TW201446961A - 用於細胞培養之組合物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

於哺乳動物細胞培養基內之諸如表沒食子兒茶素沒食子酸酯、芸香苷、柚皮苷或染料木黃酮之生物類黃酮補充已顯示出其係有效於降低重組抗體上的酸性物質變異體。通過生物類黃酮的使用所顯示出的酸性物質降低，促進了較低異質性產品之製造在抗體結構及功能上的潛在改善。

Description

用於細胞培養之組合物及其使用方法 [相關申請案]
本申請案主張2013年5月6日申請之美國臨時專利申請案第61/819,839號之優先權，其全文以引用方式併入本申請案中且用於所有目的。
本發明係有關重組蛋白質的生產。更具體而言，本發明係有關降低表現在細胞培養物中的重組單株抗體的電荷變異體之組合物及方法。
生物物質已廣泛地使用於人類治療。許多生物物質係生產做為細胞培養中的重組蛋白質。電荷變異體係可因為轉譯後修飾等因素而在這類重組蛋白質中發生。重組蛋白質的電荷變異體可影響該重組蛋白質的穩定性、活性、免疫原性及藥物代謝動力學。更具體而言，單株抗體具有廣泛的酸性物質變異體，包含那些與共價加成物以及抗體的特定肽區域上之化學降解相關者。這些變異體在重組治療性蛋白質的整體異質性上扮演重要的角色，且通常在其製造中進行監測以確保其落在規定的限度內。
異質性係可因不同類型的轉譯後修飾而引起。檢閱參見Walsh(2006)及Liu(2008)。表現為電荷變異體之異質性通常在重組表現的蛋 白質中觀測到。電荷變異體可能起因於可能發生在蛋白質不同位置之各種化學降解(例如，氧化、脫醯胺化、異構化、裂解)或加成反應(例如，醣化加成物，或共價加成物)。這些分子活動的累積影響係蛋白質分子上的結構及組成改變，其可轉而改變蛋白質的等電位點(pI)，且可能甚至影響蛋白質的功能。例如，酸性物質變異體係可能在蛋白質上賦予淨負電荷，或其可能去除額外的正電荷。檢閱參見Du(2012)。
已有許多由酸性物質造成的蛋白質變異體被報導。雖然這類變異體的一部分僅對受影響的蛋白質有微少的影響，其餘的變異體會對蛋白質的功能有更巨大的影響。已假設特定電荷變異體的影響程度係取決於該影響發生在蛋白質上的位置，以及蛋白質被修飾的程度。對於抗體Fc區的改變之影響程度不會如發生在Fab區(標靶結合發生處)的改變般地有影響(Du，2012)。電荷變異體已顯示出會影響抗體之活體外及活體內結合特性(Pardridge，1994；Pardridge，1996)。天冬醯胺的脫醯胺化已顯示出會引起抗原結合力的顯著降低(Vlasak，2009；Huang，2005)。醣化已顯示出會增加聚集體的形成(Banks，2009)。再者，酸性物質已顯示出會引起較低的FcRn結合反應，縱然在活體內的PK似乎不受影響(Khawli，2010)。綜上，在治療性蛋白質中的酸性物質變異體的存在可能潛在地影響到受影響蛋白質的功效及/或功能。
各種研究係已經進行以確定酸性物質變異體如何依賴蛋白質生產於其內之局部環境，以及其在純化後所儲存的環境。Abu Absi等人描述了較高的細胞培養溫度會促進重組蛋白質中所表現脫酰胺物質的數量增加。然而，沒有資料報導細胞培養基對於重組抗體所產生的產物品質的影響。
本發明藉由提供降低表現在細胞培養物中的重組單株抗體的電荷變異體之組合物及方法而推進其技術領域。本發明亦提供在未實質 影響抗體產生的整體產量或品質下，降低這些電荷變異體物質數量之方法。
許多治療性蛋白質，諸如單株抗體，係通過含有一或多個編碼該蛋白質之多核苷酸之培養哺乳動物細胞而產生。對於某些重組單株抗體，已有報導當化學成分確定培養基(chemically defined media，CDM)使用在細胞培養基中時，其會有數個由轉譯後修飾所引起的酸性物質。本文於此揭露了補充一或多種生物類黃酮(或類黃酮)至哺乳動物細胞培養補料培養基內會顯著降低由培養細胞所產生重組蛋白質(例如，單株抗體)的酸性物質變異體的整體數量。
在一實施例中，其揭露了一種包含在含有一或多種生物類黃酮的培養基中培養複數個細胞之方法，其中該複數個細胞中的至少一者係包含一編碼有該多肽之多核苷酸。在另一實施例中，該培養基係為CDM。在另一實施例中，該一或多種生物類黃酮係可由使用者在使用前添加至CDM內做為補充物供培養細胞。在另一實施例中，該一或多種生物類黃酮係可於製造場所添加至CDM內做為預混液體培養基。該預混液體培養基係可製備為工作溶液或可為使用者在使用前稀釋之濃縮物。或者，該一或多種生物類黃酮可係在製造場所添加至CDM內做為預混固體培養基，其係可在使用前由使用者再製。
所揭露的組合物係可使用於培養許多不同細胞種類，例如，哺乳動物細胞、昆蟲細胞等。在一實施例中，該細胞係為已引入一或多個外來基因(或轉殖基因)於其內之宿主細胞。在一個態樣中，該一或多個轉殖基因係整合至該宿主細胞的染色體內。在另一個態樣中，該一或多個轉殖基因可離開該宿主染色體外，諸如到一能夠獨立於宿主染色體而繁殖之載體內。這些轉殖細胞係能夠表現一或多個重組蛋白質。
在另一實施例中，該重組蛋白質係為抗體。在一個態樣中，該重組蛋白質係抗TNF-α單株抗體。在另一態樣中，該重組蛋白質係為一 含有一個以上的可變域之抗體，例如，含有雙可變域(DVD)者。
在另一實施例中，其揭露了一用於培養宿主細胞之培養基，其包含一或多種其含量對宿主細胞為無毒性之生物類黃酮，但其含量係有效降低由該宿主細胞所產生之重組蛋白質之酸性物質。在一個態樣中，所揭露組合物在補充至一表現抗TNF-α抗體之宿主細胞培養物內時，係能夠較不具該組合物的細胞培養物中所產生之抗TNF-α抗體，降低至少40%、50%、60%、70%、80%、90%或甚至高達100%的抗TNF-α抗體之酸性物質。術語「無毒性」係指該補充物未明顯降低細胞存活率、細胞生長或該重組蛋白質的產生。
在另一實施例中，可補充一或多種生物類黃酮至一細胞培養基以助於降低重組蛋白質的電荷變異體。在一個態樣中，以沒有生物類黃酮的CDM所產生之重組蛋白質中的電荷變異體數量係可經量測以確定是否需要補充生物類黃酮。在另一個態樣中，以具有生物類黃酮的CDM所產生之重組蛋白質中的電荷變異體數量係可經量測以評估生物類黃酮對降低蛋白質中的電荷變異體之效果。
在一實施例中，在CDM中係未添加或含有顯著的錳含量(即，不大於極微量)。在另一實施例中，該培養基係可包含在本技術領域中已知的任何其他必需或可取的成分，諸如碳水化合物(包含葡萄糖)、必需及/或非必需胺基酸、脂質及脂質前驅物、核酸前驅物、維生素、無基鹽、微量元素(包含稀有金屬)、及/或細胞生長因子。在另一實施例中，該培養基係為一補充有一或多種生物類黃酮之化學成分確定培養基。
生物類黃酮的例子係可為一或多種選自由以下組成的群組之成員：表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)、芸香苷(rutin)、柚皮苷(naringin)、染料木黃酮(genistein)及其組合。在一個態樣中，該生物類黃酮係為表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)，且 該表沒食子兒茶素沒食子酸酯使用在一液體培養基中供培養細胞的工作濃度係可自0.001g/L至0.2g/L、自0.01g/L至0.1g/L、或自0.05g/L至0.1g/L。在另一個態樣中，該生物類黃酮係為芸香苷，且該芸香苷使用在一液體培養基中供培養細胞的工作濃度係可自0.001g/L至0.2g/L、自0.01g/L至0.1g/L、或自0.05g/L至0.1g/L。在另一個態樣中，該生物類黃酮係為柚皮苷，且該柚皮苷使用在一液體培養基中供培養細胞的工作濃度係可自0.001g/L至2g/L、自0.01g/L至1g/L、或自0.05g/L至0.5g/L。在另一個態樣中，該生物類黃酮係為染料木黃酮，且該染料木黃酮使用在一液體培養基中供培養細胞的工作濃度係可自0.001g/L至0.2g/L、自0.01g/L至0.1g/L、或自0.05g/L至0.1g/L。
生物類黃酮係可自植物或植物的部分所獲得，諸如水果。本發明之生物類黃酮補充物係可以實質純淨的形式添加至培養基中，或其可為自植物或植物的部分所製備的粗萃物。在另一個態樣中，該生物類黃酮係可由自然存在的微生物或由經改造以產生生物類黃酮之微生物中獲得。
圖1A-1C顯示三個生物類黃酮(或類黃酮)的主要骨架結構。圖1D顯示了使用於本發明之生物類黃酮之化學結構。
圖2顯示表現在細胞培養物中的蛋白質之主要波峰、酸性物質及鹼性物質的溶離曲線。
圖3顯示在震盪培養瓶分批補料培養物中EGCG補充物對於抗體1在a)細胞生長b)存活率c)效價方面之功效。
圖4顯示在震盪培養瓶分批補料培養物中EGCG補充物對於抗體1在a)酸性物質百分比b)尺寸內含物方面之功效。
圖5顯示在生物反應器分批補料培養物中EGCG補充物對於抗體1在a)細胞生長b)存活率c)效價方面之功效。
圖6顯示在生物反應器分批補料培養物中EGCG補充物對於抗體1在酸性物質百分比方面之功效。
圖7顯示在生物反應器分批補料培養物中EGCG補充物對於抗體1在細胞內活性氧物質(ROS)數量之功效。
圖8顯示一起以或未以多種生物類黃酮培養之細胞株1之細胞生長及存活率曲線圖。
圖9顯示一起以或未以多種生物類黃酮培養之細胞株1收集物中之收集效價及相對酸性物質變異體。
圖10顯示培養在具有各種生物類黃酮之實驗室規模生物反應器培養物之細胞株1之(A)細胞生長(B)存活率(C)收集效價(D)收集物酸性物質數量(E)代表性WCX-10層析。
圖11顯示在具有EGCG補充培養基之震盪培養瓶培養物中之細胞株2之細胞培養效能。A：活細胞密度。B：細胞存活率。C：與未經補充的對照組平均值相比之相對收集效價。D：與未經補充的對照組平均值相比之相對酸性物質。
圖12顯示在具有EGCG補充培養基之實驗室規模生物反應器培養物中之細胞株2之細胞培養效能。A：活細胞密度。B：細胞存活率。C：與未經補充的對照組平均值相比之相對收集效價。D：與未經補充的對照組平均值相比之相對酸性物質。
圖13顯示在具有EGCG補充培養基之震盪培養瓶培養物中之細胞株3之細胞培養效能。A：活細胞密度。B：細胞存活率。C：與未經補充的對照組相比之相對收集效價。D：與未經補充的對照組相比之相對酸性物質。
圖14顯示在具有芸香苷補充培養基之震盪培養瓶培養物中之細胞株1之細胞培養效能。A：活細胞密度。B：細胞存活率。C：與未經補充的對照組相比之相對收集效價。D：與未經補充的對照組相比之 相對電荷變異體曲線(*經標記之天數或處理條件之p值<0.05，表明與未經補充的對照組相比時在統計學上顯著之差異)。
圖15顯示在具有芸香苷補充培養基之震盪培養瓶培養物中之細胞株4之細胞培養效能。A：活細胞密度。B：細胞存活率。C：與未經補充的對照組相比之相對收集效價。D：與未經補充的對照組相比之相對電荷變異體曲線(*經標記之天數或處理條件之p值<0.05，表明與未經補充的對照組相比時在統計學上顯著之差異)。
圖16顯示在具有芸香苷及EGCG補充培養基之實驗室規模生物反應器培養物中之細胞株1之細胞培養效能。A：活細胞密度。B：細胞存活率。C：與未經補充的對照組相比之相對收集效價。D：相對酸性區域之時程變化曲線(相對酸性區域≡測得實驗數值與未經補充的對照組在第8天的數值之比率)。
本文於此揭露了補充生物類黃酮至哺乳動物細胞培養補料培養基內會顯著降低重組單株抗體的酸性物質變異體整體的量。除EGCG外，其他生物類黃酮(諸如芸香苷、柚皮苷及染料木黃酮)係皆有效於減少酸性物質變異體整體的量。這些結果暗示著所觀察到的功效係因為此類分子的普遍特徵而有所相同。這些結果係一致地在多種濃度下觀察到，且遍及不同的細胞培養規模。酸性物質變異體的減少可在沒有顯著的鹼性物質改變下造成主要物質隨之增加。
生物類黃酮係常見於自然界中，如在蘋果(Bellion，2009)及綠茶(Lambert，2010)中的一種二次植物代謝物類別。生物類黃酮被認為是可供人類安全食用，因為它們具有低毒性。此家族中的分子係與多酚環化學結構及酮類相關聯。生物類黃酮已被廣泛研究，同時在活體外具有促氧化劑及抗氧化劑兩種活性。生物類黃酮已顯示出能清除廣泛的活性氧物質(ROS)及活性氮物質(RNS)(Halliwell，2008)。此外，生 物類黃酮已顯示出能螯合金屬離子，從而減少這些金屬的促氧化作用(Halliwell，2008)。
生物類黃酮，尤其是表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)，也具有眾所周知的促氧化劑角色。這些促氧化劑副產物的形成因其可導致更多的ROS而非常重要(Bellion，2009；Long，2000)。因為通常使用於這些培養物中之相對高的溶氧量，在工業用哺乳動物細胞培養物中形成ROS及RNS係預料之中的(Halliwell，2008)。這些結合額外量的生物類黃酮之基線濃度係可導致更高的ROS量。
在升高的氧化壓力條件下，哺乳動物細胞會以一氧化壓力反應而做出反應。在人類中，抗氧化防禦的誘發係設計成不會除去所有的ROS，但會控制其數量在可控制的量下，以應付氧化損害的可能(Halliwell，2008)。在培養的哺乳動物細胞中，係存有類似的防禦機制以應付ROS的數量，如經由誘發穀胱甘肽路徑所顯示(Bellion，2009)。
在本發明中，其已顯示補充多種生物類黃酮家族分子的成員會促進重組IgG1抗體上酸性物質變異體整體量的顯著減少。EGCG、芸香苷、柚皮苷及染料木黃酮係特別有效於酸性物質的整體降低。此降低的主要機制係可能通過ROS量的整體性降低或藉由生物類黃酮直接與存在於培養環境中的ROS物質生物直接相互作用，及/或藉由細胞氧化壓力反應的向上調節。
出於本發明目的，「生物類黃酮」係指具有如圖1A、1B或1C所描繪骨架結構之分子。應理解可加入不同群組於這些骨架結構內且可做不同取代，以得到不同的生物類黃酮或其衍生物。生物類黃酮的例子可包含但不限於EGCG、芸香苷、柚皮苷、染料木黃酮、槲皮黃酮(quercetin)、山茶酚(kaempferol)、楊梅黃酮(myricetin)、漆黃素(fisetin)、異鼠季素(isorhamnetin)、帕奇普達(pachypodol)、鼠李嗪(rhamnazin)、木樨草素(luteolin)、芹黃素(apigenin)、柑桔黃酮(tangeritin)、橘皮苷 素(hesperetin)、聖草酚(eriodictyol)、高聖草酚(homoeriodictyol)、二氫槲皮素(taxifolin)、二氫山奈酚(dihydrokaempferol)、大豆異黃酮苷素(daidzein)、黃豆黃素(glycitein)。藉由示例方式，EGCG、芸香苷、柚皮苷及染料木黃酮的特定結構係圖示於圖1D。
四種生物類黃酮(即EGCG、芸香苷、柚皮苷及染料木黃酮)不會對整體細胞培養效能有明顯的不利影響。然而，當這些生物類黃酮的濃度超過一定程度時，會觀察到較低的細胞生長情形。在一實施例中，當EGCG濃度高於0.1g/L時，該最高活細胞密度開始下落到低於未經補充的對照組條件。然而，除了這整體較低的細胞生長情形外，細胞存活率仍然高於對照組，直至培養收集物的點。因此，在經補充EGCG的培養物與未經補充的培養物之間的收集效價係為相當。
流動型細胞儀的結果顯示了對於培養結束與未經補充的對照組相比時，補充有EGGC的培養物的整體ROS量之顯著降低。ROS量的降低以及酸性物質變異體的降低不太可能僅僅是巧合。這些結果暗示著在一重組蛋白質上整體ROS量及酸性物質變異體數量之間的關聯性。
於此已顯示出補充生物類黃酮至哺乳動物細胞培養補料培養基內係能夠顯著減少多種重組蛋白質上酸性物質變異體的整體量，包含(但不限於)具有一或多個可變區之抗體。評估補充有EGCG及芸香苷的補料培養基之震盪培養瓶研究在這方面上皆係有效，這暗示著此作用係為此類分子的一般特徵。這些結果係與在多種濃度上所觀察到的結果一致，並以在統計學上有意義的方式遍及不同的細胞株及細胞簇規模。在酸性物質變異體上所形成的減少促使主要物質隨之增加至一較大的程度，以及使鹼性物質至一較小的程度。
在一個態樣中，所揭露之生物類黃酮在廣泛的濃度範圍內並未對整體細胞培養效能顯示不利的影響。一旦生物類黃酮的濃度超過一臨界水平，可能造成較低的細胞生長情形。
在另一個態樣中，係可使用多種生物類黃酮分子的結合。這些多種生物類黃酮分子在降低酸性物質電荷變異體上係可具有一更有效且甚至增效的影響。在另一態樣中，所揭露的生物類黃酮分子在活體外的細胞株中或在活體內的哺乳動物的本體上可具有相同或相似的效果。
除非本文中另有定義，否則本文所用科學及技術術語具有熟習此項技術者通常所理解之含義。倘若有任何潛在歧義，則本文所提供定義優先於任何詞典或外在定義。除非上下文另外需要，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。除非另有說明，否則使用「或」意指「及/或」。使用術語「包括」以及其他形式(例如「includes」及「included」)不受限制。
一般而言，用於本文所述細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學、及蛋白及核酸化學以及雜交之命名係業內熟知且常用者。除非另有說明，否則本文所提供之方法及技術通常係根據業內熟知之習用方法且如本說明書中引用及論述的各種一般及更特定參考文獻中所述實施。酶反應及純化技術係根據製造商說明書，或業內習用方法，或本文所述實施。用於本文所述分析化學、合成有機化學、以及醫學及藥物化學之命名及實驗室程序以及技術係業內熟知且常用者。化學合成、化學分析、藥物製備、調配及遞送、以及患者之治療使用標準技術。
為更容易地理解本發明，在下文中定義所選術語。
術語「化學成分確定培養基」(CDM)，如在本技術領域中已知及使用者，且如於本文所使用者，係指適合細胞培養生長的培養基，其中該培養基係未包含由植物、真菌、或動物中所獲得的萃取物、水解物或其他未知組合物之混合物。化學成分確定培養基係可與「無血清培養基」區別開來，化學成分確定培養基可含有重組形式的植物、真 菌、或動物蛋白質(例如，胎牛或人類血清白蛋白)，其中該等蛋白質的來源及組合物係為生物化學上已知者。
術語「抗體」係指免疫球蛋白(Ig)分子(其通常包括四條多肽鏈，即兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈)或其保留Ig分子之基本抗原決定基結合特徵之功能片段、突變體、變異體或衍生物。此等片段、突變體、變異體或衍生物抗體形式為業內已知。在全長抗體之一實施例中，各重鏈包括重鏈可變區(VH)及重鏈恆定區(CH)。重鏈可變區(域)在本發明中亦稱為VDH。CH包括三個域，即CH1、CH2及CH3。各輕鏈包括輕鏈可變區(VL)及輕鏈恆定區(CL)。CL包括單一CL域。輕鏈可變區(域)在本發明中亦稱為VDL。可將VH及VL進一步細分成高變區(稱為互補決定區(CDR))及較為保守之區(稱為框架區(FR))，二者間雜排列。通常，各VH及VL係由三個CDR及四個FR構成，其自胺基端至羧基端按下列順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。免疫球蛋白分子可為任何類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或亞類。
如本文中所使用，術語「人類抗體」意欲包括具有衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列的可變區及恆定區之抗體。本發明之人類抗體可包括未由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如由活體外隨機或位點特異性突變誘發或由活體內體細胞突變而引入之突變)，例如在CDRs中且尤其在CDR3中。
如本文中所使用，術語"重組人類抗體"意欲包括所有藉由重組方式製備、表現、產生或分離之人類抗體，諸如使用一種重組表現載體轉染於一個宿主細胞中所表現的抗體，自一個重組、組合人類抗體庫分離之抗體，自一種人類免疫球蛋白基因轉殖基因之動物(例如老鼠)分離的抗體(例如，參見Taylor等人(1992)Nucl.Acids Res.20：6287)，或藉由任何其他涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列 的方式所製備、表現、產生或分離的抗體。此等重組人類抗體具有人類生殖系(germline)免疫球蛋白序列所衍生的可變區及恆定區。然而，在某些實施例中，此等重組人類抗體經活體外突變誘發(或者，當使用人類Ig序列轉殖基因之動物時，經活體內體細胞突變誘發)，因此重組抗體之VH及VL區之胺基酸序列可能非天然存在於活體內人類抗體生殖系譜(repertoire)中之序列，雖然彼等係由人類生殖系VH及VL序列衍生且相關。
術語「生物功能」係指結合蛋白之特定活體外或活體內作用。結合蛋白可靶向若干類抗原/配位體並經由多種作用機制達成期望治療結果。結合蛋白可靶向可溶性蛋白、細胞表面抗原以及細胞外蛋白沈積物。結合蛋白可激動(agonize)、拮抗或中和其標靶之活性。結合蛋白可輔助清除其所結合之標靶，或在結合至細胞時可導致細胞毒性。可將兩種或更多種抗體之多個部分納入多價形式中以在單一結合蛋白分子中達成不同功能。用於評估生物功能之活體外分析及活體內模型為熟習此項技術者已知(US 20090311253)。
結合蛋白可使用多種宿主細胞產生或可在活體外產生，且相對產量/努力確定「產生效率」。影響產生效率之因素包括(但不限於)宿主細胞類型(原核或真核)、表現載體之選擇、核苷酸序列之選擇及所用方法。用於產生結合蛋白之材料及方法以及對產生效率之量測為熟習此項技術者已知。例如，參見US 20090311253。
術語「重組宿主細胞」或「宿主細胞」係指已引入外源DNA之細胞。此等術語不僅係指特定個體細胞，且亦指此一細胞之子代。由於突變或環境影響可使後續各代發生某些改變，因此，此子代實際上可能與母細胞不同但卻仍包括在本文所用術語「宿主細胞」之範圍內。在一實施例中，宿主細胞包括原核及真核細胞。在一實施例中，真核細胞包括原生生物、真菌、植物及動物細胞。在另一實施例中，宿主 細胞包括(但不限於)原核細胞系大腸桿菌；哺乳動物細胞系CHO、HEK 293、COS、NS0、SP2及PER.C6；昆蟲細胞系Sf9；及真菌細胞啤釀酒酵母菌。
術語「變異體」("Variant")係指一多肽在胺基酸序列或在轉譯後修飾方面不同於一給定的多肽。在胺基酸序列方面的差異可由胺基酸之添加(例如***)、缺失或保守性取代而引起，但保留該給定多肽之生物活性(例如，一變異TNF-α抗體可與抗TNF-α抗體競爭結合TNF-α)。在本領域中係認為胺基酸之保守性取代(亦即，胺基酸經具有類似特性(例如，親水性及帶電區程度及分佈)之不同胺基酸置換)通常涉及微小變化。如在本領域中所瞭解，可部分地藉由考慮胺基酸之親疏水性指數來鑑別此等微小變化(例如，參見Kyte等人(1982)J.Mol.Biol.157：105-132)。胺基酸之親疏水性指數係基於對其疏水性及電荷的考量。在本領域中已知蛋白質中具有類似親疏水性指數之胺基酸可經取代且該蛋白質仍保留蛋白質功能。在一態樣中，具有親疏水性指數±2之胺基酸經取代。胺基酸之親水性亦可用於揭示將會產生保留生物功能之蛋白質的取代。對於肽主體中胺基酸親水性之考量係可計算該肽之最大局部平均親水性，其為一種已報導與抗原性及免疫原性密切相關之有用度量(例如，參見美國專利第4,554,101號)。如在本領域中所瞭解，取代具有類似親水性值之胺基酸係可讓肽保留生物活性，例如免疫原性。在一態樣中，用親水性值在彼此±2的範圍內之胺基酸進行取代。胺基酸之疏水性指數及親水性值皆受該胺基酸之特定側鏈影響。與該觀測結果一致，應理解與生物功能相容之胺基酸取代係依賴該等胺基酸的相對相似性，尤其是彼等胺基酸之側鏈之相對相似性，如由疏水性、親水性、電荷、尺寸及其他特性所顯露。術語「變異體」亦包含已經過差異性處理(諸如藉由蛋白質水解、磷酸化或其他轉譯後修飾)的多肽或其片段，但仍保留其生物活性或抗原反應性，例如，結合至 TNF-α的能力)。除非另外定義，否則術語「變異體」涵蓋一變異體之片段。變異體可與野生型序列99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%或75%一致。
轉譯後修飾的不同係可藉由加入一或多個化學群組至經修飾分子的胺基酸，或從該分子移除一或多個此類群組而受影響。修飾的例子包含(但不限於)磷酸化、醣化或甲基乙二醛(MGO)修飾。
熟習此項技術者應易於瞭解，在不悖離本文所揭示之實施例之範疇下，本文所述之方法的其他適合之修改及更改為顯而易見的且可使用適合相等物進行。現已詳細描述某些實施例，參考以下實例將更清楚理解該等實施例，該等實例僅出於說明之目的包括在內且不欲構成限制。
實例 實例1：材料及方法
細胞培養-表現有人類化單株抗體(抗體1)之重組中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株(細胞株1)係於二個不同的培養容器中進行評估(震盪培養瓶及3公升實驗室規模生物反應器)。該細胞株係源於以DHFR(dihydrofolate reductase，二氫葉酸還原酶)表現系統為基礎的CHO DUX-B11，並培養在化學成分確定的基礎培養基中，並定期地以化學成分確定補料培養基(chemically-defined feed media，CDFM)補料。在所有實驗中使用的培養基皆為化學成分確定的，且不含有動物成分及蛋白質成分二者。各個培養基每一者係於需要時補充選定的生物類黃酮，以評估其對於所產生的酸性物質曲線之可能影響。在培養物的製備中，細胞株係通過單獨的接種箱(seed train)接種而連續膨脹，以產生足夠的細胞供接種。培養期間所使用的處理條件係視培養規模而有些微不同，但在每一規模內係相似於各別未經補充生物類黃酮的對照 條件。所有使用的生物類黃酮係購自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。
活細胞密度(VCD)及細胞存活率數值係通過萘胺藍排除法由Cedex自動細胞計數器(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)量測，葡萄糖及乳酸數值係以ABL-805血液氣體分析儀(Radiometer Medical，Denmark)量測。離線pH、溶氧量(DO)及pCO2(溶解的二氧化碳)的測量係依需求而以ABL-805血液氣體分析儀(Radiometer Medical，Denmark)執行。滲透壓係依需求而在Multi-Osmette 2430型滲透壓計(Precision Systems，Natick，MA)上測量。
蛋白質A親和性層析-抗體效價係由未加工的細胞培養收集物在Poros ATM(Life Technologies，Carlsbad，CA)親和性管柱上使用HPLC系統以低pH、分步溶離梯度及280nm偵測方式作業而量測。絕對濃度係相對於參考標準校準曲線而給定。
經受額外分析定性的純化抗體係使用MabSelectTM蛋白質A(GE Healthcare,Piscataway,NJ)以低pH及分步溶離梯度方式純化，接著使用Corning Lifesciences(Tewksbury，MA)Spin Concentrator X UF管柱依據製造商的建議程序進行緩衝液交換(在需要時)。
通過弱陽離子交換層析的電荷異質性-樣本係使用配有ProPac WCX-10分析型管柱(Thermo Scientific，桑尼維爾，加州)之HPLC系統分析。約100μg的樣本係裝入6%緩衝液B(10mM磷酸納、500mM氯化鈉、pH 5.5)及94%緩衝液A(10mM磷酸納、pH 5.5)。該管柱係以1.0mL/min的流速運行。蛋白質係藉由以超過20分鐘的時間將緩衝液B的組成由6%增加至16%而自該管柱溶離。蛋白質波峰係於該等波峰由管柱溶離時使用在280nm下的UV吸光度測量。管柱接著使用100%緩衝液B再生，以在注射下個樣本前處於使用初始狀態的再平衡期。於主要波峰之前所溶離的波峰係稱為「酸性波峰」，而於主要波峰之後所溶離的波峰係稱為「鹼性波峰」(圖2)。
尺寸排除層析(Size Exclusion Chromatography(SEC))-來自於細胞株1之經蛋白質A純化的抗體樣本係在需要時稀釋為在1倍PBS內有0.5-5mg/mL，並在TSKgel G3000SWXL管柱(Tosoh Bioscience，South San Francisco，CA)上使用HPLC系統上的等強度梯度在280nm的偵測下測量。高分子量(HMW)、單體及低分子量(LMW)物質係依據層析曲線而給定並接著定量。
流式細胞儀分析-至少10x106個細胞係在接種後第6、8、12及15天從3公升生物反應器培養物中收集。緊接著在採樣後，樣本係進行離心且細胞沉澱物係以1倍PBS沖洗，並以1mL預熱的1倍PBS再懸浮。接著加入2μL配製在DMSO中(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的2mM H2-DCF(Life Technologies，Grand Island，NY)，並以避光方式培養在37℃下30分鐘。細胞懸浮物係接著進行離心及再懸浮於1倍PBS中兩次，以沖洗細胞並除去殘餘的螢光團。接著裝載細胞至FACSCalibur(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)流式細胞儀以在492-495nm/517-527nm下激發/受激發光供測量胞內ROS。
實例2 測定EGCG對抗體1產物品質的影響
於此實例中，係將EGCG在震盪實驗中以5mg/L(低)、20mg/L(中)及50mg/L(高)之濃度範圍加入該補料(細胞培養基)中，以測定EGCG對人類化單株抗體(抗體1)的影響。詳細細胞培養條件係描述於表1中。
在測試濃度(5mg/L(low(低))、20mg/L(mid(中))及50mg/L(high(高)))下，EGCG對細胞培養效能沒有影響，包含細胞生長(圖3A)、存活率(圖3B)及效價(圖3C)。補充有EGCG的細胞培養物之生長曲線、存活率及生產力係非常近似於未經補充EGCG的對照(control)培養物。
細胞培養物之電荷變異體含量係經評估。EGCG的補充係以劑量依存的方式降低了總酸性物質。總酸性物質含量係於EGCG濃度增加時減少。在5mg/L、20mg/L及50mg/L的濃度下，EGCG分別降低總酸性物質含量在絕對值下的1%、2%及7%，並降低其在相對值下的5%、10%及35%(圖4A)。尺寸排除層析(SEC)的結果顯示出EGCG的補充係以劑量依存的方式降低了總聚集物含量。總聚集程度係於EGCG濃度加時減少。在5mg/L、20mg/L及50mg/L的濃度下，EGCG分別降低總聚集含量在相對值下的9%、23%及24%(圖4B)。應注意抗體1的總聚集程度甚至在沒有EGCG補充物下為偏低(2%)。尺寸排除層析法及劑量依存方式在憑靠EGCG之聚集程度中的靈敏度暗示著EGCG的補充會降低聚集作用。
在下個實驗中，係使用實驗室規模生物反應器以(1)確認該震盪器實驗結果及(2)判定較高濃度範圍的EGCG是否適合補充至細胞培養物內。EGCG係以20mg/L(mid)、50mg/L(high)、125mg/L(high+)以及250mg/L(high++)之濃度加入此反應器實驗中的分批培養物的補料中。 以20mg/L、50mg/L及125mg/L的濃度補充至1.5倍JCL5補料培養基之EGCG對細胞培養效能並無影響，包含細胞生長(圖5A)、存活率(圖5B)及效價(圖5C)。在250mg/L的濃度下，EGCG會造成早期細胞培養存活率的降低以及效價降低。
高濃度的EGCG對電荷變異體含量的影響亦經判定。在50mg/L(high)、125mg/L(high+)以及250mg/L(high++)的濃度下，EGCG降低了總酸性物質含量在絕對值下之至少2%程度，以及在相對值下之16%程度(圖6)。
流式細胞儀的數據顯示出在細胞培養物成熟時，ROS(活性氧物質)係以時間依存的方式在細胞內積聚(圖7)。EGCG係以劑量依存方式降低了細胞內ROS數量。EGCG所媒介的酸性物質降低之基本機制係可通過EGCG降低細胞內ROS數量的能力。此數據集揭示了在生物治療劑生產的細胞培養處理中，類黃酮家族對降低酸性物質及降低聚集作用的可能機制。很可能是所增加的ROS數量至少部分地促成酸性物質的增加，尤其是對於培養的末期。EGCG在減輕細胞內ROS壓力上的角色可解釋為何EGCG的補充可能有助於降低抗體中的酸性物質。
實例3 替代性生物類黃酮對於抗體1之生產品質影響評估-震盪培養瓶培養
在上述實例中，生物類黃酮EGCG已顯示出其有效於抗體1上酸性物質變異體的降低。然而，並不清楚是否有其他的生物類黃酮也具有相同效果。為評估替代性生物類黃酮的影響，係以補充有EGCG以外3種不同濃度的染料木黃酮、芸香苷、柚皮苷之CDFM開始補料分批震盪培養瓶的培養。細胞生長、存活率與效價及酸性物質變異體係經測定。該等結果係顯示於圖8及圖9中。
如由細胞生長曲線所證，當在CDFM中的EGCG濃度高於0.1g/L時，細胞生長會受到不利影響。在相關聯的細胞存活率變得太低而無 法進行培養之前，在那些EGCG濃度下培養僅能達到8天。在0.1g/L的EGCG下，細胞生長亦顯著低於對照培養物。然而，在0.1g/L的EGCG下細胞存活率仍維持與對照組相當，且培養物能夠進行直到第12天。
在補充有染料木黃酮、芸香苷及柚皮苷的細胞培養條件中，3種生物類黃酮皆致使細胞生長曲線低於未經補充的對照條件(圖8)。3種生物類黃酮中共同的是於補充物濃度增加至0.5g/L(染料木黃酮)或1g/L(芸香苷及柚皮苷)時在細胞生長上的濃度依存性減少。除了濃度0.5g/L的染料木黃酮之外，所評估的各濃度替代性生物類黃酮係能夠與對照組相似地維持細胞存活，且培養物係可進行直到第12天。
圖9顯示了上述可在第12天達到完成且有大於80%收集存活率的培養物之收集效價及酸性物質變異體。在這些培養物中，很明顯那些接受較高EGCG濃度的培養物係具有減少的效價。在該等替代性生物類黃酮之間，除了濃度1.0g/L的芸香苷之外，不論所評估的生物類黃酮濃度，很明顯該等培養物皆能夠產生與未經補充的對照組相比之相當抗體1數量。這些結果顯示出所評估的生物類黃酮在較高濃度下可減低細胞生長，其維持了細胞存活率，且收集效價程度係與對照培養物相當。
來自於各種培養物之抗體1上的酸性物質變異體數量係經測定及比較。在大多數情況下，係於以補充物處理的培養物中觀察到酸性物質變異體的顯著下降(1-5%)。此酸性物質的減弱暗示著在培養物中較高濃度的EGCG、染料木黃酮、芸香苷及柚皮苷可能是酸性物質減弱的原因。於這些化合物的濃度在細胞培養補料培養基中增加時，酸性區域(AR)會按比例減少。
總而言之，這些結果暗示著受測生物類黃酮(包含EGCG)係能夠在重組蛋白質上顯著降低酸性物質的整體數量。此類型的補充及補充物的濃度係可依據特定環境而判定，以確保所產生的酸性物質減少不是 因收集效價的耗損而達到。
實例4 替代性生物類黃酮對於在3公升生物反應器培養物中之抗體1之生產品質影響評估
細胞株1係於具有補充有各種生物類黃酮之補料培養基之大規模補料分批培養物中評定。對於細胞培養處理效能所產生的影響係顯示於圖10中。那些含有補充有0.05g/L的EGCG及0.1g/L的芸香苷(rutin)之CDFM之培養物表現了培養物在第8天達到約12x106細胞/mL的最高活細胞密度之細胞生長情形。這些生長參數係與未補充生物類黃酮的那些對照培養物相當。細胞存活率在大多的培養期間中係高於90%，其中補充有生物類黃酮的培養物在整個培養末期中展示出與對照培養物相比之較高細胞存活率(圖10B)。相反地，0.1g/L的EGCG補充條件下細胞生長效能有些微不同。與震盪培養瓶的研究結果相似，在0.1g/L的EGCG濃度下之CDFM中，細胞生長曲線係低於未經補充的對照培養物。然而，細胞存活率在0.1g/L的EGCG濃度下仍然很高。所有的培養物係成功地在接種後的第15天收集。由經評估培養物所測定的收集效價係相似的。應注意0.05g/L的EGCG及0.1g/L的芸香苷條件係以些微的量勝過對照條件的表現。
補充有0.05g/L及0.1g/L的EGCG的CDFM培養物之酸性物質曲線，以及補充有0.1g/L的芸香苷的培養物之酸性物質曲線，皆展示出比未經補充的CDFM對照組較低的量(圖10D)。其減少係早在培養的第12天就觀察到，且在第15天收集的培養物時變得更為明顯。在所評估的條件之中，0.1g/L的EGCG在絕對酸性物質百分點方面係以顯著的10%落差表現最佳。經補充0.1g/L的芸香苷的CDFM培養物在酸性物質變異體方面係以5%的落差表現良好，接著補充有0.05g/L的EGCG的CDFM培養物展示出4%的落差(圖10D)。與上述震盪培養瓶培養測試相似，當CDFM中的生物類黃酮濃度增加，在酸性物質中有著濃度依存 性的落差。應注意在未經補充的對照培養物中的總酸性物質增加係出現於第12天及第15天之間。當生物類黃酮係包含於培養物中時，此後期的酸性物質增加係顯著緩和。這些結果係與上述流式細胞儀的結果一致，其顯示出ROS數量在相同的時間周期期間會顯著增加。可能是生物類黃酮影響整體的ROS數量，並防止其在培養的後期增加。當細胞成長並凋亡於培養後期時，生物類黃酮可藉由減低ROS的數量而直接影響酸性物質變異體的後續數量。
實例5 評定生物類黃酮對於表現在CHO細胞株中之抗體1、抗體2、DVD1及DVD2之生產品質影響
表現四種不同重組醣蛋白之四種不同重組中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株係在震盪培養瓶培養，或3公升實驗室規模生物反應器中評估。細胞株1係經基因工程改造而表現抗體1，細胞株2係經基因工程改造而表現抗體2，細胞株3係經基因工程改造而表現雙可變區免疫球蛋白1(DVD1)，以及細胞株4係經基因工程改造而表現雙可變區免疫球蛋白2(DVD2)。
如先前所記載，DVD1及DVD2係為具有二個可變區之免疫球蛋白。參見Wu等人(2007)。抗體1及抗體2二者係為IgG1醣蛋白。四種細胞株皆源於以一dhfr(dihydrofolate reductase)表現系統為基礎的CHO DUX-B11，並培養在化學成分確定的基礎培養基(CDBM)中，並定期地以化學成分確定補料培養基(CDFM)補料。在所有實驗中使用的培養基皆為化學成分確定的，且不含有動物成分及蛋白質。來自於各實驗之各個培養基每一者係於需要時補充選定的生物類黃酮，以評估其對於所產生的酸性物質曲線之可能影響。
各個培養基每一者係於需要時補充選定的生物類黃酮，以評估其對於所產生的酸性物質曲線之可能影響。在培養物的製備中，細胞株係通過單獨的接種箱(seed train)接種而連續膨脹，以產生足夠的細胞 供接種。培養期間所使用的處理條件係視培養規模而有些微不同，但在每一規模內係相似於各別未經補充生物類黃酮的對照條件(表2)。所有使用的生物類黃酮係購自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。
活細胞密度(VCD)及細胞存活率數值係通過萘胺藍排除法由Cedex自動細胞計數器(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)量測，葡萄糖及乳酸數值係以ABL-805血液氣體分析儀(Radiometer Medical，Denmark)量測。離線pH、溶氧量(DO)及pCO2(溶解的二氧化碳)的測量係依需求而以ABL-805血液氣體分析儀(Radiometer Medical，Denmark) 執行。滲透壓係依需求而在Multi-Osmette 2430型滲透壓計(Precision Systems，Natick，MA)上測量。
蛋白質A親和性層析-抗體效價係由未加工的細胞培養收集物在Poros ATM(Life Technologies，Carlsbad，CA)親和性管柱上使用HPLC系統以低pH、分步溶離梯度及280nm偵測方式作業而量測。絕對濃度係相對於參考標準校準曲線而給定。
經受額外分析定性的純化抗體係使用MabSelectTM蛋白質A以低pH及分步溶離梯度方式純化，接著使用Corning Lifesciences(Tewksbury，MA)Spin Concentrator X UF管柱或其等效物，依據製造商的建議程序進行緩衝液交換(在需要時)。
通過弱陽離子交換層析的電荷異質性-樣本係使用配有ProPac WCX-10分析型管柱(Thermo Scientific，桑尼維爾，加州)之HPLC系統分析。約100μg的樣本係裝入6%緩衝液B(10mM磷酸納、500mM氯化鈉、pH 5.5)及94%緩衝液A(10mM磷酸納、pH 5.5)。該管柱係以1.0mL/min的流速運行。蛋白質係藉由以超過20分鐘的時間將緩衝液B的組成由6%增加至16%而自該管柱溶離。蛋白質波峰係於該等波峰由管柱溶離時使用在280nm下的UV吸光度測量。管柱接著使用100%緩衝液B再生，以在注射下個樣本前處於使用初始狀態的再平衡期。於主要波峰之前所溶離的波峰係稱為「酸性波峰」，而於主要波峰之後所溶離的波峰係稱為「鹼性波峰」(圖2)。
尺寸排除層析-來自於細胞株1之經蛋白質A純化的抗體樣本係在需要時稀釋為在1倍PBS內有0.5-5mg/mL，並在TSKgel G3000SWXL管柱(Tosoh Bioscience，South San Francisco，CA)上使用HPLC系統上的等度梯度在280nm的偵測下測量。高分子量(HMW)、單體及低分子量(LMW)物質係依據層析曲線而給定並接著定量。
統計-實驗結果係以至少3個的獨立培養物所產生結果之平均值在 ±1個標準差下呈現。實驗結果係由少於3個的獨立培養物所產生結果之平均值所呈現。結果係通過雙邊t測試(2-sided t-tests)進行統計學上的顯著性評估，相對於未經補充的對照條件其p值必須小於0.05。
抗體1(細胞株1)的結果係如上於實例2-4中描述。
為進一步評估EGCG對酸性區變異體的影響，抗體2及雙可變區免疫球蛋白1(DVD1)係經檢驗。抗體2係於一組震盪器及實驗室規模生物反應器實驗中以二種補料量(100%及50%)做為未經補充的對照條件而進行評估。在震盪器實驗中(參見表2)，EGCG係以0.05g/L及0.1g/L的濃度添加至100%的補料中，且那些濃度的等效物係添加至50%的補料中(以在細胞培養物中具有相同EGCG濃度)。
在研究的濃度(0.05g/L及0.1g/L)中，EGCG對細胞培養效能沒有負面影響，包含細胞生長(圖11A)、存活率(圖11B)及效價(圖11C)。補充有EGCG的培養物表現了與對照培養物非常相似的結果，在生長曲線及存活率方面有較佳的生產力。當以0.1g/L的濃度添加至100%的補料(feed)且以相等濃度添加至50%的補料中時，EGCG補充物分別達到了未經補充的對照條件的平均效價之1.22及1.11倍。當測定酸性物種變異體時，EGCG補充物係以劑量依存的方式降低了總酸性物質。總酸性物質的含量會於EGCG的濃度增加時降低。在0.05g/L及0.1g/L的濃度下，EGCG相對比未經補充的對照組分別降低總酸性物質含量的21%至45%(圖11D)。
實驗室規模的實驗室規模生物反應器係使用於確認震盪器實驗在抗體2上所見的結果。EGCG係添加至分批培養物的補料中，以0.1g/L的濃度加入100%的補料中，且以相等的濃度加入50%的補料中(表2)。具有50%補料的培養物在整體上係比具有100%的補料者達到了較高的VCD波峰，其係與先前在此細胞株的觀察一致。補充至該補料培養基之EGCG對於細胞培養效能係具有可忽略不計的影響，包含細胞生長 (圖12A)、存活率(圖12B)及效價(圖12C)。考慮到(1)其他3種條件共同具有類似的效價以及(2)補充有0.1g/L的EGCG之100%補料顯示出與未經補充100%補料的對照組之近似生長曲線，未補充100%補料之對照條件之低效價可能為測定法測量偏差。雖然如此，在0.1g/L的濃度下，EGCG相對比未經補充的對照組降低了總酸性變異體含量的29%至36%(圖12D)。
為評估EGCG對重組蛋白質上之酸性區變異體之影響，雙可變區免疫球蛋白1(DVD1)係經檢驗。EGCG係於震盪器實驗中以0.02g/L、0.05g/L、0.1g/L及0.2g/L的濃度添加至補料內(參見表2)。在經研究的0.02g/L、0.05g/L及0.1g/L濃度下，補充有EGCG的培養物在生長曲線、存活率及生產力方面(圖13A、圖13B及圖13C)，係表現與對照培養物非常相似。在0.2g/L的濃度下，EGCG與對照條件相比下導致了15%的存活率減少以及28%的生產力。當測定酸性物質變異體時，EGCG補充物係以劑量依存的方式降低總酸性物質。在0.02g/L、0.05g/L、0.1g/L及0.2g/L的濃度下，EGCG相對比為經補充的對照組分別降低了總酸性物質含量的5%、10%、17%及22%(圖13D)。
為評估其他生物類黃酮的影響，補料分批震盪培養瓶培養物係開始以多種芸香苷濃度補充CDFM。細胞生長、存活率、效價以及酸性物質變異體係經測定並分別顯示於圖14及15。
由細胞株1的細胞生長曲線可看到，在廣泛的濃度範圍內對培養效能並沒有顯著的不利影響。然而，在CDFM中的芸香苷濃度超過0.05g/L時，細胞生長會受到不利影響。最高VCD數值係由未經補充的對照組之10.3x106細胞/mL分別在經補充0.1g/L濃度的培養物中減少到9.0x106細胞/mL以及在經補充1.0g/L濃度的培養物中減少到6.9x106細胞/mL。細胞存活率結果在各個培養期間亦為非常相當。只有1g/L的芸香苷濃度條件展示出存活率的降低，其收集數值與未經補充的控制 組之79%相比係下落到76%。收集效價亦在受測濃度範圍上展示出微少的影響。芸香苷濃度由0.01g/L至0.1g/L的相對效價僅由0.98下降到0.93。1g/L的條件展示出相對效價最大下降至0.78，其在統計學上係顯著的下降。
當由各種不同的培養物中測量抗體1上的酸性物質變異體時，可發現到在各個經評定的例子中有明顯的酸性物質變異體下降。下降的幅度係直接與補料培養物中的芸香苷數量成比例。這些培養物中每一者的酸性區對未經補充的對照組之比例係由0.1g/L濃度之芸香苷培養物中的0.97下降至1g/L濃度之芸香苷培養物中的0.65。總酸性區的減少係與主要及鹼性物質數量的增加一致。
由細胞株4的細胞生長曲線可看到，在廣泛的濃度範圍內對培養效能並沒有顯著的不利影響。然而，在CDFM中的芸香苷濃度超過0.1g/L時，細胞生長係受到不利影響。最高VCD數值係由未經補充的對照組之12.4x106細胞/mL減少到在經補充1.0g/L濃度的培養物中的11.0x106細胞/mL。細胞存活率結果在各個培養期間亦為非常相當，其測得數值實質上對於彼此係為可重疊的。相對於細胞株1，收集效價實際上在所有受測濃度範圍上為增加的。在芸香苷濃度由0.01g/L至0.1g/L時，相對效價在統計學上有顯著的增加，分別由1.03g/L升至1.09g/L。當測量DVD1上的酸性物質變異體時，可發現到在該等經評估例子的每一者中，係有顯著的酸性物質變異體的下降。下降的幅度係直接與在補料培養基中的芸香苷數量成比例。這些培養物中每一者的酸性區對於未經補充的對照組之比例係由0.1g/L濃度之芸香苷培養物中的0.75下降至1g/L濃度之芸香苷培養物中的0.69。總酸性區的減少係與主要及鹼性物質數量的增加一致。
這些結果暗示著不同的生物類黃酮(諸如EGCG)係能夠顯著地降低重組蛋白質上的酸性物質整體數量。但是，必須小心選擇特定的補 充濃度，以確保所產生的酸性物質下降不是因所產生的處理效能耗損而得到，其亦可能視細胞株而定。
細胞株1亦於具有補充有不同生物類黃酮之補料培養基之實驗室規模補料分批培養物中進行評估。對於細胞培養處理效能所造成的影響係顯示於圖16中。與不具有生物類黃酮補充之對照條件相比，那些以具有0.05g/L的EGCG及0.1g/L的芸香苷之CDFM進行補料之培養物顯示出類似的細胞生長情形，其培養物在第8天具有達到約12x106細胞/mL之最高活細胞密度。細胞存活率在大部分的培養期間係超過90%，經補充生物類黃酮之培養物在整個培養末期中顯示出較高的細胞存活率。但0.1g/L的EGCG補充條件下之細胞生長效能有些微不同。與震盪培養瓶的研究結果相似，在0.1g/L的EGCG濃度下之CDFM中，相關的細胞生長曲線係低於未經補充的對照培養物，但是細胞存活率仍然很高。所有的培養物係能夠成功地在接種後的第15天收集。由經評估培養物所測定的收集效價皆為相似，0.05g/L的EGCG及0.1g/L的芸香苷條件甚至以些微的量勝過對照條件的表現。
補充有0.05g/L及0.1g/L的EGCG的CDFM培養物之酸性物質曲線，以及補充有0.1g/L的芸香苷的培養物之酸性物質曲線，皆展示出比未經補充的CDFM對照組為較低的量。此減少係早在培養的第8天就觀察到，且在第15天收集的培養物時變得更為明顯。在所評估的條件之中，0.1g/L的EGCG以0.69的相對總酸性區而表現最佳。經補充0.1g/L的芸香苷的CDFM培養物以1.00的相對總酸性區而表現良好，其係與具有1.10的相對總酸性區之0.05g/L的EGCG的條件相同。與震盪培養瓶培養的結果相似，係可於CDFM中的生物類黃酮濃度增加時，觀察到在酸性物質中有著濃度依存性的落差。在未經補充的對照條件中，很大一部分的總酸性物質係出現於第12天及第15天之間。當生物類黃酮暴露時，晚期培養物中增加的酸性物質係顯著緩和。整體而言，芸 香苷係非常有效於降低整體酸性區的量。但是，EGCG似乎更稍微有效，其較高的濃度會造成更多的總酸性區減少。芸香苷顯示出與EGCG同樣的結果，但僅在EGCG濃度下降至較低濃度時。
這些生物類黃酮對總酸性區發揮效果的確切分子機制是未知的。已顯示出活性氧物質(SOS)的存在係可影響所表現蛋白質的物理化學特性。參見Klaunig等人(2010)。生物類黃酮及其促氧化與抗氧化活性係可影響整體ROS數量，並防止其在末期培養的增加。藉由在細胞於末期培養中凋亡時防止ROS數量達到顯著高的程度，生物類黃酮可能潛在地影響酸性物質電荷變異體的後續數量。於檢測經純化之抗體1之弱陽離子交換層析圖譜時，尤其是其酸性物質時，很明顯在培養物補充以生物類黃酮時全部的酸性區層析區域會減少。由於酸性物質變異體已被先前的研究人員指示出其係包括各種修飾的混合物，可得出這些生物類黃酮係影響著不同電荷變異體之多樣混合物之結論。
受測的生物類黃酮在廣泛的濃度範圍內並未對整體細胞培養效能顯示出不利的影響。然而，一旦生物類黃酮的濃度超過一臨界水平時，可觀察到較低的細胞生長情形。以EGCG而言，0.125g/L的濃度係為其轉折點，細胞株1之最高活細胞密度於該點開始下降並低於未經補充的對照條件。以芸香苷而言，可發現到高於0.05g/L及0.1g/L的濃度分別為細胞株1與細胞株2之最高活細胞密度下降並低於未經補充的對照條件之轉折點。與未經補充的對照培養相比，大部分的細胞存活率結果在整個補充有生物類黃酮的培養期間仍然相似。甚至在生物類黃酮濃度非常高的例子中，細胞存活率的結果與控制培養物相比僅些微較低。
重組蛋白質的生產力在這些濃度高達0.2g/L之EGCG及芸香苷之生物類黃酮之培養補充中亦僅受到些微影響。在較高的濃度下，整體效價有明顯的下降。以補充有EGCG的培養物而言，高達0.1g/L的 EGCG濃度下之收集效價最多下降8%。在較高的濃度(包含0.2g/L)下，EGCG降低了收集效價約28%。以補充有芸香苷之培養物而言，以補充至1g/L的CDFM進行補料之細胞株1之收集效價係最多下降22%。在此相同芸香苷濃度下，細胞株4之收集效價實際上增加了9%。因此，不同的細胞株背景亦可在對於這些生物類黃酮的反應上具有影響。某些細胞株係可較其他細胞株對於同樣的生物類黃酮更為敏感。
本發明並不侷限於本文所述實施例之範圍內。實際上，除了本文所述內容外，本發明的各種修改對於本領域技術人員而言係可由以上描述及附圖而變得明顯。這樣的修改都將落入本發明及申請專利範圍之範圍內。
參考文獻
本申請案內或下列可引用之所有引用參考文獻(包括參考文獻、專利、專利申請案及網站)之內容皆出於任何目的以整體引用方式明確地併入本發明中，如其中所引用參考文獻一般。除非另有說明，否則本發明將採用業內熟知之免疫學、分子生物學及細胞生物學之習用技術。
本發明亦以整體引用方式併入分子生物及藥物遞送領域中熟知之技術。該等技術包括(但不限於)以下出版物中所述之技術：
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等效內容
本發明可以其他具體形式來實施，此並不背離其精神或基本特性。因此，應在所有態樣上將上述實施例視為闡釋而非限制本發明。因此，本發明範圍係由隨附申請專利範圍而非由上述說明書來指定，且因此本發明意欲涵蓋屬於申請專利範圍等效內容之含義及範圍內的所有變化。

Claims (25)

  1. 一種用於培養細胞之組合物，該組合物係包括一生物類黃酮。
  2. 如請求項1之組合物，其中該組合物係為一化學成分確定培養基(CDM)。
  3. 如請求項1之組合物，其中該組合物係添加至一化學成分確定培養基(CDM)中以做為使用於培養細胞之前的一補充物。
  4. 如請求項2之組合物，其中該組合物係為一液體形式，且以稀釋或未稀釋方式用於培養細胞。
  5. 如請求項2之組合物，其中該組合物係為一固體形式，且在使用於培養細胞之前以水再製。
  6. 如請求項1至5中任一項之組合物，其中該組合物係用於培養表現有一重組抗TNF-α抗體之哺乳動物細胞。
  7. 如請求項6之組合物，其中該組合物於補充至該哺乳動物細胞培養物時，係較在不具該組合物之細胞培養物中所產生之抗TNF-α抗體降低至少40%之該抗TNF-α抗體之酸性物質。
  8. 如請求項1至7中任一項之組合物，其中該生物類黃酮係為選自由以下組成的群組之一員：表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、芸香苷、柚皮苷、染料木黃酮及其組合。
  9. 如請求項8之組合物，該生物類黃酮係為表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)，其中該表沒食子兒茶素沒食子酸酯使用在一液體培養基中供培養細胞的工作濃度係自0.001g/L至0.2g/L。
  10. 如請求項9之組合物，其中該表沒食子兒茶素沒食子酸酯使用在一液體培養基中供培養細胞的工作濃度係自0.01g/L至0.1g/L。
  11. 如請求項8之組合物，該生物類黃酮係為芸香苷，其中該芸香苷使用在一液體培養基中供培養細胞的工作濃度係自0.001g/L至 0.2g/L。
  12. 如請求項8之組合物，該生物類黃酮係為柚皮苷，其中該柚皮苷使用在一液體培養基中供培養細胞的工作濃度係自0.001g/L至2g/L。
  13. 如請求項8之組合物，該生物類黃酮係為染料木黃酮，其中該染料木黃酮使用在一液體培養基中供培養細胞的工作濃度係自0.001g/L至0.2g/L。
  14. 一種生產多肽之方法，該方法包括培養複數細胞於一包括生物類黃酮之培養基中，其中該複數細胞之至少一者係包括編碼該多肽之多核苷酸。
  15. 如請求項14之組合物，其中該多核苷酸係為一抗體。
  16. 如請求項14至15中任一項之組合物，其中該生物類黃酮係為一選自由以下組成的群組之成員：表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、芸香苷、柚皮苷、染料木黃酮及其組合。
  17. 如請求項14之組合物，其中該生物類黃酮係為表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)，該表沒食子兒茶素沒食子酸酯係以自0.001g/L至0.2g/L之濃度存在於該培養基中。
  18. 如請求項17之組合物，其中該EGCG係以自0.01g/L至0.1g/L的濃度存在於該液體培養基中。
  19. 如請求項14之組合物，其中該生物類黃酮係為芸香苷，該芸香苷係以自0.001g/L至0.2g/L之濃度存在於該培養基中。
  20. 如請求項14之組合物，其中該生物類黃酮係為柚皮苷，該柚皮苷係以自0.001g/L至2g/L之濃度存在於該培養基中。
  21. 如請求項14之組合物，其中該生物類黃酮係為染料木黃酮，該染料木黃酮係以自0.001g/L至0.2g/L之濃度存在於該培養基中。
  22. 如請求項14之組合物，其中該生物類黃酮係以實質純淨的形式添 加至該培養基中。
  23. 如請求項14之組合物，其中該生物類黃酮係添加至該培養基中做為一自一植物或該植物的部份所製備之粗萃物。
  24. 如請求項14至23中任一項之組合物，其中該多肽係為一抗TNF-α抗體。
  25. 如請求項14至23中任一項之組合物，其中該多肽係為一包括雙可變域(DVD)之抗體。
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