CN102648210A - Dll4结合分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及Dll4结合分子，优选Dll4结合免疫球蛋白单一可变域，如VHH和VH，包含它们的药物组合物，及其在治疗与Dll4介导的血管生成作用相关疾病中的用途。本发明涉及还结合VEGF-A的双特异性Dll4结合分子。本发明涉及编码Dll4结合分子的核酸、宿主细胞及其制备方法。

Description

DLL4结合分子
发明领域
本发明涉及人治疗，特别是癌症治疗的领域以及适用于该治疗中的药物及组合物。
发明背景
如US 2008/0014196中所概述，血管生成牵涉在包括实体瘤及转移的很多疾病的发病机制中。在肿瘤生长的情况下，血管生成对于自增生转变为瘤形成及对于为肿瘤生长及转移提供营养似乎是至关重要的(Folkman等人,Nature 339-58(1989))，这使肿瘤细胞相比于正常细胞获得生长优势。因此，抗血管生成治疗已成为若干类型肿瘤的重要治疗选择。这些治疗已集中于阻断VEGF路径(Ferrara等人，Nat Rev Drug Discov.2004年5月；3(5):391-400)。
Notch信号传导路径对细胞与细胞间的通信至关重要，该路径涉及控制胚胎发育期间及成人有机体中多种细胞分化过程的基因调控机制。Notch信号传导在许多癌症中，例如在T细胞急性淋巴母细胞白血病中及在实体肿瘤中调控异常(Sharma等人2007,Cell Cycle 6(8):927-30；Shih等人,Cancer Res.2007年3月1日；67(5):1879-82)。
Dll4(或Delta样4或Delta样配位体4)为Notch配位体的Delta家族成员。Dll4的细胞外域由N-末端域、Delta/Serrate/Lag-2(DSL)域，和一串八个表皮生长因子(EGF)样重复构成。一般而言，认为EGF域包含氨基酸残基218-251(EGF-1；域1)、252-282(EGF-2；域2)、284-322(EGF-3；域3)、324-360(EGF-4；域4)和362-400(EGF-5；域5)，同时DSL域在hDll4的约氨基酸残基173-217处，并且N-末端域在约氨基酸残基27-172处(WO 2008/076379)。
已报导Dll4由血管内皮高度选择性表达，特别是在动脉内皮中高度选择性表达(Shutter等人(2000)Genes Develop.14:1313-1318)。近来在小鼠中的研究已显示，Dll4由VEGF诱导且为限制血管萌芽及分枝的负反馈调节剂。与此作用一致，缺失或抑制Dll4会导致血管生成过度(Scehnet等人,Blood.2007年6月1日；109(11):4753-60)。这种不受限制的血管生成由于非生产性(non-productive)血管的形成而反常地减缓肿瘤生长，即使在对抗VEGF治疗具有抗性的肿瘤中也是如此(Thurston等人,Nat Rev Cancer.2007年5月；7(5):327-31；WO 2007/070671；Noguera-Troise等人,Nature.2006年12月21日；444(7122))。此外，已证明在多个肿瘤类型的异种移植模型中，相比于单独的抗VEGF，VEGF与Dll4的组合抑制会提供优越的抗肿瘤活性(Noguera-Troise等人，Nature.2006年12月21日；444(7122):1032-7；Ridgway等人，Nature.2006年12月21日；444(7122):1083-7)。
由于这些结果，Dll4被视为一种用于癌症治疗的有希望的靶点，且已公开处于临床(前)研发中的若干靶向于Dll4的生物化合物：REGN-421(=SAR153192；Regeneron，Sanofi-Aventis；WO 2008076379)及OPM-21M18(OncoMed)(Hoey等人，Cell Stem Cell.2009年8月7日；5(2):168-77)，两者均为完全人Dll4抗体；YW152F(Genentech)，一种人化Dll4抗体(Ridgway等人，Nature.2006年12月21日；444(7122):1083-7)；Dll4-Fc(Regeneron，Sanofi-Aventis)，一种由Dll4细胞外区域及人IgG1的Fc区域构成的重组融合蛋白(Noguera-Troise等人，Nature.2006年12月21日；444(7122))。
然而，现有技术的单克隆抗体(MAb)及融合蛋白鉴于其治疗应用具有若干缺点：为了防止其降解，其必须储存在接近冰点的温度。此外，因为其在消化道中快速消化，所以其不适于口服给药。MAb用于癌症治疗的另一主要限制为转运不良，这导致浓度较低以及不能靶向于肿瘤中的所有细胞。
鉴于以上所述，本发明的一个目标在于提供用于人治疗的改良的Dll4结合分子。
这些Dll4结合分子或Dll4拮抗剂适用作预防、治疗、减轻和/或诊断与Dll4介导的血管生成作用相关的疾病或病症的组合物中的药理学活性剂。这些疾病的实例为癌症和眼病，包括与年龄相关的黄斑变性(AMD)及糖尿病性视网膜病变(DR)。本发明的另一个目标在于提供预防、治疗、减轻和/或诊断这些疾病、病症或症状的方法，其涉及使用和/或给予这些药剂及组合物。
特别地，本发明的一个目标在于提供所述药理学活性剂、组合物和/或方法，其相比于当前使用的和/或本领域中已知的药物、组合物和/或方法可提供某些优势。尤其相比于如上所述的常规抗Dll4抗体或其片段，这些优势包括改良的治疗性质和/或药理学性质和/或其他例如对于制造目的而言为有利的性质。
更特别地，本发明的一个目标在于提供新的Dll4结合分子和/或含有其的多肽，且具体为结合至哺乳动物Dll4、尤其是人Dll4的Dll4结合分子，其中所述分子或多肽适用于如本文所述的治疗及诊断目的。本发明的另一目标在于提供特异性结合Dll4的免疫球蛋白单一可变域。
发明内容
根据第一方面，提供Dll4结合分子，优选Dll4结合免疫球蛋白单一可变域，如VHH及VH。
在另一方面中，本发明涉及编码Dll4结合分子的核酸以及含有所述核酸的宿主细胞。
本发明还涉及一种产品或组合物，其含有或包含至少一种本发明的Dll4结合分子以及任选地含有或包含这些组合物的一种或多种其它组分。
本发明还涉及制备或产生本文所述的Dll4结合分子、核酸、宿主细胞、产品及组合物的方法。
本发明还涉及本文所述Dll4结合分子、核酸、宿主细胞、产品及组合物的应用及用途，以及预防和/或治疗与Dll4介导的血管生成作用相关的疾病及病症的方法。
本发明的这些及其他方面、实施方案、优势及应用将由下文进一步描述而变得明确。
定义
除非另有指示或定义，否则所有所用术语均具有本领域中的通常含义，该含义将为本领域技术人员所了解。参考例如标准手册，如Sambrook等人,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”(第2版),第1-3卷,Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989)；Lewin,“Genes IV”，Oxford University Press,New York,(1990)；及Roitt等人,“Immunology”(第2版),Gower MedicalPublishing,London,New York(1989)，以及本文中引用的一般现有技术；此外，除非另有说明，否则未具体详述的所有方法、步骤、技术及操作均可以且已经以本身已知的方式进行，该方式将为本领域技术人员所了解。亦参考例如标准手册、上述一般现有技术及其中引用的其他参考文献。
除非另有说明，否则术语“免疫球蛋白”在本文中无论是指重链抗体还是指常规4链抗体，均用作一般术语以包括全长抗体、其单个的链以及其所有部分、域或片段。
除非另有说明，否则术语“Dll4结合分子”包括抗Dll4抗体、抗Dll4抗体片段、“抗Dll4抗体样分子”及与任何上述物质的缀合物。抗体包括但不限于单克隆抗体及嵌合单克隆抗体。术语“抗体”包括通过于宿主细胞中重组表达产生的完全免疫球蛋白(如单克隆抗体)、以及Dll4结合抗体片段或“抗体样分子”，包括单链抗体及线型抗体，例如公开于WO 02/056910中的所谓的“SMIP”(“小模块免疫药物”)；抗Dll4抗体样分子包括如本文定义的免疫球蛋白单一可变域。抗体样分子的其他实例为免疫球蛋白超家族抗体(IgSF)或CDR移植分子。
如本文所用的术语“序列”(例如在“免疫球蛋白序列”、“(单一)可变域序列”、“VHH序列”或“蛋白序列”等的术语中)一般应理解为既包括相关氨基酸序列，又包括编码所述序列的核酸序列或核苷酸序列，除非本文需要更限定的解释。
两个Dll4结合分子序列之间的“序列一致度”指示序列之间相同氨基酸的百分比。其可如WO 08/020079第49及50页段落f)中所述加以计算或测定。“序列相似度”指示相同或表达保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。
如本文所用的术语(多肽或蛋白的)“域”是指折叠蛋白结构，其能够独立于蛋白的其余部分维持其三级结构。一般而言，域负责蛋白的单个的功能性质，且在许多情况下可添加、移除或转移至其他蛋白而不损失蛋白的其余部分和/或域的功能。
如本文所用的术语“免疫球蛋白域”是指抗体链(例如常规4链抗体的链或重链抗体的链)的球形区域，或是指基本上由这类球形区域组成的多肽。免疫球蛋白域的特征在于其维持抗体分子的免疫球蛋白折叠特征，其由排列在两个β折叠片中任选由保守二硫键稳定的约7个反平行β折叠股的2层夹层(sandwich)组成。
如本文所用的术语“免疫球蛋白可变域”是指基本上由本领域及下文中分别称为“框架区1”或“FR1”、“框架区2”或“FR2”、“框架区3”或“FR3”、和“框架区4”或“FR4”的四个“框架区”组成的免疫球蛋白域；所述框架区由本领域及下文中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”、“互补决定区2”或“CDR2”、和“互补决定区3”或“CDR3”的三个“互补决定区”或“CDR”中断。因此，免疫球蛋白可变域的一般结构或序列可如下表示为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可变域正是因具有抗原结合位点而赋予抗体对抗原的特异性。
如本文所用的术语“免疫球蛋白单一可变域”是指能够在不与其他免疫球蛋白可变域配对的情况下特异性结合抗原的表位的免疫球蛋白可变域。本发明含义中的免疫球蛋白单一可变域的实例为“域抗体”，例如免疫球蛋白单一可变域VH及VL(VH域及VL域)。免疫球蛋白单一可变域的另一实例为如下文定义的骆驼科的“VHH域”(或简称为“VHH”)。
鉴于以上定义，常规4链抗体(例如本领域中已知的IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子)或源自所述常规4链抗体的Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段(例如二硫键连接的Fv或scFv片段)、或双特异抗体(均为本领域中已知)的抗原结合域，通常不视为免疫球蛋白单一可变域，这是因为与抗原的各别表位发生结合通常并非通过一个(单一)免疫球蛋白域，而是通过共同结合各别抗原的表位的一对(缔合)免疫球蛋白域(例如轻链及重链可变域)，即通过免疫球蛋白域的VHVL对。
“VHH域”，亦称为VHH、VHH域、VHH抗体片段，和VHH抗体，已最初描述为“重链抗体”(即“缺乏轻链的抗体”)的抗原结合免疫球蛋白(可变)域(Hamers-Casterman C,Atarhouch T,Muyldermans S,Robinson G，Hamers C,Songa EB,Bendahman N,Hamers R.:“Naturally occurring antibodies devoid oflight chains”；Nature 363,446-448(1993))。已经选择术语“VHH域”以将这些可变域与存在于常规4链抗体中的重链可变域(其在本文中称为“VH域”)以及存在于常规4链抗体中的轻链可变域(其在本文中称为“VL域”)进行区分。VH或VL域正常情况下不与作为单一抗原结合域的表位结合，而与之相反，VHH域可在无其他抗原结合域下特异性结合表位。VHH域为由单一免疫球蛋白域形成的小型稳定及高效的抗原识别单元。
在本发明的上下文中，术语VHH域、VHH、VHH域、VHH抗体片段、VHH抗体以及
Figure BDA00001721901500051
及“N
Figure BDA00001721901500052
域”(“Nanobody”为Ablynx N.V公司，Ghent，Belgium的商标)可互换使用且表示免疫球蛋白单一可变域(具有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的通式结构且无需第二免疫球蛋白可变域的存在即可特异性结合表位)，且其由例如WO 2009/109635图1中定义的所谓“印记残基(hallmark residue)”与VH区分。
源自4链抗体，具体地源自人抗体的“VH域”及“VL域”(或简称为“VH”或“VL”)分别为“单域抗体”，也称为“域抗体(domain antibodies，DomainAntibodies)”、“Dab”及“dAb”(术语“域抗体(Domain Antibodies)”及“dAbs”被GlaxoSmithKline公司集团用作商标)，已公开于下列文献中：Ward,E.S.,等人:“Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variabledomains secreted from Escherichia coli”;Nature 341:544-546(1989)；Holt,L.J.等人:“Domain antibodies:proteins for therapy”;TRENDS in Biotechnology 21(11):484-490(2003)；及WO 2003/002609。
单域抗体对应于非骆驼科哺乳动物抗体(具体为人抗体)的重链或轻链的可变域。为了以单一抗原结合域形式，即在不分别与VL域或VH域配对的情况下结合表位，需要例如通过使用人单一VH或VL域序列的文库对这些抗原结合性质进行具体选择。
如同VHH的域抗体的分子量为约13kDa至约16kDa，且若源自完全人序列，则不需要进行人化以供例如人治疗使用。在VHH域的情况下，域抗体在原核表达***中也很好地得以表达，从而显著降低总制造成本。
如例如Riechmann及Muyldermans,J.Immunol.Methods 231,25-38(1999)的图2中所示，对于骆驼科的VHH域所应用的免疫球蛋白单一可变重域的氨基酸残基，根据Kabat等人给出的VH域的一般编号法来编号(“Sequence ofproteins of immunological interest”,US Public Health Services,NIH Bethesda,MD,公开案第91号)。根据该编号法，例如
-FR1包含在位置1-30处的氨基酸残基，
-CDR1包含在位置31-35处的氨基酸残基，
-FR2包含在位置36-49处的氨基酸，
-CDR2包含在位置50-65处的氨基酸残基，
-FR3包含在位置66-94处的氨基酸残基，
-CDR3包含在位置95-102处的氨基酸残基，且
-FR4包含在位置103-113处的氨基酸残基。
如例如WO 2006/040153及WO 2006/122786中所详述，VHH域可根据框架区内氨基酸的特定组合而具体分为三个组，即(a)“GLEW组”，也包括“GLEW样”序列；(b)“KERE组”，也包括KQRE序列；及(c)“103P，R,S组”，且可进一步由具体的“印记残基”表征。
“亲和力成熟的Dll4结合分子”在一个或多个CDR中具有一个或多个变化，所述变化导致对Dll4的亲和力相比于其各自的亲本Dll4结合分子有所增加。本发明的亲和力成熟的Dll4结合分子可通过例如由以下所述的本领域中已知的方法来制备：Marks等人,1992,Biotechnology 10:779-783或Barbas,等人,1994,Proc.Nat.Acad.Sci,USA 91:3809-3813.；Shier等人,1995,Gene 169:147-155；Yelton等人,1995,Immunol.155:1994-2004；Jackson等人,1995,J.Immunol.154(7):3310-9；及Hawkins等人,1992,J.MoI.Biol.226(3):889896；KS Johnson及RE Hawkins,“Affinity maturation of antibodies using phagedisplay”，Oxford University Press 1996。
对于本发明，若未另有说明，则关于相关序列(例如完全免疫球蛋白单一可变域序列或CDR序列)，“SEQ ID NO:x的氨基酸序列”包括：
a)与各别SEQ ID NO:x中所示序列100%一致的氨基酸序列；
b)与各别SEQ ID NO:x中所示序列具有至少80%氨基酸一致性的氨基酸序列；
c)与各别SEQ ID NO:x中所示序列具有3个、2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
可互换使用的术语“表位”及“抗原决定簇”是指例如多肽的大分子的一部分，其由抗原结合分子(例如常规抗体或本发明的免疫球蛋白单一可变域)识别，且更具体地由所述分子的抗原结合位点识别。表位定义免疫球蛋白的最小结合位点，因而为免疫球蛋白赋予了特异性。
如本文所用的术语“双互补位(biparatopic)Dll4结合分子”或“双互补位免疫球蛋白单一可变域”是指包含如本文定义的第一免疫球蛋白单一可变域和第二免疫球蛋白单一可变域的Dll4结合分子，其中所述分子能够结合Dll4抗原的两个不同表位。本发明双互补位多肽由具有不同特异性的免疫球蛋白单一可变域构成。抗原结合分子(例如本发明的抗体或多肽)识别表位的部分称为互补位。
可“结合”或“特异性结合”某一表位、抗原或蛋白(或其至少一部分、片段或抗原表位)、对其“具有亲和力”和/或“具有特异性”的多肽(例如免疫球蛋白、抗体、本发明的免疫球蛋白单一可变域或含有其的多肽、或一般为抗原结合分子或其片段)是指“对抗”或“针对”该表位、抗原或蛋白，或为关于该表位、抗原或蛋白的“结合”分子。
一般而言，术语“特异性”是指特定抗原结合分子或抗原结合蛋白(例如本发明的免疫球蛋白单一可变域)分子可结合的不同类型抗原或表位的数目。可基于抗原结合分子的亲和力和/或亲抗原性(avidity)确定其特异性。由抗原与抗原结合蛋白的解离平衡常数(KD)所表示的亲和力，是表位与抗原结合蛋白上抗原结合位点之间结合强度的量度：KD值越小，表位与抗原结合分子之间的结合强度越强(或者，亲和力也可表示为亲和力常数(KA)，其为1/KD)。如本领域技术人员将了解(例如基于本文其他公开的内容)，取决于具体感兴趣的抗原，可以以以本身已知方式测定亲和力。亲抗原性为抗原结合分子(例如免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单一可变域或含有其的多肽)与相关抗原之间结合强度的量度。亲抗原性与以下两者有关：与其抗原结合分子上的抗原结合位点之间的亲和力，以及存在于抗原结合分子上的相关结合位点的数目。抗原结合分子识别表位的部分称为互补位。
氨基酸残基将根据如本领域中公知且达成一致的标准三字母或一字母氨基酸码加以指示。在比较两个氨基酸序列时，术语“氨基酸差异”是指相比于第二序列，在参考序列某一位置处指定数目氨基酸残基的***、缺失或取代。在取代的情况下，所述取代将优选为保守氨基酸取代，所述保守氨基酸是指氨基酸残基被化学结构类似的另一氨基酸残基置换，且其对多肽的功能、活性或其他生物性质影响较小或基本上无影响。这些保守氨基酸取代在本领域中是公知的，例如根据WO 98/49185，其中保守氨基酸取代优选是以下组(i)-(v)内的一个氨基酸被同一组内的另一氨基酸残基所取代：(i)较小脂族非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro及Gly；(ii)极性带负电残基及其(不带电)酰胺：Asp、Asn、Glu及Gln；(iii)极性带正电残基：His、Arg及Lys；(iv)较大脂族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val及Cys；及(v)芳族残基：Phe、Tyr及Trp。特别优选的保守氨基酸取代如下：
Ala被Gly或Ser取代；
Arg被Lys取代；
Asn被Gln或His取代；
Asp被Glu取代；
Cys被Ser取代；
Gln被Asn取代；
Glu被Asp取代；
Gly被Ala或Pro取代；
His被Asn或Gln取代；
Ile被Leu或Val取代；
Leu被Ile或Val取代；
Lys被Arg、Gln或Glu取代；
Met被Leu、Tyr或Ile取代；
Phe被Met、Leu或Tyr取代；
Ser被Thr取代；
Thr被Ser取代；
Trp被Tyr取代；
Tyr被Trp或Phe取代；
Val被Ile或Leu取代。
例如相比于其天然生物来源和/或获得该核酸或多肽分子的反应介质或培养基，在其已与至少一种在该来源或介质(培养基)中其通常与之相关的其他组分分离时，多肽或核酸分子视为“(呈)基本上分离(的形式)”(所述其他组分例如另一核酸、另一蛋白/多肽、另一生物组分或大分子或至少一种污染物、杂质或微量组分)。特别地，核酸或多肽分子在其已纯化至少2倍、特别是至少10倍、更特别是至少100倍且多达1000倍或1000倍以上时被视为“基本上被分离”。经适合的技术(例如适合色谱技术，如聚丙烯酰胺凝胶电泳)确定，“呈基本上被分离的形式”的多肽或核酸分子优选基本上为均质的。
术语“癌症”及“癌性”是指或描述哺乳动物中通常以不受调控的细胞生长/增殖为特征的生理症状。可用本发明的Dll4结合分子治疗的癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤及白血病。如US 2008/0014196中表明用Dll4拮抗剂治疗的这些癌症的更特定实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、子***、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝癌(hepatoma)、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌、肝癌(liver cancer)、***癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepaticcarcinoma)、胃癌、黑素瘤、及各种类型的头颈癌。血管生成的调控异常可导致许多可由本发明组合物及方法治疗的病症。这些病症包括非肿瘤性症状及肿瘤性症状两者。肿瘤性病症包括但不限于上述病症。非肿瘤性病症包括但不限于如US 2008/0014196中所述用Dll4拮抗剂治疗的不欲或异常的肥大、关节炎、类风湿性关节炎(RA)、牛皮癣、牛皮癣斑块、类肉瘤病(sarcoidosis)、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化斑块、糖尿病性及其他增生性视网膜病(包括早产儿视网膜病、晶状体后纤维组织增生(retrolental fibroplasia)、新生血管性青光眼、年龄相关的黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、角膜新血管生成(cornealneovascularization)、角膜移植新血管生成、角膜移植排斥、视网膜/脉络膜新血管生成、隅角新血管生成(虹膜红变(rubeosis))、眼新血管病(ocularneovascular disease))、血管再狭窄(vascular restenosis)、动静脉畸形(arteriovenous malformations，AVM)、脊膜瘤(meningioma)、血管瘤、血管纤维瘤(angiofibroma)、甲状腺增生(包括格雷夫氏病(Grave's disease))、角膜及其他组织移植、慢性炎症、肺炎症、急性肺损伤/ARDS、败血症、原发性肺动脉高压(primary pulmonary hypertension)、恶性肺积液(malignant pulmonaryeffusion)、脑水肿(例如与急性中风/闭锁性头部损伤(closed head injury)/外伤相关)、滑液炎症、RA中的血管翳形成(pannus formation)、骨化性肌炎(myositisossificans)、肥大性骨形成(hypertropic bone formation)、骨关节炎(OA)、难治愈的腹水症、多囊性卵巢疾病(polycystic ovarian disease)、子宫内膜异位症(endometriosis)、第3间隔体液疾病(3rd spacing of fluid disease)(胰腺炎、间隔综合征(compartment syndrome)、灼伤、肠病)、子宫纤维瘤、早产、例如IBD(克罗恩氏病(Crohn's disease)及溃疡性结肠炎)的慢性炎症、肾同种异体移植排斥、发炎性肠病、肾病综合征、不欲或异常的组织大量生长(非癌)、血友病性关节(hemophilic joint)、肥厚性瘢痕(hypertrophic scar)、头发生长抑制、奥斯勒-韦伯综合征(Osier-Weber syndrome)、化脓性肉芽肿晶状体后纤维组织增生(pyogenic granuloma retrolental fibroplasias)、硬皮病(scleroderma)、沙眼、血管黏附(vascular adhesion)、滑膜炎(synovitis)、皮炎、子痫前症(preeclampsia)、腹水症、心包积液(pericardial effusion)(例如与心包炎(pericarditis)相关的心包积液)、及胸膜积液(pleural effusion)。
发明详述
在第一方面中，本发明涉及一种包含至少一个具有四个框架区和三个分别为CDR1、CDR2及CDR3的互补决定区的可变域的Dll4结合分子，其中CDR3具有选自如下所示氨基酸序列的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:1至166及458，
b)SEQ ID NO:333至353，或
c)SEQ ID NO:375至395。
选自第一组SEQ ID NO:1至166及458的氨基酸序列a)作为部分序列形式包含于选自表5及SEQ ID NO:167至332及459中所示的第二组序列的相应氨基酸序列中。
选自第一组SEQ ID NO:333至353的氨基酸序列b)作为部分序列形式包含于选自表16-A及SEQ ID NO:354至374中所示的第二组序列的相应序列中。
选自第一组SEQ ID NO:375至395的氨基酸序列c)作为部分序列形式包含于选自表16-B及SEQ ID NO:396至416中所示的第二组序列的相应序列中。
在第二方面中，该Dll4结合分子为一种分离的免疫球蛋白单一可变域或含有一个或多个所述免疫球蛋白单一可变域的多肽，其中该免疫球蛋白单一可变域由四个框架区和三个分别为CDR1、CDR2及CDR3的互补决定区组成，且其中CDR3具有选自如下所示的氨基酸序列的氨基酸序列
a)SEQ ID NO:1至166及458，
b)SEQ ID NO:333至353，或
c)SEQ ID NO:375至395。
在另一方面中，该免疫球蛋白单一可变域含有
a)氨基酸序列选自SEQ ID NO:1至166及458中所示的第一组氨基酸序列的CDR3；
b)氨基酸序列如表5中所指示的作为部分序列形式包含于选自SEQ IDNO:167至332及459中所示的第二组氨基酸序列的序列中的CDR1及CDR2；
其中SEQ ID No 1-166的第一组的SEQ ID NO:x对应于第二组的SEQ IDNO:y，其中y=x+166。
在另一方面中，该免疫球蛋白单一可变域含有
a)氨基酸序列选自SEQ ID NO:333至353中所示的第一组氨基酸序列的CDR3；
b)氨基酸序列如表16-A中所指示的作为部分序列形式包含于选自SEQID NO:354至374中所示的第二组序列的序列中的CDR1及CDR2；
其中该第一组的SEQ ID NO:x对应于该第二组的SEQ ID NO:y，其中y=x+21。
在另一方面中，该免疫球蛋白单一可变域具有
a)氨基酸序列选自SEQ ID NO:375至395中所示的第一组氨基酸序列的CDR3；
b)氨基酸序列如表16-B中所指示的作为部分序列形式包含于选自SEQID NO:396至416中所示的第二组序列的序列中的CDR1及CDR2；
其中第一组的SEQ ID NO:x对应于第二组的SEQ ID NO:y，其中y=x+21。
在一个优选的实施方案中，该免疫球蛋白单一可变域为VHH。
在另一方面中，VHH的氨基酸序列选自表5及SEQ ID NO:167至332及459中所示的氨基酸序列。
在治疗应用方面具有改良的性质(例如增强的亲和力或减少的免疫原性)的Dll4结合分子，可通过例如以下的技术而从本发明的各别Dll4结合分子获得：亲和力成熟(例如从合成、随机或天然存在免疫球蛋白序列起始)、CDR接枝、人化、合并源自不同免疫球蛋白序列的片段、使用重叠引物的PCR组装，和本领域技术人员熟知的用于工程改造免疫球蛋白序列的类似技术的技术；或任何上述者的任一适合组合。例如参考标准手册以及其它描述及实施例。
优选地，亲和力增加的本发明的Dll4结合分子可通过使另一Dll4结合分子亲和力成熟来获得，该另一Dll4结合分子表示就亲和力成熟分子而言的“亲本”Dll4结合分子。
因此，在另一个优选的实施方案中，本发明的Dll4结合分子为通过使以上定义的亲本免疫球蛋白单一可变域亲和力成熟而获得的免疫球蛋白单一可变域。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及通过使VHH亲和力成熟而获得的免疫球蛋白单一可变域。
用于亲和力成熟的适合的亲本Dll4结合分子为例如氨基酸序列显示于SEQ ID NO:167至332及459中的上述VHH。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及已通过使氨基酸序列显示于SEQ ID NO:197中的VHH亲和力成熟而获得的免疫球蛋白单一可变域。
在另一实施方案中，源自氨基酸序列显示于SEQ ID NO:197中的VHH的该免疫球蛋白单一可变域选自氨基酸序列显示于SEQ ID NO:354至374中的免疫球蛋白单一可变域。
在一个优选的实施方案中，该免疫球蛋白单一可变域为氨基酸序列显示于SEQ ID NO:358中的VHH。
在一个甚至更优选的实施方案中，该免疫球蛋白单一可变域通过使氨基酸序列显示于SEQ ID NO:358中的VHH人化而获得。
在另一个优选的实施方案中，该免疫球蛋白单一可变域为氨基酸序列显示于SEQ ID NO:356中的VHH。
在一个甚至更优选的实施方案中，本发明涉及已通过使氨基酸序列显示于SEQ ID NO:356中的VHH人化而获得的免疫球蛋白单一可变域。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及已通过使氨基酸序列显示于SEQ ID NO:224中的VHH亲和力成熟而获得的免疫球蛋白单一可变域。
在另一实施方案中，源自氨基酸序列显示于SEQ ID NO:224中的VHH的该免疫球蛋白单一可变域选自氨基酸序列显示于SEQ ID NO:396至416中的免疫球蛋白单一可变域。
在另一个优选的实施方案中，该免疫球蛋白单一可变域为氨基酸序列显示于SEQ ID NO:402中的VHH。
在一个甚至更优选的实施方案中，该免疫球蛋白单一可变域通过使氨基酸序列显示于SEQ ID NO:402中的VHH人化而获得。
在另一个优选的实施方案中，该免疫球蛋白单一可变域为氨基酸序列显示于SEQ ID NO:416中的VHH。
在一个甚至更优选的实施方案中，该免疫球蛋白单一可变域通过使氨基酸序列显示于SEQ ID NO:416中的免疫球蛋白单一可变域人化而获得。
在另一个优选的实施方案中，该免疫球蛋白单一可变域为氨基酸序列显示于SEQ ID NO:407中的VHH。
在一个甚至更优选的实施方案中，该免疫球蛋白单一可变域通过使氨基酸序列显示于SEQ ID NO:413中的免疫球蛋白单一可变域人化而获得。
根据本发明的优选的实施方案，免疫球蛋白单一可变域(例如VH和VHH)具有大量使其极有利于在治疗中用作功能性抗原结合分子的独特结构特征及功能性质。特别地，且不对其进行限制，VHH域(其已基本上经“设计”为在不与轻链可变域配对情况下功能性地结合抗原)可充当单一、相对较小、功能性的抗原结合结构单元。
由于其独特性质，VHH或VHS(或VLs)等如本文定义的免疫球蛋白单一可变域无论是单独存在还是作为较大多肽(例如双互补位分子)的一部分，均提供许多显著优点：
·仅需要单一域以高亲和力及高选择性地结合抗原，因而无需存在两个各别的域，也无需确保这两个域以正确的空间构象及构型存在(即通过使用特别设计的连接子，如scFv的连接子)；
·免疫球蛋白单一可变域可从单一核酸分子表达且不需要任何翻译后修饰(如糖基化)；
·免疫球蛋白单一可变域可轻易经工程改造为多价及多特异性形式(如本文进一步论述)；
·免疫球蛋白单一可变域对其靶点具有高特异性及亲和力，具有低遗传毒性，可通过输注或注射以外的替代途径给予；
·免疫球蛋白单一可变域对热、pH、蛋白酶及其他变性剂或变性条件高度稳定，因此可在不使用冷冻设备情况下制备、储存或运输；
·免疫球蛋白单一可变域无论是以小规模还是以生产规模制备均较为容易且相对廉价。例如，免疫球蛋白单一可变域及含有免疫球蛋白单一可变域的多肽可使用微生物发酵(例如下文进一步公开)产生，不需要像常规抗体那样使用哺乳动物表达***；
·相比于常规4链抗体及其抗原结合片段，免疫球蛋白单一可变域是相当小的(约15kDa，或为常规IgG的1/10)，因此显示穿透入组织(包括但不限于实体肿瘤及其他致密组织)的穿透性(更)高，且可以以高于这些常规4链抗体及其抗原结合片段的剂量给予；
·VHH具有特定的所谓“空腔结合性质”(尤其是由于其CDR3环相比于4链抗体的VH域更为延伸)，因此其也能够进入常规4链抗体及其抗原结合片段不可进入的靶点及表位；
·VHH具有高度可溶及极其稳定且不具有凝集趋势的特别优势(正如由Ward等人,Nature 341:544-546(1989)所述的小鼠源性抗原结合域的情况一样)。
本发明的免疫球蛋白单一可变域在获得所述免疫球蛋白单一可变域的具体生物来源或具体制备方法的方面不受限制。例如，获得VHH可包括以下步骤：
(1)分离天然存在的重链抗体的VHH域；或筛选包含重链抗体或VHH的文库且从中分离VHH；
(2)表达编码具有天然存在序列的VHH的核酸分子；
(3)任选在亲和力成熟之后使具有天然存在序列的VHH“人化”(如本文所述)，或表达编码所述人化VHH的核酸；
(4)使动物物种(特别是哺乳动物物种，例如人)的天然存在抗体的免疫球蛋白单一可变重域“骆驼化”(如下所述)，或表达编码所述骆驼化域的核酸分子；
(5)使VH“骆驼化”，或表达编码这类骆驼化VH的核酸分子；
(6)使用以合成方式或半合成方式制备蛋白、多肽或其他氨基酸序列的技术；
(7)使用核酸合成技术制备编码VHH域的核酸分子，随后表达由此获得的核酸；
(8)使重链抗体或VHH经受亲和力成熟、诱变(例如随机诱变或定点诱变)和/或任何其他技术以增加VHH的亲和力和/或特异性；和/或
(9)组合或选择上述步骤。
适于进行上述步骤的方法及技术在本领域中是已知的且将为本领域技术人员所了解。
根据一个具体实施方案，本发明的免疫球蛋白单一可变域或存在于本发明的多肽中的免疫球蛋白单一可变域为氨基酸序列基本上对应于天然存在VHH域的氨基酸序列的VHH域，但其已经人化(任选在亲和力成熟之后)，即通过以人的常规4链抗体可变重域中相应位置处存在的一个或多个氨基酸残基置换该天然存在VHH序列的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基。这可使用本领域中已知的方法进行，所述方法可由本领域技术人员以常规方式使用。
人化VHH可含有一个或多个完全人框架区序列，且在一个甚至更具体的实施方案中，可含有源自人生殖系Vh3序列DP-29、DP-47、DP-51或其部分，或之此高度同源的人框架区序列。因此，人化方案可包含单独或组合使用生殖系VH基因(例如DP 47、DP29及DP51)的相应骨架1、2和3(FR1、FR2和FR3)残基来置换任何VHH残基。本发明的免疫球蛋白单一可变域的适合的框架区(FR)可选自那些例如WO 2006/004678中公开的FR，且具体地包括所谓“KERE”及“GLEW”类型。在约位置44至47处具有氨基酸序列G-L-E-W的免疫球蛋白单一可变域及其分别的人化对应物是特别优选的。
属于103P，R,S组和/或GLEW组(如下文所定义)的优选但并非限制性的VHH域的人化取代为108Q至108L。使免疫球蛋白单一可变域人化的方法在本领域中是已知的。
根据另一实施方案，免疫球蛋白单一可变域为如本文所定义的VH域。
在另一实施方案中，本发明代表性种类的Dll4结合免疫球蛋白单一可变域或存在于本发明的多肽中的Dll4结合免疫球蛋白单一可变域的氨基酸序列对应于天然存在VH域已经“骆驼化”的氨基酸序列，即通过以一个或多个存在于重链抗体VHH域中相应位置处的氨基酸残基置换常规4链抗体的天然存在可变重链氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基。这可以本领域技术人员所了解的本身已知的方式进行，且另外参考WO 94/04678。所述骆驼化可优先发生在存在于VH-VL界面的氨基酸位置处及所谓骆驼科印记残基处(也例如参见WO94/04678)。这些“人化”及“骆驼化”技术及与此相符的优选框架区序列的详述也可参见WO 2006/040153的第46页及第98页及WO2006/122786的第107页。
本发明的Dll4结合分子(例如免疫球蛋白单一可变域和/或含有其的多肽)对Dll4具有特异性，因为其包含与Dll4分子内的一个或多个表位特异性结合的一个或多个免疫球蛋白单一可变域。
Dll4结合分子对其抗原Dll4的特异性结合可以以本身已知的任何适合的方式，包括例如本文所述的分析、斯卡查德分析和/或竞争性结合分析(例如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA及ELISA)及夹心式竞争分析)及本领域中本身已知的其不同变化形式来测定。
关于抗原Dll4，本发明的Dll4结合分子(例如免疫球蛋白单一可变域)在物种方面不受限制。因此，若欲用于人中的治疗目的，则本发明的免疫球蛋白单一可变域或含有其的多肽优选结合至人Dll4。然而，结合至另一哺乳动物物种的Dll4的免疫球蛋白单一可变域或含有其的多肽也在本发明的范围内。与一个物种的Dll4结合的本发明的免疫球蛋白单一可变域，可与一个或多个其他物种的Dll4发生交叉反应。例如，结合人Dll4的本发明的免疫球蛋白单一可变域可表现出与一个或多个其他灵长类物种的Dll4和/或与用于疾病动物模型(且特别是用于与Dll4介导的血管生成作用相关的疾病及病症的动物模型)中的一个或多个动物物种(例如猴(特别是短尾猴或恒河猴)、小鼠、大鼠、兔、猪、犬)(例如本文提及的物种及动物模型)的Dll4的交叉反应性。表现所述交叉反应性的本发明的免疫球蛋白单一可变域，在研究和/或药物研发中是有利的，因为其允许在公认的疾病模型(例如猴(特别是短尾猴或恒河猴)、或小鼠及大鼠)中对本发明的免疫球蛋白单一可变域进行测试。
此外，本发明的Dll4结合分子不限于其所针对的抗原的特定域或抗原决定基或不由其所针对的Dll4的特定域或抗原决定基限定。优选地，鉴于与除人以外的物种(其欲在治疗性Dll4拮抗剂的研发期间将其用作动物模型)的一种或多种Dll4分子的交叉反应性，Dll4结合分子识别与人Dll4具有高一致度的感兴趣的Dll4区域中的表位。例如，鉴于使用小鼠模型，本发明的免疫球蛋白单一可变域识别完全或部分位于Dll4的EGF-2域内的表位，该EGF-2域在人与小鼠之间显示较高的一致度。
因此，根据一个优选的实施方案，本发明涉及Dll4结合分子，具体涉及免疫球蛋白单一可变域或含有其的多肽，其中所述免疫球蛋白单一可变域选自与完全或部分地包含于EGF-2域内的表位结合的免疫球蛋白单一可变域，该EGF-2域对应于SEQ ID NO:417的氨基酸残基252-282。
若本发明的多肽为如本文所定义的包含多于一个本发明的免疫球蛋白单一可变域的双互补位分子，则至少一个免疫球蛋白单一可变域组分与上文所定义的EGF-2域内的表位结合。
优选地，本发明的免疫球蛋白单一可变域以小于500nM、优选小于200nM、更优选小于10nM，例如小于500pM(如如实例5.7中所述地通过表面等离子共振分析所测定)的亲和力结合Dll4。
优选地，如竞争ELISA分析(如实例5.1.中所述)中所测得，本发明的免疫球蛋白单一可变域具有的IC50值在10-6至10-10摩尔/升或10-10摩尔/升以下的范围内，更优选在10-8至10-10摩尔/升或10-10摩尔/升以下的范围内、且甚至更优选在10-9至10-10摩尔/升或10-10摩尔/升以下的范围内。
根据本发明的一非限制性但优选的实施方案，本发明的Dll4结合免疫球蛋白单一可变域或含有其的多肽以10-5至10-12摩尔/升(M)或10-12摩尔/升以下、且优选10-7至10-12摩尔/升(M)或10-12摩尔/升以下、且更优选10-8至10-12摩尔/升(M)或10-12摩尔/升以下的解离常数(KD)，和/或以至少107M-1、优选至少108M-1、更优选至少109M-1，例如至少1012M-1的缔合常数(KA)；且特别是以小于500nM、优选小于200nM、更优选小于10nM，例如小于500pM的KD分别结合Dll4或VEGF。可测定本发明的免疫球蛋白单一可变域针对Dll4的KD及KA值。
在另一实施方案中，本发明涉及包含两个或两个以上在不同非重叠表位处结合抗原Dll4的免疫球蛋白单一可变域的Dll4结合分子。更具体地，本发明的该多肽基本上由以下组成或包含以下：(i)特异性结合Dll4的第一表位的第一免疫球蛋白单一可变域及(ii)特异性结合Dll4的第二表位的第二免疫球蛋白单一可变域，其中Dll4的该第一表位及Dll4的该第二表位不为同一表位。换言之，本发明的该多肽包含以下或基本上由以下组成：两个或两个以上针对至少两个存在于Dll4中的不同表位的免疫球蛋白单一可变域，其中所述免疫球蛋白单一可变域以能够同时结合Dll4的方式彼此连接。在此意义中，本发明的多肽也可视为“二价”或“多价”免疫球蛋白构建体(construct)，且尤其视为“多价免疫球蛋白单一可变域构建体”，因为该多肽含有至少两个Dll4结合位点。
本发明的该Dll4结合分子包括(至少)两个抗Dll4免疫球蛋白单一可变域，其中(该)两个免疫球蛋白单一可变域是针对Dll4分子内的不同表位。因此，这两个免疫球蛋白单一可变域将具有不同抗原特异性且因此具有不同CDR序列。为此，由于所述两个免疫球蛋白单一可变域包括两个不同互补位，本发明的这些多肽在本文中也分别称为“双互补位多肽”、或“双互补位单域抗体构建体”(若免疫球蛋白单一可变域由或基本上由单域抗体组成)或“双互补位VHH构建体”(若免疫球蛋白单一可变域由或基本上由VHH组成)。
根据本发明的一具体实施方案，若本发明的多肽包括多于两个(即三个、四个或甚至四个以上)抗Dll4免疫球蛋白单一可变域，则至少两个所述抗Dll4免疫球蛋白单一可变域是针对Dll4分子内的不同表位，其中任何另一免疫球蛋白单一可变域可结合存在于Dll4分子中的这两个不同表位的任一个和/或其他表位。
根据本发明，两个或两个以上免疫球蛋白单一可变域可彼此独立地为VH或VHH，和/或如本文定义的任何其它种类的免疫球蛋白单一可变域，例如VL域，条件是这些免疫球蛋白单一可变域将结合抗原(即Dll4)。
根据一个优选的实施方案，所述第一及第二免疫球蛋白单一可变域基本上由如本文定义的VH序列或VHH序列组成。根据一个特别优选的实施方案，所述第一及第二免疫球蛋白单一可变域基本上由VHH序列组成。
根据本发明的一些实施方案，存在于本发明的Dll4结合分子中的至少两个免疫球蛋白单一可变域可彼此直接(即不使用连接子)连接或通过连接子连接。连接子优选为连接肽且将经选择以允许至少两个不同免疫球蛋白单一可变域各与同一个Dll4分子内或两个不同分子内的Dll4的至少两个不同表位结合。
连接子的选择将尤其取决于表位，且具体地取决于免疫球蛋白单一可变域所结合Dll4上的表位之间的距离，且本领域技术人员基于本文公开的内容，任选在某些有限程度的常规实验之后将了解此选择。作为该实验的起点，可通常假定存在于本发明的该类多肽中的两个免疫球蛋白单一可变域的N-末端与C-末端间的距离优选为至少50埃(Angstrom)、且更优选约55-200埃、且具体在约65-150埃的区间内，其中该距离的上限并不关键，且例如出于考虑蛋白表达/产生的便利性的考虑而加以选择。
此外，当结合Dll4的两个或两个以上免疫球蛋白单一可变域为VH或VHH时，其可分别通过第三VH或VHH而彼此连接(在这些Dll4结合分子中，两个或两个以上免疫球蛋白单一可变域可直接或通过适合的连接子连接至该第三免疫球蛋白单一可变域)。此类第三VH或VHH可例如为提供增加的半衰期的VH或VHH。例如，后一VH或VHH可为能够结合(人)血清蛋白(例如(人)血清白蛋白)或(人)转铁蛋白(transferrin)的VH或VHH。
或者，结合Dll4的两个或两个以上免疫球蛋白单一可变域可(直接或通过适合的连接子)串联连接且第三VH或第三VHH(其可提供增加的半衰期)可直接或通过连接子连接至这两个或两个以上上述免疫球蛋白序列之一。
适合的连接子可例如且不限于包含长度优选为9个或9个以上氨基酸、更优选为多于17个氨基酸，例如约20-40个氨基酸残基的氨基酸序列。然而，上限并不关键，该上限是由于与例如这些多肽的生物医药生产的便利性的相关的原因而选择的。
连接序列可为天然存在序列或非天然存在序列。若用于治疗目的，则在给予本发明的双特异性结合分子的受试者中所述连接子优选为非免疫原性的。
一组适用连接序列为如WO 96/34103及WO 94/04678中所述源自重链抗体铰链区的连接子。
其它实例为聚丙氨酸连接序列，例如Ala-Ala-Ala。
若本发明的多肽通过连接聚合物，例如聚乙二醇PEG(聚乙二醇)部分来修饰，则该连接序列优选包括允许连接区域中的此修饰(例如聚乙二醇化)的氨基酸残基，例如半胱氨酸或赖氨酸。
此外，连接子也可为例如WO 04/081026中所示的聚(乙二醇)部分。
在另一实施方案中，本发明的多肽的至少两个Dll4结合免疫球蛋白单一可变域通过另一部分(任选通过一个或两个连接子)，例如另一多肽来彼此连接，该另一多肽在一个优选但非限制性实施方案中可为如上所述的另一免疫球蛋白单一可变域。该部分可为基本上非活性的或可具有例如改良多肽的所需性质的生物效应或可赋予多肽一种或多种其他所需性质。例如但不限于，该部分可改良蛋白或多肽的半衰期，和/或可降低其免疫原性或改良任何其他所需性质。
根据本发明的一个优选的实施方案，在用作治疗剂的用途方面，本发明的Dll4结合分子包括延长本发明的多肽在患者血清或其他体液中的半衰期的部分。术语“半衰期”定义为(经修饰)多肽的血清浓度(例如由于天然机制所致的多肽降解和/或清除和/或螯合)而在体内降低50%所花费的时间。
更具体地，该半衰期延长部分可共价连接或融合至所述多肽，且可为(但不限于)Fc部分、白蛋白部分、白蛋白片段部分、白蛋白结合部分(例如抗白蛋白免疫球蛋白单一可变域)、转铁蛋白结合部分(例如抗转铁蛋白免疫球蛋白单一可变域)、聚氧化烯(polyoxyalkylene)分子(例如聚乙二醇分子)、白蛋白结合肽或羟乙基淀粉(HES)衍生物。
在另一优选的实施方案中，本发明的多肽包含与存在于血液中的抗原结合的部分，例如血清白蛋白、血清免疫球蛋白、甲状腺素结合蛋白、纤维蛋白原(fibrinogen)或转铁蛋白，因而使所得本发明的多肽的体内半衰期增加。根据一个特别优选的实施方案，该部分为白蛋白结合免疫球蛋白且尤其优选为白蛋白结合免疫球蛋白单一可变域，例如白蛋白结合VHH域。
若欲在人中使用，则该白蛋白结合免疫球蛋白单一可变域将优选结合人血清白蛋白，且将优选为人化白蛋白结合VHH域。
结合人血清白蛋白的免疫球蛋白单一可变域在本领域中是已知的，且进一步详述于例如WO 2006/122786中。特别地，适用的白蛋白结合VHH为ALB 1及其人化对应物ALB 8(WO 2009/095489)。然而，也可使用在以上专利公开案中提及的其他白蛋白结合VHH域。
根据本发明的另一实施方案，所述免疫球蛋白单一可变域可融合至例如公开于WO 01/79271及WO 03/59934中的血清白蛋白分子。如例如于WO01/79271中所述，融合蛋白可通过以下常规重组技术获得：将编码血清白蛋白或其片段的DNA分子接合至编码Dll4结合分子的DNA，将所得构建体***适于在所选宿主细胞(例如酵母细胞(如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))或细菌细胞)中表达的质粒中，接着用融合的核苷酸序列转染该宿主细胞，并使之在合适的条件下生长。
根据另一实施方案，本发明的多肽的半衰期延长修饰(此修饰亦降低多肽的免疫原性)包含连接药理学上可接受的合适的聚合物，例如直链或支链聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物(例如甲氧基聚(乙二醇)或mPEG)。一般而言，可使用任何适合形式的聚乙二醇化，例如本领域中用于抗体及抗体片段(包括但不限于单域抗体及scFv片段)的聚乙二醇化；参考例如：Chapman,Nat.Biotechnol.,54,531-545(2002)；Veronese及Harris,Adv.Drug Deliv.Rev.54,453-456(2003)；Harris及Chess,Nat.Rev.Drug.Discov.2(2003)；及WO 04/060965。
用于使多肽聚乙二醇化的各种试剂也是市售的，例如可从NektarTherapeutics,USA或NOF Corporation,Japan购得，所述试剂例如
Figure BDA00001721901500211
EA系列、SH系列、MA系列、CA系列及ME系列，例如
Figure BDA00001721901500212
ME-100MA、
Figure BDA00001721901500213
ME-200MA及
Figure BDA00001721901500214
ME-400MA。
优选使用(特别是通过半胱氨酸残基的)定点聚乙二醇化(参见例如Yang等人,Protein Engineering 16,761-770(2003))。例如，出于此目的，PEG可连接至天然存在于本发明的多肽中的半胱氨酸残基，本发明的多肽可经修饰以便适当引入一个或多个用于连接PEG的半胱氨酸残基，或包含一个或多个用于连接PEG的半胱氨酸残基的氨基酸序列可融合至本发明的多肽的N-末端和/或C-末端，以上均使用对本领域技术人员而言本身已知的蛋白工程的技术。
优选地，对于本发明的多肽，使用PEG的分子量大于5kDa(例如大于10kDa)且小于200kDa(例如小于100kDa)，例如在20kDa至80kDa范围内。
关于聚乙二醇化应注意，一般而言，本发明也优选涵盖已在一个或多个氨基酸位置处经聚乙二醇化的任何双特异性结合分子，该聚乙二醇化：(1)增加体内半衰期；(2)降低免疫原性；(3)提供对于聚乙二醇化本身已知的一种或多种其他有益性质；(4)基本上不影响多肽对其靶点的亲和力(例如通过本领域中所述的适合分析所测定，不使该亲和力降低50%以上、且更优选不使之降低10%以上)；和/或(5)不影响本发明的双特异性结合分子的任何其他所需性质。适合的PEG基团及用于特异性或非特异性与之连接的方法将为本领域技术人员所了解。用于所述聚乙二醇化的试剂盒及试剂可例如从Nektar(CA,USA)获得。
在另一方面中，本发明涉及编码本发明的Dll4结合分子的核酸分子。这些核酸分子在本文中也称为“本发明的核酸”且也可呈如本文定义的遗传构建体形式。本发明的核酸可为基因组DNA、cDNA或合成DNA (例如具有已特定适于在预定宿主细胞或宿主有机体中表达的密码子用途(codon usage)的DNA)。根据本发明的一个实施方案，本发明的核酸呈如上定义的基本上分离的形式。
本发明的核酸也可呈载体形式，可存在于载体中和/或可为载体的一部分，该载体例如质粒、粘端质粒或YAC。载体可尤其为表达载体，即可提供Dll4结合分子体外和/或体内(即在适合宿主细胞、宿主有机体和/或表达***中)表达的载体。该表达载体通常包含至少一种本发明的核酸，其可操作地连接至一个或多个适合调控组件(例如启动子、增强子、终止子等)。这些组件及其鉴于特测序列在特定宿主中的表达的选择为本领域技术人员的常识。对本发明Dll4结合分子的表达有用或必需的调控组件及其他组件的具体实例，例如启动子、增强子、终止子、整合因子(integration factor)、选择标记物、前导序列、报告基因(reporter gene)等公开于例如WO 2006/040153的第131至133页。
本发明的核酸可基于关于本文给出的本发明的多肽的氨基酸序列的信息以本身已知的方式(例如通过自动DNA合成和/或重组DNA技术)制备或获得，和/或可从适合的天然来源加以分离。
在另一方面中，本发明涉及表达或能够表达一种或多种本发明的Dll4结合分子和/或含有本发明的核酸的宿主细胞。根据一个特别优选的实施方案，所述宿主细胞为细菌细胞；其他适用细胞为酵母细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。
适合的细菌细胞包括革兰氏阴性细菌菌株(例如大肠杆菌(Escherichia coli)菌株、变形杆菌属(Proteus)菌株及假单胞菌属(Pseudomonas)菌株)及***菌株(例如芽孢杆菌属(Bacillus)菌株、链霉菌属(Streptomyces)菌株、葡萄球菌属(Staphylococcus)菌株及乳球菌属(Lactococcus)菌株)的细胞。适合真菌细胞包括木霉属(Trichoderma)、脉孢菌属(Neurospora)及曲菌属(Aspergillus)的物种的细胞。适合酵母细胞包括酵母属(Saccharomyces)(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)(例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、毕赤酵母属(Pichia)(例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)及嗜甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica))及汉森酵母属(Hansenula)的物种的细胞。
适合的哺乳动物细胞包括例如CHO细胞、BHK细胞、海拉细胞(HeLacell)、COS细胞等。然而，也可使用两栖类细胞、昆虫细胞、植物细胞及本领域中用于表达异源蛋白的任何其他细胞。
本发明还提供制造本发明的Dll4结合分子的方法，这些方法通常包含以下步骤：
-在允许表达本发明的Dll4结合分子的条件下培养包含能够编码Dll4结合分子的核酸的宿主细胞；及
-从培养物回收或分离由宿主细胞表达的多肽；及
-任选进一步纯化和/或修饰和/或调配本发明的Dll4结合分子。
对于工业规模生产而言，优选的宿主有机体包括适于大规模表达、生产及发酵，且特别是适于大规模医药表达、生产及发酵的大肠杆菌菌株、巴斯德毕赤酵母菌株及酿酒酵母菌株。
具体表达***的选择部分取决于某些翻译后修饰的要求，更特别是糖基化的要求。需要或要求糖基化的本发明的Dll4结合分子的产生，必需使用能够使所表达蛋白糖基化的哺乳动物表达宿主。就此而言，本领域技术人员将了解所获得的糖基化样式(即所连接残基的种类、数目及位置)将取决于用于表达的细胞或细胞株。
在如上所述细胞中产生的本发明的Dll4结合分子或者可以以细胞内方式(例如在细胞溶质中、在胞间质(periplasma)中或在包涵体(inclusion body)中)产生，接着从宿主细胞分离且任选进一步纯化；或者其可以以细胞外方式(例如在培养宿主细胞的培养基中)产生，接着自培养基分离且任选进一步纯化。
用于重组产生多肽的方法及试剂，例如特定适合表达载体、转化或转染方法、选择标记物、诱导蛋白表达的方法、培养条件等在本领域中是已知的。类似地，适用于制造本发明的多肽的方法中的蛋白分离及纯化技术为本领域技术人员所公知。
在另一方面中，本发明涉及氨基酸序列选自分别显示于SEQ ID NO:1至166及458、SEQ ID NO:333至353、或SEQ ID NO:375至395中的氨基酸序列的肽，及编码该肽的核酸分子。
这些肽对应于源自本发明的VHH的CDR3。这些肽，特别是编码这些肽的核酸分子，适用于CDR移植以置换免疫球蛋白链中的CDR3，或适用于***非免疫球蛋白支架，例如蛋白酶抑制剂、DNA结合蛋白、细胞色素b562、螺旋束(helix-bundle)蛋白、二硫桥式肽(disulfide-bridged peptide)、脂质运载蛋白(lipocalin)或抗运载蛋白(anticalin)中，从而赋予此支架靶结合性质。CDR移植方法在本领域中是公知的且已广泛使用，例如用于使抗体人化(此通常包含将啮齿动物抗体的CDR移植在人抗体的Fv骨架上)。
为了获得含有本发明CDR3的免疫球蛋白或非免疫球蛋白支架，可根据如例如由Daugherty等人,1991,Nucleic Acids Research,第19卷,9,2471-2476所述的分子生物学标准方法，例如通过基因合成、通过寡核苷酸退火或借助于重叠PCR片段来获得编码此分子的DNA。将VHH CDR3***非免疫球蛋白支架中的方法已由Nicaise等人,2004,Protein Science,13,1882-1891公开。
本发明还涉及一种产物或组合物，其含有或包含至少一种本发明的Dll4结合分子及任选的这些组合物的本身已知的一种或多种其他组分，即视组合物的预定用途而定。
对于医药用途而言，本发明的Dll4结合分子或含有本发明的Dll4结合分子的多肽可调配成医药制剂或组合物，其包含至少一种本发明的Dll4结合分子及至少一种医药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂和/或佐剂及任选的一种或多种其他医药活性多肽和/或化合物。借助于非限制性实例，这类调配物可呈适于口服给药、肠胃外给药(例如通过静脉内、肌内或皮下注射或静脉内输注)、局部给药或通过吸入、皮肤贴片、植入物、栓剂等给药的形式。根据给药方式，合适的给药形式可为固体、半固体或液体，且其制备方法及载剂将为本领域技术人员所了解且进一步在本文中公开。
因此，在另一方面中，本发明涉及一种药物组合物，其含有至少一种Dll4结合分子，特别是一种本发明的免疫球蛋白单一可变域或含有该免疫球蛋白单一可变域的多肽，及至少一种适合的载剂、稀释剂或赋形剂(即适于医药用途)及任选一种或多种其他活性物质。
本发明的Dll4结合分子可以以本身已知的任何适合方式调配及给予：特别是对于免疫球蛋白单一可变域，例如参考WO 04/041862、WO 04/041863、WO 04/041865、WO04/041867及WO 08/020079，以及标准手册，例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版,Mack Publishing Company,USA(1990)；Remington,the Science and Practice of Pharmacy,第21版,Lippincott Williams and Wilkins(2005)；或the Handbook of TherapeuticAntibodies(S.Dubel编),Wiley,Weinheim,2007(参见例如第252-255页)。
例如，本发明的免疫球蛋白单一可变域可以以用于常规抗体及抗体片段(包括ScFv片段及双特异抗体)及其他医药活性蛋白的本身已知的任何方式调配及给予。这些调配物及制备这些调配物的方法将为本领域技术人员所了解，且例如包括适于肠胃外给药(例如静脉内、腹膜内、皮下、肌内、腔内、动脉内或鞘内给药)或局部(即经皮或皮内)给药的制剂。
用于肠胃外给药的制剂可例如为适于输注或注射的灭菌溶液、混悬液、分散液或乳液。适用于这些制剂的载剂或稀释剂，例如包括(但不限于)灭菌水及医药学上可接受的水性缓冲液及溶液，例如生理磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)、葡萄糖溶液及汉克氏溶液(Hank's solution)；含水油(water oil)；甘油；乙醇；二醇(例如丙二醇)或以及矿物油、动物油及植物油(例如花生油、大豆油)，以及其适合的混合物。通常将优选水性溶液或混悬液。
因此，本发明的Dll4结合分子可组合医药学上可接受的载体(例如惰性稀释剂或可吸收食用载剂)而全身给予(例如口服给予)。对于口服治疗性给药而言，可将本发明的Dll4结合分子与一种或多种赋形剂组合且以可摄取片剂、口腔锭、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬液、糖浆、糯米纸囊剂(wafer)等形式使用。这些组合物及制剂应含有至少0.1%的本发明的Dll4结合分子。其在组合物及制剂中的百分比当然可变化且宜介于既定单位剂型重量的约2%与约60%之间。本发明的Dll4结合分子在用于这些治疗的组合物中的量为获得有效剂量浓度的量。
所述片剂、丸剂、胶囊剂等也可含有粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂及甜味剂或矫味剂，例如在WO08/020079的第143-144页上所提及的。当单位剂型为胶囊剂时，其除以上类型的物质外也可含有液体载剂，例如植物油或聚乙二醇。可存在各种其他物质作为包衣或者用以修饰固体单位剂型的外形。例如，片剂、丸剂或胶囊剂可由明胶、蜡、虫胶(shellac)或糖等包衣。糖浆或酏剂可含有本发明的Dll4结合分子、蔗糖或果糖(作为甜味剂)、对羟基苯甲酸甲酯及对羟基苯甲酸丙酯(作为防腐剂)、色素及矫味剂(例如樱桃或橙香料)。当然，在制备任何单位剂型中使用的任何物质均应为医药学上可接受且在所用量下基本上无毒。此外，本发明的Dll4结合分子可并入持续释放制剂及装置中。
用于口服给药的制剂及调配物也可具有将使本发明构建体抵抗胃环境且进入肠中的肠溶包衣。更一般地，用于口服给药的制剂及调配物可经适当调配以递送进入胃肠道的任何所需部分中。此外，可使用适合的栓剂以递送进入胃肠道中。
如WO 08/020079第144及145页上所进一步公开，本发明的Dll4结合分子也可通过输注或注射而经静脉内或腹膜内给予。
对于本发明的Dll4结合分子的局部给药而言，如WO08/020079第145页上所进一步公开，一般需要将其与皮肤可接受的载剂(其可为固体或液体)组合而以组合物或调配物形式给予皮肤。
一般而言，本发明的Dll4结合分子在液体组合物(例如洗剂)中的浓度将为约0.1-25重量%、优选约0.5-10重量%。在半固体或固体组合物(例如凝胶或粉末)中的浓度将为约0.1-5重量%、优选约0.5-2.5重量%。
本发明的Dll4结合分子的治疗中需要的量不仅依所选具体Dll4结合分子，而且也依给药途径、所治疗症状特性及患者年龄及症状而变化且将最终由当值医师或临床医师酌情决定。此外，本发明的Dll4结合分子的剂量视靶细胞、肿瘤、组织、移植物或器官而变化。
所需剂量宜呈现为单次剂量或以适当间隔给予的分次剂量，例如呈每天两次、三次、四次或四次以上的亚剂量形式。所述亚剂量自身可经进一步划分，例如分成大量单个的松散间隔的给药；例如来自吹入器(insufflator)的多次吸入或通过对眼中多次滴眼。
给药方案可包括长期每天治疗。“长期”是指持续时间至少两周且优选数周、数月或数年。该剂量范围的必要修改可由一般技术人员仅使用本文教导的常规实验来确定。参见Remington's Pharmaceutical Sciences(Martin,E.W.第4版),Mack Publishing Co.,Easton,PA。若发生任何并发症，则该剂量也可由单个的医师来调整。
根据另一实施方案，本发明涉及本发明的Dll4结合分子(例如免疫球蛋白单一可变域或含有其的多肽)的用途，其用于治疗目的，例如
-尤其在人中用于预防、治疗和/或减轻与Dll4介导的血管生成作用相关或可通过用Dll4结合分子调节Notch信号传导路径来预防、治疗或减轻的病症、疾病或症状，
-在一治疗需要此治疗的患者的方法中，该方法包含给予有需要的个体医药活性量的至少一种本发明的Dll4结合分子(例如免疫球蛋白单一可变域)或含有所述的本发明的Dll4结合分子的药物组合物；
-用于制备预防、治疗或减轻与Dll4介导的血管生成作用相关的病症、疾病或症状的药物；
-作为用于以上目的药物组合物或药物中的活性成分。
根据一个具体的方面，该病症、疾病或症状为如本文定义的癌症或癌性疾病。
根据另一方面，疾病为与Dll4介导的血管生成作用相关或可通过用Dll4结合分子调节Notch信号传导路径来治疗或减轻的眼病。
视欲治疗的癌性疾病而定，本发明的Dll4结合分子可单独或组合一种或多种特别是选自以下的其他治疗剂加以使用：化学治疗剂(如DNA损伤剂)，或抑制癌细胞中血管生成、信号转导路径或有丝***检查点(mitoticcheckpoint)的治疗活性化合物。
其他治疗剂可任选作为同一医药制剂的组分与Dll4结合分子的给药同时给予、或在该Dll4结合分子的给药之前或之后给予。
在某些实施方案中，所述其他治疗剂可为(而不限于)一种或多种选自以下物质的抑制剂：EGFR、VEGFR、HER2-neu、Her3、AuroraA、AuroraB、PLK及PI3激酶、FGFR、PDGFR、Raf、KSP、PDK1、PTK2、IGF-R或IR。
其他治疗剂的其他实例为CDK、Akt、src/bcr abl、cKit、cMet/HGF、c-Myc、Flt3、HSP90的抑制剂；刺猬拮抗剂(hedgehog antagonist)；JAK/STAT、Mek、mTor、NFκB、蛋白酶体、Rho的抑制剂；wnt信号传导的抑制剂或遍在蛋白化(ubiquitination)路径的抑制剂或Notch信号传导路径的另一抑制剂。
Aurora抑制剂的实例为(但不限于)PHA-739358、AZD-1152、AT 9283、CYC-116、R-763、VX-680、VX-667、MLN-8045、PF-3814735。
PLK抑制剂的一个实例为GSK-461364。
raf抑制剂的实例为BAY-73-4506(也为VEGFR抑制剂)、PLX 4032、RAF-265(此外也为VEGFR抑制剂)、索拉非尼(sorafenib)(此外也为VEGFR抑制剂)及XL 281。
KSP抑制剂的实例为伊斯平斯(ispinesib)、ARRY-520、AZD-4877、CK-1122697、GSK 246053A、GSK-923295、MK-0731及SB-743921。
src和/或bcr-abl抑制剂的实例为达沙替尼(dasatinib)、AZD-0530、博舒替尼(bosutinib)、XL 228(也为IGF-1R抑制剂)、尼洛替尼(nilotinib)(也为PDGFR及cKit抑制剂)、伊马替尼(imatinib)(也为cKit抑制剂)及NS-187。
PDK1抑制剂的一个实例为BX-517。
Rho抑制剂的一个实例为BA-210。
PI3激酶抑制剂的实例为PX-866、BEZ-235(也为mTor抑制剂)、XL 418(也为Akt抑制剂)、XL-147及XL 765(也为mTor抑制剂)。
cMet或HGF的抑制剂的实例为XL-184(也为VEGFR、cKit、Flt3的抑制剂)、PF-2341066、MK-2461、XL-880(也为VEGFR的抑制剂)、MGCD-265(也为VEGFR、Ron、Tie2的抑制剂)、SU-11274、PHA-665752、AMG-102及AV-299。
c-Myc抑制剂的一个实例为CX-3543。
Flt3抑制剂的实例为AC-220(也为cKit及PDGFR的抑制剂)、KW 2449、来他替尼(lestaurtinib)(也为VEGFR、PDGFR、PKC的抑制剂)、TG-101348(也为JAK2的抑制剂)、XL-999(也为cKit、FGFR、PDGFR及VEGFR的抑制剂)、舒尼替尼(sunitinib)(也为PDGFR、VEGFR及cKit的抑制剂)及坦度替尼(tandutinib)(也为PDGFR及cKit的抑制剂)。
HSP90抑制剂的实例为坦螺旋霉素(tanespimycin)、阿螺旋霉素(alvespimycin)、IPI-504及CNF 2024。
JAK/STAT抑制剂的实例为CYT-997(其也与微管蛋白相互作用)、TG101348(也为Flt3的抑制剂)及XL-019。
Mek抑制剂的实例为ARRY-142886、PD-325901、AZD-8330及XL 518。
mTor抑制剂的实例为西罗莫司脂化物(temsirolimus)、AP-23573(其也作为VEGF抑制剂)、依维莫司(everolimus)(此外也为VEGF抑制剂)、XL-765(也为PI3激酶抑制剂)及BEZ-235(也为PI3激酶抑制剂)。
Akt抑制剂的实例为哌立福辛(perifosine)、GSK-690693、RX-0201及曲西立滨(triciribine)。
cKit抑制剂的实例为AB-1010、OSI-930(也作为VEGFR抑制剂)、AC-220(也为Flt3及PDGFR的抑制剂)、坦度替尼(也为Flt3及PDGFR的抑制剂)、阿西替尼(也为VEGFR及PDGFR的抑制剂)、XL-999(也为Flt3、PDGFR、VEGFR、FGFR的抑制剂)、舒尼替尼(也为Flt3、PDGFR、VEGFR的抑制剂)、及XL-820(也作为VEGFR及PDGFR抑制剂)、伊马替尼(也为bcr-abl抑制剂)、尼洛替尼(也为bcr-abl及PDGFR的抑制剂)。
刺猬拮抗剂的实例为IPI-609及CUR-61414。
CDK抑制剂的实例为塞来昔布(seliciclib)、AT-7519、P-276、ZK-CDK(亦抑制VEGFR2及PDGFR)、PD-332991、R-547、SNS-032、PHA-690509及AG 024322。
蛋白酶体抑制剂的实例为硼替佐米(bortezomib)、卡菲佐米(carfilzomib)及NPI-0052(也为NFκB的抑制剂)。
NFκB路径抑制剂的一个实例为NPI-0052。
遍在蛋白化路径抑制剂的一个实例为HBX-41108。
在优选的实施方案中，所述其他治疗剂为抗血管生成剂。
抗血管生成剂的实例为FGFR、PDGFR及VEGFR或各别配位体的抑制剂(例如VEGF抑制剂，如哌加他尼(pegaptanib)或抗VEGF抗体贝伐单抗(bevacizumab))及沙立度胺(thalidomide)，这些药物选自(但不限于)贝伐单抗、莫替沙尼(motesanib)、CDP-791、SU-14813、替拉替尼(telatinib)、KRN-951、ZK-CDK(也为CDK的抑制剂)、ABT-869、BMS-690514、RAF-265、IMC-KDR、IMC-18F1、IMiD(免疫调节药物)、沙立度胺衍生物CC-4047、来那度胺(lenalidomide)、ENMD 0995、IMC-D11、Ki23057、布里瓦尼(brivanib)、西地尼布(cediranib)、XL-999(也为cKit及Flt3的抑制剂)、1B3、CP 868596、IMC3G3、R-1530(也为Flt3的抑制剂)、舒尼替尼(也为cKit及Flt3的抑制剂)、阿西替尼(也为cKit的抑制剂)、来他替尼(也为Flt3及PKC的抑制剂)、瓦拉他尼(vatalanib)、坦度替尼(也为Flt3及cKit的抑制剂)、帕唑帕尼(pazopanib)、GW786034、PF-337210、IMC-1121B、AVE-0005、AG-13736、E-7080、CHIR258、甲苯磺酸索拉非尼(sorafenib tosylate)(也为Raf的抑制剂)、RAF-265(也为Raf的抑制剂)、凡德他尼(vandetanib)、CP-547632、OSI-930、AEE-788(也为EGFR及Her2的抑制剂)、BAY-57-9352(也为Raf的抑制剂)、BAY-73-4506(也为Raf的抑制剂)、XL 880(也为cMet的抑制剂)、XL-647(也为EGFR及EphB4的抑制剂)、XL 820(也为cKit的抑制剂)及尼洛替尼(也为cKit及brc-abl的抑制剂)。
其他治疗剂也可选自EGFR抑制剂，其可为小分子EGFR抑制剂或抗EGFR抗体。抗EGFR抗体的实例(但不限于)为西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)、马妥珠单抗(matuzumab)；小分子EGFR抑制剂的一个实例为吉非替尼(gefitinib)。EGFR调节剂的另一实例为EGF融合毒素。
尤其适用于与本发明的Dll4结合分子组合的EGFR及Her2抑制剂为拉帕替尼(lapatinib)、吉非替尼、厄洛替尼(erlotinib)、西妥昔单抗(cetuximab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、扎鲁木单抗(zalutumumab)、凡德他尼(也为VEGFR的抑制剂)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、XL-647、HKI-272、BMS-599626、ARRY-334543、AV 412、mAB-806、BMS-690514、JNJ-26483327、AEE-788(也为VEGFR的抑制剂)、ARRY-333786、IMC-11F8、Zemab。
宜在治疗中与本发明的Dll4结合分子组合的其他药物为替坦托西莫单抗(tositumumab tiuxetan)及替坦伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)(两种放射性标记的抗CD20抗体)、阿仑单抗(alemtuzumab)(一种抗CD52抗体)、地诺单抗(denosumab)(一种破骨细胞分化因子配位体抑制剂)、加利昔单抗(galiximab)(一种CD80拮抗剂)、奥法木单抗(ofatumumab)(一种CD20抑制剂)、扎木单抗(zanolimumab)(一种CD4拮抗剂)、SGN40(一种CD40配位体受体调节剂)、利妥昔单抗(rituximab)(一种CD20抑制剂)或马帕木单抗(mapatumumab)(一种TRAIL-1受体激动剂)。
可与本发明的Dll4结合分子组合使用的其他化学治疗药物选自但不限于激素、激素类似物及抗激素药(例如他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、雷诺昔芬(raloxifene)、氟维司群(fulvestrant)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、乙酸环丙孕酮(cyproterone acetate)、非那雄胺(finasteride)、乙酸布舍瑞林(buserelin acetate)、氟氢可的松(fludrocortisone)、氟***(fluoxymesterone)、甲羟孕酮(medroxyprogesterone)、奥曲肽(octreotide)、阿佐昔芬(arzoxifene)、帕西瑞肽(pasireotide)、伐普肽(vapreotide))；芳香酶抑制剂(例如阿那曲唑(anastrozole)、来曲唑(letrozole)、利阿唑(liarozole)、依西美坦(exemestane)、阿他美坦(atamestane)、福美坦(formestane))；LHRH激动剂及拮抗剂(例如乙酸性瑞林(goserelin acetate)、亮丙瑞林(leuprolide)、阿巴瑞克(abarelix)、西曲瑞克(cetrorelix)、地洛瑞林(deslorelin)、组氨瑞林(histrelin)、曲普瑞林(triptorelin))；抗代谢物(例如抗叶酸物(如甲胺喋呤(methotrexate)、培美曲塞(pemetrexed))、嘧啶类似物(如5-氟尿嘧啶、卡培他滨(capecitabine)、地西他滨(decitabine)、奈拉滨(nelarabine)、及吉西他滨(gemcitabine))、嘌呤及腺苷类似物(例如巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、克拉屈滨(cladribine)及喷司他汀(pentostatin)、阿糖胞苷(cytarabine)、氟达拉滨(fludarabine)))；抗肿瘤抗生素(例如蒽环霉素(anthracycline)(如多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)及伊达比星(idarubicin))、丝裂霉素-C(mitomycin-C)、博莱霉素(bleomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、普卡霉素(plicamycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、匹杉琼(pixantrone)、链佐星(streptozocin))；铂衍生物(例如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、卡铂(carboplatin)、洛铂(lobaplatin)、沙铂(satraplatin))；烷化剂(例如雌莫司汀(estramustine)、氮芥(meclorethamine)、美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、白消安(busulphan)、达卡巴嗪(dacarbazine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、羟基脲(hydroxyurea)、替莫唑胺(temozolomide)、亚硝基脲(nitrosourea)(例如卡莫司汀(carmustine)及洛莫司汀(lomustine))、塞替派(thiotepa))；抗有丝***剂(例如长春花生物碱类(vinca alkaloids)，如长春碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine)、长春瑞宾(vinorelbine)、长春氟宁(vinflunine)及长春新碱(vincristine)；及紫杉烷类(taxanes)，如紫杉醇(paclitaxel)、多西紫杉醇(docetaxel)及其调配物、拉诺他赛(larotaxel)、司莫紫杉醇(simotaxel)；及埃博霉素(epothilone)，如伊沙匹隆(ixabepilone)、帕土匹隆(patupilone)、ZK-EPO)；拓扑异构酶抑制剂(例如表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)(如依托泊苷(etoposide)及凡毕复(etopophos)、替尼泊苷(teniposide))、安吖啶(amsacrine)、拓朴替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan))及杂项化学治疗药物，例如氨磷汀(amifostine)、阿那格雷(anagrelide)、干扰素P、丙卡巴肼(procarbazine)、米托坦(mitotane)、及卟菲尔钠(porfimer)、贝沙罗汀(bexarotene)、塞来考昔(celecoxib)。
可根据感兴趣的具体疾病或病症而使用本身已知的任何适合的体外分析、基于细胞的分析、体内分析和/或动物模型或其任何组合来测试本发明的Dll4结合分子或含有所述分子的多肽以及包含本发明的双特异性结合分子的组合物的效能。适合的分析及动物模型将为本领域技术人员所了解且例如包括本文所述且用于以下实例中的分析，例如增殖分析。
如可例如从图10的ELISA数据了解，本发明实验中获得的数据证实本发明的Dll4结合分子具有优于现有技术的Dll4结合分子的性质，图10的ELISA数据表明亲和力成熟VHH以完全方式阻断hDLL4/hNotch1-Fc相互作用，并且显示了亲和力成熟VHH在hDLL4/hNotch1-Fc竞争ELISA中的IC50(nM)值、及纯化的亲和力成熟VHH对重组人DLL4及小鼠DLL4的亲和力KD(nM)。这表明对于与Dll4介导的血管生成作用相关的疾病及病症(例如癌症)，本发明的Dll4结合分子为具有治疗功效的有希望候选者。
根据本发明的另一实施方案，提供一种通过以下来诊断疾病的方法：
a)使样品与如上文定义的本发明的Dll4结合分子接触，及
b)检测该Dll4结合分子对该样品的结合，及
c)将步骤(b)中检测到的结合与标准物进行比较，其中相对于该样品的结合差异可诊断出与Dll4介导的血管生成作用相关的疾病或病症。
对于此用途及其它用途，例如通过引入作为特异性结合对(例如生物素-(链菌素)抗生物素蛋白结合对)的一部分的官能团来进一步修饰本发明的Dll4结合分子可为有用的。此类官能团可用于将本发明的Dll4结合分子与结合至该结合对另一半的另一蛋白、多肽或化合物进行连接，即通过形成结合对而连接。例如，本发明的Dll4结合分子可接合至生物素并连接至与抗生物素蛋白或链亲和素接合的另一蛋白、多肽、化合物或载体。例如，本发明的这些经接合的Dll4结合分子可用作例如可检测信号产生剂接合至抗生物素蛋白或链亲和素的诊断***中的报道基因。
附图说明
图1：人、恒河猴及短尾猴DLL4的氨基酸序列比对。
图2：人及小鼠DLL4缺失突变体(上标中为氨基酸域边界)。
图3：纯化的VHH阻断hDLL4/hNotch1-Fc相互作用(ELISA)。
图4：纯化的VHH阻断hDLL4/hNotch1-Fc相互作用(AlphaScreen)。
图5：纯化的VHH阻断CHO-hDLL4/hNotch1-Fc和CHOmDLL4/hNotch1-Fc相互作用(FMAT)。
图6：纯化的VHH阻断DLL4介导的Notch1裂解(报告基因)。
图7：纯化的VHH对重组人及小鼠DLL4的结合(ELISA)。
图8：纯化的VHH对重组人DLL1及人Jagged-1的结合(ELISA)。
图9：纯化的VHH对人/小鼠/短尾猴DLL4的结合(FACS)。
图10：亲和力成熟的VHH阻断hDLL4/hNotch1-Fc相互作用(ELISA)。
图11：亲和力成熟的VHH  阻断CHO-hDLL4/hNotch1-Fc和CHOmDLL4/hNotch1-Fc相互作用(FMAT)。
图12：纯化的VHH对人/小鼠DLL4的结合(ELISA)。
图13：纯化的亲和力成熟的VHH对重组人DLL1及人Jagged-1的结合(ELISA)。
图14：纯化的VHH对人/小鼠/短尾猴DLL4的结合(FACS)。
图15：VHH对Dll4介导的HUVEC增殖抑制效应的评估。
材料和方法
a)过度表达人、小鼠及短尾猴Dll4的CHO及HEK293细胞株的产生
使用按照相应序列(参见表1；SEQ ID NO:421至426)的5'及3'UTR设计的寡核苷酸分别从人成人正常组织心脏cDNA文库(BioChain,Hayward,CA,USA)及小鼠心脏组织cDNA文库(分离自C57/Bl6株)扩增编码人(SEQ IDNO:417；NM_019074.2)及小鼠Dll4(NM_019454.3)的cDNA。将扩增子克隆入哺乳动物表达载体pCDNA3.1(+)-neo(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中。表1：用于扩增DLL4基因全长直系同源物(orthologue)的寡核苷酸序列。
使用根据亲缘关系接近的物种恒河猴的Dll4编码序列(猕猴(Macacamulatta)Dll4，SEQ ID NO:418；XM_001099250.1)的5'及3'UTR设计的引物，从短尾猴正常组织心脏cDNA文库(BioChain,Hayward,CA,USA)扩增短尾猴Dll4cDNA(参见表1)。最终将扩增子克隆于哺乳动物表达载体pCDNA3.1(+)-neo(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中。显示短尾猴Dll4的氨基酸序列与恒河猴100%一致且与人99%一致(参见图1；与人序列的差异用粗体加下划线标示)。
为了产生过度表达人Dll4、小鼠Dll4或短尾猴Dll4的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，分别用pCDNA3.1(+)-neo-hDll4、pcDNA3.1(+)-neo-mDll4或pcDNA3.1(+)-neo-cDll4对亲本CHO细胞进行电穿孔。过度表达人Dll4及小鼠Dll4的人胚肾(HEK293)细胞是通过分别使用pCDNA3.1(+)-neo-hDll4质粒或pCDNA3.1(+)-neo-mDll4质粒的Fugene(Roche)于HEK293亲本细胞株中进行脂质介导的转染而产生的。对于所有条件，转染子均通过添加1mg/mL遗传霉素(geneticin)(Invitrogen,Carlsbad CA,USA)来选择。
b)单克隆抗Dll4IgG及Fab片段的产生
在US 2008/0014196(Genentech)中，公开了人/小鼠交叉反应性Dll4mAb，其由Ridgway等人(2006)使用以显示大量异种移植模型中VEGF mAb及Dll4mAb对肿瘤生长的累加效应。将该抗Dll4mAb及其相应的Fab纯化，以在生物化学/细胞分析及异种移植模型中针对噬菌体选择期间的特异性洗脱来评估该抗体(片段)性质。将所公开的Dll4mAb的可变重链及轻链序列克隆入hIgG2aκ骨架中，在HEK293细胞中短暂表达且使用蛋白A色谱法自上清液纯化。纯化Dll4mAb在ELISA及FACS (使用CHO-mDll4及CHO-hDll4细胞)中显示对人Dll4及小鼠Dll4的结合，在Biacore中显示对两种生长因子直系同源物(orthologue)的低于纳摩尔的亲和力。
通过基于回译(back-translation)及使用Leto's基因最佳化软件(www.entechelon.com)针对大肠杆菌中的表达的密码子最佳化的基因组装来构筑相应的Dll4Fab片段。设计用于组装可变轻链(VL)、可变重链(VH)、恒定轻链(CL)及重链(CH1)的恒定区1的寡核苷酸引物，并进行组装PCR。分别使用限制位点SfiI、AscI及限制位点KpnI、NotI，将编码VL+CL及VH+CH1的cDNA区段克隆入源自pUC119的载体中，该载体含有LacZ启动子、卡那霉素抗性基因、多克隆位点及杂交gIII-pelB前导序列。在Fab编码序列的框架内，表达载体编码C-末端HA及His6标签。Fab片段在大肠杆菌中表达为标记His6的蛋白，且随后通过固定化金属亲和力色谱法(IMAC)及尺寸排阻色谱法(SEC)从培养基纯化。描述了可变重链及可变轻链的相关氨基酸序列(分别为US 2008/0014196的SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2)；完全重链及轻链的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO:419及420中。
c)用于表位定位的Dll4突变体的产生
为了鉴别包含可由抗Dll4VHH识别的表位的区域的Dll4的细胞外域(ECD)，产生了Dll4ECD的渐进缺失突变体。使用标准重组DNA技术产生包含CMV启动子的哺乳动物表达载体pSecTag2/Hygro(Invitrogen，Carlsbad,CA,USA)，该启动子位于编码融合至聚His标签的Dll4ECD的一系列巢式缺失片段的聚核苷酸上游(参见图2；上标为氨基酸域边界)。使用Freestyle 293表达***(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)(可从其中收集条件培养基)在经短暂转染的HEK293细胞中表达这些重组蛋白，并通过IMAC纯化。只有缺乏EGF2样域的Dll4突变体才显示对上述人化人/小鼠交叉反应性抗Dll4mAb (通过捕获型抗人IgG涂布的Biacore传感器芯片来固定)的减弱结合。已知该IgG在该Dll4域中具有特异性结合表位(专利申请案Genentech，US2008/0014196A1)。
d)Dll4报告分析质粒的产生
基本上如Struhl及Adachi,Cell.1998年5月15；93(4):649-60所述，基于γ分泌酶介导的Notch1裂解以及Dll4刺激后Notch1细胞内域(NICD)的核转位来开发报告分析(reporter assay)。将Gal4/VP 16编码序列***NICD编码序列中。有效杂交转录活化因子GAL4-VP16***Notch1跨膜域的羧基末端，该因子由融合至单纯疱疹病毒转录活化域VP16的酵母GAL4DNA结合片段组成。γ分泌酶将该构建体裂解，导致Gal4/VP16NICD融合蛋白的释放，其将该蛋白转位至核，在核中该融合蛋白将结合至(并以转录方式激活)含有强力GAL4-UAS启动子序列的共转染的荧光素酶报告质粒(Struhl,G.及Adachi,A.,Cell,第93卷,649-660,1998)。将人Notch1-Gal4/VP 16表达盒(expressioncassette)克隆于pcDNA3.1(+)-neo(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中。将pGL4.31[Luc2P/Gal4UAS/Hygro]载体(Promega,Madison,WI,USA)用作荧光素酶报告质粒。
实施例1
使用来自不同物种的Dll4免疫来诱导美洲驼(llama)中的体液免疫反应
1.1.免疫化
在经兽医学学院的伦理委员会(the Ethical Committee of the faculty ofVeterinary Medicine，University Ghent,Belgium)批准之后，通过6次肌内注射(以每周一次的间隔，每次给药100或50μg)重组人Dll4(R&D Systems,Minneapolis,MN,US)来使4只美洲驼(命名为第208、209、230、231号)免疫化。用Stimune(Cedi Diagnostics BV，Lelystad,The Netherlands)调配Dll4抗原。根据标准方案，通过4次交替皮下注射如上所述产生的过度表达人Dll4的CHO细胞及过度表达小鼠Dll4的CHO细胞来使另外三只美洲驼(命名为第127b、260、261号)免疫化。将细胞再混悬于DPBS中且在注射之前保存在冰上。此外，根据标准方案，通过4次交替肌内注射(以两周一次的间隔，每次给药100或50μg)重组人Dll4及小鼠Dll4(R&D Systems,Minneapolis,MN,US)来使另外三只美洲驼(命名为第282、283、284号)免疫化。第0天含有人Dll4的首次注射液是用弗氏完全佐剂(Complete Freund's Adjuvant，Difco,Detroit,MI,USA)调配的，而随后含有人及小鼠Dll4的注射液是用弗氏不完全佐剂(Incomplete Freun d's Adjuvant，Difco,Detroit,MI,USA)调配的。
1.2.美洲驼中诱导免疫反应的评估
为了通过ELISA评估动物中对抗人Dll4的免疫反应的诱导，在第0天(免疫前)、第21天及第43天(收集外周血液淋巴细胞[PBL]的时间)从美洲驼208、209、230及231收集血清；在第0天及第51天从美洲驼127b、260及261收集血清；且在第0天、第28天及第50天从美洲驼282、283及284收集血清。简言之，2μg/mL重组人Dll4或小鼠Dll4(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)在4℃于96孔MaxiSorp培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中固定过夜。用酪蛋白溶液(1%)阻断各孔。在添加血清稀释液之后，使用辣根过氧化酶(HRP)接合的羊抗美洲驼免疫球蛋白(Bethyl Laboratories Inc.,Montgomery,TX,USA)且接着使用底物TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)(Pierce,Rockford,IL,USA)存在下的酶促反应来检测经特异性结合的免疫球蛋白，从而显示诱导对抗Dll4的显著抗体依赖性免疫反应。抗体反应是由表达常规抗体的B细胞谱系及表达仅有重链的抗体的B细胞谱系来发动，因为经特异性结合的免疫球蛋白可用特异性识别常规美洲驼IgG1抗体或仅有重链的美洲驼IgG2或IgG3抗体的抗体来检测(表2-A)。在所有注射小鼠Dll4的美洲驼中，抗体反应由表达常规抗体及仅有重链的抗体的、特异性针对小鼠Dll4的B细胞发动。另外，经细胞免疫的动物的血清效价是通过对过度表达人及小鼠Dll4的HEK293细胞进行FACS分析来确认的(表2-B)。各美洲驼的Dll4血清效价反应见于表2中。
表2：抗体介导的对抗DLL4的特异性血清反应
A)ELISA(重组蛋白，涂布于固相上)
Figure BDA00001721901500371
ND：未测定
B)FACS(HEK293细胞上的天然表达蛋白)
Figure BDA00001721901500381
ND：未测定
实施例2
仅有重链的抗体片段谱系的克隆及噬菌体的制备
在末次免疫原注射之后，从免疫化美洲驼收集作为产生重链抗体的B细胞的来源的免疫组织。通常，收集每只动物在末次抗原注射后4天及8天收集的两个150ml血液样品，及在末次抗原注射之后4天收集的一个***活组织检查。根据制造商说明书(Amersham Biosciences,Piscataway，NJ,USA)，使用聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)由血液样品制备外周血液单核细胞(PBMC)。如WO 05/044858中所述，从PBMC及***活组织检查提取总RNA，其用作扩增编码VHH的DNA区段的RT-PCR的起始物质。对于各免疫化美洲驼，通过汇集从该动物收集的所有免疫组织分离的总RNA来构筑文库。简言之，经PCR扩增的VHH谱系通过特定限制位点克隆入经设计以便于噬菌体展示VHH文库的载体中。该载体源自pUC119且含有LacZ启动子、M13噬菌体gIII蛋白编码序列、氨苄西林或羧苄西林抗性基因、多克隆位点及杂交gIII-pelB前导序列(pAX050)。载体编码与VHH编码序列同框的C-末端c-myc标签及His6标签。根据标准方案制备噬菌体，且在过滤灭菌后储存在4℃以供进一步使用。
实施例3
通过噬菌体展示进行Dll4特异性VHH的选择
将从所有美洲驼获得且克隆为噬菌体文库的VHH谱系用于应用许多选择条件的不同选择策略中。变量包括：i)Dll4蛋白形式(人Dll4(Met1-Pro524)及小鼠Dll4(Met1-Pro525)的C末端标记His的重组表达细胞外域(R&DSystems,Minneapolis,MN,USA)、或存在于过度表达Dll4的CHO或HEK293细胞上的全长人Dll4及小鼠Dll4)，ii)抗原呈现方法(直接涂布Dll4的培养板或通过生物素标签涂布Dll4的中性链亲和素(Neutravidin)培养板；溶液相：在溶液中培养，随后在中性链亲和素涂布培养板上捕获)，iii)抗原浓度及iv)不同洗脱方法(通过胰蛋白酶的非特异性方法或通过同源受体Notch1/Fc嵌合体或抗Dll4IgG/Fab的特异性方法)。所有选择均在Maxisorp 96孔培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中进行。
如下进行选择：如上所述以多个浓度呈现用于固相及溶液相选择形式的Dll4抗原制备物。在与噬菌体文库一起培养2h、随后充分洗涤之后，用胰蛋白酶(1mg/mL)洗脱结合噬菌体30分钟。若胰蛋白酶用于噬菌体洗脱，则施用0.8mM蛋白酶抑制剂ABSF立刻中和蛋白酶活性。平行进行无抗原选择作为对照。将显示超过背景值(无抗原对照)的富集的噬菌体输出(phage output)用于感染大肠杆菌。经感染的大肠杆菌细胞用于制备下一轮选择的噬菌体(噬菌体补救)或接种于琼脂培养板(LB+amp+葡萄糖2%)上用于分析单个的VHH纯系。为了筛选特异性结合物的选择输出，从琼脂培养板挑取单一群落且在1mL 96深孔培养板中培养。通过在葡萄糖存在下添加IPTG(终浓度为0.1-1mM)来诱导受LacZ控制的VHH表达。根据标准方案制备周质(periplasmic)提取物(体积约80μL)。
实施例4
Dll4-Notch1AlphaScreen及FMAT竞争分析中周质提取物的筛选
在人Dll4/人Notch1AlphaScreen分析中筛选周质提取物以评估被表达的VHH的阻断能力。使用生物素(Sigma,St Louis,MO,USA)及生物素氨基己酸3-硫代-N-羟基琥珀酰亚胺酯钠盐(Sigma,St Louis,MO,USA)对人Dll4进行生物素化。根据制造商说明书(Perkin Elmer,Waltham,MA,US)，使用偶联至受体微珠的抗Fc VHH来捕获Notch1/Fc嵌合体(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)。
为了评估VHH的中和能力，使周质提取物的系列稀释液与生物素化的人Dll4一起预培养。将受体微珠及链亲和素(streptavidin)供体微珠添加至该混合物中并进一步在室温培养1小时。通过使用680nm的激发波长及520nm的发射波长在Envision多标记培养板读取器(Perkin Elmer,Waltham,MA,USA)上读取培养板来测量荧光。荧光信号减少表明生物素化的人Dll4对人Notch1/Fc受体的结合是由表达于周质提取物中的VHH阻断的。
或者，在人Notch1/Fc FMAT(荧光微容量分析技术)竞争分析中使用CHO-hDll4及CHO-mDll4细胞。用Alexa-647(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)随机标记重组的人Notch1/Fc嵌合体(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)。简言之，将5μL周质物质连同7,500个分别过度表达CHOhDll4或CHO-mDll4的细胞一起添加至100pM或175pM经标记的人Notch1/Fc中，且在培养2小时后进行读数。为了设定无竞争基线，用人Notch1/Fc~Alexa647至少30次重复测定细胞且由该基线计算抑制百分比。所有计算均基于FL1总信号，该信号包含每孔荧光的平均值乘以每孔计数数目。
从该筛选来选择抑制性VHH且测序。序列分析探明了属于40个不同B细胞系的167个独特的VHH。各B细胞系发现的变异体的总数见于表3中。周质筛选数据的概述在表4中给出。所得全部独特的VHH的氨基酸序列显示于序列表(SEQ ID NO:167至332及459)及表5(指示了CDR及框架区)中。
表3：用于鉴别DLL4特异性VHH B细胞系的选择参数。
Figure BDA00001721901500411
Figure BDA00001721901500421
Figure BDA00001721901500431
表4：含有表达的抗DLL4VHH的周质提取物的筛检
Figure BDA00001721901500432
Figure BDA00001721901500441
(a)若鉴别了B细胞系内的多个独特变异体，则在括号内以斜体字给出细胞系成员的解离速率范围(最大值-最小值)或解离速率。
(b)异质拟合(heterogeneous fit)：测出的快速及缓慢解离速率。
Figure BDA00001721901500451
Figure BDA00001721901500461
Figure BDA00001721901500471
Figure BDA00001721901500481
Figure BDA00001721901500491
Figure BDA00001721901500501
Figure BDA00001721901500511
Figure BDA00001721901500521
Figure BDA00001721901500541
Figure BDA00001721901500551
Figure BDA00001721901500561
实施例5
纯化的抗Dll4VHH的表征
对选自实施例4中所述筛选的抑制性抗Dll4VHH进行进一步纯化且加以表征。所选VHH在大肠杆菌TG1中表达为标记c-myc、His6的蛋白。通过添加1mM IPTG来诱导表达且使其在37℃继续4小时。在旋转细胞培养物之后，通过冻融片状沉淀物来制备周质提取物。这些提取物用作起始物质且通过IMAC及尺寸排阻色谱法(SEC)纯化VHH，经SDS-PAGE评估得到95%的纯度。
5.1.ELISA中阻断Dll4的VHH的评估
在人Dll4-人Notch1/Fc阻断ELISA中评估VHH的阻断能力。简言之，将1μg/mL人Notch1/Fc嵌合体(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)涂布于96孔MaxiSorp培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中。使15nM固定浓度的生物素化的人Dll4与VHH的系列稀释液一起预培养1小时，此后将该混合物在被涂布的Notch1受体上再培养1小时。使用辣根过氧化酶(HRP)接合的extravidin(Sigma,St.Louis,MO,USA)检测生物素化的人Dll4的残余结合(图3)。如上所述对人Dll4进行生物素化。阻断人Dll4-人Notch1/Fc相互作用的VHH的IC50值见于表6中。
表6：hDLL4/hNotch1-Fc竞争ELISA中VHH的IC50(nM)值
  VHH ID   IC50(nM)
  6B11   1.5
  55D12   12.3
  56A09   4.9
  56C04   33.9
  56H08   6.9
  57C11   17.3
  62C11   72.0
  96C03   38.4
  101G08   9.5
  104G01   1.1
  115A05   9.1
  抗DLL4Fab   0.7
5.2.AlphaScreen中阻断Dll4的VHH的评估
简言之，在链亲和素涂布的供体微珠(20μg/mL)上捕获1nM生物素化的人Dll4，而在抗人Fc VHH涂布的受体微珠(20μg/mL)上捕获0.4nM的受体人Notch1(呈Fc融合蛋白形式)。两种负载微珠均与一定稀释度范围的竞争VHH一起培养(图4)。阻断人Dll4-人Notch1/Fc相互作用的VHH的IC50值见于表7中。
表7：hDLL4/hNotch1竞争AlphaScreen中VHH的IC50(nM)值
  VHH ID   IC50(nM)
  5B11   0.7
  6B11   0.3
  7A02   0.4
  7B05   1.1
  8A09   0.4
  8C11   0.7(a)
  19F04   0.05(a)
  55D12   2.3
  56A09   1.2
  56C04   5.4
  56H08   1.6
  57C11   2.2
  62C11   24.1
  115A05   5.0
  抗DLL4Fab   0.3
(a)部分抑制剂
5.3.抗Dll4VHH对人Notch1/Fc与表达在CHO细胞上的人或小鼠Dll4的结合的抑制
在如实施例4中概述的人及小鼠Dll4-人Notch1/Fc竞争性FMAT分析(图5)中来评估VHH的阻断能力。阻断人Notch1/Fc与表达在CHO细胞上的人或小鼠Dll4的相互作用的VHH的IC50值见于表8中。
表8：阻断人Notch1/Fc与在CHO细胞上表达的人或小鼠DLL4的相互作用的纯化的VHH的(平均)IC50值(nM)(FMAT)
  hDLL4   mDLL4
  VHH ID   IC50(nM)   IC50(nM)
  6B11   8.9   -
  8A09   5.5   -
  19F04   33.0   -
  55D12   39.1   41.0
  56A09   10.6   15.0
  56C04   28.7   49.6
  56H08   22.0   33.7
  57C11   53.9   49.5
  62C11   172.2   106.3
  96C03   160.8   28.8
  101G08   24.6   92.1
  104G01   2.5   -
  115A05   22.0   43.0
  抗DLL4Fab   5.4   2.3
5.4.报告分析中阻断Dll4的VHH的评估
为了评估所选VHH的效能，建立基于Notch1的γ分泌酶介导的裂解及Dll4刺激后Notch1细胞内域(NICD)的释放的报告分析。将Notch1-GAL4/VP16构建体与pGL4.31[Luc2P/Gal4UAS/Hygro]报告质粒一起共转染于HEK细胞中，使融合蛋白短暂表达。通过与HEK293-hDll4稳定细胞株共培养来刺激这些经短暂转染细胞24小时。转染后48小时进行读数。VHH在开始共培养之前与HEK293-hDll4细胞一起预培养1小时且包括在共培养期间内(图6)。阻断Notch1的Dll4介导的裂解且随后阻断其NICD转位至受体细胞核的VHH的IC50值见于表9中。
表9：DLL4/Notch1报告分析中纯化的VHH的(平均)IC50值(nM)
  VHH ID   IC50
  56A09   540
  62C11   4663
  96C03   5156
  101G08   2760
  104G01   964
  115A05   1740
  抗DLL4Fab   133
5.5.表位重新分级(epitope binning)
在例如基准抗体经结合时为了确定VHH是否可同时结合Dll4，通过Biacore T100仪器上的表面等离子共振(SPR)进行表位重新分级实验。抗-Dll4Fab片段以不可逆方式固定在CM5传感器芯片的参考及活性流量槽上。对于各样品(循环)，将人Dll4注射在活性及参考流量槽上且由抗Dll4Fab以可逆方式捕获。通过注射在固定表面上评估另外的VHH结合。所有VHH及抗Dll4Fab均以100nM注射，表面接触时间为120秒，且流速为10微升/分钟。使用10mM甘氨酸(pH 1.5)使表面再生。用Biacore T100评估软件来评估经处理的曲线。表10-A表示所分析VHH及对照的依序注射/再生的途径。显示VHH DLLBII56A09(SEQ ID NO:300)、DLLBII96C03(SEQ ID NO:326)、DLLBII101G08(SEQ ID NO:197)及DLLBII115A05(SEQ ID NO:224)不另外地与由Dll4Fab捕获到的人Dll4结合。Dll4Fab的注射也未能另外地结合人Dll4，表明所有表位均已饱和。因此，可断定这些VHH识别了与用于结合人Dll4的Dll4Fab重叠的表位。人所独有的VHH DLLBII6B11(SEQ ID NO:174)及DLLBII104G01(SEQ ID NO:215)显示对捕获Dll4Fab的人Dll4的额外结合，表明对人Dll4具有特异性的这些VHH识别了与人/小鼠交叉反应性VHH不同的表位。
表10-A：抗DLL4VHH的表位重新分级-同时以DLL4Fab进行结合
  注射步骤   结合/再生   [样品]   结合水平(RU)
  1   hDLL4   100nM   1727
  2   DLL4Fab   100nM   无结合
  3   59A9   100nM   无结合
  4   6B11   100nM   405
  5   甘氨酸pH1.5   10mM   90
  6   hDLL4   100nM   1349
  7   104G1   100nM   276
  8   甘氨酸pH1.5   10mM   87
  9   hDLL4   100nM   1336
  10   甘氨酸pH1.5   10mM   70
  11   hDLL4   100nM   1333
  12   96C3   100nM   无结合
  13   101G8   100nM   无结合
  14   115A05   100nM   无结合
  15   甘氨酸pH1.5   10mM   70
5.6.使用Dll4缺失突变体的表位定位
在Biacore中评估VHH对这些Dll4突变体的结合。简言之，将VHHDLLBII101G08(SEQ ID NO:197)及DLLBII115A5SEQ ID NO:224)涂布于CM4传感器芯片上且横跨芯片注射200nM的各缺失突变体。对结合进行定性评估。未观测到DLLBII56A09(SEQ ID NO:300)、DLLBII101G08(SEQ IDNO:197)及DLLBII115A05(SEQ ID NO:224)分别对缺乏EGF样2域的人及小鼠Dll4突变体hDll4.1及mDll4.8的结合(表10-B)。使用hDll4/Dll4IgG竞争性ELISA的间接证据已指出了该观测结果。简言之，将1μg/mL Dll4IgG涂布于96孔MaxiSorp培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中。使固定浓度6nM的生物素化的人Dll4与VHH的系列稀释液一起预培养1小时，此后将该混合物在经涂布的IgG上再培养1小时。使用辣根过氧化酶接合的extravidin(Sigma,St.Louis,MO,USA)检测生物素化的人Dll4的残余结合(数据未显示)。如上所述对人Dll4进行生物素化。从专利文献得知单克隆抗Dll4IgG(Genentech,US 2008/0014196A1)与Dll4的EGF样2域内的表位相结合。
表10-B：抗DLL4VHH的表位定位-结合DLL4缺失突变体
Figure BDA00001721901500621
5.7.测定hDll4-VHH相互作用的亲和力
测定Dll4-VHH相互作用的亲和力的动力学分析系通过Biacore T100仪器上的表面等离子共振(SPR)来进行。使用EDC及NHS通过胺偶联将重组人Dll4固定在CM5芯片上或在SA芯片(链亲和素表面)上捕获生物素化的人Dll4。将纯化的VHH或Fab片段在不同浓度(介于10与300nM之间)下注射2分钟且使其在45μl/分钟的流速下解离20分钟。在样品注射之间，用10mM甘氨酸(pH 1.5)及100mM HCl使表面再生。将HBS-N(Hepes缓冲液，pH 7.4)用作操作缓冲液。若有可能，则通过将1∶1相互作用模型(朗缪尔(Langmuir)结合)拟合在结合曲线上来评估数据。亲和力常数KD由所得缔合及解离速率常数(ka)及(kd)来计算。抗Dll4VHH的亲和力见于表11中。
表11：纯化VHH对重组人DLL4的亲和力KD(nM)
Figure BDA00001721901500622
(a)导致非1:1拟合的异质结合曲线
5.8.与直系同源物(mDll4，cDll4)及家族成员(hJagged-1，hDLL1)结合
为了测定对小鼠Dll4的交叉反应性，进行结合ELISA。简言之，重组小鼠Dll4(R&D Systems,Minneapolis,MS,USA)在4℃以1μg/mL于96孔MaxiSorp培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中涂布过夜。用酪蛋白溶液(1%的PBS溶液)阻断各孔。以系列稀释液形式施用VHH，并使用小鼠抗myc(Roche)及抗小鼠AP接合物(Sigma,St Louis,MO,USA)来检测结合(图7)。测量对人Dll4的结合作为参考。EC50值概述于表12中。
表12：重组人DLL4及小鼠DLL4结合ELISA中VHH的EC50(nM)值
  rhDLL4   rmDLL4
  VHH ID   EC50(nM)   EC50(nM)
  5B11   1.8   -
  6B11   1.4   -
  7A02   1.4   -
  7B05   7.2   -
  8A09   0.9   -
  8C11   1.1   -
  17F10   0.9   -
  19F04   0.9   0.8
  55D12   13.1   30.0
  56A09   3.6   6.3
  56C04   44.3   244.0
  56H08   4.1   8.7
  57C11   7.9   83.4
  62C11   137.0   13.1
  96C03   86.5   8.7
  101G08   8.9   53.9
  104G01   8.4   -
  115A05   5.0   33.4
  抗DLL4Fab   3.0   3.0
为了确定VHH的短尾猴交叉反应性，进行FACS结合实验。将表达短尾猴Dll4的HEK293细胞(短暂或稳定转染)用于VHH的滴定结合实验。在冰上培养30分钟后，洗涤所有样品且通过施用抗c-myc~Alexa647(Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz,CA,USA)来进行检测。过度表达人及小鼠Dll4的HEK293细胞作为参考。在FACS数组(FACS Array)上测定平均MCF值且用于计算EC50值(参见图9)。
通过固相结合分析(ELISA)评估对同源配位体人DLL1及人Jagged-1结合的缺失。简言之，人DLL1(Alexis,San Diego,CA,USA)及人Jagged-1(Alexis,San Diego,CA,USA)在4℃以1μg/mL于96孔MaxiSorp培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中涂布过夜。用酪蛋白溶液(1%的PBS溶液)阻断各孔。以系列稀释液形式施用VHH，并使用小鼠抗myc(Roche)及抗小鼠AP接合物(Sigma,St.Louis,MO,USA)来检测结合。所有抗Dll4VHH均视为对这些同源配位体无交叉反应性(图8)。
5.9.VHH阻断Dll4介导的HUVEC增殖的评估
在如Ridgway等人,Nature.2006年12月21日；444(7122):1083-7所述的增殖分析(以经修饰的形式)中评估所选VHH的效能。简言之，96孔组织培养板经涂布缓冲液(PBS，0.1%BSA)中的纯化Dll4-His(RnD Systems；C-末端标记His的人Dll4，氨基酸27-524，0.75毫升/孔，10ng/ml)涂布。用PBS洗涤各孔，随后一式四份每孔接种4000个HUVEC细胞。在第4天通过引入[3H]-胸苷来测量细胞增殖。图15中所示的结果说明DLL4VHHDLLBII101G08、DLLBII104G01、DLLBII115A05、DLLBII56A09及DLL4Fab以剂量依赖性方式抑制对HUVEC增殖的DLL4依赖性效应，IC50值概述于表13中。所测试VHH在10μM下完全抑制DLL4依赖性效应。
表13：DLL4增殖分析中获得的IC50值
  VHH/Fab   Fab   56A9   104G1   101G8   115A5
  IC50(nM)(实验1)   4.9   11.0   103   401   10002
  IC50(nM)(实验2)   5.6   6.8   32   112   N.D.
  n   2   2   2   2   1
实施例6
所选VHH的亲和力成熟
使VHH DLLBII101G08及DLLBII115A05经受两个循环的亲和力成熟。
在第一循环中，使用易错PCR方法在骨架(FW)及互补决定区(CDR)两者中随机引入氨基酸取代。用两轮基于PCR的方法(从Stratagene,La Jolla,CA,USA获得的Genemorph II随机诱变试剂盒)来进行诱变，该方法使用1ngDLLBII101G08或DLLBII115A05cDNA模板，随后使用0.1ng的第1轮产物进行第二次易错PCR。在精制步骤之后，将PCR产物通过独特限制位点***经设计以便于噬菌体展示VHH文库的载体中。使用递减浓度的生物素化重组人DLL4(biot-rhDLL4)及胰蛋白酶洗脱来进行连续多轮的溶液中选择(in-solution selection)。也在第三轮中使用冷rhDLL4(至少比biot-rhDLL4过量100倍)进行亲和力驱动选择(affinity-driven selection)。关于鼠类DLL4的选择不包括在内，因为交叉反应性(的保留)是在筛选水平上加以评估的。使用源自pUC119的表达载体产生呈重组蛋白形式的单个的突变体，该表达载体含有LacZ启动子、氨苄西林抗性基因、多克隆位点及ompA前导序列(pAX50)。大肠杆菌TG1细胞经表达载体文库转化且涂布于琼脂培养板(LB+Amp+2%葡萄糖)上。从琼脂培养板挑取单一群落且在1mL 96深孔培养板中培养。通过添加IPTG(1mM)来诱导VHH表达。根据标准方法制备周质提取物(体积约80μL)且在ProteOn(BioRad,Hercules,CA,USA)解离速率分析中针对与重组人及小鼠Dll4的结合加以筛选。简言之，GLC ProteOn传感器芯片在“配位体通道”L2及L4(L1/L3作为参考通道)上由重组人Dll4涂布，而“配位体通道”L3及L6由小鼠Dll4涂布。将亲和力成熟纯系的周质提取物稀释10倍且横跨“分析物通道”A1-A6加以注射。计算存在于培养板中的野生型纯系的平均解离速率且作为计算解离速率增加的参考。
在第二循环中，通过同时将第一循环中鉴别的敏感位置随机化来产生组合文库。为此，使用在随机化位置处经简并的寡核苷酸(NNS)，通过重叠PCR来合成全长DLLBII101G8或DLLBII115A05cDNA且进行补救PCR。用于产生组合文库的引物列举于表14及SEQ ID NO:427至457中。如上(实施例2)所述，使用特定限制位点将随机化的VHH基因***噬菌体展示载体(pAX50)中。如先前所述制备单个的VHH纯系的周质提取物。
表14：寡核苷酸亲和力成熟文库
ProteOn解离速率分析中针对与重组人Dll4的结合进行的筛选鉴别出了解离速率增加多达38倍的纯系(DLLBII101G08)及多达11倍的纯系(DLLBII115A05)(表15)。
表15：DLLBII101G08及DLLBII115A05亲和力成熟纯系的解离速率筛选
在C-末端c-myc标签及(His)6标签的框架内，将最佳的顶端(top)DLLBII101G08变异体及DLLBII115A05变异体克隆入表达载体pAX100中。重组小鼠Dll4的解离速率也得以增加。VHH是以标记His6的蛋白形式在大肠杆菌中产生，且通过IMAC及SEC来纯化。序列分别见于表16-A(DLLBII101G08)及表16-B(DLLBII115A05)中。
Figure BDA00001721901500691
Figure BDA00001721901500701
Figure BDA00001721901500711
实施例7
亲和力成熟的纯化VHH的表征
如上(实施例6)所述，表达并纯化VHH DLLBII101G08及DLLBII115A05的亲和力成熟变异体。在以下中对VHH进行表征：rhDLL1/rhJAG1结合ELISA及hDll4/mDll4/短尾猴Dll4FACS(实施例5.8；表20；图12及13)、rhDll4-rhNotch1竞争ELISA(实施例5.1；表17；图10)、竞争rhNotch1-CHO-hDll4FMAT(实施例5.3；表18；图11)。
表征数据概述于表21中。总之，亲和力成熟VHH显示亲和力及效能的明确增加，同时维持其对mDll4及短尾猴Dll4的结合且未观测到对hDLL1或hJAG1的结合。
表17：hDLL4/hNotch1-Fc竞争ELISA中亲和力成熟VHH的IC50(nM)值
  VHH ID   IC50(nM)
  101G08   10.0
  129A03   1.8
  129B05   0.9
  129D08   1.2
  129E11   1.3
  129H07   1.0
  130B03   1.5
  130F06   1.3
  抗DLL4Fab   1.5
  VHH ID   IC50(nM)
  115A05   7.5
  133A05   2.1
  133A09   1.5
  133G05   2.0
  134D10   1.3
  136C07   1.4
  015   0.9
  抗DLL4Fab   1.2
表18：阻断人Notch1/Fc与表达在CHO细胞上的人或小鼠DLL4的相互作用的纯化的亲和力成熟VHH的IC50值
  hDLL4   mDLL4
  VHH ID   IC50(nM)   IC50(nM)
  101G08   69.3   140.5
  129B05   7.4   14.4
  129D08   7.8   11.0
  129E11   8.1   12.3
  抗DLL4Fab   5.5   3.0
  hDLL4   mDLL4
  VHH ID   IC50(nM)   IC50(nM)
  115A05   106.7   348.9
  133A09   6.6   18.6
  133G05   5.9   12.0
  136C07   8.0   31.2
  015   5.7   21.2
  抗DLL4Fab   3.4   1.6
表19：纯化的亲和力成熟VHH对重组人DLL4及小鼠DLL4的亲和力KD(nM)
Figure BDA00001721901500731
表20：结合CHO-hDLL4、CHO-mDLL4及CHO-cDLL4的亲和力成熟VHH的EC50(nM)值
  hDLL4   mDLL4   cDLL4
  VHH ID   EC50(nM)   EC50(nM)   EC50(nM)
  101G08(wt)   17.5   11.2
  129B05   9.7   3.9   3.9
  129D08   9.6   3.7   3.8
  129E11   1.4   4.1   4.2
  抗DLL4Fab   5.6   2.1   2.5
  hDLL4   mDLL4   cDLL4
  VHH ID   EC50(nM)   EC50(nM)   EC50(nM)
  115A05(wt)   11.3   13.8
  133A09   7.2   1.7   2.3
  133G05   8.5   2.8   2.7
  136C07   10.9   8.3   3.5
  015   14.8   7.0   5.1
  抗DLL4Fab   5.6   2.1   2.5
表21：源自DLLBII101G08及DLLBII115A05的亲和力成熟VHH的特征
Figure BDA00001721901500752
nb：无结合
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Claims (27)

1.一种Dll4结合分子，其包含至少一个具有四个框架区和三个分别为CDR1、CDR2及CDR3的互补决定区的可变域，其中CDR3具有选自如下所示氨基酸序列的氨基酸序列：
a.SEQ ID NO:1至166及458，
b.SEQ ID NO:333至353，或
c.SEQ ID NO:375至395。
2.权利要求1的Dll4结合分子，其为分离的免疫球蛋白单一可变域，或其为含有一个或多个所述免疫球蛋白单一可变域的多肽，其中所述免疫球蛋白单一可变域由四个框架区和三个分别为CDR1、CDR2及CDR3的互补决定区组成，且其中CDR3具有选自如下所示氨基酸序列的氨基酸序列：
a.SEQ ID NO:1至166及458，
b.SEQ ID NO:333至353，或
c.SEQ ID NO:375至395。
3.权利要求2的Dll4结合分子，其中所述一个或多个免疫球蛋白单一可变域含有：
a.CDR3，其具有选自SEQ ID NO:1至166中所示的第一组氨基酸序列的氨基酸序列；
b.CDR1和CDR2，其具有如表5中所示的作为部分序列形式包含于选自SEQ ID NO:167至332及459中所示的第二组氨基酸序列的序列中的氨基酸序列；
其中SEQ ID No 1-166的第一组的SEQ ID NO:x对应于第二组的SEQ IDNO:y，其中y=x+166。
4.权利要求2的Dll4结合分子，其中该一个或多个免疫球蛋白单一可变域含有：
a.CDR3，其具有选自SEQ ID NO:333至353中所示的第一组氨基酸序列的氨基酸序列；
b.CDR1及CDR2，其具有如表16-A中所示的作为部分序列形式包含于选自SEQ ID NO:354至374中所示的第二组序列的序列中的氨基酸序列；
其中第一组的SEQ ID NO:x对应于第二组的SEQ ID NO:y，其中y=x+21。
5.权利要求2的Dll4结合分子，其中该一个或多个免疫球蛋白单一可变域含有
a.CDR3，其具有选自SEQ ID NO:375至395中所示的第一组氨基酸序列的氨基酸序列；
b.CDR1及CDR2，其具有如表16-B中所示的作为部分序列形式包含于选自SEQ ID NO:396至416中所示的第二组序列的序列中的氨基酸序列；
其中第一组的SEQ ID NO:x对应于第二组的SEQ ID NO:y，其中y=x+21。
6.权利要求2至5中任一项的Dll4结合分子，其中所述一个或多个免疫球蛋白单一可变域为VHH。
7.权利要求6的Dll4结合分子，其中所述一个或多个VHH具有选自SEQID NO:167至332及459中所示氨基酸序列的氨基酸序列。
8.权利要求6的Dll4结合分子，其中所述一个或多个VHH具有选自SEQID NO:354至374中所示氨基酸序列的氨基酸序列。
9.权利要求6的Dll4结合分子，其中所述一个或多个VHH具有选自SEQID NO:396至416中所示氨基酸序列的氨基酸序列。
10.一种免疫球蛋白单一可变域，其通过使权利要求3中定义的免疫球蛋白单一可变域亲和力成熟而获得。
11.一种VHH，其通过使权利要求7中定义的VHH亲和力成熟而获得。
12.一种VHH，其具有选自SEQ ID NO:356及358中所示氨基酸序列的氨基酸序列。
13.一种免疫球蛋白单一可变域，其通过使权利要求12中定义的VHH人化而获得。
14.一种VHH，其具有选自SEQ ID NO:402、407及416中所示序列的氨基酸序列。
15.一种免疫球蛋白单一可变域，其通过使权利要求14中定义的VHH人化而获得。
16.一种免疫球蛋白单一可变域，其通过使权利要求3中定义的免疫球蛋白单一可变域人化而获得。
17.一种免疫球蛋白单一可变域，其通过使权利要求10中定义的免疫球蛋白单一可变域人化而获得。
18.权利要求1的Dll4结合分子，其结合至完全或部分含于EGF-2域内的Dll4的表位，该EGF-2域对应于SEQ ID NO:417的氨基酸残基252至282。
19.权利要求18的Dll4结合分子，其为免疫球蛋白单一可变域或含有该免疫球蛋白单一可变域的多肽。
20.一种核酸分子，其编码权利要求1至19中任一项的Dll4结合分子或含有其的载体。
21.一种宿主细胞，其含有权利要求20的核酸分子。
22.药物组合物，其含有至少一种权利要求1至19中任一项的Dll4结合分子作为活性成分。
23.权利要求22的药物组合物，其用于治疗与Dll4介导的血管生成作用相关的疾病。
24.权利要求22的药物组合物，其用于治疗癌症及癌性疾病。
25.权利要求22的药物组合物，其用于治疗眼病。
26.一种肽，其包含具有选自如下所示氨基酸序列的氨基酸序列的序列：
a.SEQ ID NO:1至166及458，
b.SEQ ID NO:333至353，或
c.SEQ ID NO:375至395。
27.一种核酸分子，其编码权利要求26的肽。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109160948A (zh) * 2018-09-21 2019-01-08 成都阿帕克生物科技有限公司 一种乙肝表面抗原纳米抗体及核酸分子和应用
CN111875706A (zh) * 2020-07-16 2020-11-03 广州康盛生物科技股份有限公司 一种抗人IgE蛋白的单域抗体及其应用
CN116547006A (zh) * 2021-08-06 2023-08-04 贝达药业股份有限公司 抗pd-l1纳米抗体及其应用
CN117659194A (zh) * 2023-11-30 2024-03-08 科弈(浙江)药业科技有限公司 靶向egfr的纳米抗体、药物偶联物及其用途

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9527925B2 (en) 2011-04-01 2016-12-27 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bispecific binding molecules binding to VEGF and ANG2
US20130078247A1 (en) * 2011-04-01 2013-03-28 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bispecific binding molecules binding to dii4 and ang2
HUE042192T2 (hu) 2011-09-23 2019-06-28 Oncomed Pharm Inc VEGF/DLL4-kötõ ágensek és alkalmazásaik
KR101535341B1 (ko) 2012-07-02 2015-07-13 한화케미칼 주식회사 Dll4에 특이적으로 결합하는 신규한 단일클론항체 및 이의 용도
KR102089591B1 (ko) * 2013-07-29 2020-03-18 삼성전자주식회사 항 EGFR scFv 단편 및 이를 포함하는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체
ES2889906T3 (es) 2015-05-21 2022-01-14 Harpoon Therapeutics Inc Proteínas de unión triespecíficas y usos médicos
JP6967003B2 (ja) 2015-09-23 2021-11-17 メレオ バイオファーマ ５ インコーポレイテッド がんの処置のための方法および組成物
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
WO2017201488A1 (en) 2016-05-20 2017-11-23 Harpoon Therapeutics, Inc. Single domain serum albumin binding protein
CA3044659A1 (en) 2016-11-23 2018-05-31 Harpoon Therapeutics, Inc. Prostate specific membrane antigen binding protein
BR112019010602A2 (pt) 2016-11-23 2019-12-17 Harpoon Therapeutics Inc proteínas trispecíficas para psma e métodos de uso
EP3589662A4 (en) 2017-02-28 2020-12-30 Harpoon Therapeutics, Inc. INDUCTIBLE MONOVALENT ANTIGBINDING PROTEIN
CA3063362A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 Harpoon Therapeutics, Inc. Msln targeting trispecific proteins and methods of use
JP7090347B2 (ja) 2017-05-12 2022-06-24 ハープーン セラピューティクス，インク． メソテリン結合タンパク質
CR20200195A (es) 2017-10-13 2020-08-14 Harpoon Therapeutics Inc Proteínas de unión a antigenos de maduraciòn de celulas b
BR112020007196A2 (pt) 2017-10-13 2020-12-01 Harpoon Therapeutics, Inc. proteínas triespecíficas e métodos de uso
US10815311B2 (en) * 2018-09-25 2020-10-27 Harpoon Therapeutics, Inc. DLL3 binding proteins and methods of use
CN115768463A (zh) 2020-02-21 2023-03-07 哈普恩治疗公司 Flt3结合蛋白及使用方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008060705A2 (en) * 2006-06-06 2008-05-22 Genentech, Inc. Anti-dll4 antibodies and methods using same
WO2008076379A2 (en) * 2006-12-14 2008-06-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Human antibodies to human delta like ligand 4

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1087013T3 (da) 1992-08-21 2009-05-11 Univ Bruxelles Immunoglobuliner uden lette kæder
EP0739981A1 (en) 1995-04-25 1996-10-30 Vrije Universiteit Brussel Variable fragments of immunoglobulins - use for therapeutic or veterinary purposes
US6329516B1 (en) 1997-04-28 2001-12-11 Fmc Corporation Lepidopteran GABA-gated chloride channels
CA2405709A1 (en) 2000-04-12 2001-10-25 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
WO2002056910A1 (en) 2001-01-17 2002-07-25 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
EP1399484B1 (en) 2001-06-28 2010-08-11 Domantis Limited Dual-specific ligand and its use
AU2002364587A1 (en) 2001-12-21 2003-07-30 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
WO2004041865A2 (en) 2002-11-08 2004-05-21 Ablynx N.V. Stabilized single domain antibodies
EP2267032A3 (en) 2002-11-08 2011-11-09 Ablynx N.V. Method of administering therapeutic polypeptides, and polypeptides therefor
KR101025143B1 (ko) 2002-12-31 2011-04-01 넥타르 테라퓨틱스 가수분해상으로 안정한 말레이미드－종결 중합체
PL1639011T3 (pl) 2003-06-30 2009-05-29 Domantis Ltd Pegilowane przeciwciała jednodomenowe (dAb)
DK1687338T3 (da) 2003-11-07 2011-02-07 Ablynx Nv Camelidae enkeltdomæne-antistoffer VHH, der er rettet mod epidermal vækstfaktor-receptor og anvendelser deraf
US20050284249A1 (en) 2004-06-29 2005-12-29 Arnone David F Worm type gear mover assembly
AU2005293752A1 (en) 2004-10-13 2006-04-20 Ablynx N.V. Single domain camelide anti-amyloid beta antibodies and polypeptides comprising the same for the treatment and diagnosis of degenarative neural diseases such as Alzheimer's disease
US8048418B2 (en) * 2004-10-29 2011-11-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic methods for inhibiting tumor growth with combination of Dll4 antagonists and VEGF antagonists
EP1888640B1 (en) 2005-05-18 2012-03-14 Ablynx N.V. Improved nanobodies against tumor necrosis factor-alpha
JP5489465B2 (ja) * 2005-12-16 2014-05-14 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｄｌｌ４アンタゴニストによって腫瘍増殖を阻害する治療方法
KR20090016762A (ko) 2006-06-06 2009-02-17 제넨테크, 인크. 혈관 발달을 조정하기 위한 조성물 및 방법
WO2008020079A1 (en) 2006-08-18 2008-02-21 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against il-6r and polypeptides comprising the same for the treatment of deseases and disorders associated with il-6-mediated signalling
US20080132451A1 (en) * 2006-12-01 2008-06-05 Alcon Manufacturing Ltd. Modulation of polysialylated neural adhesion molecules (psa-ncam) as a regulator of ocular disease
GB0709333D0 (en) * 2007-05-15 2007-06-20 Smart Targeting Ltd Binding protein
WO2009095489A2 (en) 2008-02-01 2009-08-06 Ablynx N.V. Improved amino acid sequences directed against il-6r and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with il-6-mediated signalling
US20110091462A1 (en) 2008-03-05 2011-04-21 Ablynx N.V. Novel antigen binding dimer-complexes, methods of making and uses thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008060705A2 (en) * 2006-06-06 2008-05-22 Genentech, Inc. Anti-dll4 antibodies and methods using same
WO2008076379A2 (en) * 2006-12-14 2008-06-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Human antibodies to human delta like ligand 4

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HARMSEN MM等: "Properties,production,and applications of camelid single-domain antibody fragments", 《APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109160948A (zh) * 2018-09-21 2019-01-08 成都阿帕克生物科技有限公司 一种乙肝表面抗原纳米抗体及核酸分子和应用
CN109160948B (zh) * 2018-09-21 2021-07-16 成都阿帕克生物科技有限公司 一种乙肝表面抗原纳米抗体及核酸分子和应用
CN111875706A (zh) * 2020-07-16 2020-11-03 广州康盛生物科技股份有限公司 一种抗人IgE蛋白的单域抗体及其应用
CN116547006A (zh) * 2021-08-06 2023-08-04 贝达药业股份有限公司 抗pd-l1纳米抗体及其应用
CN117659194A (zh) * 2023-11-30 2024-03-08 科弈(浙江)药业科技有限公司 靶向egfr的纳米抗体、药物偶联物及其用途

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