CN102656185B - 杀虫基因的axmi-192家族和使用它们的方法 - Google Patents

Abstract

提供了对细菌、植物、植物细胞、组织和种子赋予杀虫活性的组合物和方法。提供了包含毒素多肽编码序列的组合物。所述编码序列可以在用于植物和细菌中转化和表达的DNA构建体或表达盒中使用。组合物也包含转化的细菌、植物、植物细胞、组织和种子。特别地，提供了分离的毒素核酸分子。另外，本发明包含与所述多核苷酸对应的氨基酸序列和与那些氨基酸序列特异性结合的抗体。特别地，本发明提供了分离的核酸分子以及其变体和片段，所述分离的核酸分子包含编码SEQ ID NO：28‑62中所示氨基酸序列的核苷酸序列或SEQ ID NO：1‑27中所示的核苷酸序列。

Description

杀虫基因的AXMI-192家族和使用它们的方法

相关申请的交互参考

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发明领域

本发明涉及分子生物学领域。提供了编码杀虫蛋白的新基因。这些蛋白质和编码它们的核酸序列在制备杀虫制剂中并且在产生转基因抗害虫植物中有用。

发明背景

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)是形成孢子的革兰氏阳性土壤细菌，其特征在于它产生晶状包涵体的能力，其中所述的晶状包涵体特异性地对某些目和种的昆虫有毒，但是对植物和其他非靶向的生物无害。出于这个原因，包括苏云金芽孢杆菌菌株或它们的杀昆虫性蛋白质的组合物可以作为环境可接受的杀虫剂用来控制农业害虫或多种人或动物疾病的昆虫媒介。

来自苏云金芽孢杆菌的晶体(Cry)蛋白(Δ-内毒素)具有主要针对鳞翅目的、双翅目的和鞘翅目的幼虫的强力杀昆虫活性。这些蛋白质也显示针对膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、虱目(Phthiraptera)、食毛目(Mallophaga)和蜱螨亚纲(Acari)害虫类以及其他无脊椎动物类如线虫类动物(Nemathelminthe)、扁形虫(Platyhelminthe)和Sarcomastigorphora的活性(Feitelson(1993)The Bacillus Thuringiensis familytree.在Advanced Engineered Pesticides中，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.)。这些蛋白质起初主要基于它们的杀昆虫活性分类为CryI至CryV。主要类型是鳞翅目特异的(I)、鳞翅目与双翅目特异的(II)、鞘翅目特异的(III)、双翅目特异的(IV)和线虫特异的(V)与(VI)。所述蛋白质进一步划分成亚家族；每个家族内部更高度相关的蛋白质被给予区分性字母如Cry1A、Cry1B、Cry1C等。在每个部分内部甚至更密切相关的蛋白质给予名称，如Cry1C1、Cry1C2等。

基于氨基酸序列同源性而非昆虫靶特异性，最近描述了Cry基因的一种新命名法(Crickmore等人，(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62：807-813)。在这种新分类中，每种毒素赋予一个独特名称，包含初阶(***数字)、次阶(大写字母)、三阶(小写字母)和四阶(另一个***数字)。在这个新分类法中，罗马数字已经更换为初阶中的***数字。序列同一性小于45％的蛋白质具有不同的初阶，并且次阶和三阶的标准分别是78％和95％。

晶体蛋白在昆虫中肠中被摄取和溶解之前不显示杀昆虫活性。所摄取的前毒素(protoxin)由昆虫消化道中的蛋白酶水解成活性有毒分子。(和Whiteley(1989)Microbiol.Rev.53：242-255)。这种毒素与靶幼虫中肠中的顶部刷状缘受体结合并***顶膜，产生离子通道或孔，从而导致幼虫死亡。

Δ-内毒素通常具有5个保守的序列结构域和3个保守的结构性结构域(见，例如，de Maagd等人，(2001)Trends Genetics 17：193-199)。第一个保守的结构性结构域由7个α螺旋组成并且参与膜***和孔形成。结构域II由以希腊钥构型排列的3个β-片层组成，并且结构域III由“簿卷饼型”形式的2个反平行β-片层组成(de Maagd等人，2001，见上文)。结构域II和III参与受体识别和结合，并且因此被视为毒素特异性的决定因素。

除Δ-内毒素之外，还存在几种其他已知类型的杀虫蛋白毒素。VIP1/VIP2毒素(见，例如，美国专利号5,770,696)是通过下述机制对昆虫显示强烈活性的双元杀虫毒素，其中所述机制据信涉及受体介导的内吞作用，随后是细胞中毒，其类似于其他双元(“A/B”)毒素的作用模式。A/B毒素如VIP、C2、CDT、CST或炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)水肿和致死毒素起初借助作为单体的“B”组分的受体介导的特异性结合与靶细胞相互作用。这些单体随后形成同七聚体。“B”七聚体-受体复合体随后作为停靠平台发挥作用，所述的停靠平台依次结合并允许酶促“A”组分借助受体介导的内吞作用转位至细胞溶胶中。一旦在细胞的细胞溶胶内部，“A”组分通过例如G-肌动蛋白的ADP-核糖基化或增加环AMP(cAMP)胞内水平抑制正常的细胞功能。见Barth等人，(2004)Microbiol Mol Biol Rev 68：373-402。

密集使用基于苏云金芽孢杆菌的杀虫剂已经在小菜蛾(Plutella xylostella)田间种群中导致抗性(Ferré和Van Rie(2002)Annu.Rev.Entomol.47：501-533)。最常见的抗性机制是减少毒素与其特异性中肠受体的结合。这也可以赋予针对相同受体的其他毒素的交叉抗性(Ferré和Van Rie(2002))。

发明概述

提供了用于赋予害虫抗性至细菌、植物、植物细胞、组织和种子的组合物和方法。组合物包括编码毒素多肽的序列的核酸分子、包含这些核酸分子的载体和包含所述载体的宿主细胞。组合物也包括该毒素的多肽序列和针对那些多肽的抗体。所述核苷酸序列可以在用于生物(包括微生物和植物)中转化和表达的DNA构建体或表达盒中使用。所述核苷酸或氨基酸序列可以是已经设计用于在生物中表达的合成序列，所述的生物包括但不限于微生物和植物。组合物也包含转化的细菌、植物、植物细胞、组织和种子。

特别地，提供了与毒素核酸序列对应的分离的或者重组的核酸分子。额外地，包括与所述多核苷酸相对应的氨基酸序列。特别地，本发明提供了分离的核酸分子以及其变体和片段，所述的分离核酸分子包含编码任一SEQ ID NO：28-62所示氨基酸序列的核苷酸序列或任一SEQ ID NO：1-27所示的核苷酸序列。也包括与本发明核苷酸序列互补或与本发明序列杂交的核苷酸序列。

本发明的组合物和方法用于产生具有杀虫剂抗性的生物，特别地是细菌和植物。这些生物和从它们衍生的组合物对农业目的而言是希望的。本发明的组合物也用于产生具有杀虫活性的改变或改良的毒素蛋白，或用于检测产品或生物中毒素蛋白或核酸的存在。

发明详述

本发明涉及用于调节生物中、特别是植物或植物细胞中害虫抗性或耐受性的组合物和方法。“抗性”意指摄取或者另外地接触本发明的多肽后杀死害虫(例如昆虫)。“耐受性”意指削弱或者降低害虫的移动、进食、繁殖或者其他功能。所述方法涉及用编码本发明杀虫蛋白的核苷酸序列转化生物。特别地，本发明的核苷酸序列用于制备拥有杀虫活性的植物和微生物。因而，提供了转化的细菌、植物、植物细胞、植物组织和种子。组合物是细菌物种的杀虫核酸和蛋白质。所述序列用于构建随后转化至目的生物中的表达载体，作为探针用于分离其他同源的(或部分同源的)基因，和用于通过本领域已知方法(如结构域交换法(domain swapping)或DNA改组法)产生改变的杀虫蛋白。所述蛋白质用于控制或杀死鳞翅目的、鞘翅目的、双翅目的和线虫类的害虫种群并且用于产生具有杀虫活性的组合物。

“杀虫毒素”或“杀虫蛋白”意指针对一种或多种害虫具有毒害活性的毒素或者与该蛋白质具有同源性的蛋白质，其中所述的害虫包括但不限于鳞翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)和鞘翅目(Coleopter)或线虫纲(Nematoda)的成员。杀虫蛋白已经从生物，包括例如芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)、双酶梭菌(Clostridium bifermentans)和Paenibacillus popilliae分离。杀虫蛋白包括从本文所公开的全长核苷酸序列推导的氨基酸序列和因使用下游备选起始位点或因产生具有杀虫活性的更短蛋白质的加工作用而短于全长序列的氨基酸序列。加工可以在表达该蛋白质的生物中或在摄取该蛋白质后的害虫中发生。

在多个实施方案中，本文中所公开的序列与Δ-内毒素蛋白具有同源性。Δ-内毒素包括鉴定为cry1至cry53、cyt1和cyt2和Cyt样毒素的蛋白质。目前存在超过250个具有广泛类型特异性和毒性的Δ-内毒素已知种类。对于广泛列表，见Crickmore等人(1998)，Microbiol.Mol.Biol.Rev.62：807-813，并且对于定期更新内容，见在www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index处的Crickmore等人(2003)“Bacillus thuringiensis toxin nomenclature(苏云金芽孢杆菌毒素命名法)”。在一些实施方案中，本文中所公开的Δ-内毒素序列包括任一SEQ ID NO：1-27所述的核苷酸序列、任一SEQ ID NO：28-62所述的氨基酸序列、以及它们的变体和片段。

因此，本文提供了新分离的或重组的赋予杀虫活性的核苷酸序列。还提供了杀虫蛋白质的氨基酸序列。产生自这种基因的翻译的蛋白质允许细胞控制或者杀死摄取它的害虫。

分离的核酸分子及其变体和片段

本发明的一个方面涉及分离或重组的核酸分子，其包含编码杀虫蛋白和多肽或其生物学活性部分的核苷酸序列，以及这样的核酸分子，其足以用作杂交探针来鉴定编码具有序列同源性区域的蛋白质的核酸分子。如本文中所用，术语“核酸分子”意图包括DNA分子(例如，重组DNA、cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如，mRNA)和使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。核酸分子可以是单链的或双链的，但优选是双链DNA。

本文中所用的“分离的”核酸序列(或DNA)指已不再在其天然环境，例如在体外或者在重组的细菌或植物宿主细胞中的核酸序列(或DNA)。在一些实施方案中，“分离的”核酸不含在衍生该核酸的生物的基因组DNA中天然分布于该核酸侧翼的序列(即，位于该核酸的5′端和3′端处的序列)(优选地是蛋白质编码序列)。出于本发明的目的，用来指核酸分子时，“分离的”核酸分子排除分离的染色体。例如，在多个实施方案中，分离的编码杀虫蛋白质的核酸分子可以含有小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的下述核苷酸序列，所述的核苷酸序列在衍生该核酸分子的细胞的基因组DNA中天然分布于该核酸分子侧翼。基本上不含细胞物质的杀虫蛋白包括具有少于约30％、20％、10％或5％(以干重计)的非杀虫蛋白(本文中也称作“杂质蛋白”)的蛋白制备物。

编码本发明蛋白质的核苷酸序列包括SEQ ID NO：1-27中所述的序列及其变体、片段和互补物。“互补物”意指与给定核苷酸序列充分互补，从而它可以与给定核苷酸序列杂交以因而形成稳定双链体的核苷酸序列。由该核苷酸序列编码的毒素蛋白的对应氨基酸序列在SEQ ID NO：28-62中给出。

作为这些编码杀虫蛋白的核苷酸序列的片段的核酸分子也由本发明包括。“片段”意指编码杀虫蛋白的核苷酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以编码杀虫蛋白的生物学活性部分，或它可以是使用下文公开的方法时可以作为杂交探针或PCR引物使用的片段。取决于预期用途，作为编码杀虫蛋白的核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少约50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1350、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000个连续核苷酸，或者直至本文中所公开的编码杀虫蛋白的全长核苷酸序列中存在的核苷酸数目。“连续的”核苷酸意指彼此紧密相邻的核苷酸残基。本发明核苷酸序列的片段将编码保留杀虫蛋白的生物学活性并且因而保留杀虫活性的蛋白质片段。“保留活性”意指该片段将具有该杀虫蛋白至少约30％、至少约50％、至少约70％、80％、90％、95％或更高的杀虫活性。在一个实施方案中，杀虫活性是杀鞘翅目的活性。在另一实施方案中，杀虫活性是杀鳞翅目的活性。在另一实施方案中，杀虫活性是杀线虫的活性。在另一实施方案中，杀虫活性是杀双翅目的活性。用于测量杀虫活性的方法是本领域熟知的。见，例如，Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.83：2480-2485；Andrews等人(1988)Biochem.J.252：199-206；Marrone等人(1985)J.of EconomicEntomology 78：290-293；和美国专利号5,743,477，所述全部文献均通过引用方式完整并入本文作为参考。

编码本发明杀虫蛋白的生物活性部分的核苷酸序列片段将编码至少约15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100个连续氨基酸，或者直至本发明全长杀虫蛋白中存在的氨基酸总数。在一些实施方案中，该片段是相对于本发明的氨基酸序列具有至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400、450、500、650、600个或者更多氨基酸的C末端截短。

本发明的优选杀虫蛋白由与SEQ ID NO：1-27的核苷酸序列充分同一的核苷酸序列编码。“充分同一的”意指使用标准参数，使用本文中所述的比对程序之一，与参考序列相比，具有至少约60％或65％序列同一性、约70％或75％序列同一性、约80％或85％序列同一性、约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸或核苷酸序列。本领域技术人员将会认识到通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、可读框定位等，可以适当调整这些值以确定两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应同一性。

为确定两个氨基酸序列或两个核酸的同一性百分数，所述序列为了最佳比较目的进行比对。这两个序列之间的同一性百分数是所述序列共有的相同位置的数值的函数(即，同一性百分数＝相同位置数/总位置数(例如，重叠位置)x100)。在另一个实施方案中，比较遍及参考序列的全部范围(即，遍及任一SEQ ID NO：1-61的全部范围)。可以使用与下文所述那些技术相似的技术，在容许或不容许空位的情况下确定两个序列之间的同一性百分数。在计算同一性百分数中，一般计数精确匹配。

使用数学算法，可以完成两个序列之间同一性百分数的确定。用于比较两个序列的数学算法的非限制性实例是Karlin和Altschul，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264的算法，该算法如Karlin和Altschul，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877中那样修改。该算法集成至Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215：403的BLASTN和BLASTX程序中。BLAST核苷酸搜索可以在采用BLASTN程序，评分＝100、字长度＝12的情况下执行以获得与本发明的杀虫样核酸分子同源的核苷酸序列。可以用BLASTX程序、评分＝50、字长度＝3进行BLAST蛋白质搜索以获得同源于本发明杀虫蛋白质分子的氨基酸序列。为获得用于比较目的的空位比对，可以如Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389中所述那样使用空位BLAST(在BLAST 2.0中)。备选地，PSI-Blast可以用来执行检测分子之间远缘关系的重复搜索。见上文Altschul等人，(1997)。当使用BLAST、空位BLAST和PSI-Blast程序时，可以使用相应程序(例如，BLASTX和BLASTN)的默认参数。比对也可以通过目测法人工地进行。

用来比较序列的数学算法的另一个非限制性实例是ClustalW算法(Higgins等人(1994)Nucleic acids Res.22：4673-4680)。ClustalW比较序列和比对氨基酸或DNA序列的完整性，并且因而可以提供关于完整氨基酸序列的序列保守性的数据。ClustalW算法在几个市售的DNA/氨基酸分析软件包中使用，如Vector NTI程序包的ALTGNX模块(InvitrogenCorporation，Carlsbad，CA)。在用ClustalW比对氨基酸序列后，可以评估氨基酸同一性百分数。用于分析ClustalW比对的软件程序的非限制实例是GENEDOC^TM。GENEDOC^TM(KarlNicholas)允许评估多种蛋白质之间的氨基酸(或DNA)相似性和同一性。另一个用于序列比较的非限制性数学算法的实例是Myers和Miller，(1988)CABIOS 4：11-17的算法。该算法集成至作为(从美国加利福尼亚州圣迭戈Accelrys，Inc.，9685 Scranton Rd.可获得的)GCGWisconsin遗传学软件包版本10的一部分的ALIGN程序(版本2.0)。当使用ALIGN程序以比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4。

除非另外说明，使用Needleman和Wunsch算法(1970)J.Mol.Biol.48(3)：443-453的GAP第10版，使用以下参数：对于核苷酸序列的％同一性和％相似性，使用GAP权重50和长度权重3及nwsgapdna.cmp评分矩阵；对于氨基酸序列的％同一性或％相似性，使用GAP权重8和长度权重2及BLOSUM62评分程序，确定序列同一性或相似性。也可以使用等同程序。“等同程序”意指任何序列比较程序，其中对于所讨论的任意两个序列而言，与GAP第10版所产生的相应比对结果比较时，所述的序列比较程序产生具有相同核苷酸残基匹配和相同序列同一性百分数的比对结果。

本发明也包括变体核酸分子。编码杀虫蛋白的核苷酸序列的“变体”包括编码本文公开的杀虫蛋白、但是因为遗传密码简并性而保守地不同的那些序列，以及如上文所讨论的充分同一的那些序列。天然存在的等位基因变体可以使用熟知的分子生物学技术鉴定，如下文说明的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术。变体核苷酸序列也包括合成方式衍生的核苷酸序列，所述核苷酸序列例如通过使用位点定向诱变法产生，但如下文所讨论的那样仍编码本发明中所公开的杀虫蛋白。由本发明包括的变体蛋白是有生物学活性的，即它们继续拥有天然蛋白的想要的生物学活性，即，保留杀虫活性。“保留活性”意指该变体将具有天然蛋白至少约30％、至少约50％、至少约70％或至少约80％的杀虫活性。用于测量杀虫活性的方法是本领域熟知的。见，例如，Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.83：2480-2485；Andrews等人(1988)Biochem.J.252：199-206；Marrone等人(1985)J.of EconomicEntomology 78：290-293；和美国专利号5,743,477，所述全部文献均通过引用方式完整地并入本文作为参考。

技术人员会进一步理解，可以通过突变本发明的核苷酸序列引入变化，从而导致编码的杀虫蛋白的氨基酸序列变化，而不改变该蛋白质的生物学活性。因而，分离的变体核酸分子可以通过将一个或多个核苷酸置换、添加或缺失导入本文公开的相应核苷酸序列来产生，从而将一个或多个氨基酸置换、添加或缺失导入所编码的蛋白质。突变可以通过标准技术如位点定向诱变法和PCR介导的诱变法导入。此类变体核苷酸序列也由本发明包括。

例如，可以在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行保守性氨基酸置换。“非必需”氨基酸残基是可以被改变而偏离杀虫蛋白的野生型序列，但是不改变生物学活性的残基，而“必需”氨基酸残基是生物学活性所需要的。“保守性氨基酸置换”是其中氨基酸残基以具有相似侧链的氨基酸残基替换的置换。具有相似侧链的氨基酸残基家族已经在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支的侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)，以及具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

Δ-内毒素通常具有5个保守的序列结构域和3个保守的结构性结构域(见，例如，de Maagd等人.(2001)Trends Genetics 17：193-199)。第一个保守的结构性结构域由7个α螺旋组成并且参与膜***和孔形成。结构域II由以希腊钥构型排列的3个β-片层组成，并且结构域III由“簿卷饼型”形式的2个反平行β-片层组成(de Maagd等人，2001，上文)。结构域II和III参与受体识别和结合，并且因此被视为毒素特异性的决定因素。

可以在非保守区域进行氨基酸置换，其保留功能。通常，此类置换不对保守氨基酸残基或不对位于保守基序内部的氨基酸残基进行，鉴于此类残基对蛋白质活性而言为必需的。保守并且可能对蛋白质活性为必需的残基的实例包括例如在与本发明序列类似的或者相关的毒素的比对结果中所含的全部蛋白质之间相同的残基(例如，在同源性蛋白质的比对结果中相同的残基)。保守但可能允许保守性氨基酸置换并仍保持活性的残基的实例包括例如在与本发明氨基酸序列类似的或者相关的毒素的比对结果中所含的全部蛋白质之间仅具有保守性置换的残基(例如，在同源性蛋白质的比对结果中所含的全部蛋白质之间具有仅保守性置换的残基)。然而，本领域技术人员将会理解，功能性变体可以在保守残基中具有少量保守或非保守的改变。

备选地，变体核苷酸序列可以通过沿着全部或部分的编码序列随机导入突变(如通过饱和诱变法)产生，并且可以对得到的突变体筛选赋予杀虫活性的能力以鉴定保留活性的突变体。诱变后，可以重组地表达所编码的蛋白质，并且可以使用标准测定法技术测定该蛋白质的活性。

使用如PCR、杂交等方法，可以从样品(例如，含有核酸序列的样品，例如生物样品)中鉴定、分离或者回收相应的杀虫序列，此类序列与本发明的序列具有相当大的同一性(例如，遍及参照序列的全部范围的至少约70％、至少约75％、80％、85％、90％、95％或更多的序列同一性)并具有或者赋予杀虫活性。见，例如，Sambrook和Russell(2001)MolecularCloning：A Laboratory Manual.(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY)，和Innis等人(1990)PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(Academic Press，NY)。

在杂交方法中，全部或部分的杀虫核苷酸序列可以用来筛选cDNA或基因组文库。用于构建此类cDNA和基因组文库的方法通常是本领域已知的并且在上文Sambrook和Russell，2001中公开。所谓的杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，并且可以用可检测基团如³²P或任何其他可检测标记物(如其他放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)标记。可以通过标记以本文中公开的编码已知杀虫蛋白的核苷酸序列为基础的合成性寡核苷酸产生用于杂交的探针。可以额外地使用基于核苷酸序列或编码的氨基酸序列中保守的核苷酸或氨基酸残基设计的简并性引物。探针一般包含核苷酸序列的区域，所述的区域在严格条件下与本发明编码杀虫蛋白的核苷酸序列或其片段或变体的至少约12个、至少约25个、至少约50、75、100、125、150、175或200个连续核苷酸杂交。用于制备杂交用探针的方法通常是本领域已知的并且在通过引用方式并入本文的上文Sambrook和Russell，2001中公开。

例如，本文中公开的完整杀虫蛋白序列或其一个或多个部分可以作为能够与相应的杀虫蛋白样序列和信使RNA特异性杂交的探针使用。为在多种条件下实现特异性杂交，此类探针包括下述序列，所述序列是独特的并且优选地是至少约10个核苷酸长度或至少约20个核苷酸长度。此类探针可以用来通过PCR从所选的生物或样品扩增相应的杀虫序列。该项技术可以用来从目的生物中分离额外的编码序列或作为诊断性测定法用来确定生物中编码序列的存在。杂交技术包括铺板DNA文库的杂交筛选法(蚀斑或菌落；见，例如，Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)。

此类序列的杂交可以在严格性条件下实施。“严格条件”或“严格杂交条件”意指这样的条件，在所述条件下探针将会与其靶序列杂交至比其与其他序列杂交可检测性更大的程度(例如，高于背景至少2倍)。严格条件是序列依赖的并且在不同的情况下不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。备选地，可以调节严格性条件以允许序列中的一些错配，从而检测到较低程度的相似性(异源探测)。通常，探针是小于约1000个核苷酸长度，优选地小于500个核苷酸长度。

一般而言，严格性条件将是这些条件，其中盐浓度在pH 7.0至8.3时小于约1.5MNa离子，一般约0.01至1.0M Na离子浓度(或其他盐)并且对于短探针(例如10至50个核苷酸)，温度是至少约30℃，并且对于长探针(例如多于50个核苷酸)，温度是至少约60℃。也可以通过添加去稳定剂如甲酰胺实现严格条件。示例性低严格性条件包括在37℃用30至35％甲酰胺，1M NaCl，1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液杂交，并且在50至55℃于1X至2XSSC(20XSSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性中等严格性条件包括在37℃于40至45％甲酰胺，1.0M NaCl，1％SDS中杂交，并且在55至60℃于0.5X至1XSSC中洗涤。示例性高严格性条件包括在37℃于50％甲酰胺，1M NaCl，1％SDS中杂交，并且在60至65℃于0.1XSSC中洗涤。任选地，洗涤缓冲液可以包含约0.1％至约1％SDS。杂交的持续时间一般是小于约24小时，通常约4至约12小时。

特异性一般是杂交后洗液的函数，关键因素是终末洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂合体，T_m可以从Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138：267-284的等式：T_m＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L近似算出；其中M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分数，％form是杂交溶液中甲酰胺的百分数，并且L是该杂合体的碱基对长度。T_m是50％互补性靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在定义的离子强度和pH下)。T_m因每1％错配下降约1℃；因此，可以调节T_m、杂交和/或洗涤条件以杂交至具有目的同一性的序列。例如，如果寻求具有≥90％同一性的序列，则T_m可以降低10℃。通常，选择严格性条件比在定义的离子强度和pH下的该特定序列及其互补物的热变性温度低约5℃。然而，极严格性条件可以利用比热变性温度(T_m)低1、2、3或4℃的杂交和/或洗涤；中等严格性条件可以利用比热变性温度(T_m)低6、7、8、9或10℃的杂交和/或洗涤；低严格性条件可以利用比热变性温度(T_m)低11、12、13、14、15或20℃的杂交和/或洗涤。使用该等式、杂交与洗涤组合和想要的T_m，普通技术人员将会理解杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化被固有地描述。如果想要的错配程度产生小于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)的T_m，则优选增加SSC浓度，从而可以使用更高的温度。在Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridizationwith Nucleic Acid Probes，第I部分，第2章(Elsevier，New York)；和Ausubel等人编辑(1995)Current Protocols in Molecular Biology，第2章(Greene Publishing和Wiley-Interscience，New York)中存在对核酸杂交的广泛指导。见Sambrook等人(1989)Molecular Cioning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，New York)。

分离的蛋白质及其变体和片段

杀虫蛋白也包括在本发明范围内。“杀虫蛋白”意图指具有SEQ ID NO：28-62中所述氨基酸序列的蛋白质。也提供了其片段、生物学活性部分和变体，并且可以用来实施本发明的方法。“分离的蛋白质”用于指不再在其天然环境中，例如在体外或者在重组的细菌或植物宿主细胞中的蛋白质。

“片段”或“生物学活性部分”包括多肽片段，它们包含与任一SEQ ID NO：28-62所述的氨基酸序列充分同一并且显示杀虫活性的氨基酸序列。杀虫蛋白的生物学活性部分可以是例如10、25、50、100个或更多氨基酸长度的多肽。此类生物学活性部分可以通过重组技术制备并评价杀虫活性。用于测量杀虫活性的方法是本领域熟知的。见，例如，Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.83：2480-2485；Andrews等人(1988)Biochem.J.252：199-206；Marrone等人(1985)J.of Economic Entomology 78：290-293；和美国专利号5,743,477，所述全部文献均通过引用方式完整并入本文。如此处使用，片段包含SEQ ID NO：28-62的至少8个连续氨基酸。然而，本发明包括其他片段，如蛋白质中多于约10、20、30、50、100、150、200、250、300、350、400、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250个或1300个氨基酸的任意片段。

“变体”意指具有与任一SEQ ID NO：28-62的氨基酸序列至少约60％、65％、约70％、75％、约80％、85％、约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的蛋白质或多肽。变体也包括由下述核酸分子编码的多肽，其中所述核酸分子与SEQ ID NO：1-27的核酸分子或其互补物在严格条件下杂交。变体包括因诱变而在氨基酸序列上不同的多肽。由本发明包括的变体蛋白是有生物学活性的，即它们继续拥有天然蛋白的目的生物学活性，即，保留杀虫活性。在一些实施方案中，变体具有改善的活性。用于测量杀虫活性的方法是本领域熟知的。见，例如，Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.83：2480-2485；Andrews等人(1988)Biochem.J.252：199-206；Marrone等人(1985)J.of Economic Entomology 78：290-293；和美国专利号5,743,477，所述全部文献均通过引用方式完整地并入本文。

细菌基因，如本发明的axmi基因，相当经常地拥有多个靠近可读框起点的甲硫氨酸起始密码子。常常，在这些起始密码子中一个或多个起始密码子处的翻译起始将会导致功能性蛋白质的产生。这些起始密码子可以包括ATG密码子。然而，细菌(如芽孢杆菌属物种)也将密码子GTG识别为起始密码子，并且在GTG密码子处启动翻译的蛋白质含有在第一氨基酸处的甲硫氨酸。在个别情况下，细菌***中的翻译可以在TTG密码子处启动，不过在该情况下TTG编码甲硫氨酸。另外，常常不推理地确定在细菌中天然地使用这些密码子中的哪些密码子。因而，可以理解使用可选甲硫氨酸密码子中的一个甲硫氨酸密码子也可以导致杀虫蛋白的产生。在本发明中包括这些杀虫蛋白并且它们可以在本发明的方法中使用。应当理解，当在植物中表达时，必须将备选的起始密码子改变成ATG，以正确地翻译。

本发明也包括针对本发明多肽或针对其变体或片段的抗体。用于产生抗体的方法是本领域熟知的(见，例如，Harlow和Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY；美国专利号4,196,265)。

改变或改善的变体

认识到可以通过多种方法改变杀虫蛋白的DNA序列，并且这些改变可以产生编码蛋白质的DNA序列，其中所述的蛋白质具有与本发明杀虫蛋白所编码的氨基酸序列不同的氨基酸序列。这个蛋白质可以以多种方式改变，所述方式包括SEQ ID NO：28-62的一个或多个氨基酸的氨基酸置换、缺失、截短和***，包括多达约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约100、约105、约110、约115、约120、约125、约130个或更多个氨基酸置换、缺失或***。

用于此类操作的方法通常是本领域已知的。例如，可以通过在DNA中突变来制备杀虫蛋白的氨基酸序列变体。这也可以通过几种形式的诱变法之一和/或在定向进化中完成。在一些方面中，氨基酸序列中所编码的变化基本上不会影响蛋白质的功能。此类变体会拥有目的杀虫活性。然而，可以理解，杀虫蛋白赋予杀虫活性的能力可以通过使用此类技术至本发明的组合物来改善。例如，可以在DNA复制期间显示高碱基错误掺入率的宿主细胞如XL-1 Red(Stratagene)中表达杀虫蛋白。在此类菌株中增殖后，可以分离毒素DNA(例如通过制备质粒DNA或通过PCR扩增并将所得的PCR片段克隆至载体中)，在非诱变性菌株中培养毒素突变体，并且鉴定具有杀虫活性的突变毒素基因，例如通过实施检测杀虫活性的测定法。一般而言，将所述蛋白质混合并用于饲喂测定法中。见，例如Marrone等人(1985)J.ofEconomic Entomology 78：290-293。此类测定法可以包括使植物与一种或多种害虫接触并且确定植物存活和/或造成害虫死亡的能力。导致毒性增加的突变的实例存在于Schnepf等人(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62：775-806中。

备选地，可以在氨基或羧基端改变许多蛋白质的蛋白质序列，而基本上不影响活性。这可以包括通过现代分子方法(如PCR)导入的***、缺失或改变，所述的PCR包括通过在PCR扩增中所用的寡核苷酸中纳入氨基酸编码序列而改变或延伸蛋白质编码序列的PCR扩增。备选地，所添加的蛋白质序列可以包括完整的蛋白质编码序列，如本领域常见用来产生蛋白质融合物的那些序列。此类融合蛋白常常用来(1)增加目的蛋白的表达，(2)导入结合结构域、酶活性或表位来促进蛋白质纯化、蛋白质检测或本领域已知的其他实验用途，(3)将蛋白质靶向分泌或翻译至亚细胞器，如革兰阴性细菌的周质间隙或真核细胞的内质网，后者常常导致蛋白质的糖基化。

本发明的变体核苷酸和氨基酸序列也包括从诱变性和重组方法如DNA改组法衍生的序列。采用这种方法，一种或多种不同的杀虫蛋白编码区可以用来产生拥有想要的特性的新杀虫蛋白。以这种方式，从包含具有相当高序列同一性并且可以在体外或体内同源重组的序列区的相关性序列多核苷酸群产生重组多核苷酸的文库。例如，使用这种方法，可以改组本发明的杀虫基因和其他已知的杀虫基因之间编码目的结构域的序列基序以获得编码蛋白质的新基因，其中所述蛋白质具有改善的目的特性，如增加的杀昆虫活性。用于这种DNA改组的策略是本领域已知的。见，例如Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751；Stemmer(1994)Nature 370：389-391；Crameri等人(1997)NatureBiotech.15：436-438；Moore等人(1997)J.Mol.Biol.272：336-347；Zhang等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4504-4509；Crameri等人(1998)Nature 391：288-291；和美国专利号5,605,793和5,837,458。

结构域交换或改组是用于产生改变的Δ-内毒素蛋白的另一种机制。结构域可以是在Δ-内毒素蛋白之间交换，从而产生具有改善的杀虫活性或靶谱的杂合体或嵌合毒素。用于产生重组蛋白和测试其杀虫活性的方法是本领域熟知的(见，例如，Naimov等人(2001)Appl.Environ.Microbiol.67：5328-5330；de Maagd等人(1996)Appl.Environ.Microbiol.62：1537-1543；Ge等人(1991)J.Biol.Chem.266：17954-17958；Schnepf等人(1990)J.Biol.Chem.265：20923-20930；Rang等人91999)Appl.Environ.Microbiol.65：2918-2925)。

又在另一实施方案中，可以使用错配PCR、针对寡核苷酸的诱变、组装PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒诱变、递归整体诱变、指数整体诱变、位点特异的诱变、基因重装配、基因位点饱和诱变、全突变诱变(permutational mutagenesis)、合成的连接重装配(SLR)、重组、递归序列重组、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、含尿嘧啶模板的诱变、缺口双链体诱变、点错配修复诱变、修复缺陷型宿主菌株诱变、化学诱变、放射所致的诱变、缺失诱变、限制选择诱变、限制纯化诱变、人工基因合成、整体诱变、嵌合的核酸多聚体产生等等中的一种或多种获得变体核苷酸和/或氨基酸序列。

载体

可以在用于目的植物中表达的表达盒中提供本发明的杀虫序列。“植物表达盒”意指能够在植物细胞中导致蛋白质从可读框中表达的DNA构建体。一般地，这些植物表达盒含有启动子和编码序列。常常地，此类构建体也会含有3′非翻译区。此类构建体可以含有促进该肽共翻译或翻译后运输至某些胞内结构如叶绿体(或其他质体)、内质网或高尔基体的“信号序列”或“前导序列”。

“信号序列”意指已知或推测导致跨细胞膜共翻译或翻译后肽运输的序列。在真核生物中，这一般涉及分泌至高尔基体中，伴有所得的一些糖基化。通常将细菌的杀昆虫毒素合成为前毒素，其在靶害虫的肠中蛋白水解(protolytically)活化(Chang(1987)MethodsEnzymol.153：507-516)。在本发明的一些实施方案中，信号序列定位于天然序列中，或者可以来源于本发明的序列。“前导序列”意指任意的下述序列，所述序列在翻译时产生足以触发肽链共翻译性运输至亚细胞器的氨基酸序列。因而，这包括通过进入内质网、进入液泡、质体(包括叶绿体)、线粒体等引导运输和/或糖基化的前导序列。

“植物转化载体”意指用于有效转化植物细胞必需的DNA分子。这种分子可以由一个或多个植物表达盒组成，并且可以组织成多于一个“载体”DNA分子。例如，双元载体是使用两个非连续DNA载体来编码用于转化植物细胞的全部必要顺式和反式作用功能的植物转化载体(Hellens和Mullineaux(2000)Trends in Plant Science 5：446-451)。“载体”指为不同宿主细胞之间转移所设计的核酸构建体。“表达载体”指在外来细胞中具有并入、整合和表达异源DNA序列或片段的能力的载体。该盒将包括与本发明序列有效连接的5′和3′调节序列。“有效连接”意指启动子与第二序列之间的功能性连接，其中所述启动子序列启动并且介导与第二序列相对应的DNA序列的转录。通常，有效连接意指被连接的核酸序列是连续的，并且在需要连接两个蛋白质编码区的情况下，是连续的并且处于相同的可读框中。该盒可以额外地含有至少一个待共转化入生物中的额外基因。备选地，可以在多个表达盒上提供额外的基因。

“启动子”指发挥指导下游编码序列转录的功能的核酸序列。对于目的DNA序列的表达而言，启动子连同其他转录性和翻译性调节核酸序列(又称作“调控序列”)是必需的。

这种表达盒提供有用于***处在调节区转录性调控下的杀虫序列的多个限制性位点。

所述表达盒将会在5’-3’转录方向包括在植物中有功能的转录和翻译起始区(即，启动子)、本发明的DNA序列和转录与翻译终止区(即，终止区)。启动子可以是天然的或类似的，或对植物宿主和/或对本发明的DNA序列是外来或异源的。另外，启动子可以是天然序列或备选地是合成序列。在启动子对植物宿主是“天然”或“同源”的情况下，意指该启动子存在于导入该启动子的天然植物中。在启动子对本发明的DNA序列是“外来”或“异源”的情况下，意指该启动子对于有效连接的本发明DNA序列而言不是本来的或天然存在的启动子。

终止区可以相对于转录起始区是固有的，可以相对于有效连接的目的DNA序列是固有的，可以相对于植物宿主是固有的，或可以从另外来源衍生(即，相对于启动子、目的DNA序列、植物宿主或其任意组合是外来或异源的)。常规的终止区是从根瘤农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒可得到的，如章鱼碱合酶和胭脂碱合成酶的终止区。也见Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot(1991)Cell 64：671-674；Sanfacon等人(1991)Genes Dev.5：141-149；Mogen等人(1990)Plant Cell 2：1261-1272；Munroe等人(1990)Gene 91：151-158；Ballas等人(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903；和Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.15：9627-9639。

根据需要，基因可以优化为在转化的宿主细胞中增加的表达。即，基因可以为了改善的表达而使用宿主细胞优选的密码子合成，或可以以宿主优选的密码子选择频率使用密码子加以合成。通常，基因的GC含量将会增加。见，例如，Campbell和Gowri(1990)PlantPhysiol.92：1-11对宿主优选密码子使用的讨论。用于合成植物优选基因的方法是本领域可获得的。见，例如，通过引用的方式并入本文的美国专利号5,380,831和5,436,391以及Murray等人，1989，Nucleic Acids Res.17：477-498。

在一个实施方案中，将杀虫序列靶向至叶绿体用于表达。以这种方式，在杀虫序列不直接***叶绿体的情况下，表达盒将额外地含有这样的核酸，其编码指引杀虫序列至叶绿体的转运肽。此类转运肽是本领域已知的。见，例如，Von Heijne等人(1991)PlantMol.Biol.Rep.9：104-126；Clark等人(1989)J.Biol.Chem.264：17544-17550；Della-Cioppa等人(1987)Plant Physiol.84：965-968；Romer等人(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196：1414-1421；和Shah等人(1986)Science 233：478-481。

待靶向至叶绿体的杀虫基因可以为了在叶绿体中表达进行优化以解决植物细胞核和这种细胞器之间密码子选择的差异。以这种方式，目的核酸可以使用叶绿体优选的密码子来合成。见，例如，通过引用方式并入本文的美国专利号5,380,831。

植物转化

本发明的方法涉及导入核苷酸构建体至植物中。术语“导入”意指如此方式向植物呈递核苷酸构建体，从而该构建体进入该植物的细胞的内部。本发明的方法不要求使用将核苷酸构建体导入植物中的特定方法，只要该核苷酸构建体进入植物的至少一个细胞的内部即可。用于将核苷酸构建体导入植物中的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法。

“植物”意指完整植物、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚和其子代。植物细胞可以是分化的或未分化的(例如愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞、花粉)。

“转基因植物”或“转化的植物”或“稳定转化的”植物或细胞或组织指已经使外源核酸序列或DNA片段并入或整合入植物细胞中的植物。这些核酸序列包括外源的或在未转化的植物细胞中不存在的那些核酸序列以及可以内源或在未转化的植物细胞中存在的那些核酸序列。“异源的”通常指这些核酸序列，所述核酸序列相对于它们存在其中的细胞或天然基因组的部分而言不为内源并且已经通过感染法、转染法、微量注射法、电穿孔法、微量投射法等添加至细胞。

本发明的转基因植物表达本文中公开的一种或多种杀虫序列。在多个实施方案中，转基因植物还包含一个或多个用于昆虫抵抗性的额外基因，例如，一个或多个用于控制鞘翅目的、鳞翅目的、异翅目的或线虫类害虫的额外基因。本领域技术人员将会理解该转基因植物可以包含赋予目的农学性状的任意基因。

植物细胞的转化可以通过本领域已知的几项技术之一完成。可以修饰本发明的杀虫基因以获得或增强在植物细胞中的表达。一般而言，表达这种蛋白质的构建体含有驱动该基因转录的启动子以及允许转录终止和多腺苷酸化的3′非翻译区。此类构建体的组织构造是本领域熟知的。在一些情况下，可能有用的是使该基因工程化，从而所得的肽被分泌或靶向于植物细胞内部。例如，该基因可以工程化以含有促进肽转移至内质网的信号肽。也可以优选的是工程化植物表达盒以含有内含子，从而对表达而言需要内含子的mRNA加工。

一般而言，这种“植物表达盒”将***“植物转化载体”中。这种植物转化载体可以包含实现植物转化所需要的一个或多个DNA载体。例如，本领域中常见的实践是使用由多于一个连续DNA节段组成的植物转化载体。这些载体在本领域常常称作“双元载体”。双元载体以及带有辅助质粒的载体最常用于农杆菌介导的转化，其中为实现高效转化所需要的DNA节段的大小和复杂度是相当大的，并且有利的是将多项功能分配至独立的DNA分子上。双元载体一般含有这样的质粒载体，其含有为T-DNA转移所需要的顺式作用序列(如左边界和右边界)、工程化以能够在植物细胞中表达的选择标记和“目的基因”(工程化以能够在对于产生转基因植物所需要的植物细胞中表达的基因)。在这种质粒载体上也存在为细菌复制所需要的序列。顺式作用序列以允许高效转移至植物细胞中并在其中表达的方式排列。例如，选择标记基因和杀虫序列位于左边界和右边界之间。第二种质粒载体经常含有介导T-DNA从农杆菌转移至植物细胞的反式作用因子。如本领域理解，这种质粒经常含有允许农杆菌感染植物细胞的毒力功能(Vir基因)和通过在边界序列处切割的DNA的转移和vir介导的DNA转移(Hellens和Mullineaux(2000)Trends in Plant Science 5：446-451)。几个类型的农杆菌菌株(例如LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105等)可以用于植物转化。第二质粒载体对于通过其他方法如微量投射法、微量注射法、电穿孔法、聚乙二醇法等转化植物而言不是必需的。

通常，植物转化方法涉及将异源DNA转移至靶植物细胞中(例如不成熟或成熟的胚、悬浮培养物、未分化的愈伤组织、原生质体等)，随后施加最大阈水平的适宜选择(取决于选择标记基因)以从一组未转化的细胞团回收转化的植物细胞。一般将外植体转移至相同培养基的新鲜补给物并且例行地培养。随后，转化的细胞在补充有最大阈水平选择剂的再生培养基上放置后分化成苗。苗随后转移至选择性生根培养基用于回收生根的苗或小植株。转基因小植株随后生长为成熟植物并且产生能育性种子(例如Hiei等人(1994)ThePlant Journal 6：271-282；Ishida等人(1996)Nature Biotechnology 14：745-750)。一般将外植体转移至相同培养基的新鲜补给物并且例行地培养。对产生转基因植物的技术和方法的一般描述存在于Ayres和Park(1994)Critical Critical Reviews in Plant Science13：219-239以及Bommineni和Jauhar(1997)Maydica 42：107-120中。由于转化的材料含有许多细胞；转化和未转化的细胞均存在于任何一片受处理的靶愈伤组织或组织或细胞群中。杀死未转化细胞并且允许转化细胞增殖的能力产生转化的植物培养物。除去未转化细胞的能力经常是快速回收转化的植物细胞和成功产生转基因植物的限制。

转化方案以及用于将核苷酸序列导入植物中的方案可以根据用于转化的植物或植物细胞的类型(即单子叶植物或双子叶植物)变化。可以通过几种方法之一进行转基因植物的产生，所述方法包括但不限于微量注射法、电穿孔法、直接基因转移法、通过农杆菌导入异源DNA至植物细胞中(农杆菌介导的转化法)、用粘附至粒子的异源外来DNA轰击植物细胞、射弹粒子加速法、气溶胶束转化法(美国公开的申请号20010026941；美国专利号4,945,050；国际公开号WO 91/00915；美国公开的申请号2002015066)、Lec1转化法和转移DNA的多种其他的非粒子直接介导方法。

用于转化叶绿体的方法是本领域已知的。见，例如，Svab等人，(1990)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：8526-8530；Svab和Maliga，(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：913-917；Svab和Maliga，(1993)，EMBO J.12：601-606。该方法依赖于粒子枪递送含有选择性标记的DNA和通过同源重组导引该DNA至质体基因组。额外地，质体转化可以通过组织优选性表达细胞核编码且指向质体的RNA聚合酶反式地激活质体携带的沉默转基因来实现。这种***已经在McBride等人，(1994)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：7301-7305中报道。

在异源外来DNA整合至植物细胞中之后，随后在培养基中施加最大阈水平的适宜选择以通过定期转移至新鲜培养基而杀死未转化的细胞并且分离和增殖从这种选择处理中存活的推定的转化细胞。通过连续传代并且用适宜的选择攻击，鉴定并且增殖用质粒载体转化的细胞。随后可以使用分子方法和生物化学方法来证实存在整合至转基因植物基因组中的异源目的基因。

已经转化的细胞可以根据常规方法培育成植物。见，例如McCormick等人(1986)Plant Cell Reports 5：81-84。这些植物随后可以进行培育，并且用相同的转化株系或不同的株系授粉，并且鉴定具有所需要表型特征组成型表达的所得杂交种。可以培育两个或多个世代以确保稳定维持并且遗传了所需要表型特征的表达，并且随后可以收获种子以确保已经实现所需要表型特征的表达。以这种方式，本发明提供了使本发明的核苷酸构建体(例如本发明的表达盒)稳定并入其基因组中的转化种子(也称作“转基因种子”)。

植物转化的评价

在导入异源外来DNA至植物细胞中之后，通过多种方法如分析与所整合基因相关的核酸、蛋白质和代谢物来证实异源基因在植物基因组中的转化或整合。

PCR分析是在移植入土壤之前的早期对转化的细胞、组织或苗筛选所并入基因存在的快速方法(Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning：A LaboratoryManual.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。使用针对目的基因或农杆菌载体背景等特异的寡核苷酸引物实施PCR。

可以通过基因组DNA的DNA印迹分析证实植物转化(上文Sambrook和Russell，2001)。通常，从转化体提取总DNA，用适宜的限制酶消化，在琼脂糖凝胶中分离并且转移至硝化纤维素或尼龙膜。膜或“印迹物”随后根据标准技术(上文Sambrook和Russell，2001)用例如放射标记的³²P靶DNA片段探测以证实所导入基因整合到植物基因组中。

在RNA印迹分析中，从转化体的特定组织分离RNA，在甲醛琼脂糖凝胶中分离并且根据本领域例行所用的标准方法(上文Sambrook和Russell，2001)印迹至尼龙滤膜上。随后通过本领域已知方法(上文Sambrook和Russell，2001)使该滤膜与从毒素基因衍生的放射活性探针杂交，检验由杀虫序列编码的RNA的表达。

可以对转基因植物实施蛋白质印迹法、生物化学测定法等以使用与杀虫蛋白上存在的一个或多个表位结合的抗体，通过标准方法(上文Sambrook和Russell，2001)证实由杀虫基因编码的蛋白质的存在。

植物中的杀虫活性

在本发明的另一个方面，可以产生表达具有杀虫活性的毒素的转基因植物。上文通过例举方式所述的方法可以用来产生转基因植物，但是产生转基因植物细胞的方式对于本发明并非关键。本领域已知或描述的方法，如农杆菌介导的转化法、生物射弹转化法和非粒子介导方法，可以由实验者酌情使用。表达杀虫序列的植物可以通过本领域描述的常见方法予以分离，例如通过转化愈伤组织、选择转化的愈伤组织和从此类转基因愈伤组织再生能育植物。在这个方法中，可以使用任意基因作为选择标记，只要该选择标记在植物细胞中的表达赋予鉴定或选择转化细胞的能力。

已经开发了随植物细胞一起使用的众多标记，如氯霉素、氨基糖甙G418、潮霉素等抗性标记。也可以使用编码参与叶绿体代谢的产物的其他基因作为选择标记。例如，提供针对植物除草剂如草甘膦、溴苯腈或咪唑啉酮的抗性的基因可能特别有用。已经报道了此类基因(Stalker等人(1985)J.Biol. Chem.263：6310-6314(溴苯腈抗性腈水解酶基因)；和Sathasivan等人(1990)Nucl.Acids Res.18：2188(AHAS咪唑啉酮抗性基因)。额外地，本文中公开的基因用作标记以评估细菌细胞或植物细胞的转化。用于检测转基因在植物、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚或其子代中存在的方法是本领域熟知的。在一个实施方案中，通过测试杀虫活性检测该转基因的存在。

可以对表达杀虫序列的能育植物测试杀虫活性，并且选择显示最佳活性的植物用于进一步育种。检测杀虫活性的方法是本领域可获得的。一般而言，将所述蛋白质混合并用于饲喂测定法中。见，例如Marrone等人(1985)J.of Economic Entomology 78：290-293。

本发明可以用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。目的植物的实例包括但是不限于谷物(玉米)、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒属植物、马铃薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦和油籽油菜、芸苔属物种(Brassicasp.)、苜蓿、黑麦、粟、红花、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、凤梨、柑桔树、可可、茶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、油橄榄、番木瓜、腰果、全缘叶澳洲坚果、扁桃、燕麦、蔬菜类、观赏植物类和松柏类。

蔬菜包括但是不限于番茄、生菜、青豆、利马豆、豌豆和黄瓜属(Cucumis)的成员如黄瓜、网纹甜瓜和香甜瓜。观赏植物包括但是不限于杜鹃花、八仙花、朱槿、玫瑰、郁金香、水仙、矮牵牛、康乃馨、一品红和菊花。优选地，本发明的植物是作物植物(例如，玉米、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒属植物、马铃薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、油籽油菜等)。

在杀虫控制中的用途

将包含本发明核苷酸序列或其变体的菌株应用于杀虫剂控制中或工程化其他生物作为杀虫剂中的一般方法是本领域已知的。见，例如，美国专利号5,039,523和EP0480762A2。

含有本发明核苷酸序列或其变体的芽孢杆菌属菌株或已经遗传地改变以含有杀虫基因和蛋白质的微生物可以用于保护农作物和农产品免遭害虫影响。在本发明的一个方面，产毒素(杀虫剂)生物的完整(即未裂解)细胞用下述试剂处理，其中在应用该细胞至靶害虫的环境时，所述的试剂延长了细胞中所产生杀虫蛋白的活性。

备选地，通过导入杀虫基因至细胞性宿主中产生杀虫剂。杀虫基因的表达直接或间接地导致该杀虫剂的胞内产生和维持。在本发明的一个方面，这些细胞随后在下述条件下处理，其中在应用该细胞至靶害虫的环境时，所述的条件延长了细胞中所产生杀虫的活性。所得的产物保留杀虫蛋白的毒性。这些天然包囊化的杀虫剂随后可以根据常规技术配制以应用至靶害虫所在的环境，例如，土壤、水和植物的叶。见，例如EPA 0192319及其中援引的参考文献。备选地，可以配制表达本发明基因的细胞，从而允许应用所得的物质作为杀虫剂。

杀虫组合物

本发明的活性成分通常以组合物形式应用并且可以随其他复合物同时或依次地应用至待处理的作物区域或植物。这些复合物可以是肥料、除草剂、抗冻剂、表面活性剂、去垢剂、杀虫皂、休眠油、聚合物和/或在单次应用该制剂后允许对靶区域长期投药的延时释放或生物可降解载体制剂。它们也可以是选择性除草剂、化学杀虫剂、杀病毒剂、杀微生物剂、抗阿米巴药、杀虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫药、杀螺剂或这些制品中几种制品的混合物，根据需要，连同制剂领域通常使用的其他农药可接受载体、表面活性剂或应用促进佐剂。合适的载体和佐剂可以是固体或液体并且对应于制剂技术中通常使用的物质，例如天然或再生性矿物质、溶剂、分散剂、润湿剂、增粘剂、粘合剂或肥料。同样地，制剂可以制备成可食性“饵料”或加工成害虫“陷阱”以允许靶害虫采食或摄取杀虫制剂。

应用本发明活性成分或本发明农业化学组合物的方法包括叶面应用、种子包衣和土壤应用，其中所述的本发明活性成分或农业化学组合物含有少一种由本发明细菌菌株产生的杀虫蛋白。应用的次数和应用的速率取决于相应害虫的侵袭强度。

该组合物可以作为粉剂、尘剂、丸剂、粒剂、喷雾剂、乳剂、胶体剂、溶液剂等配制，并且可以通过常规手段如干燥、冻干、均化、提取、过滤、离心、沉淀或浓缩包含所述多肽的细胞的培养物来制备。在含有至少一种所述杀虫多肽的全部此类组合物中，该多肽可以以按重量计约1％至约99％的浓度存在。

可以通过本发明的方法杀死给定地区内的鳞翅目害虫、双翅目害虫、异翅目害虫、鞘翅目害虫或线虫类害虫或减少其数目，或可以预防地应用至某环境区域以防止易感害虫侵袭。优选地，害虫摄取或接触杀虫有效量的所述多肽。“杀虫有效量”意指杀虫剂的能够对至少一种害虫造成死亡或能够显著减少害虫生长、采食或正常生理发育的量。该量将根据此类因素变动，例如，待控制的特定靶害虫、待处理的具体环境、位置、植物、作物或农业地点、环境条件，和应用杀虫有效的多肽组合物的方法、速率、浓度、稳定性及量。所述制剂也可以根据气候条件、环境考虑和/或应用频率和/或害虫侵袭的严重性方面而变动。

可以通过将细菌细胞、晶体和/或孢子悬液或分离的蛋白质组分与想要的可农用载体配制来制造所述杀虫剂组合物。所述组合物可以在施用之前以适宜手段如冻干、冷冻干燥、干燥或在水性载体、培养基或合适的稀释剂(如盐水或其他缓冲液)中配制。配制的组合物可以是尘剂或颗粒物质形式或是在油(植物油或矿物油)中的混悬剂或水或油/水乳剂，或作为可湿性粉剂，或与适用于农业应用的任何其他载体物质组合。合适的农用载体可以是固体或液体并且是本领域熟知的。术语“可农用载体”涵盖杀虫剂配制技术中通常使用的全部佐剂、惰性组分、分散剂、表面活性剂、增粘剂、粘合剂等；这些物质是杀虫剂配制领域技术人员熟知的。所述制剂可以与一种或多种固体或液体佐剂混合并且通过多种手段制备，例如，通过使用常规配制技术将杀虫性组合物与合适佐剂均匀地混合、掺合和/或研磨。合适的配制和应用方法在通过引用方式并入本文的美国专利号6,468,523中描述。

植物也可以用一种或多种化学组合物处理，所述的化学组合物包括一种或多种除草剂、杀虫剂或杀真菌剂。示例性化学组合物包括：水果/蔬菜除草剂：莠去津(Atrazine)、除草定(Bromacil)、敌草隆(Diuron)、草甘膦(Glyphosate)、利谷隆(Linuron)、嗪草酮(Metribuzin)、西玛津(Simazine)、氟乐灵(Trifluralin)、吡氟禾草灵(Fluazifop)、草铵膦(Glufosinate)、氯吡嘧磺隆(Halosulfuron Gowan)、百草枯(Paraquat)、炔草胺(Propyzamide)、稀禾定(Sethoxydim)、氟丙嘧草酯(Butafenacil)、氯吡嘧磺隆(Halosulfuron)、Indaziflam；水果/蔬菜杀虫剂：涕灭威(Aldicarb)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuriengiensis)、甲萘威(Carbaryl)、克百威(Carbofuran)、毒死蜱(Chlorpyrifos)、氯氰菊酯(Cypermethrin)、溴氰菊酯(deltamethrin)、地亚农(Diazinon)、马拉硫磷(Malathion)、阿维菌素(Abamectin)、氟氯氰菊酯/β-氟氯氰菊酯(Cyfluthrin/Beta-Cyfluthrin)、顺式氰戊菊酯(Esfenvalerate)、高三氟氯氰菊酯(Lambda-cyhalothrin)、灭螨醌(Acequinocyl)、联苯肼酯(Bifenazate)、甲氧虫酰肼(Methoxyfenozide)、双苯氟脲(Novaluron)、环虫酰肼(Chromafenozide)、噻虫啉(Thiacloprid)、呋虫胺(Dinotefuran)、嘧螨酯(fluacrypyrim)、唑虫酰胺(Tolfenpyrad)、可尼丁(Clothianidin)、螺螨酯(spirodiclofen)、γ-氯氟氰菊酯(gama-cyhalothrin)、螺甲螨酯(spiromesifen)、艾克敌(spinosad)、氯虫苯甲酰胺(Rynaxypyr)、溴氰虫酰胺(Cyazypyr)、乙基多杀菌素(Spinoteram)、杀铃脲(Triflumuron)、螺虫乙酯(Spirotetramat)、吡虫啉(Imidacloprid)、氟虫双酰胺(Flubendiamide)、硫双威(Thiodicarb)、氰氟虫腙(Metaflumizone)、氟啶虫胺腈(Sulfoxaflor)、丁氟螨酯(Cyflumetofen)、Cyanopyrafen、吡虫啉(Imidacloprid)、可尼丁(Clothianidin)、噻虫嗪(Thiamethoxam)、Spinotoram、硫双威(Thiodicarb)、氟啶虫酰胺(Flonicamid)、甲硫威(Methiocarb)、氨基阿维菌素苯甲酸盐(Emamectin-benzoate)、二唑虫(Indoxacarb)、Fozthiazate、苯线磷(Fenamiphos)、硫线磷(Cadusaphos)、吡丙醚(Pyriproxifen)、苯丁锡(Fenbutatin-oxid)、噻螨酮(Hexthiazox)、灭多威(Methomyl)、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮；水果/蔬菜杀真菌剂：多菌灵(Carbendazim)、百菌清(Chlorothalonil)、EBDC、硫、甲基硫菌灵(Thiophanate-methyl)、嘧菌酯(Azoxystrobin)、霜脲氰(Cymoxanil)、氟啶胺(Fluazinam)、福賽得(Fosetyl)、异菌脲(Iprodione)、醚菌酯(Kresoxim-methyl)、甲霜灵/精甲霜灵(Metalaxyl/mefenoxam)、肟菌酯(Trifloxystrobin)、噻唑菌胺(Ethaboxam)、丙森锌(Iprovalicarb)、肟菌酯(Trifloxystrobin)、环酰菌胺(Fenhexamid)、延胡索酸唑(Oxpoconazolefumarate)、氰霜唑(Cyazofamid)、咪唑菌酮(Fenamidone)、苯酰菌胺(Zoxamide)、啶氧菌酯(Picoxystrobin)、吡唑醚菌酯(Pyraclostrobin)、环氟菌胺(Cyflufenamid)、啶酰菌胺(Boscalid)；谷类植物除草剂：异丙隆(Isoproturon)、溴苯腈(Bromoxynil)、碘苯腈(Ioxynil)、苯氧基类(Phenoxies)、氯磺隆(Chlorsulfuron)、炔草酸(Clodinafop)、禾草灵酸(Diclofop)、吡氟草胺(Diflufenican)、禾草灵(Fenoxaprop)、双氟磺草胺(Florasulam)、氟草烟(Fluroxypyr)、甲磺隆(Metsulfuron)、醚苯磺隆(Triasulfuron)、氟酮磺隆(Flucarbazone)、碘甲磺隆(Iodosulfuron)、丙苯磺隆(Propoxycarbazone)、氟吡酰草胺(Picolinafen)、甲磺胺磺隆(Mesosulfuron)、氟丁酰草胺(Beflubutamid)、唑啉草酯(Pinoxaden)、酰嘧磺隆(Amidosulfuron)、噻磺隆(Thifensulfuron)、苯磺隆(Tribenuron)、氟啶嘧磺隆(Flupyrsulfuron)、磺酰磺隆(Sulfosulfuron)、Pyrasulfotole、甲氧磺草胺(Pyroxsulam)、氟噻草胺(Flufenacet)、肟草酮(Tralkoxydim)、Pyroxasulfon；谷类植物杀真菌剂：多菌灵(Carbendazim)、百菌清(Chlorothalonil)、嘧菌酯(Azoxystrobin)、环丙唑醇(Cyproconazole)、嘧菌环胺(Cyprodinil)、丁苯吗啉(Fenpropimorph)、氟环唑(Epoxiconazole)、醚菌酯(Kresoxim-methyl)、苯氧喹啉(Quinoxyfen)、戊唑醇(Tebuconazole)、肟菌酯(Trifloxystrobin)、硅氟唑(Simeconazole)、啶氧菌酯(Picoxystrobin)、吡唑醚菌酯(Pyraclostrobin)、醚菌胺(Dimoxystrobin)、丙硫菌唑(Prothioconazole)、氟嘧菌酯(Fluoxastrobin)；谷类植物杀虫剂：乐果(Dimethoate)、三氟氯氰菊酯(Lambda-cyhalthrin)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、α-氯氰菊酯(alpha-Cypermethrin)、β-氟氯氰菊酯(β-Cyfluthrin)、联苯菊酯(Bifenthrin)、吡虫啉(Imidacloprid)、可尼丁(Clothianidin)、噻虫嗪(Thiamethoxam)、噻虫啉(Thiacloprid)、啶虫脒(Acetamiprid)、呋虫胺(Dinetofuran)、Clorphyriphos、甲胺磷(Metamidophos)、乙酰甲胺磷(Oxidemethon-methyl)、抗蚜威(Pirimicarb)、甲硫威(Methiocarb)；玉米除草剂：莠去津(Atrazine)、甲草胺(Alachlor)、溴苯腈(Bromoxynil)、乙草胺(Acetochlor)、麦草畏(Dicamba)、二氯吡啶酸(Clopyralid)、二甲吩草胺(S-)Dimethenamid)、草铵膦(Glufosinate)、草甘膦(Glyphosate)、异唑草酮(Isoxaflutole)、精异丙甲草胺(S-Metolachlor)、甲基磺草酮(Mesotrione)、烟嘧磺隆(Nicosulfuron)、氟嘧磺隆(Primisulfuron)、玉嘧磺隆(Rimsulfuron)、磺草酮(Sulcotrione)、甲酰胺磺隆(Foramsulfuron)、苯吡唑草酮(Topramezone)、Tembotrione、苯嘧磺草胺(Saflufenacil)、酮脲磺草吩(Thiencarbazone)、氟噻草胺(Flufenacet)、Pyroxasulfon；玉米杀虫剂：克百威(Carbofuran)、毒死蜱(Chlorpyrifos)、联苯菊酯(Bifenthrin)、氯虫双酰胺(Cyazypyr)、氟虫腈(Fipronil)、吡虫啉(Imidacloprid)、高三氟氯氰菊酯(Lambda-Cyhalothrin)、七氟菊酯(Tefluthrin)、特丁硫磷(Terbufos)、噻虫嗪(Thiamethoxam)、可尼丁(Clothianidin)、螺甲螨酯(spiromesifen)、氟虫双酰胺(Flubendiamide)、杀铃脲(Triflumuron)、氯虫苯甲酰胺(Rynaxypyr)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、硫双威(Thiodicarb)、β-氟氯氰菊酯(β-Cyfluthrin)、氯氰菊酯(Cypermethrin)、联苯菊酯(Bifenthrin)、虱螨脲(Lufenuron)、杀虫隆(Triflumoron)、七氟菊酯(Tefluthrin)、丁基嘧啶磷(Tebupirimphos)、乙虫腈(Ethiprole)、溴氰虫酰胺(Cyazypyr)、噻虫啉(Thiacloprid)、啶虫脒(Acetamiprid)、呋虫胺(Dinetofuran)、阿维菌素(Avermectin)、甲硫威(Methiocarb)、螺螨酯(spirodiclofen)、螺虫乙酯(Spirotetramat)；玉米杀真菌剂：种衣酯(Fenitropan)、福美双(Thiram)、丙硫菌唑(Prothioconazole)、戊唑醇(Tebuconazole)、肟菌酯(Trifloxystrobin)；稻除草剂：丁草胺(Butachlor)、敌稗(Propanil)、四唑嘧磺隆(Azimsulfuron)、苄嘧磺隆(Bensulfuron)、氰氟草酯(Cyhalofop)、杀草隆(Daimuron)、四唑酰草胺(Fentrazamide)、咪唑磺隆(Imazosulfuron)、苯噻草胺(Mefenacet)、嗪草酮(Oxaziclomefone)、吡嘧磺隆(Pyrazosulfuron)、稗草畏(Pyributicarb)、二氯喹啉酸(Quinclorac)、禾草丹(Thiobencarb)、茚草酮(Indanofan)、氟噻草胺(Flufenacet)、四唑酰草胺(Fentrazamide)、氯吡嘧磺隆(Halosulfuron)、嗪草酮(Oxaziclomefone)、双环磺草酮(Benzobicyclon)、环酯草醚(Pyriftalid)、五氟磺草胺(Penoxsulam)、双草醚(Bispyribac)、丙炔草酮(Oxadiargyl)、乙氧磺隆(Ethoxysulfuron)、丙草胺(Pretilachlor)、甲基磺草酮(Mesotrione)、Tefuryltrione、草酮(Oxadiazone)、唑禾草灵(Fenoxaprop)、Pyrimisulfan；稻杀虫剂：地亚农(Diazinon)、杀螟硫磷(Fenitrothion)、仲丁威(Fenobucarb)、久效磷(Monocrotophos)、丙硫克百威(Benfuracarb)、噻嗪酮(Buprofezin)、呋虫胺(Dinotefnran)、氟虫腈(Fipronil)、吡虫啉(Imidacloprid)、异丙威(Isoprocarb)、噻虫啉(Thiacloprid)、环虫酰肼(Chromafenozide)、噻虫啉(Thiacloprid)、呋虫胺(Dinotefuran)、可尼丁(Clothianidin)、乙虫腈(Ethiprole)、氟虫双酰胺(Flubendiamide)、氯虫苯甲酰胺(Rynaxypyr)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、啶虫脒(Acetamiprid)、噻虫嗪(Thiamethoxam)、溴氰虫酰胺(Cyazypyr)、艾克敌(spinosad)、Spinotoram、氨基阿维菌素苯甲酸盐(Emamectin-benzoate)、氯氰菊酯(Cypermethrin)、毒死蜱(Chlorpyriphos)、杀螟丹(Cartap)、对甲胺磷(Methamidophos)、醚菊酯(Etofenprox)、***磷(Triazophos)、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、克百威(Carbofuran)、丙硫克百威(Benfuracarb；稻杀真菌剂：甲基硫菌灵(Thiophanate-methyl)、嘧菌酯(Azoxystrobin)、环丙酰亚胺(Carpropamid)、敌瘟磷(Edifenphos)、嘧菌腙(Ferimzone)、异稻瘟净(Iprobenfos)、稻瘟灵(Isoprothiolane)、戊菌隆(Pencycuron)、烯丙苯噻唑(probenazole)、咯喹酮(Pyroquilon)、三环唑(Tricyclazole)、肟菌酯(Trifloxystrobin)、双氯氰菌胺(Diclocymet)、稻瘟酰胺(Fenoxanil)、硅氟唑(Simeconazole)、噻酰菌胺(Tiadinil)；棉花除草剂：敌草隆(Diuron)、伏草隆(Fluometuron)、MSMA、乙氧氟草醚(Oxyfluorfen)、扑草净(Prometryn)、氟乐灵(Trifluralin)、唑草酮(Carfentrazone)、烯草酮(Clethodim)、精吡氟禾草灵(Fluazifop-butyl)、草甘膦(Glyphosate)、氟草敏(Norflurazon)、二甲戊(Pendimethalin)、嘧草硫醚(Pyrithiobac-sodium)、三氟啶磺隆(Trifloxysulfuron)、吡喃草酮(Tepraloxydim)、草铵膦(Glufosinate)、丙炔氟草胺(Flumioxazin)、噻苯隆(Thidiazuron)；棉花杀虫剂：乙酰甲胺磷(Acephate)、涕灭威(Aldicarb)、毒死蜱(Chlorpyrifos)、氯氰菊酯(Cypermethrin)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、马拉硫磷(Malathion)、久效磷(Monocrotophos)、阿维菌素(Abamectin)、啶虫脒(Acetamiprid)、甲胺基阿维菌素苯甲酸盐(Emamectin Benzoate)、吡虫啉(Imidacloprid)、二唑虫(Indoxacarb)、高三氟氯氰菊酯(Lambda-Cyhalothrin)、艾克敌(spinosad)、硫双威(Thiodicarb)、γ-氯氟氰菊酯、螺甲螨酯(spiromesifen)、啶虫丙醚(Pyridalyl)、氟啶虫酰胺(Flonicamid)、氟虫双酰胺(Flubendiamide)、杀铃脲(Triflumuron)、氯虫苯甲酰胺(Rynaxypyr)、Beta-Cyfluthrin、螺虫乙酯(Spirotetramat)、可尼丁(Clothianidin)、噻虫嗪(Thiamethoxam)、噻虫啉(Thiacloprid)、呋虫胺(Dinetofuran)、氟虫双酰胺(Flubendiamide)、溴氰虫酰胺(Cyazypyr)、艾克敌(spinosad)、Spinotoram、γ氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、硫双威(Thiodicarb)、阿维菌素(Avermectin)、氟啶虫酰胺(Flonicamid)、啶虫丙醚(Pyridalyl)、螺甲螨酯(spiromesifen)、氟啶虫胺腈(Sulfoxaflor)、丙溴磷(Profenophos)、***磷(Thriazophos)、硫丹(Endosulfan)；棉花杀真菌剂：土菌灵(Ftridiazole)、甲霜灵(Metalaxyl)、五氯硝基苯(Quintozene)；大豆除草剂：甲草胺(Alachlor)、灭草松(Bentazone)、氟乐灵(Trifluralin)、氯嘧磺隆(Chlorimuron-Ethyl)、氯酯磺草胺(Cloransulam-Methyl)、唑禾草灵(Fenoxaprop)、氟磺胺草醚(Fomesafen)、吡氟禾草灵(Fluazifop)、草甘膦(Glyphosate)、甲氧咪草烟(Imazamox)、咪唑喹啉酸(Imazaquin)、咪唑乙烟酸(Imazethapyr)、精异丙甲草胺(S-)Metolachlor)、嗪草酮(Metribuzin)、二甲戊(Pendimethalin)、吡喃草酮(Tepraloxydim)、草铵膦(Glufosinate)；大豆杀虫剂：高三氟氯氰菊酯(Lambda-Cyhalothrin)、灭多威(Methomyl)、对硫磷(Parathion)、硫双威(Thiocarb)、吡虫啉(Imidacloprid)、可尼丁(Clothianidin)、噻虫嗪(Thiamethoxam)、噻虫啉(Thiacloprid)、啶虫脒(Acetamiprid)、呋虫胺(Dinetofuran)、氟虫双酰胺(Flubendiamide)、氯虫苯甲酰胺(Rynaxypyr)、溴氰虫酰胺(Cyazypyr)、艾克敌(spinosad)、Spinotoram、氨基阿维菌素苯甲酸盐(Emamectin-benzoate)、氟虫腈(Fipronil)、乙虫腈(Ethiprole)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、β-氟氯氰菊酯(β-Cyfluthrin)、γ和λ氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、螺虫乙酯(Spirotetramat)、Spinodiclofen、杀铃脲(Triflumuron)、氟啶虫酰胺(Flonicamid)、硫双威(Thiodicarb)、高效氟氯氰菊酯(Beta-Cyfluthrin)；大豆杀真菌剂：嘧菌酯(Azoxystrobin)、环丙唑醇(Cyproconazole)、氟环唑(Epoxiconazole)、粉唑醇(Flutriafol)、吡唑醚菌酯(Pyraclostrobin)、戊唑醇(Tebuconazole)、肟菌酯(Trifloxystrobin)、丙硫菌唑(Prothioconazole)、四氟醚唑(Tetraconazole)；甜菜除草剂：氯草敏(Chloridazon)、双苯胺灵(Desmedipham)、乙氧呋草黄(Ethofumesate)、甲双苯胺灵(Phenmedipham)、野麦畏(Triallate)、二氯吡啶酸(Clopyralid)、吡氟禾草灵(Fluazifop)、环草定(Lenacil)、苯嗪草酮(Metamitron)、氯甲喹啉酸(Quinmerac)、噻草酮(Cycloxydim)、氟胺磺隆(Triflusulfuron)、吡喃草酮(Tepraloxydim)、喹禾灵(Quizalofop)；甜菜杀虫剂：吡虫啉(Imidacloprid)、可尼丁(Clothianidin)、噻虫嗪(Thiamethoxam)、噻虫啉(Thiacloprid)、啶虫脒(Acetamiprid)、呋虫胺(Dinetofuran)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、β-氟氯氰菊酯(β-Cyfluthrin)、γ/λ氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、七氟菊酯(Tefluthrin)、氯虫苯甲酰胺(Rynaxypyr)、Cyaxypyr、氟虫腈(Fipronil)、克百威(Carbofuran)；卡诺拉油菜除草剂：二氯吡啶酸(Clopyralid)、禾草灵酸(Diclofop)、吡氟禾草灵(Fluazifop)、草铵膦(Glufosinate)、草甘膦(Glyphosate)、吡唑草胺(Metazachlor)、氟乐灵(Trifluralin)、胺苯磺隆(EthaMetsulfuron)、氯甲喹啉酸(Quinmerac)、喹禾灵(Quizalofop)、烯草酮(Clethodim)、吡喃草酮(Tepraloxydim)；卡诺拉油菜杀真菌剂：嘧菌酯(Azoxystrobin)、多菌灵(Carbendazim)、咯菌腈(Fludioxonil)、异菌脲(Iprodione)、咪鲜胺(Prochloraz)、乙烯菌核利(Vinclozolin)；卡诺拉油菜杀虫剂：克百威(Carbofuran)、有机磷农药类、拟除虫菊酯类、噻虫啉(Thiacloprid)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、吡虫啉(Imidacloprid)、可尼丁(Clothianidin)、噻虫嗪(Thiamethoxam)、啶虫脒(Acetamiprid)、呋虫胺(Dinetofuran)、β-氟氯氰菊酯(β-Cyfluthrin)、γ和λ氯氟氰菊酯、τ-氟胺氰菊酯(Fluvaleriate)、乙虫腈(Ethiprole)、艾克敌(spinosad)、Spinotoram、氟虫双酰胺(Flubendiamide)、氯虫苯甲酰胺(Rynaxypyr)、溴氰虫酰胺(Cyazypyr)、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮。

“害虫”包括但是不限于昆虫、真菌、细菌、线虫、螨、蜱等。昆虫害虫包括选自鞘翅目(Coleoptera)、双翅目(Diptera)、膜翅目(Hymenoptera)、鳞翅目(Lepidoptera)、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthroptera)、缨翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Loptera)、虱目(Anoplura)、蚤目(Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)等，特别地选自鞘翅目、鳞翅目和双翅目的昆虫。

鞘翅目包括肉食亚目(Adephaga)和多食亚目(Polyphaga)。肉食亚目包括步甲总科(Caraboidea)和豉甲总科(Gyrinoidea)、而多食亚目包括水龟甲总科(Hydrophiloidea)、隐翅甲总科(Staphylinoidea)、花萤总科(Cantharoidea)、郭公甲总科(Cleroidea)、叩甲总科(Elateroidea)、花甲总科(Dascilloidea)、泥甲总科(Dryopoidea)、丸甲总科(Byrrhoidea)、扁甲总科(Cucujoidea)、芫菁总科(Meloidea)、花蚤总科(Mordelloidea)、拟步甲总科(Tenebrionoidea)、长蠹总科(Bostrichoidea)、金龟总科(Scarabaeoidea)、天牛总科(Cerambycoidea)、叶甲总科(Chrysomeloidea)和象甲总科(Curculionoidea)。步甲总科包括虎甲科(Cicindelidae)、步甲科(Carabidae)和龙虱科(Dytiscidae)。豉甲总科包括豉甲科(Gyrinidae)。水龟甲总科包括水龟甲科(Hydrophilidae)。隐翅甲总科包括葬甲科(Silphidae)和隐翅甲科(Staphylinidae)。花萤总科包括花萤科(Cantharidae)和萤科(Lampyridae)。郭公甲总科包括郭公甲科(Cleridae)和皮蠹科(Dermestidae)。叩甲总科包括叩甲科(Elateridae)和吉丁甲科(Buprestidae)。扁甲总科包括瓢甲科(Coccinellidae)。芫菁总科包括芫箐科(Meloidae)。拟步甲总科包括拟步甲科(Tenebrionidae)。金龟总科包括黑蜣科(Passalidae)和金龟科(Scarabaeidae)。天牛总科包括天牛科(Cerambycidae)。叶甲总科包括叶甲科(Chrysomelidae)。象甲总科包括象甲科(Curculionidae)和小蠹科(Scolytidae)。

双翅目包括亚目长角亚目(Nematocera)、短角亚目(Brachycera)和环裂亚目(Cyclorrhapha)。长角亚目(Nematocera)包括大蚊科(Tipulidae)、毛蠓科(Psychodidae)、蚊科(Culicidae)、蠓科(Ceratopogonidae)、摇蚊科(Chironomidae)、蚋科(Simuliidae)、毛蚊科(Bibionidae)和瘿蚊科(Cecidomyiidae)。短角亚目包括水虻科(Stratiomyidae)、虻科(Tabanidae)、剑虻科((Therevidae)、食虫虻科(Asilidae)、拟蜂虻科(Mydidae)、蜂虻科(Bombyliidae)和长足虻科(Dolichopodidae)。环裂亚目(Cyclorrhapha)包括无缝组(Aschiza)和有缝组。无缝组包括科蚤蝇科(Phoridae)、食蚜蝇科(Syrphidae)和眼蝇科(Conopidae)。有缝组包括无瓣类(Acalyptratae)和有瓣类(Calyptratae)。无瓣类包括斑蝇科(Otitidae)、实蝇科(Tephritidae)、潜蝇科(Agromyzidae)和果蝇科(Drosophilidae)。有瓣类包括科虱蝇科(Hippoboscidae)、狂蝇科(Oestridae)、寄蝇科(Tachinidae)、花蝇科(Anthomyiidae)、蝇科(Muscidae)、丽蝇科(Calliphoridae)和麻蝇科(Sarcophagidae)。

鳞翅目包括凤蝶科(Papilionidae)、粉蝶科(Pieridae)、灰蝶科(Lycaenidae)、蛱蝶科(Nymphalidae)、斑蝶科(Danaidae)、眼蝶科(Satyridae)、弄蝶科(Hesperiidae)、天蛾科(Sphingidae)、大蚕蛾科(Saturniidae)、尺蛾科(Geometridae)、灯蛾科(Arctiidae)、夜蛾科(Noctuidae)、毒蛾科(Lymantriidae)、透翅蛾科(Sesiidae)和谷蛾科(Tineidaee)。

线虫包括寄生性线虫如根结线虫、胞囊线虫和根腐线虫，包括胞囊线虫属(Heterodera)某些物种、根结线虫属(Meloidogyne)某些物种和球胞囊属(Globodera)某些物种；特别地是胞囊线虫成员，包括但不限于Heterodera glycines(大豆胞囊线虫)；Heterodera schachtii(甜菜胞囊线虫)；Heterodera avenae(谷类胞囊线虫)；和马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)和马铃薯白线虫(Globodera pailiaa)(马铃薯胞囊线虫)。根腐线虫包括短体属(Pratylenchus)某些物种，例如穿刺根腐线虫(Pratylenchuspenetrans)。

对于主要作物的本发明昆虫害虫包括：玉米：玉米螟(Ostrinia nubilalis)、欧洲玉米钻心虫(European corn borer)；小地老虎(Agrotis ipsilon)、黑地蚕(blackcutworm)；谷实夜蛾(Helicoverpa zea)、美洲棉铃虫(corn earworm)；草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)、秋夜蛾(fall armyworm)；西南玉米杆草螟(Diatraeagrandiosella)、西南玉米钻心虫(southwestern corn borer)；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus)、小玉米茎钻心虫(lesser cornstalk borer)；小蔗螟(Diatraea saccharalis)、甘蔗钻心虫(surgarcane borer)；玉米根叶甲(Diabroticavirgifera)、西方玉米根虫(western corn rootworm)；长角叶甲barberi亚种(Diabroticalongicornis barberi)、北方玉米根虫(northern corn rootworm)；黄瓜十一星叶甲食根亚种(Diabrotica undecimpunctata howardi)、南方玉米根虫(southern cornrootworm)；纹路叩甲属(Melanotus spp.)、铁线虫(wireworms)；圆头犀金龟(Cyclocephala borealis)、圆头独角仙(northern masked chafer(蛴螬))；圆头无斑犀金龟(Cyclocephala immaculata)、南方圆头犀金龟(southern masked chafer(蛴螬))；日本金龟(Popillia japontca)、日本甲虫(Japanese beetle)；玉米铜色跳甲(Chaetocnemapulicaria)、玉米跳甲(corn flea beetle)；玉米谷喙甲(Sphenophorus maidis)、玉米谷象(maize billbug)；玉米缢管蚜(Rhopalosiphum maidis)、玉米蚜(corn leaf aphid)；玉米根蚜(Anuraphis maidiradicis，corn root aphid)；美洲谷长蝽(Blissus leucopterusleucopterus)、麦虱(chinch bug)；赤腿黑蝗(Melanoplus femurrubrum)、赤腿蚱蜢(redlegged grasshopper)；血黑蝗(Melanoplus sanguinipes)、迁徙蚱蜢(migratorygrasshopper)；玉米种蝇(Hylemya platura)、玉米种蛆(seedcorn maggot)；美洲黍潜叶蝇(Agromyza parvicornis)、玉米斑潜叶蝇(corn blot leafminer)；玉米黄呆蓟马(Anaphothrips obscrurus)、草蓟马(grass thrips)；窃叶蚁(Solenopsis milesta，thiefant)；二斑叶螨(Tetranychus urticae)、二点叶螨(twospotted spider mite)；高粱：玉米禾螟(Chilo partellus)、高粱钻心虫(sorghum borer)；草地夜蛾，秋夜蛾；谷实夜蛾，美洲棉铃虫；南美玉米苗斑螟，小玉米茎钻心虫；粒肤地老虎(Feltia subterranea，granulatecutworm)；Phyllophaga crinita，蛴螬；伪金针虫属(Eleodes)、Conoderus和Aeolus属某些物种，铁线虫；黑甲负泥虫(Oulema melanopus)、(谷类植物跳甲)；玉米铜色跳甲(Chaetocnema pulicaria)、玉米跳甲(corn flea beetle)；玉米谷喙甲(Sphenophorusmaidis)、玉米谷象(maize billbug)；玉米缢管蚜(Rhopalosiphum maidis)、玉米蚜(cornleaf aphid)；蔗黄伪毛蚜(Sipha flava)、甘蔗黄蚜(yellow sugarcane aphid)；美洲谷长蝽(Blissus leucopterus leucopterus)、麦虱(chinch bug)；高粱瘿蚊(Contariniasorghicola)、高粱蠓(sorghum midge)；朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)、棉红蜘蛛(carmine spider mite)；二斑叶螨(Tetranychus urticae)、二点叶螨(twospottedspider mite)；小麦：美洲一星粘虫(Pseudaletia unipunctata)、行军虫(army worm)；草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)、秋夜蛾(fall armyworm)；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus)、小玉米茎钻心虫(lesser cornstalk borer)；Agrotisorthogonia，西部切根虫(western cutworm；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpuslignosellus)、小玉米茎钻心虫(lesser cornstalk borer)；黑甲负泥虫，禾谷跳甲；三叶草叶象(Hypera punctata)、车轴草叶象甲(clover leaf weevil)；黄瓜十一星叶甲食根亚种，南方玉米根虫；俄罗斯麦蚜(Russian wheat aphid)；麦二叉蚜(Schizaphisgraminum)、绿虫(greenbug)；麦长管蚜(Macrosiphum avenae)、英国禾谷蚜(Englishgrain aphid)；赤腿黑蝗，赤腿蚱蜢；殊种黑蝗，殊种蚱蜢；血黑蝗，迁徙蚱蜢；小麦瘿蚊(Mayetiola destructor)、黑森瘿蚊(hessian fly)；麦红吸浆虫(Sitodiplosismosellana)、麦蠓(wheat midge)；美洲麦杆蝇(Meromyza americana，wheat stemmaggot)；冬作种蝇(Hylemya coarctata，wheat bulb fly)；烟草蓟马(Frankliniellafusca)、烟蓟马(tobacco thrips)；茎锯蜂(Cephus cinctus)、麦茎蜂(wheat stemsawfly)；郁金香瘤瘿螨(Aceria tulipae)、麦瘿螨(wheat curl mite)；向日葵：Suleimahelianthana，sunflower bud moth；向日葵斑螟(Homoeosoma electellum)、美洲向日葵螟(sunflower moth)；向日葵叶甲(zygogramma exclamationis，sunflower beetle)；胡萝卜金龟(Bothyrus gibbosus，carrot beetle)；向日葵籽瘿蚊(Neolasiopteramurtfeldtiana，sunflower seed midge)；棉属植物：烟蚜夜蛾(Heliothis virescens)、棉卷叶蛾(cotton budworm)；谷实夜蛾(Helicoverpa zea)、美洲棉铃虫(cotton bollworm)；甜菜夜蛾(spodoptera exigua)、甜菜粘虫(beet armyworm)；红铃麦蛾(Pectinophoragossypiella)、棉红铃虫(pink bollworm)；墨西哥棉铃象(Anthonomus grandis)、棉铃象甲(boll weevil)；棉蚜(Aphis gossypii，cotton aphid)；棉跳盲蝽(Pseudatomoscelisseriatus，cotton fleahopper)；结翅粉虱(Trialeurodes abutilonea，bandedwingedwhitefly)；牧草盲蝽(Lygus lineolaris，tarnished plant bug)；赤腿黑蝗，赤腿蚱蜢；殊种黑蝗，殊种蚱蜢；棉蓟马(Thrips tabaci)、洋葱蓟马(onion thrips)；烟草蓟马，草蓟马；朱砂叶螨，棉红蜘蛛；二斑叶螨，二点叶螨；稻：小蔗螟，甘蔗钻心虫；草地夜蛾，秋夜蛾；谷实夜蛾，美洲棉铃虫；葡萄肖叶甲(Colaspis brunnea，grape colaspis)；稻水象甲(Lissorhoptrus oryzophilus，rice water weevil)；米象(Sitophilus oryzae，riceweevil)；黑尾叶蝉(Nephotettix nigropictus)、稻叶蝉(rice leafhopper)；美洲谷长蝽，麦虱；喜绿蝽(Acrosternum hilare，green stink bug)；大豆：大豆夜蛾(Pseudoplusiaincludens)、大豆尺蠖(soybean looper)；梨豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)、梨豆毛虫(velvetbean caterpillar)；苜蓿绿夜蛾(Plathypena scabra，green cloverworm)；玉米螟，欧洲玉米钻心虫；小地老虎，黑地蚕；甜菜夜蛾，甜菜粘虫；烟蚜夜蛾，棉卷叶蛾；谷实夜蛾，美洲棉铃虫；墨西哥豆瓢虫(Epilachna varivestis，Mexican bean beetle)；桃蚜(Myzus persicae，green peach aphid)；蚕豆微叶蝉(Empoasca fabae)、马铃薯叶蝉(potato leafhopper)；喜绿蝽(Acrosternum hilare)、绿臭蝽(green stink bug)；赤腿黑蝗，赤腿蚱蜢；殊种黑蝗，殊种蚱蜢；玉米种蝇，玉米种蛆；Sericothrips variabilis、大豆蓟马(soybean thrips)；棉蓟马，洋葱蓟马；土耳其斯坦叶螨(Tetranychus turkestani，strawberry spider mite)；二斑叶螨，二点叶螨；大麦：玉米螟，欧洲玉米钻心虫；小地老虎，黑地蚕；麦二叉蚜，绿虫；美洲谷长蝽，麦虱；喜绿蝽，绿臭蝽；褐臭椿(Fuschistusservus，brown stink bug)；玉米种蝇，玉米种蛆；小麦瘿蚊，黑森瘿蚊；麦岩螨(Petrobialatens，brown wheat mite)；油籽油菜(Oil Seed Rape)：甘蓝短棒蚜(Brevicorynebrassicae)、甘蓝蚜(cabbage aphid)；十字花科跳甲(Phyllotreta cruciferae，Fleabeetle)；蓓带夜蛾(Mamestra configurata、Bertha armyworm)；小菜蛾(Plutellaxylostella，Diamond-back moth)；地种蝇属某些物种(Delia ssp.)、根蛆(Rootmaggots)。

用于增加植物产量的方法

提供了用于增加植物产量的方法。所述方法包括提供植物或植物细胞，其表达编码本文中所公开的杀虫多肽序列的多核苷酸，和在被害虫侵袭的田间生长该植物或其种子，其中所述多肽对所述害虫具有杀虫活性。在一些实施方案中，所述多肽具有针对鳞翅目的、鞘翅目的、双翅目的、半翅目的或线虫类的害虫的杀虫活性并且所述的田地用鳞翅目的、半翅目的、鞘翅目的、双翅目的或线虫类的害虫侵袭。

如本文中定义，植物的“产量”指由植物产生的生物量的质量和/或数量。“生物量”意指任何所度量的植物产物。生物量产生的增加是所度量植物产物的产量方面的任意改善。增加植物产量具有几项商业应用。例如，增加植物叶生物量可以增加用于人或动物消费的叶菜类的产量。另外，增加叶生物量可以用来增加植物衍生的药用或工业产物的生产。产量的增加可以包含任何统计显著的增加，包括但不限于与不表达杀虫序列的植物相比，产量增加至少1％、增加至少3％、增加至少5％、增加至少10％、增加至少20％、增加至少30％、至少50％、至少70％、至少100％或更多。

在具体的方法中，植物产量因表达本文中所公开杀虫蛋白的植物的改善的害虫抗性而增加。杀虫蛋白的表达导致害虫侵袭或采食植物的能力降低，因而，改善植物产量。

以下实施例以说明方式且不以限制方式提供。

实施例1.来自苏云金芽孢杆菌的与杀虫基因具有同源性的新杀虫基因的发现

使用如下步骤从表1中列出的细菌菌株中鉴定新杀虫基因：

·从包含通常携带Δ-内毒素基因的质粒的菌株中制备染色体外DNA

·机械剪切染色体外DNA以产生大小分布的片段

·克隆约2Kb至约10Kb的染色体外DNA片段

·生长出染色体外DNA的约1500个克隆

·使用克隆载体特异性引物，对这1500个克隆进行部分测序(末端读取)

·通过MiDAS方法(如通过引用方式完整并入本文的美国专利公开号20040014091中所述)，通过同源性分析鉴定推定的毒素基因

·含有推定的目的毒素基因的片段的克隆的序列整理(步行法)

表1

¹与axmi201配对

²与axmi200配对

³与axmi214配对

⁴与axmi213配对

⁵基于检查ATX24031的序列，鉴定了两个重叠的可读框(ORFs)，每一个可读框都具有与内毒素样基因的同源性。检查了这些ORF及它们编码的蛋白质后，显而易见，这两个ORFs可能起源于单一的ORF，所述单一的ORF在从第一个ORF开始的核苷酸224至309区域中经历了单核苷***(或者产生了单核苷酸移码的更大***)。将这些orf在本文中称为ATX24031_contig4_orf1(SEQ ID NO：63)和ATX424031_contig4_orf2(SEQ ID NO：64)。全长序列在SEQ ID NO：65中示出。通过“固定”***来产生单一的ORF，可以装配与内毒素完全同源的复合ORF。然而应当理解，可以创造多种解决方案来产生此种ORF，并且这些解决方案在ORFs之间重叠的区域方面不同，本文提供了一种解决方案，称为axmi196(SEQ ID NO：7)。

6在紧接axmi211的上游鉴定了p19/CryBP1样基因。这种基因的核苷酸序列在SEQID NO：66中示出，并在SEQ ID NO：67中示出了氨基酸序列。

6在紧接axmi212的上游鉴定了p19样基因。这种基因的核苷酸序列在SEQ ID NO：68中示出，并在SEQ ID NO：69中示出了氨基酸序列。

实施例2.在芽孢杆菌属中表达

通过PCR从pAX980扩增本文中所公开的杀虫基因并且通过本领域熟知的方法，将PCR产物克隆到芽孢杆菌表达载体pAX916或另一个合适载体中。含有携带axmi基因的载体的所得芽孢杆菌菌株在常规生长培养基上培养，如CYS培养基(10g/l细菌用酪蛋白胨；3g/l酵母提取物；6g/l KH₂PO₄；14g/l K₂HPO₄；0.5mM MgSO₄；0.05mM MnCl₂；0.05mM FeSO₄)，直至通过显微镜检表明芽孢形成明显。制备样品并在生物测定法中测试活性。

实施例3.Axmi-191和Axmi-192的杀虫活性

基因表达和纯化

编码Axmi-191和Axmi-192的毒素结构域的多个DNA区域独立地克隆到大肠杆菌表达载体pMAL-C4x中于编码麦芽糖结合蛋白(MBP)的malE基因之后。这些符合读码框的融合导致大肠杆菌中的MBP-Axmi融合蛋白表达。

为了在大肠杆菌中表达，BL21＊DE3以各个质粒转化。将单菌落接种到补充有羧苄西林和葡萄糖的LB中并且在37℃培育过夜。次日，新鲜培养基用1％过夜培养物接种并且在37℃生长至对数期。随后，培养物用0.3mM IPTG在20℃诱导过夜。将每份细胞沉淀悬浮于20mM Tris-Cl缓冲液，pH 7.4+200mM NaCl+1mM DTT+蛋白酶抑制剂中并作超声处理。通过SDS-PAGE分析证实了融合蛋白的表达。

使无细胞的总提取物经过与FPLC连接的直链淀粉柱以亲和纯化MBP-axmi融合蛋白。结合的融合蛋白用10mM麦芽糖溶液从树脂洗脱。纯化的融合蛋白随后以因子Xa切割以从Axmi蛋白去除氨基端MBP标签。通过SDS-PAGE确定蛋白质的切割和溶解性。

昆虫生物测定法

在带有适宜对照的昆虫测定法中测试切割的蛋白质。对平板读取5天，显示Axmi-191和Axmi-192具有针对小菜蛾(Diamondback moth)的活性。Axmi191显示出引起矮化，且Axmi192显示出引起严重矮化和100％的死亡率。

实施例4.合成序列的构建

在本发明的一个方面，产生了合成的毒素序列。这些合成的序列相对于亲代毒素序列具有改变的DNA序列，并且编码这样的蛋白质，该蛋白质与其相对应的亲代毒素蛋白相符，但是缺少在许多Δ-内毒素蛋白中存在的C末端“结晶结构域”。

在本发明的另一个方面，如此设计改变形式的合成基因，从而将所得的肽靶向植物细胞器，如内质网或质外体。已知导致融合蛋白靶向植物细胞器的肽序列是本领域已知的。例如，本领域已知来自白羽扇豆(Lupinus albus)的酸性磷酸酶基因(Genebank ID GI：14276838；Miller等人(2001)Plant Physiology 127：594-606)的N端区导致异源蛋白靶向内质网。如果所得的融合蛋白还在C末端含有包含肽N-末端-赖氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸(即，“KDEL”基序，SEQ ID NO：70)的内质网停留序列，则该融合蛋白会被靶向内质网。如果融合蛋白在C末端处缺少内质网靶向序列，则蛋白质将会被靶向内质网，但最终会隔绝在质外体中。

实施例5.杀虫活性的测定法

常常以众多方式评估杀虫蛋白作为杀虫剂对害虫发挥作用的能力。本领域熟知的一种方式是进行饲喂测定法。在这种饲喂测定法中，使害虫暴露于含有待测试化合物的样品或对照样品。这常常通过将待测试物质或该物质的合适稀释物放置到害虫会摄取的物质(如人工食物)上进行。待测试的物质可以由液体、固体或浆液组成。待测试的物质可以置于表面上并且随后允许干燥。备选地，待测试的物质可以与熔融的人工食物混合，随后分配至测定箱中。测定箱可以是例如杯、碟或微量滴定板的孔。

用于吸吮性害虫(例如蚜虫)的测定法可以涉及试验材料与昆虫通过隔离物(理想地是可以被吸吮昆虫的吸口部分穿透的部分)分隔以允许摄取试验材料。该试验材料常常与饲喂刺激物如蔗糖混合以促进试验化合物的摄取。

其他类型的测定法可以包括微量注射试验材料至害虫的口或肠，以及产生转基因植物，随后测试害虫以该转基因植物为食后的能力。植物测试法可以涉及分离通常消费的植物部分，例如，附着在叶子上的小笼状物，或在含有昆虫的小笼状物中分离完整植株。

测定害虫的其他方法和手段是本领域已知的，并且可以例如在Robertson，J.L.和H.K.Preisler(1992)Pesticide bioassays with arthropods，CRC，Boca Raton，FL中找到。备选地，测定法通常在期刊“Arthropod Management Tests”和“Journal of EconomicEntomology”中或通过美国昆虫学学会(Entomological Society of America(ESA))”成员讨论来描述。

实施例6.pMal融合蛋白的表达

为了在大肠杆菌中表达，将本发明的选定基因克隆入pMal表达载体(New EnglandBiolabs)中，以使在大肠杆菌中表达的该蛋白质具有N端融合至麦芽糖结合蛋白(MBP)。将编码Axmi207的截短变体的核苷酸序列(对应于SEQ ID NO：47的位置15至647)用于生物活性的测试。截短的变体Axmi207序列在SEQ ID NO：62中示出。对于Axmi196、Axmi204和Axmi209，使用全长天然序列。

随后通过本领域已知的亲和层析纯化这些融合蛋白。然后用本领域已知的蛋白酶切割纯化的蛋白质，以将MBP从本发明的蛋白质中分离。然后将所得的蛋白质针对选定的害虫在生物测定法中测试。结果显示于表2中。

表2.

DBM-小菜蛾

CPB-科罗拉多马铃薯叶甲虫(Colorado potato beetle)

SWCB-西南玉米钻心虫

VBC-梨豆毛虫(Velvetbean caterpillar)

ECB-欧洲玉米钻心虫

Hz-谷实夜蛾

FAW-秋夜蛾

SCB-甘蔗螟虫(Sugarcane borer)

SCN-大豆孢囊线虫(Soybean cyst nematode)

实施例7.用于植物表达的本发明毒素基因的载体

本发明基因的每个编码区独立地与用于植物中表达的适宜启动子序列和终止子序列连接。此类序列是本领域熟知的，并且可以包括用于单子叶植物中表达的稻肌动蛋白启动子或玉米遍在蛋白启动子、用于双子叶植物中表达的拟南芥UBQ3启动子或CaMV 35S启动子和nos或PinII终止子。用于产生并证实启动子-基因-终止子构建体的技术也是本领域熟知的。

实施例8.本发明基因通过农杆菌介导的转化法转化入植物细胞中

在授粉后8-12日收获穗。从穗中分离胚，并且将大小0.8-1.5mm的那些胚用于转化。将胚以小盾片侧朝上平铺在合适的孵育培养基上，并且在25℃于黑暗下孵育过夜。然而，本身并不必需要孵育胚过夜。使胚与含有用于Ti质粒介导转移的适宜载体的农杆菌菌株接触5-10分钟，并且随后铺在共培育培养基上3天(25℃于黑暗下)。在共培育后，将外植体转移至恢复期培养基5天(在25℃于黑暗下)。取决于所用具体选择的性质和特征，在选择培养基中孵育外植体持续直至8周。在选择期之后，将所得的愈伤组织转移至胚成熟培养基，直至观察到成熟体细胞胚的形成。所得的成熟体细胞胚随后置于低光照下，并且如本领域已知那样启动再生的过程。允许所得的苗在生根培养基上生根，并且将所得的植物转移至苗圃钵并作为转基因植物繁殖。

实施例9.用本发明毒素基因转化玉米细胞

在授粉后8-12日收获玉米穗。从穗中分离胚，并且将大小0.8-1.5mm的那些胚用于转化。胚以小盾片侧朝上平铺在合适的孵育培养基如DN62A5S培养基(3.98g/L N6盐；1mL/L(1000x母液)N6维生素；800mg/L L-天冬酰胺；100mg/L肌醇；1.4g/L L-脯氨酸；100mg/L酪蛋白氨基酸；50g/L蔗糖；1mL/L(1mg/mL母液)2，4-D)上，并且在25℃于黑暗下孵育过夜。

将所得的外植体转移至筛板(mesh squares)(每个平板30-40个网孔)，转移到渗透培养基上30-45分钟，随后转移至照射平板(beaming plate)(见，例如，PCT公开号WO/0138514和美国专利号5,240,842)。

使用气溶胶束加速器，使用基本上如PCT公开号WO/0138514中所述的条件，将设计旨在植物细胞中表达本发明基因的DNA构建体加速至植物组织中。在照射后，将胚在渗透培养基上孵育30分钟，随后置于孵育培养基上在25℃黑暗中过夜。为避免过分损伤照射过的外植体，将它们在转移至恢复培养基之前孵育至少24小时。胚随后铺展在恢复期培养基上，于25℃黑暗下5日，随后转移至选择培养基。取决于所用具体选择的性质和特征，在选择培养基中孵育外植体持续直至8周。在选择期之后，将所得的愈伤组织转移至胚成熟培养基，直至观察到成熟体细胞胚的形成。所得的成熟体细胞胚随后置于低光照下，并且通过本领域已知的方法启动再生的过程。允许所得的苗在生根培养基上生根，并且将所得的植物转移至苗圃钵并作为转基因植物繁殖。

材料

DN62A5S培养基

用1N KOH/1N KCl调节溶液的pH至pH 5.8，添加Gelrite(Sigma)至3g/L，并且高压灭菌。在冷却至50℃后，添加2ml/L的5mg/ml硝酸银母液(植物技术实验室)。配方产生约20个平板。

本说明书中提到的全部出版物及专利申请说明了本发明所属领域的技术人员的水平。全部出版物及专利申请通过引用的方式以相同程度并入本文，如同专门且个别地说明通过引用方式并入每份单独的出版物或专利申请。

虽然为了清楚理解的目的已经通过阐述和实例的方式某种程度上详细地描述了上述发明，但是显然可以在所附权利要求的范围内进行某些改变和变化。

Claims (17)

1.重组的核酸分子，其选自以下的核苷酸序列且编码的多肽具有杀虫活性：

a)SEQ ID NO:7的核苷酸序列或者其互补序列；和

b)编码SEQ ID NO:34的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述的核苷酸序列是经设计用于在植物中表达的合成序列。

3.权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述的核苷酸序列与能指导所述核苷酸序列在植物细胞中表达的启动子有效连接。

4.表达盒，其包含权利要求3所述的重组核苷酸序列。

5.权利要求4所述的表达盒，其进一步包含编码异源多肽的核酸分子。

6.细菌宿主细胞，其含有权利要求4所述的表达盒。

7.具有杀虫活性的重组多肽，其选自SEQ ID NO:34的氨基酸序列的多肽。

8.一种多肽，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列和异源氨基酸序列。

9.组合物，其包含权利要求7所述的多肽。

10.权利要求9所述的组合物，其中所述组合物选自粉剂、尘剂、丸剂、颗粒剂、喷雾剂、乳剂、胶体剂和溶液剂。

11.权利要求9所述的组合物，其中所述的组合物通过干燥、冻干、匀化、提取、过滤、离心、沉淀或浓缩苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)细胞培养物来制备。

12.权利要求9所述的组合物，其包含以重量计1％至99％的所述多肽。

13.用于控制鳞翅目的或线虫类的害虫种群的方法，包括使所述种群与杀虫有效量的权利要求7的多肽接触。

14.用于矮化鳞翅目的害虫的方法，包括使所述害虫与杀虫有效量的权利要求7的多肽接触或向所述害虫饲喂杀虫有效量的权利要求7的多肽，其中所述鳞翅目的害虫是梨豆毛虫和谷实夜蛾。

15.用于杀死线虫类的害虫的方法，包括使所述害虫与杀虫有效量的权利要求7的多肽接触或向所述害虫饲喂杀虫有效量的权利要求7的多肽，其中所述线虫类的害虫是大豆孢囊线虫、秀丽隐杆线虫和穿刺根腐线虫。

16.用于产生具有杀虫活性的多肽的方法，包括在编码所述多肽的核酸分子表达的条件下培养权利要求6的宿主细胞。

17.用于保护植物免遭害虫侵害的方法，包括在植物或其细胞中表达至少一个表达载体，所述至少一个表达载体包含编码杀虫多肽的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列选自：

a)SEQ ID NO:7所述的核苷酸序列；和

b)编码SEQ ID NO:34的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，

其中所述害虫是梨豆毛虫、谷实夜蛾、大豆孢囊线虫、秀丽隐杆线虫和穿刺根腐线虫。