CN102653778A - 一种磷脂酰肌醇的酶解制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种磷脂酰肌醇的酶解制备方法。它是将预处理后大豆磷脂溶于溶剂中，再加入磷脂酶D，磷脂酶D的加入量按50~150unints/100mg预处理后大豆磷脂的量添加，然后在36~40℃，pH值为7.0~9.0，搅拌反应3~12小时，得到酶解产物，酶解产物用正己烷浸提，浸提液浓缩干燥后再用乙醇或乙醇水溶液洗涤并干燥得到磷脂酰肌醇产品；所述的预处理后大豆磷脂是通过以下方法制备的：将大豆磷脂溶于氯仿中，再用甲醇沉淀，收集沉淀物，如此反复若干次，最后得到的沉淀物经干燥后得到预处理后大豆磷脂。本发明酶解制备方法简单，成本较低，制得的磷脂酰肌醇的纯度高，可以用作显色底物应用到显色培养基中对LM进行快速检测。

Description

一种磷脂酰肌醇的酶解制备方法

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种磷脂酰肌醇的酶解制备方法。

背景技术：

单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是一种重要食源性致病菌。针对LM特有的肌醇磷酸磷脂酶（Cphosphatidylinositol phospholipase C，PI-PLC）和β-D-葡萄糖苷酶(β-D-glucosidase)设计显色底物进行快速检测的方法近年来备受关注。PI-PLC酶可以特异性的作用于磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）结构，分解出游离的脂肪烃链，由于大分子脂肪烃链的疏水作用，应用到显色培养基时，在LM菌落周围形成不透明的白色晕圈，从而将LM与其他食源性致病菌及非单增李斯特氏菌区分开来。

目前国内关于PI分离提纯的相关研究较少，主要采用的制备方法局限于利用组分极性差异的溶剂法和色谱柱层析法等。柱层析法分离PI虽然简便有效但是产率较低，重复性差；溶剂抽提法纯化PI消耗大量有机溶剂，成本较高不利于生产应用；另外也有采用高效液相色谱法以及薄层层析法制备的报道，但是由于处理量太少，且成本高难以应用。国内关于PI的制备最近几年只有齐齐哈尔大学以及武汉工程学院做了相关研究，但是由于产率问题都没有得到在LM快速检测方面的应用，因此寻找可行的高效分离手段成为目前亟待解决的问题。

国内LM显色底物制备方面的研究相对落后，直接制约了其在LM检测显色培养基等方面中的应用。随着研究的发展和深入，采用两种以上分离方法相结合的组合方法手段来提高分离纯度，或者酶解法制备PI均具有一定的发展潜力。随着对PI需求的增加，开发一种简便可行的高纯度制备工艺将成为未来研究的发展方向。

传统的PI的制备方法主要利用其组分间极性的差异而分离，有溶剂萃取法、柱色谱法、薄层层析法、高效液相色谱法（HPLC）等。但是仅依靠分离方法很难得到单一磷脂，且溶剂消耗量大，成本较高，难以广泛应用。结合微生物方法，发现常见的四种磷脂酶（磷脂酶A1、A2、C和D）对大豆肌醇磷脂具有特异性作用，其作用位点如式1所示，特别是磷脂酶D可以特异性地水解磷脂酸与碱基(胆碱等)的酯键；并且具有碱基转移特性（transphosphatidylationreaction），即在特定条件下，能催化各种含伯仲位羟基的底物结合到磷脂的碱基上。

式1

磷脂酶已经在磷脂的定向改性、药物的合成等方面得到了有效应用。1987年Nakazato利用混合磷脂在磷脂酶D作用下得到纯度为70%的PI；1989年Rakhimov等在醇和肌醇存在下制备肌醇磷脂；1989年Juneja等报道了在L或D-丝氨酸存在下，将磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine，PC）转化为磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS），转化率分别为98.5%和100%，可见采用磷脂酶制备单一磷脂的方法是可行的，但是不同磷脂酶在不同环境下，作用于不同种类的磷脂时，其分解条件均不相同。

发明内容：

本发明的目的是提供一种成本低廉、操作简便、能获取高纯度的磷脂酰肌醇的酶解制备方法。

本发明利用磷脂酶D特异性地水解磷脂酸与碱基(胆碱等)的酯键，并且具有磷脂转移特性（transphosphatidylation reaction），即在特定条件下，能催化各种含伯仲位羟基的底物结合到磷脂的碱基上，而PI却不受影响，利用其对混合磷脂中其它组分的分解，从而提纯高纯度的磷脂酰肌醇，为了实现酶解反应，探索磷脂酶D分解大豆磷脂得到高纯度PI的条件，从而实现了本发明的目的。

本发明的磷脂酰肌醇的酶解制备方法，其特征在于包括以下步骤：

将预处理后大豆磷脂溶于溶剂中，再加入磷脂酶D，磷脂酶D的加入量按50~150unints/100mg预处理后大豆磷脂的量添加，然后在36~40℃，pH值为7.0-9.0，搅拌反应3~12小时，得到酶解产物，酶解产物用正己烷浸提，浸提液浓缩干燥后再用乙醇或乙醇水溶液洗涤并干燥得到磷脂酰肌醇产品；所述的预处理后大豆磷脂是通过以下方法制备的：将大豆磷脂溶于氯仿中，再用甲醇沉淀，收集沉淀物，如此反复若干次，最后得到的沉淀物经干燥后得到预处理后大豆磷脂。

所述的溶剂优选为***。

进一步优选，所述的磷脂酶D的加入量按100unints/100mg预处理后大豆磷脂的量添加，然后在37℃，pH值为8.0，搅拌反应4小时；所述的乙醇水溶液优选为体积分数为5%的酸性乙醇水溶液。应用该优选方式可以得到高纯度的磷脂酰肌醇产品。

本发明的磷脂酰肌醇的酶解制备方法，方法简单，成本低廉，所制得的磷脂酰肌醇的纯度比较高，可以用作显色底物应用到显色培养基中对LM快速检测。利用本发明方法制备的磷脂酰肌醇由于其纯度较高，具有一定的商品化价值，并且该方法简单，容易操作，反应时间短，并且环保无污染，是一种极具应用前景的磷脂酰肌醇的制备方法，为磷脂酰肌醇的扩大化制备及应用打下了很好的基础。

附图说明：

图1是磷脂酰肌醇产品对不同菌株显色效果图，a、LM菌株，b、格氏李斯特菌株；

图2是不同底物显色效果图，a、PI标准品，b、磷脂酰肌醇产品。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

一、磷脂酰肌醇产品的制备和测定

步骤1、原料的预处理

称取5g粉末大豆磷脂，用50mL冷三氯甲烷（4℃）将样品溶解，充分溶解后加入60mL冷甲醇，搅拌1h。在2℃、5000r/min下离心10min，弃去上层溶液，收集固体用25mL冷氯仿（4℃）溶解，再加入60mL碱性甲醇浸提，充分搅拌，相同条件下离心10min，收集固体。上述操作继续重复两次。最后得到的不溶固体干燥后即为预处理后大豆磷脂。

步骤二产物提纯

将每50mg酶解产物用10-100mL正己烷溶剂溶解，在200r/min，4℃下充分搅拌1h,，在8000r/min，4℃下离心，将上清液在真空干燥器中浓缩干燥，干燥物再用体积分数为5％酸性乙醇（pH=6）浸洗三次并干燥得到磷脂酰肌醇产品。

步骤三、磷脂酶D酶解实验

一、加酶量因素50-150units

实施例1：

参照步骤1原料预处理的方法处理大豆磷脂，得到预处理后大豆磷脂。称取预处理后大豆磷脂100mg，溶解于20mL***中，加入含有0.001mol/LCa²⁺的Tris-HCl缓冲液10mL，调节pH为8，加入磷脂酶D 50units，在恒温水浴锅37℃，转速800r/min下反应4h，得到酶解产物，参照步骤二，每50mg酶解产物用100mL正己烷溶剂溶解，在200r/min，4℃下充分搅拌1h,，在8000r/min，4℃下离心，将上清液置于真空干燥器中浓缩干燥，干燥物再用体积分数为5％酸性乙醇（pH=6）浸洗三次并干燥得到磷脂酰肌醇产品，磷脂酰肌醇的纯度为80.18％。

实施例2：

本实施例与实施例1基本相同，只是加入磷脂酶D的量为150units，得到磷脂酰肌醇产品，其磷脂酰肌醇的纯度为90.13％。

二、pH因素（7-9）

实施例3：

参照步骤1原料预处理的方法处理大豆磷脂，得到预处理后大豆磷脂。称取预处理后大豆磷脂100mg，溶解于20mL***中，加入含有0.001mol/LCa²⁺的Tris-HCl缓冲液10mL，调节pH为7.0，加入磷脂酶D 150units，在恒温水浴锅37℃，转速800r/min下反应4h，得到酶解产物，参照步骤二，每50mg酶解产物用100mL正己烷溶剂溶解，在200r/min，4℃下充分搅拌1h,，在8000r/min，4℃下离心，将上清液置于真空干燥器中浓缩干燥，干燥物再用体积分数为5％酸性乙醇（pH=6）浸洗三次并干燥得到磷脂酰肌醇产品，其磷脂酰肌醇的纯度为87.68％。

实施例4：

本实施例与实施例3基本相同，只是在称取预处理后大豆磷脂100mg，溶解于20mL***中，加入含有0.001mol/LCa²⁺的Tris-HCl缓冲液10mL后，调节pH为9.0，其他与实施例3相同，最后得到磷脂酰肌醇产品，其磷脂酰肌醇的纯度为88.81％。

三、温度因素（36-40℃）

实施例5：

参照步骤1原料预处理的方法处理大豆磷脂，得到预处理后大豆磷脂。称取预处理后大豆磷脂100mg，溶解于20mL***中，加入含有0.001mol/LCa²⁺的Tris-HCl缓冲液10mL，调节pH为8.0，加入磷脂酶D 150units，在恒温水浴锅36℃，转速800r/min下反应4h，得到酶解产物，参照步骤二，每50mg酶解产物用100mL正己烷溶剂溶解，在200r/min，4℃下充分搅拌1h,，在8000r/min，4℃下离心，将上清液放在真空干燥器中浓缩干燥，干燥物再用体积分数为5％酸性乙醇（pH=6）浸洗三次并干燥得到磷脂酰肌醇产品，其磷脂酰肌醇的纯度为77.33％。

实施例6：

本实施例与实施例5基本相同，只是恒温水浴锅的温度为40℃，最后得到磷脂酰肌醇产品，其磷脂酰肌醇的纯度为72.17％。

四．时间因素3-12h

实施例7：

参照步骤1原料预处理的方法处理大豆磷脂，得到预处理后大豆磷脂。称取预处理后大豆磷脂100mg，溶解于20mL***中，加入含有0.001mol/LCa²⁺的Tris-HCl缓冲液10mL，调节pH为8.0，加入磷脂酶D 150units，在恒温水浴锅37℃，转速800r/min下反应3h，得到酶解产物，参照步骤二，每50mg酶解产物用100mL正己烷溶剂溶解，在200r/min，4℃下充分搅拌1h,，在8000r/min，4℃下离心，将上清液放在真空干燥器中浓缩干燥，干燥物再用体积分数为5％酸性乙醇（pH=6）浸洗三次并干燥得到磷脂酰肌醇产品，其磷脂酰肌醇的纯度为85.21％。

实施例8：

本实施例与实施例7基本相同，只是在恒温水浴锅37℃，转速800r/min下反应12h，最后得到磷脂酰肌醇产品，其磷脂酰肌醇的纯度为90.04％。

步骤四HPLC测定条件

4、高效液相（HPLC）色谱测定条件

Agilent RTX-Si色谱柱(4.6mm×250mm×5μm)；柱温30℃；流动相：V(正己烷)∶V(异丙醇)∶V(1％甲酸)=8∶8∶1-；流速1mL/min；进样量为10μL；DAD检测器，检测波长为203nm；采用等度洗脱方法。

步骤五显色平板试验

5、显色培养条件

称取上述步骤处理后的磷脂酰肌醇产品，按照配方琼脂15.0g/L，蛋白胨及酵母浸出物23.0g/L，β-D-glu 0.5-2g/L、磷脂酰肌醇产品1-8g/L制备显色培养基，调节pH=7.0±0.2，高温灭菌，并倒板制备显色培养基平板。

6.正交试验

为了进一步优化实验条件，在单因素实验的基础上，选取影响酶解反应的主要因素，即溶剂温度、加酶量、pH、时间4个作为反应因素，以预处理后大豆磷脂作为原料，以后处理后的磷脂酰肌醇产品PI纯度为评价指标，设计正交试验，对实验条件进行正交优选，正交试验因素水平表见表1，正交试验结果见表2。

表1正交实验因素水平

表2正交试验结果

由表2可知，各因素对PI纯度的影响顺序为A>C>D>B，即温度的影响最大，其次是加酶量的影响，再者是pH的影响，时间的影响最小。最佳组合为A₂B₁C₃D₂，即在温度为37℃、加入2.0μL/100mg磷脂酶D（100units/100mg）、在pH=8.0下反应4h时，PI纯度可以达到极大值，且经过进一步实验验证，该条件所得PI纯度为90.13％，且回收率为54.82％。

步骤6显色效果实验

显色效果测试

1、分别用接种环挑复苏的LM菌株（a）以及格氏李斯特菌（b）在显色平板上划线；将接种后的平板置于37℃下培养24~48h，观察菌落形态，如图1所示：本发明的磷脂酰肌醇产品可以与LM特有的PI-PLC发生特异性反应，在显色平板上LM生长为蓝绿色规则圆形菌落并且周围带有不透明晕环，而非LM菌在显色培养基上不显示明显的不透明晕环，从而可以对LM进行特异性检测。

2、采用相同的显色培养基，分别用购买的PI（Sigma）标准品与本发明的磷脂酰肌醇产品作为显色底物制备显色培养基，在37℃下培养24~28h，观察实验结果如图2所示。LM在两种显色平板上均呈现蓝绿色菌落，并且周围被不透明晕环包围。两种底物具有相当的显色效果，而本发明制备的磷脂酰肌醇产品价格较低，可以作为进口磷脂酰肌醇的替代品应用于LM显色培养基中。

Claims (3)

1.一种磷脂酰肌醇的酶解制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将预处理后大豆磷脂溶于溶剂中，再加入磷脂酶D，磷脂酶D的加入量按50~150unints/100mg预处理后大豆磷脂的量添加，然后在36~40℃，pH值为7.0~9.0，搅拌反应3~12小时，得到酶解产物，酶解产物用正己烷浸提，浸提液浓缩干燥后再用乙醇或乙醇水溶液洗涤并干燥得到磷脂酰肌醇产品；所述的预处理后大豆磷脂是通过以下方法制备的：将大豆磷脂溶于氯仿中，再用甲醇沉淀，收集沉淀物，如此反复若干次，最后得到的沉淀物经干燥后得到预处理后大豆磷脂。

2.根据权利要求1所述的酶解制备方法，其特征在于，所述的溶剂为***。

3.根据权利要求1所述的酶解制备方法，其特征在于，所述的磷脂酶D的加入量按100unints/100mg预处理后大豆磷脂的量添加，然后在37℃，pH值为8.0，搅拌反应4小时；所述的乙醇水溶液是体积分数为5%的酸性乙醇水溶液。

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