CN102634509B - 一种直接从感病小麦叶片上高效快速提取小麦条锈菌dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种直接从感病小麦叶片上高效快速提取小麦条锈菌DNA的方法，其特征在于，吸取20μl配好的20％的chelex-100混悬液于100μl PCR管中，吸取5μl的Chelex-100上清液于长有小麦条锈菌夏孢子小麦叶片上，并在滴有Chelex-100上清液的病斑处反复涂抹叶片多次，将锈孢子洗下后，吸回叶片上含有锈孢子的Chelex-100上清液并加入到装有20μl 20％chelex-100混悬液的PCR管中，用移液器反复吸取混匀，放入沸水浴中水浴2min，再放到旋涡混合器上振荡混匀10s，水浴5min后保存于-20℃备用，上清液均可作为PCR的模板。建立一套高效、快速、可直接从感小麦条锈病菌的植株上提取小麦条锈病菌DNA作为PCR扩增模板的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种直接从感病小麦叶片上高效快速提取小麦条锈菌DNA的方法，属于植物保护领域。
背景技术
由小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)引起的小麦条锈病是世界各小麦产区的主要病害之一。随着分子生物学的发展，越来越多的研究人员在小麦条锈菌相关蛋白质和DNA分子水平上的探索迅速增多，基于PCR研究的内容也逐渐丰富起来。而进行PCR扩增的前提是提取较完整的基因组DNA。国内外提取真菌DNA的方法主要有：CTAB法，SDS提取法，尿素提取法、氯化苄提取法等化学方法破除细胞壁，再用有机溶剂抽提DNA。这些方法均存在操作步骤繁琐，费时费力，菌体需要量大，DNA获得率低等。而对于不能进行人工培养的专性寄生真菌——小麦条锈病菌，在提取单孢子堆DNA时，则需要通过单孢子堆分离接种，条锈菌的繁殖培养等获取足够的小麦条锈病菌夏孢子，而且由于夏孢子细胞壁较厚，在提取其基因组DNA时较一般真菌繁琐和困难。到目前为止，对小麦条锈菌DNA提取方法探索的报道虽然不少，但这些报道中对小麦条锈菌夏孢子的需求量仍然很多。因此，探索一种高效、快速、所需样品量少的DNA提取方法用于小麦条锈病菌分子检测是十分必要的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种直接从感病小麦叶片上高效快速提取小麦条锈菌DNA的方法。
本发明的技术方案如下：
一种直接从感病小麦叶片上高效快速提取小麦条锈菌DNA的方法，其特征在于，吸取20μl配好的20％的chelex-100混悬液于100μl PCR管中，吸取5μl的Chelex-100上清液于长有小麦条锈菌夏孢子小麦叶片上，并在滴有Chelex-100上清液的病斑处反复涂抹叶片多次，将锈孢子洗下后，吸回叶片上含有锈孢子的Chelex-100上清液并加入到装有20μl 20％chelex-100混悬液的PCR管中，用移液器反复吸取混匀，放入沸水浴中水浴2min，再放到旋涡混合器上振荡混匀10s，水浴5min后保存于-20℃备用，上清液均可作为PCR的模板；真菌核糖体rDNA-ITS引物：F：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，R：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；小麦条锈病菌特异性引物CYR33：F：5′-TGTCGTCTCGCCAATCTTT-3′，R：5′-GCGGGTGTCAGTTTCTCC-3′，进行PCR扩增，PCR扩增体系为10μl，其中用1μl上清液做DNA模板，5μl的supperMix，0.8μl的引物，ddH2O 3.2μl；扩增程序为94℃3min，94℃50s，53℃或51℃1min，72℃1min，30循环，72℃10min；用1.5％的琼脂糖凝胶检测PCR产物
本发明利用chelex-100直接对含有小麦条锈菌的叶片进行病原菌基因组DNA提取后，用真菌核糖体rDNA-ITS引物和小麦条锈病菌特异性引物进行PCR检测。建立一套高效、快速、可直接从感小麦条锈病菌的植株上提取小麦条锈病菌DNA作为PCR扩增模板的方法。
附图说明
图1为ITS扩增产物检测；M为DL2000Marker，1-6分别代表1-6号小麦条锈病菌样品，C为人工培养的平脐蠕孢属真菌对照，CK为阴性对照20％的chelex-100。
图2为CYR33扩增产物检测；M为DL2000Marker，1-6分别代表1-6号小麦条锈病菌样品，C为人工培养的平脐蠕孢属真菌对照，CK为阴性对照20％的chelex-100。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
直接从感病小麦叶片上高效快速提取小麦条锈菌DNA的方法：
将20g的chelex-100溶于100mL灭菌的双蒸水中，配成20％的chelex-100混悬液备用。充分混匀后，吸取20μl配好的chelex-100混悬液于100μl PCR管中，吸取5μl的Chelex-100上清液于长有小麦条锈菌夏孢子小麦叶片上，并在滴有Chelex-100上清液的病斑处反复涂抹叶片多次，将锈孢子洗下后，吸回叶片上含有锈孢子的Chelex-100上清液并加入到装有20μl 20％chelex-100混悬液的PCR管中，用移液器反复吸取混匀，放入沸水浴中水浴2min，再放到旋涡混合器上振荡混匀10s，水浴5min后保存于-20℃备用，上清液均可作为PCR的模板。
真菌核糖体rDNA-ITS引物(F：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，R：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和小麦条锈病菌特异性引物CYR33(F：5′-TGTCGTCTCGCCAATCTTT-3′，R：5′-GCGGGTGTCAGTTTCTCC-3′)进行PCR扩增，PCR扩增体系为10μl，其中用1μl上清液做DNA模板，5μl的supperMix，0.8μl的引物，ddH2O3.2μl。扩增程序为94℃3min，94℃50s，53℃或51℃1min，72℃1min(30循环)，72℃10min。用1.5％的琼脂糖凝胶检测PCR产物。
结果表明，所有经过Chelex-100法提取的小麦条锈病菌标样和人工培养的平脐蠕孢属真菌的DNA样品均能扩增出rDNA-ITS片段，片段大小在600bp(图1)左右，与预计片段大小相符，条带也比较清晰。用小麦条锈病菌生理小种特异引物CYR33对其进行检测，其结果表明，经过Chelex-100法提取的小麦条锈病菌标样均可扩增出CYR33的目标条带(图2)，条带非常清晰；而平脐蠕孢属真菌和阴性对照水均未能扩增出目标条带。由此可见，使用该法直接从感病小麦叶片上提取小麦条锈菌的DNA并用于PCR是可行的。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (1)
1.一种直接从感病小麦叶片上高效快速提取小麦条锈菌DNA的方法，其特征在于，吸取20μl配好的20％的chelex-100混悬液于100μl PCR管中，吸取5μl的Chelex-100上清液于长有小麦条锈菌夏孢子小麦叶片上，并在滴有Chelex-100上清液的病斑处反复涂抹叶片多次，将锈孢子洗下后，吸回叶片上含有锈孢子的Chelex-100上清液并加入到装有20μl 20％chelex-100混悬液的PCR管中，用移液器反复吸取混匀，放入沸水浴中水浴2min，再放到旋涡混合器上振荡混匀10s，水浴5min后保存于-20℃备用，上清液均可作为PCR的模板；真菌核糖体rDNA-ITS引物：F：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，R：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；小麦条锈病菌特异性引物CYR33：F：5′-TGTCGTCTCGCCAATCTTT-3′，R：5′-GCGGGTGTCAGTTTCTCC-3′，进行PCR扩增，PCR扩增体系为10μl，其中用1μl上清液做DNA模板，5μl的supperMix，0.8μl的引物，ddH2O 3.2μl；扩增程序为94℃3min，94℃50s，53℃或51℃1min，72℃1min，30循环，72℃10min；用1.5％的琼脂糖凝胶检测PCR产物。
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