CN102643361B - 纳米硒小分子微生物多糖及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种纳米硒小分子微生物多糖，是采用小分子锦鸡尔根瘤菌胞外多糖为原料，经均匀分散后与二氧化硒及还原剂共同作用，在超声条件下制备而成。具体生产方法：配制合适浓度的小分子细菌多糖溶液，小分子锦鸡尔根瘤菌多糖与维生素C混合均匀，混合体系中缓慢滴加二氧化硒，超声分散反应，透析，冷冻干燥。通过该制备工艺制备的纳米硒小分子微生物多糖产品，其硒含量可达15.2～16.4μg/mg，硒颗粒平均粒径为380nm左右，多糖收率达到70％以上。经小鼠试验表明，该纳米硒小分子多糖具有良好的抗癌活性，可在制备抗癌药物、保健品中应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用物理分散、修饰的方法处理经微生物发酵、小分子化后获得的细菌多糖而制备新的活性更高的多糖衍生物，具体属于一种纳米硒小分子微生物多糖及其生产方法与应用。
背景技术
近年来，微生物多糖作为一类极具开发潜力的生物活性物质备受世人瞩目，从属于真菌类的灵芝多糖、香菇多糖到属于细菌类的黄原胶、乳酸菌胞外多糖等，已经开发了多种微生物多糖产品。其中，很多多糖类产品被用作食品添加剂、增稠剂、悬浮剂和化工凝固剂、润滑剂、絮凝剂等，广泛应用于医药、食品、石油、轻工及化工等多个领域，也有一部分生物多糖具有抗肿瘤、提高机体免疫力作用而被用作免疫增强剂、抗氧化、抗癌药物等应用于保健品、医药等领域。
然而，天然的微生物多糖一般具有分子量大、难于溶解及生物活性(增强免疫力、抗氧化活性及抗肿瘤活性等)较低等缺陷，极大的限制了其在医药领域的应用。因此，对微生物多糖进行修饰改性以提高其溶解度及生物活性逐渐成为近年来的研究热点之一，目前国内外对微生物多糖的修饰改性主要集中在多糖的小分子化、硫酸酯化、磷酸化、羧甲基化、烷基化、硒化等方面。
含硒多糖是一类由无机硒和多糖通过多种硒化方式结合形成的具生物活性的复合物。作为一种新型的有机硒复合物，含硒多糖对多种癌症都有疗效，如：肺癌，乳腺癌，卵巢癌，恶性胸腺瘤，胆囊癌，食道癌以及膀胱癌等。比起单独使用硒或者多糖，含硒多糖的疗效更为显著且毒副作用更小，进年来对含硒多糖抑瘤活性的研究已经成为大家关注的焦点。同时，有科学家提出其潜在抑制肿瘤细胞生长的分子机制可能包括过抗氧化，促进癌细胞调亡，阻断癌细胞周期，增强机体免疫力等，含硒多糖在癌症预防及治疗领域具有更加明显的优势及更好的应用前景。
含硒多糖主要有天然存在的含硒多糖、通过培养基中添加硒产生的富集硒多糖、利用化学方法使多糖被***、氯氧化硒等硒化产生硒化多糖以及利用纳米技术获得纳米硒并与多糖复合形成的纳米硒多糖等。其中，纳米硒多糖因具备较大的生物学活性和极低的细胞毒性而成为目前硒化多糖的研究焦点。纳米硒即零价硒，最初是由我国科学家以蛋白质的酰胺平面为吸引源及分散物质而制得的红色纳米颗粒，其生物功能优异甚至胜过有机硒，毒性剂量远远小于其他价态的硒，纳米硒可杀伤人白血病细胞、人肺癌细胞、肝癌细胞等，具有良好的抗肿瘤、增强免疫力、护肝保健的作用。
综上所诉，目前已有开发报道的多糖很多，其中绝大多数为真菌多糖，受资源限制较为明显；具有生物学活性的细菌多糖较少，但产量比真菌多糖要高；对微生物多糖进行小分子化与修饰改性已经成为目前多糖领域的研究热点，也开发出一些经过修饰的多糖产品，但多存在多糖产量偏低、修饰过程复杂等缺陷。因此，开发一种产量高、制备工艺简便、生物活性较强而毒副作用小的多糖产品是很有必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有较强免疫活性、抗肿瘤活性的纳米硒小分子微生物多糖，其生产方法简单、原料廉价且无毒；这种纳米硒小分子微生物多糖能够用于制备提高免疫功能、抗肿瘤的药品及保健品。
本发明提供的一种纳米硒小分子微生物多糖(Nano-Se-LREPS)，采用通过包括如下步骤的方法制得：
(1)取分子量7～16KD的小分子锦鸡尔根瘤菌胞外多糖，以超纯水配制成5～7mg/mL(优选6mg/mL)的多糖溶液；同时配制50～70mg/mL(优选60mg/mL)的维生素C(简称，Vc)溶液和50～70μg/mL(优选60μg/mL)的SeO2溶液；
(2)取上述LREPS和Vc溶液混合，磁力搅拌25～35min使其充分混合均匀；将SeO2溶液缓慢加入，边滴边搅拌；而后加入超纯水；所述的多糖溶液、维生素C溶液、SeO2溶液及超纯水的体积比为1∶0.05～0.15∶1.2～2.8∶2～3，优选为1∶0.08～0.12∶1.6～2.4∶2.5；
(3)上述体系在超声状态下反应5～10min，使硒颗粒分散均匀；
(4)将反应体系用超纯水透析24～36h，直到检测透析外液中没有硒为止；
(5)冷冻干燥，得纳米硒小分子微生物多糖产品。
所述的LREPS，是将锦鸡尔根瘤菌胞外多糖(可按照专利号ZL 200510048129.0制备)经过微波辐照氧化降解处理(见文献：魏国琴等，小分子Rhizobium sp.N613胞外多糖的制备及其抗肿瘤活性，微生物学通报，2011，38(5)：743-749)，获得的分子量约为7～16KD的小分子锦鸡尔根瘤菌胞外多糖。
所述步骤(1)中的LREPS的分子量优选为9～13KD。
所述的Nano-Se-LREPS可以在制备抗癌药物中的应用，也可以在在制备保健品中的应用。
本发明Nano-Se-LREPS经过透射电镜及扫描电镜检验，表明其中的硒以纳米硒颗粒形态存在，且均匀分布于多糖之中，多糖的形态也较修饰前发生了较大的改变；粒径分布检测表明Nano-Se-LREPS中的硒颗粒平均粒径约为380nm；动物试验证明Nano-Se-LREPS具有很强的抗肿瘤活性，对小鼠S180肉瘤抑瘤率可达到70％以上(同等剂量下LREPS的抑瘤率为52％左右)，且对动物脏器有明显的保护作用。本发明Nano-Se-LREPS可作为免疫增强剂、抗肿瘤药物等被开发应用于医药、保健品等领域。
本发明所采用的检测方法：
(1)多糖含量测定：苯酚硫酸法。
(2)分子量测定：凝胶过滤层析法。
(3)硒含量测定：比色法。
(4)粒径分布：采用激光粒径分布仪结合投射电镜观察、测定。
(5)多糖表观结构：采用扫描电镜观察。
与现有技术相比本发明有以下优点和效果：
本发明涉及的原料锦鸡尔根瘤菌胞外多糖具有生产速度快、质量稳定及价格较低等特点，利用本发明的方法生产的Nano-Se-LREPS硒含量可达15.2～16.4μg/mg，硒颗粒平均粒径为380nm左右，多糖收率达到70％以上。与目前同类技术产品相比，质量稳定、成本较低，具有较强的竞争优势。
Nano-Se-LREPS具有较高的肿瘤生长抑制率，在较小剂量下即可对小鼠S180肉瘤产生70％以上的抑瘤率，具有诱人的应用前景。
附图说明
图1Nano-Se-LREPS透射电镜照片
图2Nano-Se-LREPS扫描电镜照片
具体实施方式：
实施例1
(1)取分子量11.4KD的LREPS，以超纯水配制成6mg/mL的LREPS溶液；同时配制60mg/mL的Vc溶液和60μg/mL的SeO2溶液
(2)取上述LREPS溶液20mL、Vc溶液2mL混合，磁力搅拌30min使其充分混和成均一体系。
(3)将48mL SeO2溶液用真空滴液漏斗逐滴加入上述均一的体系中，边滴边搅拌，并加入超纯水50mL。
(4)上述体系在超声状态下反应5min。
(5)将反应体系用超纯水透析30h，检测透析外液中不再有硒析出。
(6)冷冻干燥，得Nano-Se-LREPS，其硒含量为16.2μg/mg，硒颗粒的平均粒径为380nm。纳米硒小分子微生物多糖经过透射电镜及扫描电镜检验，表明其中的硒以纳米硒颗粒形态存在，且均匀分布于多糖之中(见附图1)，多糖的形态也较修饰前发生了较大的改变(见附图2)。
实施例2
(1)取分子量约11.0KD的LREPS，以超纯水配制成6mg/mL的LREPS溶液；同时配制60mg/mL的Vc溶液和60μg/mL的SeO2溶液
(2)取上述LREPS溶液20mL和Vc溶液1.6mL混合，磁力搅拌30min使其充分混和成均一体系。
(3)将32mL SeO2溶液用真空滴液漏斗逐滴加入上述均一的体系中，边滴边搅拌，并加入超纯水50mL。
(4)上述体系在超声状态下反应7min。
(5)将反应体系用超纯水透析，直到检测透析外液中没有硒为止。
(6)冷冻干燥，得Nano-Se-LREPS，其硒含量为15.2μg/mg，硒颗粒的平均粒径为370nm。
实施例3
(1)取分子量约10.2KD的LREPS，以超纯水配制成6mg/mL的LREPS溶液；同时配制60mg/mL的Vc溶液和60μg/mL的SeO2溶液。
(2)取上述LREPS溶液10mL和Vc溶液1.2mL混合，磁力搅拌30min使其充分混和成均一体系。
(3)将20mL SeO2溶液用真空滴液漏斗逐滴加入上述均一的体系中，边滴边搅拌，并加入纯水25mL。
(4)上述体系在超声状态下反应10min。
(5)将反应体系用超纯水透析，直到Vc检测透析外液中没有硒为止。
(6)冷冻干燥，得Nano-Se-LREPS，其硒含量为16.4μg/mg，硒颗粒的平均粒径为380nm。
实施例4
有关Nano-Se-LREPS的抗肿瘤动物试验实施例如下：
(1)建立荷瘤小鼠模型：昆明小鼠每组20只，全部为雌性小鼠，随机分组。分成1、3、5、10mg/lg剂量组和阴性、阳性对照组。抽取肝癌S180的肿瘤鼠的腹水，以生理盐水配制成浓度为106个/mL的肿瘤细胞悬液，在小鼠左腋皮下接种0.2mL，建立荷瘤小鼠模型。
(2)给药：分别按分组剂量给小鼠腹腔注射Nano-Se-LREPS，给阴性对照组注射生理盐水，阳性对照组注射环磷酰胺，连续注射10天。
(3)抑瘤率及脏器指数测定与计算：处死肿瘤试验小鼠，以实体瘤重法表征抑瘤率；测定和计算脏器指数，结果见下表。
表1.不同剂量Nano-Se-LREPS(硒含量16.2μg/mg)对S180荷瘤小鼠瘤重及脏器指数的影响
Claims (6)
1.一种纳米硒小分子微生物多糖，其特征在于，采用通过包括如下步骤的方法制得：
（1）取分子量7～16kD的小分子锦鸡尔根瘤菌胞外多糖，以超纯水配制成5～7mg/mL的多糖溶液；同时配制50～70mg/mL的维生素C溶液和50～70μg/mL的SeO2溶液；
（2）取上述多糖溶液和维生素C溶液混合，磁力搅拌25～35min使其充分混合均匀；将SeO2溶液缓慢加入，边加入边搅拌；而后加入超纯水；所述的多糖溶液、维生素C溶液、SeO2溶液及超纯水的体积比为1：0.05～0.15：1.2～2.8：2～3；
（3）上述体系在超声状态下反应5～10min；
（4）将反应体系用超纯水透析，直到检测透析外液中没有硒为止；
（5）冷冻干燥，得纳米硒小分子微生物多糖产品。
2.按照权利要求1所述的纳米硒小分子微生物多糖，其特征在于，所述步骤（1）取分子量7～16kD的小分子锦鸡尔根瘤菌胞外多糖，以超纯水配制成6mg/mL的多糖溶液；同时配制60mg/mL的维生素C溶液和60μg/mL的SeO2溶液。
3.按照权利要求1所述的纳米硒小分子微生物多糖，其特征在于，所述步骤（2）中所述的多糖溶液、维生素C溶液、SeO2溶液及超纯水的体积比为1：0.08～0.12：1.6～2.4：2.5。
4.按照权利要求1所述的纳米硒小分子微生物多糖，其特征在于，所述步骤（1）中的小分子锦鸡尔根瘤菌胞外多糖的分子量为9～13kD。
5.按照权利要求1所述的纳米硒小分子微生物多糖在制备抗癌药物中的应用。
6.按照权利要求1所述的纳米硒小分子微生物多糖在制备保健品中的应用。
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