；95℃30s、55℃30s、72℃30s，10cycle；72℃10min；
第三轮扩增EWP片段；其扩增条件为：
EWP12341ul；LWP15ul；LWP45ul；pfu Mix 12.5ul；ddH2O 12.5ul；
扩增程序均为：95℃3min；95℃30s、60℃30s、72℃30s，30cycle；72℃10min；
EWP片段PCR产物用2.5％琼脂糖电泳后，用胶回收试剂盒回收146bpDNA片段。
将载体pReport和EWP片段分别用AvrII和Sph I双酶切后，用T4连接酶连接(16℃水浴过夜连接)后得到载体pReport-N2。其中N2表示所构建的启动子，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，通过其实现锌指核酸酶识别序列的***(两个Bsu36I酶切位位点)以及EGFP报告基因的启动。
将pReport-N2载体转化DH5α感受态细胞。将转化产物均匀涂布在含有100ug/ml amp的LB固体培养基的平板中，37℃倒置培养12h后，挑去单菌落，通过菌落PCR鉴定后，选取正确单菌落测序。选取测序正确单菌落，培养100ml菌液，用OMGA中提试剂盒提取质粒。
2.2以载体pMD19T为基本骨架串联aada基因和EGFP基因构建pMD 19T-T-E-A载体
2.2.1设计引物对EGFP-F、EGFP-R，以载体pEGFP-C1为模板扩增EGFP基因，EGFP-F、EGFP-R具体为：
EGFP-F：gctgcatgcg aagcttagg tgagcaaggg；
EGFP-R：ggagtcgact tattacttgt acagctcgtc catgcc；
扩增程序为：95℃3min；95℃45s、60℃30s、72℃90s，30cycle；72℃10min；
回收扩增的EGFP，分别用Sal I和Sph I双切载体pMD19T-T-A和EGFP，用Solution I连接(16℃水浴过夜连接)，从而TES序列上游***EGFP，得到载体PMD19T-T-E-A；
将PMD19T-T-E-A载体转化DH5α感受态细胞，将转化产物均匀涂布在含有100ug/ml amp的LB固体培养基的平板中，37℃倒置培养12h后，挑去单菌落，通过菌落PCR鉴定后，选取正确单菌落测序。选取测序正确单菌落，摇菌，提试剂盒提取质粒。
2.2.2通过HindIII和Avr II双酶切pReport-N2和PMD19T-T-E-A载体，回收相应片段，连接两片段用Solution I连接(16℃水浴过夜连接)得到基本报告载体pReport-N2-EGFP(pReport-N2-T-E-A)。其质粒图谱如图2所示，可以看到上述构建的元件的排列如下：N2启动子(RBS、两个Bsu36I酶切位点及-35、-10、lac operator、)EGFP、TES(串联表达序列)、Aada。
双酶切pReport-N2和PMD19T-T-E-A载体图谱如图4所示：其中M为frans15k；泳道1为pReport-N2被HindIII和AvrII双切，其双切后的大小为12461bp；泳道2为PMD19T-T-E-A被HindIII和AvrII双切，其双切后的大小1731bp。
将pReport-EGFP载体转化DH5α感受态细胞，将转化产物均匀涂布在含有100ug/ml amp的LB固体培养基的平板中，37℃倒置培养12h后，挑去单菌落，通过菌落PCR鉴定后，选取正确单菌落测序。选取测序正确单菌落，摇菌，提试剂盒提取质粒。
3、激活载体pAD-RNAP-alpha GAL4(pAD-R-G)的构建
3.1以载体pBD-LGF2为模板扩增Gal4片段，扩增引物为：
Gal4-F：ggcgcggccg cagaatcaa；
Gal4-R：ctcgaactag ttcaaaataa tcctgttaac aat；
扩增程序为：95℃3min；95℃30s、57℃45s、72℃45s，35cycle；72℃10min；
回收扩增的Gal4，分别用Not I和Spe I双切载体pTRG和Gal4，T4DNA连接酶16℃过夜连接后，得到载体pTRG-R-G；
将pTRG-R-G载体转化DH5α感受态细胞，将转化产物均匀涂布在含有100ug/ml amp的LB固体培养基的平板中，37℃倒置培养12h后，挑去单菌落，通过菌落PCR鉴定，选取正确单菌落测序。选取测序正确单菌落，摇菌，提试剂盒提取质粒。
3.2以pTRG-R-G载体为模板扩增RNAP-alpha GAL4，扩增引物为：
28R-F：ctcgaattca aataagtgcc ttcccatca；
28R-R：gcgagatctc gctcagtgga acgaaaa；
扩增程序为：95℃3min；95℃45s、60℃45s、72℃90s，30cycle；72℃10min；
回收扩增的RNAP-alpha GAL4，分别用BglII与NcoI双切载体pAD及RNAP-alpha GAL4，T4DNA连接酶16℃过夜连接后，得到载体pAD-R-G；其质粒图谱如图5所示，可以看到目标元件RNAP-alpha GAL4克隆到相应的位置。其酶切鉴定结果如图6所示：M1为Trans 2k plus DNA Marker；M2Trans 15k DNA Marker；1、2为pAD-R-G激活载体的两个不同单克隆酶切结果，两个片段大小分别为5582bp和885bp。
4、为了验证上述两个报告载体，具体的以牛β酪蛋白基因上的锌指核酸酶识别位点为靶标，设计以下酪蛋白基因上的锌指核酸酶识别半位点：
具体设计以下三个锌指核酸酶识别位点CNS1，CNS2，CNS3(分别如SEQ.ID.NO.4～9所示)。每个识别位点包括了左右两个半识别位点，下划线部分为左右两个半结合位点序列。
CNS1：1882TAGAAGCAACTATAAAGATTTGTAAC 1907
1882ATCTTCGTTGATATTTCTAAACATTG 1907
CNS2：3706CATCCTTGCCTGCCTGGTGGCTCTG 3730
3706GTAGGAACGGACGGACCACCGAGAC 3730
CNS3：3723TGGCTCTGGCCCTTGCAAGAGAGGTA3748
3723ACCGAGACCGGGAACGTTCTCTCCAT3748
合成CNS1、CNS2、CNS3三个位点上6个半位点引物，通过退火获得6个半位点***序列：CNS1Y，CNS1Z，CNS2Y，CNS2Z，CNS3Y，CNS3Z。
其中，Y代表锌指核酸酶右边的半识别位点，Z代表锌指核酸酶左边的半识别位点。
将设计得到的酪蛋白基因上的锌指核酸酶识别半位点分别通过Asc I和Nhe I***pReport-N1-T-L-A报告载体中得到报告载体pReport-N1-T-L-A-CN，其中CN代表CNS1Y、CNS1CNS2Y、CNS2Z、CNS3Y或CNS3Z；
Asc I和Nhe I双切pReport-N1-T-L-A报告载体如图7所示：其中M为trans15k，1为质粒，2为双酶切条带，大小为16360bp。
PCR鉴定报告载体pReport-N1-T-L-A-CN如图8所示：其中M为trans5k，1-22为挑取单克隆PCR鉴定条带，条带大小为750bp，其1，2，4，5，6，7，8，9，12，13，14，15，16，19，20为阳性克隆。
同时将设计得到的酪蛋白基因上的锌指核酸酶识别半位点通过两个Bsu36I酶切位点***pReport-N2-T-E-A报告载体中得到pReport-N2-T-E-A-CN，其中CN代表CNS1Y、CNS1CNS2Y、CNS2Z、CNS3Y或CNS3Z；
Bsu36I酶切pReport-N2-T-E-A报告载体如图9所示：其中M为trans15k；1为pReport-N2-EGFP Bsu361酶切图，其大小为14142bp；2为质粒pReport-N2-EGFP。
PCR鉴定pReport-N2-T-E-A-CN如图10所示：其中M为trans2Kplus；1，2为PCR鉴定条带，目的条带的大小为750bp。半位点中心位于转录起点-62，为最佳的结合位点。
5、为了更好的实现锌指蛋白的筛选，将能够相互作用的Gal11p、Gal4分别设置在随机锌指库质粒和激活载体当中。Gal11p可以与Gal4两者相互作用，能够调控启动子转录与否，已被广泛应用于蛋白质与蛋白质或做研究中，如细菌双杂交***和酵母双杂交***。
如图11-1、11-2所示，当将设有的随机锌指库质粒转染到含有报告载体与激活载体都转染到宿主细菌中，如果位于报告载体的待筛选锌指蛋白结合位点能与随机锌指质粒中的某个锌指蛋白相互作用，则激活载体上GAL4与随机锌指库质粒上的与该锌指蛋白序列结合的GAL11P元件靠近并结合，GAL4与GAL11P结合后促使RNA聚合酶α结合在报告载体的启动子区从而激活报告基因LacZ或EGFP的表达(图11-1所示)；如果待筛选的识别位点与锌指蛋白无相互作用则不能激活报告基因表达(图11-2所示)。
6、锌指蛋白的筛选及条件优化
1)将pAD-R-G载体转入DH5a中制备感受态细胞(参照分子克隆第二版超级感受态的制备方法)，然后其中一部分转入pReport-N1-T-L-A-CN报告载体得到包含两种质粒的菌株DH5a-L，另一部分转入pReport-N2-T-E-A-CN报告载体得到包含两种质粒的菌株DH5a-E。
2)分别用包含两种质粒的菌株DH5a-L与菌株DH5a-E制备电转化细胞：接菌1％的新鲜菌种于SOB液体培养液，37℃培养8-10h至OD为0.8-1.0之间，接1ml菌液于100ml灭菌SOC培养液中于25℃-37℃培养，待OD为0.6时，收集100ml菌体，4℃，3000g离心5min，去上清，10％甘油洗菌体，4℃，5000g离心5min，重复两次，用400ul10％甘油悬浮菌体，以上步骤都在冰上操作。
3)电转化条件：将锌指蛋白库质粒浓度10ug到20ug每1ul为一梯度加入制备好的电转化感受态细胞中，1500-2500v电击5ms，冰上放置6min-8min，加入SOC培养液，37℃，120rpm摇菌1h，将摇菌所得的菌体涂于多种抗生素的固体培养基上筛选。调整各种抗生素的浓度，调整好培养液、培养基中葡萄糖的用量。电击杯规格：Gap(mm)2.0，Minimum Volume 40μl，Maximum Volume 400μl。电转化随机锌指库，将锌指库质粒加入制备的电转化细胞中，冰上操作。电击1800v-2500v，5ms。
电击后冰上放置6min，然后加入SOC液体培养液，37℃，120rpm培养1h后涂含多种抗生素的固体培养基上，37℃倒置培养。挑取单克隆鉴定。
并且LacZ报告***中要加入X-gal用来显示LacZ的活性。
4)锌指蛋白的筛选及条件优化结果：
制备电转化感受态细胞最佳的摇菌温度为26.7℃，确定电转化时最佳的电击条件为2000v，5ms，细胞的损伤最小。
确定最终的抗生素浓度kan为30ug/m；Cm为34ug/ml；Amp为50ug/ml；Sm的浓度＜80ug/ml，0.2％gluclose，IPTG为50uM。
5)在报告载体报告表达后，PCR鉴定筛选得到的锌指蛋白，结果如图12所示：其中M为50bpmarker(从下而上为50bp，100bp，150bp，200bp，250bp，300bp，400bp，500bp)1-7为筛选得到菌株质粒PCR结果，片段大小为273bp。
6)锌指蛋白EGFP/LacZ活性的测定
筛选得到的锌指蛋白抗链霉素浓度高达80ug/ml，得到的锌指蛋白测定EGFP/LacZ活性。提取所得单克隆的质粒，经过两次重接与两次重转得到纯度较高的随机锌指蛋白质粒，将LacZ***筛选到的锌指蛋白质粒转EGFP***，测定其EGFP强度；将EGFP***筛选到的锌指蛋白质粒转LacZ***测定其LacZ活性。两种***的交互使用加强了筛选得到的锌指蛋白的可信度。PCR并测序鉴定所筛选到的锌指蛋白。
其中Lac活性测定的方法：从玻璃皿中挑取筛选得到的单克隆，接于含多种抗生素(kan为30ug/m；Cm为34ug/ml；Amp为50ug/ml；Sm的浓度为40ug/ml)的soc培养液中，37℃，200rpm过夜摇菌。将过夜摇得的菌液100ul接于新鲜的soc培养液中37℃，200rpm摇至OD至0.8左右。收集菌体(12000rpm离心1min)，用Z Buffer洗剂菌体2次以除去残留的培养液，稀释菌体使得其od600介于0.8左右，将所得的菌液200ul加入96孔板中用od仪准确测定每个菌液OD600值，以pReprorT-N1-LacZ质粒菌株为对照组，以Z Buffer溶液为误差对照组。取100ul菌液加入11ul的裂解液A，室温下裂解15min。将Z Buffer含巯基乙醇135ul，30ml 4mg/ml的ONPG混匀加入9孔板中然后将所得的裂解液取15ul加入，混匀。应用动态法测定OD420值，测定50分钟内OD420值的变化，每隔50秒测定一次，以Z Buffer含巯基乙醇及ONPG混合物做对照组。以时间轴对得到的OD420值作图，所得的趋势线斜率为ONPG的裂解速率(V)，利用公式LacZ活性＝V*1000/OD600得到最终的LacZ活性。测得lacz活性如表1所示，相对于对照组，实验组即筛选得到的锌指蛋白明显提高了lacz的活性。
表1筛选的锌指蛋白的lacz的活性
| control | CSNY1 | CSNY5 | CSNY9 | CNSZ3 | CNSZ4 | CNSZ16 | |
| OD600 | 0.773 | 0.796 | 0.673 | 0.788 | 0.77 | 0.888 | 0.865 |
| velocity | 0 | 0.0101 | 0.0108 | 0.0111 | 0.01 | 0.0114 | 0.0096 |
| activity | 0 | 12.74 | 16.05 | 14.10 | 13.0 | 12.84 | 11.10 |
而EGFP强度测定的方法：从玻璃皿中挑取筛选得到的单克隆，接于含多种抗生素(kan为30ug/m；Cm为34ug/ml；Amp为50ug/ml；Sm的浓度为40ug/ml)的soc培养液中，37℃，200rpm过夜摇菌。将过夜摇得的菌液100ul接于新鲜的soc培养液中37℃，200rpm摇至OD至0.8左右。收集菌体(12000rpm离心1min)，用磷酸钠洗剂菌体2次以除去残留的培养液，稀释菌体使得其od600介于0.5左右，将所得的菌液200ul加入96孔酶标板中用酶标仪准确测定每个菌液OD600值，以报告载体菌株pReprorT-EGFP为对照组，用磷酸钠溶液为误差对照组。然后测定其荧光强度，荧光强度的测定条件，应用酶标仪设定荧光激发光波长为491nm，荧光的发射波长为511nm，EGFP强度的测定在低于22℃下进行。测定的荧光强度/OD600为最终菌株的荧光强度。测定的EGFP活性如表2所示，相对于对照组，实验组即筛选得到的锌指蛋白明显提高了EGFP的表达。
表2筛选的锌指蛋白的EGFP的活性
应用上述构建的筛选***，对于牛β酪蛋白基因上的锌指核酸酶结合位点进行筛选，得到了高效的锌指蛋白。通过抗生素筛选、lacz活性测定及EGFP的高表达验证了筛选得到的锌指蛋白的活性，并且筛选得到的锌指蛋白已经在牛成纤维细胞上进行了验证，其效果良好。
Claims (10)
1.一种筛选锌指蛋白的筛选***，其特征在于，包括两个报告载体pReport-N1-LacZ、pReport-N2-EGFP和一个激活载体pAD-RNAP-alpha-GAL4；
所述的报告载体pReport-N1-LacZ包括锌指核酸酶识别序列***位点、核糖体结合位点和启动子，在启动子的下游设有报告基因LacZ和抗生素筛选基因；
所述的报告载体pReport-N2-EGFP包括锌指核酸酶识别序列***位点、核糖体结合位点和启动子，在启动子的下游设有报告基因EGFP和抗生素筛选基因；
所述的激活载体pAD-RNAP-alpha-GAL4包括RNA聚合酶α和激活元件GAL4。
2.如权利要求1所述的筛选锌指蛋白的筛选***，其特征在于，所述的报告载体pReport-N1-LacZ的锌指核酸酶识别序列***位点、核糖体结合位点和启动子的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；
所述的报告载体pReport-N2-EGFP的锌指核酸酶识别序列***位点、核糖体结合位点和启动子的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。
3.如权利要求1所述的筛选锌指蛋白的筛选***，其特征在于，所述的报告载体pReport-N1-LacZ和pReport-N2-EGFP上均设有单拷贝控制元件。
4.如权利要求1所述的筛选锌指蛋白的筛选***，其特征在于，所述的报告载体pReport-N1-LacZ中的抗生素筛选基因为aada基因，报告基因LacZ和aada基因通过串联表达序列相连接；
所述的报告载体pReport-N2-EGFP中的抗生素筛选基因为aada基因，报告基因EGFP和aada基因通过串联表达序列相连接；
串联表达序列的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。
5.如权利要求1所述的筛选锌指蛋白的筛选***，其特征在于，所述的激活载体pAD-RNAP-alpha-GAL4中的RNA聚合酶α和激活元件GAL4通过表达五个氨基酸残基的linker序列连接。
6.如权利要求5所述的筛选锌指蛋白的筛选***，其特征在于，所述的五个氨基酸残基为Gly-Ser-Ala-Ala-Ala。
7.如权利要求1所述的筛选锌指蛋白的筛选***，其特征在于，所述的报告载体pReport-N1-LacZ、报告载体pReport-N2-EGFP中还通过锌指核酸酶识别序列***位点***锌指核酸酶识别序列。
8.如权利要求7所述的筛选锌指蛋白的筛选***，其特征在于，所述的锌指蛋白识别序列为SEQ.ID.NO.4～SEQ.ID.NO.9所示的一种。
9.如权利要求7所述的筛选锌指蛋白的筛选***，其特征在于，所述的报告载体pReport-N1-LacZ和激活载体pAD-RNAP-alpha-GAL4共转染于宿主细菌，构成LacZ报告***；
所述的报告载体pReport-N2-EGFP和激活载体pAD-RNAP-alpha-GAL4共转染于宿主细菌，构成EGFP报告***。
10.如权利要求7所述的筛选锌指蛋白的筛选***，其特征在于，分别在LacZ报告***和EGFP报告***中转染待筛选的设有随机锌指蛋白和GAL11P元件的随机锌指库质粒；然后添加抗生素进行筛选阳性克隆，并根据报告基因的表达筛选出锌指蛋白质粒；再将LacZ报告***筛选到的锌指蛋白质粒通过EGFP报告***筛选，将EGFP报告***筛选到的锌指蛋白质粒通过LacZ报告***筛选。
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