CN102650628A

CN102650628A - 一种快速检测生物胺的方法

Info

Publication number: CN102650628A
Application number: CN2012101569631A
Authority: CN
Inventors: 潘秋红; 段长青; 田园; 黎姗姗
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2012-05-18
Filing date: 2012-05-18
Publication date: 2012-08-29
Anticipated expiration: 2032-05-18
Also published as: CN102650628B

Abstract

本发明提供一种快速检测生物胺的方法，包括步骤：将生物胺标准品和待检测样品用衍生剂衍生化后带上发色基团，于层析材料聚酰胺薄膜上点样，用展开剂展开，在展开剂前沿距薄膜顶端0.5～1cm时停止层析，显色，观察显色结果。本发明提出使用聚酰胺薄膜作为生物胺的层析测定材料，此材料方便易得，展开迅速，展开后的薄层板可以长期保存以备复查，且可以应用薄层扫描仪进行定量测定；利用适当配比的展开剂，可以完全分离目标物与其他组分，因此本方法可以对生物胺实现快速定性、半定量检测，该方法全过程约为1h即可以得到结果，而仪器分析需时较长。

Description

一种快速检测生物胺的方法

技术领域

本发明属于色谱分析领域，具体为一种快速检测生物胺的方法。

背景技术

生物胺是一类含氮的脂肪族或杂环类低分子化合物，在含有蛋白或游离氨基酸的食品和饮料中发现较多。它广泛存在于各种动植物的组织之中，具有重要的生理活性。低浓度的生物胺对血管和肌肉有明显的舒张或收缩作用，能抑制癫痫的发作，对精神活动和大脑皮层有重要的调节作用，对心脏有不同程度的正性肌力和正性频率作用。但是，当人体吸收过量的生物胺时，可能会引起头痛，呼吸紊乱、心悸血压变化等过敏性反应。

生物胺的毒性作用会引起食品的安全问题。其中组胺对人类的健康的影响最大，其次是酪胺。美国FDA通过对爆发组胺中毒的大量数据的研究确定组胺的危害作用水平为：500mg/kg(食品)。欧美及我国对部分食品中组胺含量做了限量要求：美国FDA要求进口水产品组胺不得超过50mg/kg；欧盟规定鲭科鱼类中组胺含量不得超过100mg/kg；其它食品中组胺不得超过1000mg/kg；酪胺不得超过100～800mg/kg；我国规定鲐鱼中组胺不得超过1000mg/kg；其他海水鱼不得超过300mg/kg。

基于生物胺在食品中广泛存在以及潜在的安全性问题，对生物胺进行检测具有重要意义。生物胺本身没有荧光和紫外的发色集团，因此都要经过衍生化才能在色谱仪器下检测出来。丹磺酰氯作为液相色谱柱前衍生试剂具有衍生操作简单、衍生物稳定性好、可定量完成磺酰化反应、有较强的荧光和紫外吸收、灵敏度高、反应范围宽、集体干扰不明显等优点，所以成了生物胺高效液相色谱检测中最多的衍生试剂。

目前，国内外研究对生物胺的检测方法包括酶生物传感器法、薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、电泳法等。生物胺的定性和定量分析方法虽然能在准确度、精密度等方面已经随着分析仪器的进步达到了一定水平，但仪器分析方法耗时长、操作复杂、造价高。因此研究快速、简便、低廉的分析方法十分必要。本研究提供了在食品质量监测方面生物胺的半定量技术，为判别其安全性提供了快速分析方法。

发明内容

针对现有检测生物胺技术的不足之处，本发明的目的是提出一种快速检测生物胺的方法。

实现本发明目的的技术方案为：

一种检测生物胺的方法，包括步骤：将生物胺标准品和待检测样品用衍生剂衍生化后带上发色基团，于层析材料聚酰胺薄膜上点样，用展开剂展开，在展开剂前沿距薄膜顶端0.5～1cm时停止层析，显色，观察显色结果。

其中，所述生物胺是苯乙胺、腐胺、组胺、酪胺、色胺、尸胺、精胺、亚精胺中的一种。

其中，所述生物胺标准品和待检测样品的pH值调节为9.4～10.0。

其中，所述衍生剂为丹磺酰氯。

其中，所述衍生化的条件为生物胺标准品和待检测样品分别和等量衍生剂振荡混匀后于58～65℃下反应25～35min。

其中，所述点样是在层析材料上点样5～12μL。

其中，所述展开剂为体积比配比的二甲苯∶冰醋酸＝5～20∶1的混合物，展开步骤是在该展开剂中进行。

优选地，所述展开剂为体积比配比的二甲苯∶冰醋酸＝10∶1的混合物。

其中，所述显色是层析后的生物胺标准品和待检测样品在250～280nm紫外线照射下，出现黄绿色斑点。

其中，所述显色结果的观察，包括步骤：在紫外线下肉眼观察，如果在比移值0.5～0.7之间同时观察到待测样品与标准品比移值位置相同的黄绿色的斑点，则认为待测样品中含有该种生物胺，然后将层析斑点与标准品比较进行半定量分析；如果在比移值0.5～0.7之间没有观察到待测样品与标准品比移值位置相同的黄绿色斑点，则认为待测样品中不含有该种生物胺。

本发明的有益效果在于：

本发明首次提出使用聚酰胺薄膜作为生物胺的层析测定材料，此材料方便易得，展开迅速，展开后的薄层板可以长期保存以备复查，且可以应用薄层扫描仪进行定量测定；利用适当配比的展开剂，可以完全分离目标物与其他组分，因此本方法可以对生物胺实现快速定性、半定量检测，该方法全过程约为1h即可以得到结果，而仪器分析需时较长。食品、酒中含量较高的生物胺有苯乙胺、腐胺、组胺、酪胺等，通过聚酰胺薄膜层析对其进行半定量检测方便快速。

附图说明

图1为显色结果的照片。图中浅色的斑点从左到右依次为生物胺混标、DNS-Cl(丹磺酰氯)衍生的葡萄酒样品、1/2的DNS-Cl(丹磺酰氯)衍生的葡萄酒混合1/2的腐胺(100mg/L)的显色结果。

具体实施方式

现以以下最佳实施例来说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：

用0.1M盐酸配制成质量浓度为5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L的腐胺溶液，取标准溶液和待检测的葡萄酒样品各1mL，以2M NaOH调节pH值至9.4～10.0，加入1mL丹磺酰氯衍生剂(5mg/L丙酮)，振荡混匀。置于60℃下反应30min(期间振荡3～8次)。

用微量点样器在在10cm×10cm的层析材料聚酰胺薄膜上点样10μL，将点完样吹干的聚酰胺薄片光滑面向外，聚酰胺面向内，用皮筋扎住，垂直放入密闭的、装有饱和展开剂(二甲苯∶冰醋酸＝10∶1)的展开缸中上行展开，展开缸内的平衡溶剂即为展开剂在密闭的展开缸内混合静置得到的。在展开剂前沿距薄膜顶端0.5～1cm时停止层析，挥干溶剂，可以实现目标化合物与杂质完全分离，在280nm紫外检测灯下显色后肉眼直接观察。展开距离约为4.5cm，在比移值0.5～0.7之间同时观察到待测样品与标准品比移值位置相同的黄绿色荧光斑点。与定量点于同一薄层板的腐胺标准品比较，可以观察到该酒样中腐胺荧光亮度高于5mg/L而低于15mg/L腐胺标准品(如图1所示)，初步判断该酒样中腐胺含量接近于10mg/L，远低于国内外对食品中生物胺的限量。

实施例2：

用0.1M盐酸配制成质量浓度为5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L的组胺溶液，取标准溶液和待检测的啤酒样品各1mL，以2M NaOH调节pH值至9.4，加入1mL丹磺酰氯衍生剂(5mg/L丙酮)，振荡混匀。置于65℃下反应25min(期间振荡5次)。

用微量点样器在在10cm×10cm的层析材料聚酰胺薄膜上点样5μL，将点完样吹干的聚酰胺薄片光滑面向外，聚酰胺面向内，用皮筋扎住，垂直放入密闭的、装有饱和展开剂(二甲苯∶冰醋酸＝10∶1)的展开缸中上行展开，在展开剂前沿距薄膜顶端0.8cm时停止层析，挥干溶剂，在254nm紫外检测灯下显色。展开距离约为4.5cm，在比移值0.5～0.7之间同时观察到待测样品与标准品比移值位置相同的黄绿色斑点。与定量点于同一薄层板的腐胺标准品比较，可以观察到该酒样中组胺斑点亮度低于5mg/L，半定量判断该酒样中组胺含量接近于5mg/L。

实施例3：

用0.1M盐酸配制成质量浓度为5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L的酪胺溶液，取标准溶液和待检测的白酒样品各1mL，以2M NaOH调节pH值至10.0，加入1mL丹磺酰氯衍生剂(5mg/L丙酮)，振荡混匀。置于58℃下反应35min(期间振荡3次)。

用微量点样器在在10cm×10cm的层析材料聚酰胺薄膜上点样12μL，将点完样吹干的聚酰胺薄片光滑面向外，聚酰胺面向内，用皮筋扎住，垂直放入密闭的、装有饱和展开剂(二甲苯∶冰醋酸＝10∶1)的展开缸中上行展开，在展开剂前沿距薄膜顶端1cm时停止层析，挥干溶剂，在280nm紫外检测灯下显色。展开距离约为4.5cm，在比移值0.5～0.7之间同时观察到待测样品与标准品比移值位置相同的黄绿色荧光斑点。与定量点于同一薄层板的酪胺标准品比较，可以观察到该酒样中酪胺荧光亮度低于5mg/L，半定量判断该酒样中酪胺含量接近于5mg/L。

实施例4：

待测样品为豆酱10g，粉碎研磨，溶于0.1M盐酸溶液，定容至100ml。

用0.1M盐酸配制成质量浓度为5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L的尸胺溶液，取标准溶液和待检测的豆酱样品各1mL，以2M NaOH调节pH值至9.8，加入1mL丹磺酰氯衍生剂(5mg/L丙酮)，振荡混匀。置于60℃下反应30min(期间振荡5次)。

用微量点样器在在10cm×10cm的层析材料聚酰胺薄膜上点样10μL，将点完样吹干的聚酰胺薄片光滑面向外，聚酰胺面向内，用皮筋扎住，垂直放入密闭的、装有饱和展开剂的展开缸中上行展开，在展开剂前沿距薄膜顶端1cm时停止层析，挥干溶剂，在280nm紫外检测灯下显色。展开距离约为4.5cm，在比移值0.5～0.7之间同时观察到待测样品与标准品比移值位置相同的黄绿色荧光斑点。与定量点于同一薄层板的尸胺标准品比较，可以观察到该样品中尸胺荧光亮度约相当于5mg/L标准品的亮度，半定量判断该样品中尸胺含量接近于5mg/L，即豆酱中尸胺含量约为0.05mg/g。

以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种检测生物胺的方法，包括步骤：将生物胺标准品和待检测样品用衍生剂衍生化后带上发色基团，于层析材料聚酰胺薄膜上点样，用展开剂展开，在展开剂前沿距薄膜顶端0.5～1cm时停止层析，显色，观察显色结果。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物胺是苯乙胺、腐胺、组胺、酪胺、色胺、尸胺、精胺、亚精胺中的一种。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物胺标准品和待检测样品的pH值调节为9.4～10.0。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述衍生剂为丹磺酰氯。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述衍生化的条件为生物胺标准品和待检测样品分别和等量衍生剂振荡混匀后于58～65℃下反应25～35min。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述点样是在层析材料上点样5～12μL。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述展开剂为体积比配比的二甲苯∶冰醋酸＝5～20∶1的混合物，展开步骤是在该展开剂中进行。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述展开剂为体积比配比的二甲苯∶冰醋酸＝10∶1的混合物。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述显色是层析后的生物胺标准品和待检测样品在250～280nm紫外线照射下，出现黄绿色斑点。

10.如权利要求1～9任一所述的方法，其特征在于，所述显色结果的观察，包括步骤：在紫外线下肉眼观察，如果在比移值0.5～0.7之间同时观察到待测样品与标准品比移值位置相同的黄绿色的斑点，则认为待测样品中含有该种生物胺，然后将层析斑点与标准品比较进行半定量分析；如果在比移值0.5～0.7之间没有观察到待测样品与标准品比移值位置相同的黄绿色斑点，则认为待测样品中不含有该种生物胺。