CN102649975A

CN102649975A - 补体因子h基因型、载脂蛋白上氧化磷酸胆碱和血浆补体因子h定量测定试剂盒及测定方法

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Publication number: CN102649975A
Application number: CN2011100432266A
Authority: CN
Inventors: 张康
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-02-23
Filing date: 2011-02-23
Publication date: 2012-08-29

Abstract

本发明要解决的技术问题是年龄相关性黄斑变性(AMD)疾病发生、发展的诊断试剂。本发明涉及的技术方案是对补体因子H的两种基因型(rs10611170(Y402H)/rs2274700)的鉴定以及对氧化特异性抗原的及其试剂盒和定量检测方法。本发明公开的定量检测方法包括下列方面：(a)外周血基因组DNA的提取以及测定rs10611170(Y402H)/rs2274700的引物与序列；(b)将抗磷酸胆碱的抗体与含有OxLDL的受试血浆样品接触；测定氧化磷脂的含量。(c)将受试血浆与氧化特异性抗原接触；测定补体因子H与氧化特异性抗原结合的量。本发明对年龄相关性黄斑变性(AMD)疾病发生、发展的诊断提供了可靠的参照指标。

Description

补体因子H基因型、载脂蛋白上氧化磷酸胆碱和血浆补体因子H定量测定试剂盒及测定方法

技术领域

本发明涉及补体因子H(CFH)的基因型鉴定，CFH对氧化特异性抗原的结合，以及低密度脂蛋白(LDL)上氧化磷脂的检测，并且通过以上检测所得到的数据，对年龄相关性黄斑变性进行预警性诊断和治疗指导。具体涉及有关的定量检测方法及其试剂盒。

背景技术

全基因组研究(GWAS)促进了复杂性状疾病^[1]分子基础方面的研究。但是，对于疾病发病机制和遗传变异相关性的研究仍不足。比如年龄相关性黄斑变性(AMD)的发病机制与补体因子H基因(CFH)的相关性。AMD在老年致盲性眼病中占首位，世界各地大约有3000多万AMD患者。AMD患者视力的严重损失大多是由于脉络膜新生血管(CNV)出血及渗出，或湿性AMD。AMD发病机制与CFH基因复制有密切相关性。在CFH基因位点包含两种常见患病风险单倍型：即rs10611170(Y402H)和rs2274700^[2345678]。超过60％AMD患者据有这两种风险单倍型标签。

已有研究表明许多疾病与氧化损伤有关，包括动脉粥样硬化，老年痴呆症和AMD^{[9，10 11 12]}。视网膜感光细胞含有丰富的多不饱和脂肪酸磷脂，如卵磷脂(PtC)，PtC易在氧化作用下被修饰或产生多种分解产物。例如，在氧化修饰作用下，PtC的头端——磷酸胆碱(PC)，会发生构象变化而暴露一氧化表位，这种结构可被PC的自然抗体——T15识别(附图1)。T15是天然免疫***的一部分，它能识别某些细菌，如同肺炎球菌，细胞壁表面的PC并与之发生相互作用，，这种机制为保护宿主避免致命的感染^[13]。

T15 antibody通常不能结合正常细胞膜或脂蛋白上的PC结合。但是，当发生氧化损伤之后，如氧化低密度脂蛋白(oxLDL)，被氧化的光感细胞外节(OS)或凋亡的细胞，其脂膜结构中的PC，会发生构像的改变，由先前的隐形状态，改变为显性状态。所以能够被抗磷酸胆碱(PC)的自然抗体T15所识别与结合，从而达到清除氧化损伤结构，维系机体平衡的功能。氧化反应也会导致多不饱和脂肪酸侧链的进一步氧化分解，并产生一些高活性分子，如丙二醛(MDA)，这些活性中间体将进一步与蛋白质和脂肪反应而形成复合物。例如，MDA与乙醛反应生成丙二醛-乙醛(MAA)并与蛋白质或者脂质相偶联。这些与oxPC和MAA相关的结构能够刺激并引发强烈的炎症反应^[14，15]。两者通过与视网膜色素上皮细胞(RPE)和巨噬细胞表面受体——如CD36结合，激发下游级联炎症反应。

因此，天然抗体不仅在机体抵抗细菌感染中起重要作用，在氧化损伤中也能保护细胞和分子结构，维持内环境稳定的，消除不健康的细胞；如清除凋亡细胞或光感受器的氧化光感受器外节。已有研究证明：这些天然抗体所识别的靶位正是这些分子上的氧化表位，如oxPC，MDA和MAA的相关结构^[13；14]。

鉴于先天免疫***中天然抗体和补体共同形成机体防御***，抵抗多种外源性致病因素的，如感染以及清除内源性的氧化损伤；同时，在基因水平上，AMD发病与CFH具有较强的相关性。

脂蛋白是血浆胆固醇和甘油三酯的主要载体。低密度脂蛋白(LDL)是由磷脂、ApoB多肽链、胆固醇、甘油三酯、碳水化合物等组成的(附图1)。近年来人们发现低密度脂蛋白的氧化态变化与许多疾病有关，如糖尿病、肾衰竭和惊厥前期。人们还发现氧化低密度脂蛋白与心血管疾病有密切的关系。例如，在动脉壁中以及其他位点，LDL被氧化成氧化低密度脂蛋白(OxLDL)。OxLDL不再被正常细胞上的LDL受体识别，反而被巨噬细胞上的清道夫受体识别。使巨噬细胞摄取OxLDL不受调控，结果OxLDL中的脂类(包括被氧化的脂类)就在巨噬细胞中越积越多直到巨噬细胞变为泡沫细胞。据信这种泡沫细胞分泌各种导致血小板不稳和血液凝结的因子。另外，这些泡沫细胞的死亡导致脂类沉积并导致炎症反应。

尽管目前人们已经知道氧化损伤与多种疾病的发生、发展有一定的联系，也针对OxLDL提出了一些检测方法，但这些检测方法都不能做到将OxLDL含量与氧化损伤的程度与疾病的程度直接联系起来，因此其实用性不是很大。例如Young等(参见：美国专利号5,460,947)公开了使用免疫分析方法检测血清中ApoB的含量。但这种方法测定的是氧化和非氧化LDL之和，而不能将氧化的和非氧化的LDL区别开。此外，LDL的氧化是一个复杂的过程，其被氧化的程度目前尚没有定量的标准。因此，用体外催化获得的OxLDL来作为标准物，确定体内产生的OxLDL，既缺乏坚实的理论支持，又会造成每次测量间的***误差。

发明内容

本发明要解决的一个技术问题是提供一种用于鉴定人组织样本DNA中补体因子H基因型的试剂盒。该试剂盒包含下列成分：

a、从人组织样本中提取DNA模板的试剂；

b、用于从DNA模版中扩增补体因子H基因片段的引物；包括：

补体因子H：rs2274700基因型的扩增引物对：

上游引物：5’-CAGCCCCCACAAAAAGACTA-3’(SEQ ID No 1)；

下游引物：5’-TGCTTGTCTTTTTCTTATTCTCTTCC-3’(SEQ ID No 2)；

和补体因子H：rs1061170基因型的扩增引物对：

上游引物：5’-TTTTTGGATGTTTATGCAATCTT-3’(SEQ ID No 3)；

下游引物：5’-GGATGCATCTGGGAGTAGGA-3’(SEQ ID No 4)；

以及c、用于对DNA扩增产物的片断进行基因型鉴定的引物序列，包括：

CFH rs10611170基因型鉴定的引物序列：

5’-TTG TTA TGG TCC TTA GGA AAA TGT TAT TTT CCT TAT TTG GAA AAT GGATA T AAT CAA AAT-3’(SEQ ID No 5)；

CFH rs2274700基因型鉴定的引物序列：

5’-ATC CTG ATG TTT CAC CAT CTG CTG TTA CAT ATC CTA GTT TGC ATT GATATT T-3’(SEQ ID No 6)。

其中，上述的试剂盒种所述的人组织样本为外周血样本。

本发明还提供了一种鉴定人组织样本DNA中补体因子H基因型的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

a、从人组织样本中提取和纯化DNA模板；

b、从DNA模板中扩增补体因子H的基因片段，扩增用引物包括：

补体因子H：rs2274700基因型的扩增引物对：

上游引物：5’-CAGCCCCCACAAAAAGACTA-3’；

下游引物：5’-TGCTTGTCTTTTTCTTATTCTCTTCC-3’；

和补体因子H：rs1061170基因型的扩增引物对：

上游引物：5’-TTTTTGGATGTTTATGCAATCTT-3’

下游引物：5’-GGATGCATCTGGGAGTAGGA -3’；

c、使用基因型鉴定的引物序列对步骤b得到的补体因子H的基因片段进行扩增，得到的产物测序进行基因型SNP鉴定，如果其中保护性等位基因为纯合子标记为TT；其中如果致病性等位基因为纯合子标记为CC；其中如果保护性与致病性等位基因为杂合子标记为TC；

所述的基因型鉴定的引物序列包括：

CFH rs10611170基因型鉴定的引物序列：

5’-TTG TTA TGG TCC TTA GGA AAA TGT TAT TTT CCT TAT TTG GAA AAT GGATA T AAT CAA AAT-3’；

CFH rs2274700基因型鉴定的引物序列：

5’-ATC CTG ATG TTT CAC CAT CTG CTG TTA CAT ATC CTA GTT TGC ATT GATATT T-3’。

本发明另外还提供了一种定量检测载脂蛋白B上氧化磷脂的试剂盒。该试剂盒包含下列成分：

a、抗载脂蛋白B抗体，用以将血浆中低密度脂蛋白俘获；

b、抗磷酸胆碱的抗体，用以与俘获的含有氧化低密度脂蛋白的样品接触；

其中，上述试剂盒中所述抗体的编码基因含有S107VH重链可变区和V-kappa22VL轻链可变区。

本发明同时也提供了定量检测载脂蛋白B上氧化磷脂的方法。该方法包括以下步骤：

a、用抗载脂蛋白B抗体将血浆中低密度脂蛋白俘获；

b、将抗磷酸胆碱的抗体与含有氧化低密度脂蛋白的样品接触；

c、使所述抗体与氧化磷酸胆碱结合；

d、测定所述抗体与氧化低密度脂蛋白的结合量。

其中，上述方法中所述的抗体为单克隆抗体、多克隆抗体或单链抗体可变区片段中的任意一种。

其中，上述方法中所述的抗体的编码基因含有S107VH重链可变区和V-kappa22VL轻链可变区。

其中，上述方法中所述的含有氧化低密度脂蛋白样品为血清、血浆、组织匀浆液或组织提取液。

其中，上述方法中所述的步骤d可采用化学发光免疫分析法、酶联免疫吸附试验法、生物素-亲和素***测定法、放射免疫测定法中的至少一种方法来所述抗体氧化低密度脂蛋白的结合量。

其中，上述方法中还可包括步骤e，即：根据以磷酸胆碱化合物为标准品测得的标准曲线，确定氧化低密度脂蛋白表面的氧化特异抗原决定簇的量。

本发明还提供了一种定量测定补体因子H(外周血或血浆中的补体因子H) 与氧化特异性抗原结合的试剂盒。该试剂盒包含有：氧化特异性抗原；抗补体因子H的抗体。

所述的氧化特异性抗原为：低密度脂蛋白上的氧化磷脂(oxPL on LDL oroxLDL)、丙二醛(MDA)与蛋白质和脂肪反应而形成复合物(MDA-LDL，MDA-BSA，etc)、MDA与乙醛反应生成丙二醛-乙醛(MAA)并与蛋白质或者脂质反应而形成复合物(MAA-LDL，MAA-BSA，etc)中的至少一种。

本发明还提供了一种定量测定补体因子H与氧化特异性抗原结合的方法。该方法还包含下列操作步骤：

a、制备氧化特异性抗原；

b、包被氧化特异性抗原在微孔板上；

c、将血浆中补体因子H与氧化特异性抗原结合；

d、用抗补体因子H的抗体测定补体因子H与氧化特异性抗原的结合量。

其中，上述方法中所述的抗补体因子H的抗体为单克隆抗体、多克隆抗体或单链抗体可变区片段中的任一种。

其中，上述方法中还包括步骤e，即：根据纯化CFH为标准品测得的标准曲线，测定CFH的定量，以及CFH与氧化特异性抗原结合量与CFH含量的比值。

根据本法明的第一个方面，我们的研究发现有两种基因型的CFH与年龄相关性黄斑变性，我们分别以单独和组合的方式检测每一种疾病单倍型。通过我们建立的计算公式，我们可以推断出AMD发病的几率。

本发明试剂盒的使用包括下列的步骤和材料。

a)外周血基因组DNA作为测定模版的制备；

b)基因型鉴定引物的制备；

c)DNA扩增产物片断的基因型鉴定序列。

本发明中外周血基因组DNA的提取与纯化，可以通过本领域熟知的生物工程方法制备，我们建议使用Qiagen公司的血液DNA纯化试剂盒。

测定模版的制备的方法为：

10XNEB Buffer 1ul

dNTP(10uM) 0.25ul

Primer-F(10uM) 0.25ul

Primer-R(10uM) 0.25ul

NEB Taq(5U/ul) 0.05ul

DNA(25-50ng/ul) 1-1.5ul

H2O 补充至10ul

PCR：95度5min

95度30s

58度30s，

72度30s 30-32cycle

72度5min

跑胶验证PCR是否成功.

本发明中DNA模版制备的引物为：

CFH：rs2274700基因型

上游引物：5’-CAGCCCCCACAAAAAGACTA-3’(SEQ ID No 1)

下游引物：5’-TGCTTGTCTTTTTCTTATTCTCTTCC-3’(SEQ ID No 2)；

CFH：rs1061170基因型

上游引物：5’-TTTTTGGATGTTTATGCAATCTT-3’(SEQ ID No 3)

下游引物：5’-GGATGCATCTGGGAGTAGGA -3’(SEQ ID No 4)；

本发明中SNPs测定的反应为：

SNaPShot mix 0.5μl

Purified PCR mix 1μl

SnapShot primer(n)0.2μl×n

H₂O to Total 5μl

96℃10sec

50℃5sec

60℃30sec

25cycles

本发明中所采用的基因型(SNP)鉴定的引物为：

CFH rs10611170基因型鉴定的引物序列：60-Forward-C/T

5’-TTG TTA TGG TCC TTA GGA AAA TGT TAT TTT CCT TAT TTG GAA AAT GGATA T AAT CAA AAT-3’(SEQ ID No 5)

CFH rs2274700基因型鉴定的引物序列：52-Forward-A/G

5’-ATC CTG ATG TTT CAC CAT CTG CTG TTA CAT ATC CTA GTT TGC ATT GATATT T-3’(SEQ ID No 6)

本发明中DNA扩增产物片断的基因型鉴定序列，我们采用(但不限制于)ABI3100XL分析仪(ABI，Foster City，CA，USA)根据说明进行基因分型。所有的SNPs进行基因分型的成功率＞99.9％，准确度＞99％，由20％随机重排序列判断。

CFH rs2274700保护性基因型(T)的鉴定序列为(SEQ ID No 7)：

ATAGGGACTTTATGAGAATATCTATATAATTTATACATCTATTAATTATAAAAACTAAAGATAAGTAATA

TTGAATATTGATATTTCTTTTTGTGCAAACCTTTGTTAGTAACTTTAGTTCGTCTTCAGTTATACATTAT

TTTTGGATGTTTATGCAATCTTATTTAAATATTGTAAAAATAATTGTAATATACTATTTTGAGCAAATTT

ATGTTTCTCATTTACTTTATTTATTTATCATTGTTATGGTCCTTAGGAAAATGTTATTTTCCTTATTTGG

AAAATGGATATAATCAAAATTATGGAAGAAAGTTTGTACAGGGTAAATCTATAGACGTTGCCTGCCATCC

TGGCTACGCTCTTCCAAAAGCGCAGACCACAGTTACATGTATGGAGAATGGCTGGTCTCCTACTCCCAGA

TGCATCCGTGTCAGTAAGTACACTACTCTGAAATCCTAGCATGTTCATGTCTTTCTAAGTAACATAGATG

ACATTCTAAGACTCATCTATATTAATTGTGGCAAAATGTTTATGTCACCTTGTTTTACCAATGGACCTAT

TTAGTTTTTGGTTTTTCAACTGTGTATAAATGAATATACAA。

CFH rs10611170致病性基因型(C)的鉴定序列为(SEQ ID No 8)：

ATAGGGACTTTATGAGAATATCTATATAATTTATACATCTATTAATTATAAAAACTAAAGATAAGTAATA

TTGAATATTGATATTTCTTTTTGTGCAAACCTTTGTTAGTAACTTTAGTTCGTCTTCAGTTATACATTAT

TTTTGGATGTTTATGCAATCTTATTTAAATATTGTAAAAATAATTGTAATATACTATTTTGAGCAAATTT

ATGTTTCTCATTTACTTTATTTATTTATCATTGTTATGGTCCTTAGGAAAATGTTATTTTCCTTATTTGG

AAAATGGATATAATCAAAATCATGGAAGAAAGTTTGTACAGGGTAAATCTATAGACGTTGCCTGCCATCC

TGGCTACGCTCTTCCAAAAGCGCAGACCACAGTTACATGTATGGAGAATGGCTGGTCTCCTACTCCCAGA

TGCATCCGTGTCAGTAAGTACACTACTCTGAAATCCTAGCATGTTCATGTCTTTCTAAGTAACATAGATG

ACATTCTAAGACTCATCTATATTAATTGTGGCAAAATGTTTATGTCACCTTGTTTTACCAATGGACCTAT

TTAGTTTTTGGTTTTTCAACTGTGTATAAATGAATATACAA。

CFH rs2274700保护性基因型(T)的鉴定序列为(SEQ ID No 9)：

TAACAGTCATAAAGGTCTCAGCTAAAGCAAAATCAGTTTAAACCAGAATACACATAAAGCTCCCTAACTT

GTTTCTGTAACACAGAATGCTTTAGAGTAGGAAAAGCCTGAATGGAAAGACAGACTAATATCTGAGTAAT

TAATGTGAAAAGGAAAAAAAATTGATGTCTGCTTTGTTCCTGCAGGTTTTTTTTTCTTATCTTTTCAAAT

GAAATTATATCAGCCCCCACAAAAAGACTAAAGTTAGTAAACTTTTGTGTATCATCTGGATAATCAATAC

AAACATAATAAATTACTTACTAATGCACGTGGGTTGAGCTGACCATCCATCTTTCCCACATGTAATTGAT

CCTGATGTTTCACCATCTGCTGTTACATATCCTAGTTTGCATTGATATTTTGCTTTTTCTTTTAAGGCAT

ATGTATACTGAGATTCAGAAATAAACCCATTCTCAATATCTATACTTGATTTGGAACATGTTTCTAAAAG

GGAAGAGAATAAGAAAAAGACAAGCATATGATCAATAACATTTTATAAGAATTTAAGTAATATGTAAATA

TAAAAAATAATGAGTCATTTGTAACTGAAAACCTGGATAACCATAAGCATTCAAATACTTAAGTCAAGGA

AAATAAGCTCAGAGTTGCCAAAGACATTACATCAAGACTCTTCATCACTTTTTAAAACAAGGCTCTATTT

AAGACACTTACAATTATTTCTAAGAAATTATTGGAAATCTGTTTGTCTAATGGATTTGGAATTCTACAGC

ATGTCAGAACTCAATAGACAATGAGTATTAT。

CFH rs2274700致病性基因型(C)的鉴定序列为(SEQ ID No 10)：

TAACAGTCATAAAGGTCTCAGCTAAAGCAAAATCAGTTTAAACCAGAATACACATAAAGCTCCCTAACTT

GTTTCTGTAACACAGAATGCTTTAGAGTAGGAAAAGCCTGAATGGAAAGACAGACTAATATCTGAGTAAT

TAATGTGAAAAGGAAAAAAAATTGATGTCTGCTTTGTTCCTGCAGGTTTTTTTTTCTTATCTTTTCAAAT

GAAATTATATCAGCCCCCACAAAAAGACTAAAGTTAGTAAACTTTTGTGTATCATCTGGATAATCAATAC

AAACATAATAAATTACTTACTAATGCACGTGGGTTGAGCTGACCATCCATCTTTCCCACATGTAATTGAT

CCTGATGTTTCACCATCTGCTGTTACATATCCTAGTTTGCATTGATATTTCGCTTTTTCTTTTAAGGCAT

ATGTATACTGAGATTCAGAAATAAACCCATTCTCAATATCTATACTTGATTTGGAACATGTTTCTAAAAG

GGAAGAGAATAAGAAAAAGACAAGCATATGATCAATAACATTTTATAAGAATTTAAGTAATATGTAAATA

TAAAAAATAATGAGTCATTTGTAACTGAAAACCTGGATAACCATAAGCATTCAAATACTTAAGTCAAGGA

AAATAAGCTCAGAGTTGCCAAAGACATTACATCAAGACTCTTCATCACTTTTTAAAACAAGGCTCTATTT

AAGACACTTACAATTATTTCTAAGAAATTATTGGAAATCTGTTTGTCTAATGGATTTGGAATTCTACAGC

ATGTCAGAACTCAATAGACAATGAGTATTAT。

其中如果保护性等位基因为纯合子标记为(TT)；

其中如果致病性等位基因为纯合子标记为(CC)；

其中如果保护性/致病性等位基因为杂合子标记为(TC)。

根据本发明的第二个方面，我们研究发现低密度脂蛋白经氧化修饰后表面呈现与游离状磷酸胆碱(PC)的抗原决定簇一样的抗原决定簇，或称表位结构。因此，抗磷酸胆碱抗体只能与氧化低密度脂蛋白(OxLDL)结合，而不与未经氧化的低密度脂蛋白结合，并且结合的量与低密度脂蛋白氧化的程度成正比。本发明研究发现这种PC表位在载脂蛋白B呈现的量与CFH致病性基因型相关，这种抗磷酸胆碱的抗体与血浆载脂蛋白B上PC表位结合的量在纯合子CFH rs10611170致病性基因型(CC)为最高；在保护性/致病性等位基因为杂合子(TC)为次高；在保护性等位基因为纯合子(TT)最低。(参见附图2A)。因此，本发明提供了抗磷酸胆碱的抗体的新应用，即通过抗原抗体的特异反应定量检测出样品中载脂蛋白B上PC表位的含量用于检测人体内氧化损伤的程度。并根据该含量可判断出AMD的发病的风险。

故本发明提供了一整套定量检测载脂蛋白B上PC表位的试剂和操作方法，其包括下列步骤：

a)用抗载脂蛋白B抗体将血浆中低密度脂蛋白俘获；

b)将抗磷酸胆碱的抗体与含有氧化低密度脂蛋白的样品接触；

c)使所述抗体与氧化磷酸胆碱结合；

d)测定所述抗体与氧化磷酸胆碱的结合量。

在本发明的方法中，所述抗载脂蛋白B抗体和抗磷酸胆碱的抗体可从市场上购买也可通过本领域熟知的生物工程方法制备。例如，购自Sigma化学公司的Anti-human ApoB(LDL)和TEPC15即可用做本发明方法中的抗体。此外，可以用常规免疫学方法制备抗载脂蛋白B抗体(即用纯化人载脂蛋白B注射山羊制备抗血清纯化IgG的方法)，或者用生物工程方法制备抗磷酸胆碱的抗体，优选编码所述抗磷酸胆碱的抗体的基因含有S107 VH重链可变区和V-kappa 22VL轻链可变区。有关这方面的具体内容，可参见文献：(Shaw，et al.：Natural antibodieswith the T15 idiotype may act in atherosclerosis，apoptotic clearance，andprotective immunity.J.Clin.Invest.105：1731-1740(2000)¹³。这些抗体可以是选自抗磷酸胆碱单克隆抗体、抗磷酸胆碱多克隆抗体或单链抗体可变区片段。如TEPC15(见文献：Moragan G，Berek C，Miller JF.An idiotypic determinantformed by both immunoglobulin constant and variable regions.Nature 1983；301(5902)：720-2)。

本文所用的术语“磷酸胆碱”(Phosphocholine)指的是磷脂酰胆碱(卵磷脂)的两条脂肪酸尾巴被去掉后所余下的结构部分。

本发明的方法可用于检测任何含有带PC表位的氧化低密度脂蛋白的生物样品。所述样品优选为血清、血浆、组织匀浆液、组织提取液，最优选为血清。

本发明的方法基于抗原抗体间反应的特异性和标记物检测的灵敏性，是一种免疫标记测定方法。即采用酶、荧光剂、放射性同位素、发光剂或电子致密物质标记抗体或抗原，进行抗原抗体间的特异性反应，从而能定量检测抗体或抗原的量。其中将抗原特异性抗体标记后进行检测的方法是直接法，采用标记的第二抗体对检测结果进行放大的方法为间接法。

因此，在本发明的方法中，步骤(d)可采用直接化学发光免疫分析法、间接化学发光免疫分析法、直接放射免疫测定法、间接放射免疫测定法、直接酶联免疫吸附试验法、间接酶联免疫吸附试验法、直接生物素-亲和素***测定法、间接生物素-亲和素***测定法中的任一种来完成。而上述这些直接法和间接法又分别可进一步地分为夹心法和非夹心法。

双抗体夹心法可如下完成：先将抗磷酸胆碱抗体固定在固相载体上，加入含有氧化低密度脂蛋白的样品，使二者接触，再加入抗ApoB抗体(或称抗LDL抗体，Sigma)，使之与氧化低密度脂蛋白接触，测定抗ApoB抗体的量而定量氧化低密度脂蛋白的含量。或者，先将抗ApoB抗体固定在固相载体上，加入含有氧化低密度脂蛋白的样品，使二者接触，再加入抗磷酸胆碱抗体，使之与氧化低密度脂蛋白接触，测定抗磷酸胆碱抗体的量而定量氧化低密度脂蛋白的含量。

非夹心法可如下完成：先用含有氧化低密度脂蛋白的样品包被固相载体，再加入抗磷酸胆碱的第一抗体，使之与氧化低密度脂蛋白接触(如有必要还可进一步加入抗磷酸胆碱抗体的第二抗体，使之抗磷酸胆碱的第一抗体接触并结合)，然后测定抗磷酸胆碱抗体的量而定量氧化低密度脂蛋白的含量。

为了避免人为操作、试剂盒不同批次和试验仪器不同而导致的误差，在本发明的方法中，优选还包括步骤(e)以磷酸胆碱化合物为标准品制得标准曲线，并根据该标准曲线定量。所测得的结合量所代表的载脂蛋白B表面的氧化特异抗原的量。即，依据标准曲线，计算出单位数量的ApoB中所呈现的PC表位的含量，从而确定低密度脂蛋白在体内被氧化的程度。

各种磷酸胆碱化合物均可用做在步骤(d)中所用的磷酸胆碱化合物，例如但不限于：磷酸胆碱、氯化磷酸胆碱、乙酰化磷酸胆碱、与血清白蛋白或匙孔血蓝素偶联的磷酸胆碱、与血清白蛋白或匙孔血蓝素偶联的磷酸胆碱、氯化磷酸胆碱或乙酰化磷酸胆碱。

根据本发明的第三个方面，我们研究发现：鉴于先天免疫***中天然抗体和补体共同形成机体防御***，抵抗多种外源性致病因素的，如感染以及清除内源性的氧化损伤；同时，在基因水平上，AMD发病与CFH具有较强的相关性。我们的研究验证这种假说——即CFH可能与具有氧化特异性的分子抗原表位，如oxPC、MAA相结合，从而对由此引发的炎症反应进行调节并控制AMD的进程。

故本发明据此提供了一整套定量测定血浆CFH与氧化特异性抗原结合的试剂和操作方法，其包括下列步骤：

a)氧化特异性抗原的制备；

b)氧化特异性抗原在微孔板的包被；

c)血浆中CFH与氧化特异性抗原的结合；

d)用抗CFH抗体测定CFH与氧化特异性抗原的结合量。

本发明所使用的氧化特异性抗原包括(但不限制于)：

低密度脂蛋白上的氧化磷脂(oxPL on LDL or oxLDL)；

丙二醛(MDA)与蛋白质和脂肪反应而形成复合物(MDA-LDL，MDA-BSA，etc)；

MDA与乙醛反应生成丙二醛-乙醛(MAA)并与蛋白质或者脂质反应而形成复合物(MAA-LDL，MAA-BSA，etc)。

这些抗原的制备或已有文献表述，但在本发明的试剂中将其标准化。其中LDL用正常志愿者所捐献的血浆，通过分部离心法分离制备得到^[16]。天然LDL保存在含有0.27mM EDTA的磷酸缓冲液(PBS)中，4℃保存，2周内使用。将LDL(1mg/mL)加入10μM的硫酸铜，37℃孵化18小时，得到OxLDL。MDA-LDL用由1，1，3，3-四甲丙醚，新鲜制成的MDA加入LDL而得到。MAA-LDL由新鲜制备的MDA和乙醛(LDL/MDA/AA＝1mg/50μmol/100μmol)在pH 5.0和37℃4小时的条件下合成。

这些氧化特异性抗原的特异性必须用两种抗体检测后方可使用：TEPC15(Sigma)与Anti-MDA-OxLDL(Abcam Cat #ab17354)。天然LDL必须不能够被两种抗体的任何一种结合；用于氧化磷脂的OxLDL只能够被TEPC15结合而不能够被Anti-MDA-OxLDL结合；MDA-LDL，MDA-BSA，MAA-LDL，或者MAA-BSA只能够被Anti-MDA-OxLDL结合而不能够被TEPC15结合。(见附图3)如有交叉结合，则不能够使用。

本发明上述b)中，需将氧化特异性抗原溶解于含有0.27mM EDTA的磷酸缓冲液(PBS)中，先将抗原(5μg/ml，溶于PBS中)包被于微孔酶标板，置于4℃过夜。将血浆1∶100稀释(与MAA-LDL结合1∶1000稀释)后加入微孔板中，然后用生物素标记抗-CFH作为第一抗体，并用碱性磷酸酶(AP)标记的第二抗体来进行检测。将所得数据中每个相同稀释倍数的血浆样品中CFH的量作为标准，用于修正该样品CFH与抗原结合的的绝对值，而得到CFH与抗原结合的的百分比。

因此，在本发明的方法中，步骤(d)可采用直接化学发光免疫分析法、间接化学发光免疫分析法、直接放射免疫测定法、间接放射免疫测定法、直接酶联免疫吸附试验法、间接酶联免疫吸附试验法、直接生物素-亲和素***测定法、间接生物素-亲和素***测定法中的任一种来完成。

附图说明

附图1 1-a表示低密度脂蛋白的结构，TEPC15的氧化特异性抗原决定族。1-b表示氧化磷脂上的磷酸胆碱(圈内部分)。

附图2(A)血浆中CFH与氧化特异性抗原的结合。(B)和(C)不同基因型的CFH，包括其rs10611170(Y402H)/rs2274700为CC/CC(19例)，TT/CC(13例)和TT/TT型(16例)的组合，与OxLDL(B)或者MAA-LDL(C)都有具有非常明显差异的不同结合。所得值由相同稀释度血浆样品中CFH读数进行调整，取其百分百。数据表示为相对光单位(RLU)/100毫秒，平均值±标准差。

附图3 T15和抗MAA/MDA-LDL(Abcam Cat#ab17354)与LDL上的氧化抗原表位结合，但不结合天然的(未修饰的)LDL，数据记录方式——相对光单位(RLU)/100毫秒，取重复测量三次的平均值。

附图4(4-a)不同基因型的CFH的血浆的oxPL/载脂蛋白B水平(用RLU相当光单位表示)。(4-b)相对基因型血浆CFH与氧化特异性抗原的结合。

附图5.CFH rs10611170基因型的鉴定图谱。5-a为TT，5-b为CT，5-c为CC.

具体实施方式

实施例1

CFH基因型的鉴定。

外周血基因组DNA的提取采用Qiagen的方法。

a)基因型鉴定模版用PCR法制备：

体系如下：

10XNEB Buffer 1ul

dNTP(10uM) 0.25ul

Primer-F(10uM) 0.25ul

Primer-R(10uM) 0.25ul

NEB Taq(5U/ul) 0.05ul

DNA(25-50ng/ul) 1-1.5ul

H2O 补充至10ul

DNA模版制备的引物为：

CFH：rs2274700基因型

Primer-F：CAGCCCCCACAAAAAGACTA

Primer-R：TGCTTGTCTTTTTCTTATTCTCTTCC

CFH：rs1061170基因型

Primer-F：TTTTTGGATGTTTATGCAATCTT

Primer-R：GGATGCATCTGGGAGTAGGA

PCR条件：95度5min

95度30s

58度30s，

72度30s 30-32cycle

72度5min

跑胶验证PCR是否成功

PCR产物纯化：这时的体系要看做几个snp，如果只做一个，就PCR产物都纯化。如果要做几个snp在一个体系里的，就要每个PCR产物加不同的量进行纯化。具体情况要根据预实验结果。

PCR(n)8-9μl

SAP 2μl(1U/μl)

ExoI 1μl(1U/μl)

Total 11-12μl

37℃1h

75℃15min

1cycle

b)SNaPShot反应***

SNaPShot mix 0.5μl

Purified PCR mix 1μl

SnapShot primer(n)0.2μl×n

H2O to Total 5μl

96℃10sec

50℃5sec

60℃30sec

25cycles

这里的n就是，如果是1个snp，就是1，如果几个snp一起做，就要每个primer都要加。这样体系有所不同。

SNaPShot产物的纯化

1μl SAP per well

37℃1h

75℃15min

1cycle

SNaPShot产物的变性

Product 1μl

HiDi 7μl

95℃5min

Ice chill immediately

c)上ABI sequencer测序仪进行操作

结果的读取，是根据snp的原理，我们设计的引物长度和所带荧光不同而读取。比如rs1061170，是C还是T，我们就在图里面，根据颜色不同区分。如果是一个黑峰，就读CC，如果是一个红峰，就读TT，或者是2个峰，读成CT(附图5)。

实施例2

酶联免疫法(ELISA)测定载脂蛋白B上的氧化磷脂

采用双抗体法测定血清样品中ApoB上的氧化特异性抗原OxPC。

材料：MicroFluor微滴板，山羊抗人源ApoB抗体，PBS，检测样本，BSA，TEPC15，碱性磷酸酶(AP)标记的抗TEPC15第二抗体，LumiPhos 530(Lumigen Inc.，Southfield，Michigan，USA)，Glomax亮度计(Promega)，磷酸胆碱(PC)化合物。

方法：用俘获抗体，即抗ApoB抗体包被MicroFluor微滴板的孔。这些抗体可以是选自单克隆抗体、多克隆抗体或单链抗体。用PBS洗涤孔三次，然后将检测样本-血浆用含1％BSA的PBS(BSA-PBS)稀释(1∶50至1∶1000)后，加入微滴板的孔。室温孵育20-60分钟，优选50分钟。用PBS洗涤孔三次，将BSA-PBS稀释的第一抗体TEPC15加入孔中，并于室温下温育。用PBS洗涤孔三次。加入碱性磷酸酶(AP)标记的抗TEPC15第二抗体。用PBS洗涤孔三次后，接着用水漂洗，并加入LumiPhos 530溶液。使用Glomax亮度计以相对光单位(RLU)测定光发射。同时以已知浓度的磷酸胆碱(PC-Cl)化合物连续10倍梯度稀释后包被孔，以BSA-PBS稀释的第一抗体TEPC15加入孔中，并于室温下温育。用PBS洗涤孔三次。加入碱性磷酸酶(AP)标记的抗TEPC15第二抗体。接着用水漂洗，并加入LumiPhos530溶液，测定RLU，制作标准曲线。根据样品的测定值查找出OxPC氧化表位的含量。

我们用此法测定了血浆中OxPL/ApoB的值并且发现了他们与CFH基因型的反向相关。我们对AMD病人血浆中OxPL/apoB的测定表明，其OxPL/apoB值与该病人的CFH基因型相关。由于CFH疾病型单倍体1(Y402H)是最主要的疾病型单倍体，我们的测定发现，具有CFH风险型Y402H基因型(CC)的血浆的oxPL/载脂蛋白B水平(用RLU相当光单位表示)，高于具有CFH保护型Y402H基因型(TT)的血浆：(CC型为46006±2333 Vs.CT型为40806±1363，P值为0.018；Vs.TT型为34706±1929，P值为0.00027，RLU±标准差)(见附图4)。这表明CFH与oxPL的亲和力与血浆oxPL的水平呈反向相关。这可以解释为CFH与OxPL的结合，降低了血液中氧化损伤的整体状态。

实施例3

酶联免疫法(ELISA)测定CFH与氧化特异性抗原的结合

材料：MicroFluor微滴板，氧化特异性抗原，PBS，检测样本，BSA，抗CFH 抗体，碱性磷酸酶(AP)标记的抗CFH第二抗体，LumiPhos 530(Lumigen Inc.，Southfield，Michigan，USA)，Glomax亮度计(Promega)。

方法：用氧化特异性抗原，包括天然LDL(作为阴性对照)，OxLDL，MDA-LDL，MAA-LDL以2微克/毫升稀释于PBS，加入每孔50微升包被MicroFluor微滴板的孔。用PBS洗涤孔三次，然后将检测样本-血浆用含1％BSA的PBS(BSA-PBS)稀释(1∶50至1∶1000)后，加入微滴板的孔。室温孵育20-60分钟，优选50分钟。用PBS洗涤孔三次，加入生物素标记的抗CFH抗体。用PBS洗涤孔三次，加入碱性磷酸酶(AP)标记的Neutravdin第二抗体。用PBS洗涤孔三次后，接着用水漂洗，并加入LumiPhos 530溶液。使用Glomax亮度计以相对光单位(RLU)测定光发射。

实验观察到，CFH与OxLDL，MDA-LDL和MAA-LDL有较强的结合力。将血浆(含CFH)1∶100稀释后，其中的CFH会与与吸附在微孔板上的抗原相结合，CFH与未氧化-LDL，Ox-LDL，MDA-LDL和MAA-LDL的结合力分别为7.9±0.19，19.9±0.80，37.7±1.60和102.4±1.44(平均值±标准差)，均具有显著差异性(ANOVA统计结果：N＝70，P＝6.4xE-164)(图2A)。

由于有两种主要类型AMD疾病单倍型与CFH有关，我们分别以单独和组合的方式检测每一种疾病单倍型的结合力。纯合rs10611170CC(402H风险等位基因)较之保护性TT(402Y)的CFH对于OxLDL(16.3±0.77Vs.23.3±1.21，P＝1.06xE-5)或MAA(99.2±1.93 Vs.105.2±2.18，P＝0.04)的结合力均较弱。同样，CFH纯合rs2274700CC等位基因的结合力具有比等位基因TT的结合力弱，两者与oxLDL的结合分别为(CC对TT为16.3±0.94比25.8±1.67，P＝0.00034)，两者与MAA-LDL的结合分别为(CC对TT为97.6±2.10比109.1±4.09，P＝0.028)。

我们进一步分析当两个单倍型同时作用时是否存在结合作用的附加效应。与OxLDL结合相比的统计结果显示：一对保护单倍型TT/TT与一个风险单倍型相比(TT/TT比TT/CC为27.7±1.05比21.7±1.83，P＝0.010)，TT/TT与一对风险单倍型相比(TT/TT比CC/CC，为27.7±1.05比16.8±0.97，P＝4.68xE-8)(图2B)，即单倍型TT/TT与OxLDL的结合力显着增高。由于CFH与MAA-LDL的结合在1∶100稀释几乎已经达到饱和，我们在将血浆1∶1000比例稀释后，检测其对结合力的影响。与MAA-LDL结合相比的统计结果显示，一对保护单倍型TT/TT与一个风险单倍型TT/CC相比(TT/TT比TT/CC为59.7±2.46Vs. 50.1±3.13，P＝0.026)，一对保护单倍型TT/TT与一对风险单倍型相比(TT/TT比CC/CC为59.7±2.46Vs.40.8±2.46，P＝3.37xE-6)即一对保护单倍型TT/TT与MAA-LDL的结合力显著增高(附图2C).

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Claims

1.一种用于鉴定人组织样本DNA中补体因子H基因型的试剂盒，该试剂盒包含下列成分：

a、从人组织样本中提取DNA模板的试剂；

b、用于从DNA模版中扩增补体因子H基因片段的引物；包括：

补体因子H：rs2274700基因型的扩增引物对：

上游引物：5’-CAGCCCCCACAAAAAGACTA-3’；

下游引物：5’-TGCTTGTCTTTTTCTTATTCTCTTCC-3’；

和补体因子H：rs1061170基因型的扩增引物对：

上游引物：5’-TTTTTGGATGTTTATGCAATCTT-3’

下游引物：5’-GGATGCATCTGGGAGTAGGA-3’；

以及：

c、用于对DNA扩增产物的片断进行基因型鉴定的引物序列，包括：

CFH rs10611170基因型鉴定的引物序列：

5’-TTG TTA TGG TCC TTA GGA AAA TGT TAT TTT CCT TAT TTG GAA AATGGA TAT AAT CAA AAT-3’；

CFH rs2274700基因型鉴定的引物序列：

5’-ATC CTG ATG TTT CAC CAT CTG CTG TTA CAT ATC CTA GTT TGC ATTGAT ATT T-3’。

2.根据权利要求所述的试剂盒，其特征在于所述的人组织样本为外周血样本。

3.鉴定人组织样本DNA中补体因子H基因型的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

a、从人组织样本中提取和纯化DNA模板；

补体因子H：rs2274700基因型的扩增引物对：

上游引物：5’-CAGCCCCCACAAAAAGACTA-3’；

下游引物：5’-TGCTTGTCTTTTTCTTATTCTCTTCC-3’；

和补体因子H：rs1061170基因型的扩增引物对：

上游引物：5’-TTTTTGGATGTTTATGCAATCTT-3’

下游引物：5’-GGATGCATCTGGGAGTAGGA-3’；

c、使用基因型鉴定的引物序列对步骤b得到的补体因子H的基因片段进行扩增，得到的产物测序进行基因型SNP鉴定，如果其中保护性等位基因为纯合子标记为TT；其中如果致病性等位基因为纯合子标记为CC；其中如果保护性/致病性等位基因为杂合子标记为TC；

所述的基因型鉴定的引物序列包括：

CFH rs10611170基因型鉴定的引物序列：

CFH rs2274700基因型鉴定的引物序列：

4.一种定量检测载脂蛋白B上氧化磷脂的试剂盒，该试剂盒包含下列成分：

a、抗载脂蛋白B抗体，用以将血浆中低密度脂蛋白俘获；

b、抗磷酸胆碱的抗体，用以与俘获的含有氧化低密度脂蛋白的样品接触。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述抗体的编码基因含有S107VH重链可变区和V-kappa 22VL轻链可变区。

6.定量检测载脂蛋白B上氧化磷脂的方法：

a、用抗载脂蛋白B抗体将血浆中低密度脂蛋白俘获；

c、使所述抗体与氧化磷酸胆碱结合；

d、测定所述抗体与氧化低密度脂蛋白的结合量。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述抗体为单克隆抗体、多克隆抗体或单链抗体可变区片段中的任意一种。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述抗体的编码基因含有S107VH重链可变区和V-kappa 22VL轻链可变区。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述有氧化低密度脂蛋白样品为血清、血浆、组织匀浆液或组织提取液。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤(d)可采用化学发光免疫分析法、酶联免疫吸附试验法、生物素-亲和素***测定法、放射免疫测定法中的至少一种方法来所述抗体氧化低密度脂蛋白的结合量。

11.根据权利要求6～10任一项所述的方法，其特征在于：还包括步骤e，即：根据以磷酸胆碱化合物为标准品测得的标准曲线，确定氧化低密度脂蛋白表面的氧化特异抗原决定簇的量。

12.一种定量测定补体因子H与氧化特异性抗原结合的试剂盒，该试剂盒含有：氧化特异性抗原；抗补体因子H的抗体。

13.一种定量测定补体因子H与氧化特异性抗原结合的方法，包含下列操作步骤：

a、制备氧化特异性抗原；

b、包被氧化特异性抗原在微孔板上；

c、将血浆中补体因子H与氧化特异性抗原结合；

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于所述抗补体因子H的抗体为单克隆抗体、多克隆抗体或单链抗体可变区片段中的任一种。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于所述抗补体因子H为单克隆抗体、多克隆抗体或单链抗体可变区片段中的任意一种。

16.根据权利要求14所述的方法，其特征在于所述抗体的编码基因含有S107VH重链可变区和V-kappa 22VL轻链可变区。

17.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：所述步骤d可采用化学发光免疫分析法、酶联免疫吸附试验法、生物素-亲和素***测定法、放射免疫测定法中的至少一种方法来所述抗体氧化低密度脂蛋白的结合量。

18.根据权利要求6～11任一项所述的方法，其特征在于：还包括步骤e，即：根据纯化补体因子H为标准品测得的标准曲线，测定补体因子H的定量，以及补体因子H与氧化特异性抗原结合量与补体因子H含量的比值。