CN102621027A - 一种茶皂素中皂苷的定量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种茶皂素中皂苷的定量检测方法，取油茶籽粕或茶皂素提取物3.0~3.5g，经碱、酸水解，溶于水，将水解液倾注在水中使之沉淀析出，测得皂苷元质量，再换算成皂苷质量分数。本发明具有检测设备简单，成本低、操作简便，精确度高，可直接测定的特点，适合于油茶籽粕、茶皂素粗提物和高纯度茶皂素检测。该方法尤其适用缺少仪器设备、检测人员文化程度不高的创业中小企业。

Description

一种茶皂素中皂苷的定量检测方法

技术领域

本发明涉及一种检测技术，尤其涉及一种茶皂素中皂苷的定量检测方法。

背景技术

茶皂素又称茶皂苷、茶皂甙，是由七种配基、四种配糖体和二种有机羧酸组成的一种五环三萜类皂苷，主要来源于山茶科植物（如茶、山茶、油茶）。茶皂素具有抗菌、抗氧化、抗高胆固醇高血脂、湿润发泡等性能，在医药、建材、水产、农药、化妆品、洗涤剂等行业用途广泛，作为一种绿色环保型非离子表面活性剂，具有良好的应用前景。我国是世界油茶产量最多的国家，目前油茶林面积达到360万公顷，占全国木本食用油料面积的80％以上，每年榨油后剩下的油茶籽粕有50多万吨，而油茶籽粕含茶皂素10～20%，为生产茶皂素提供了丰富的原料。近年来国内外对油茶籽粕和茶皂素的市场需求呈现出所未有的增长趋势，促进了油茶籽粕深加工产业的快速发展。

与此同时，茶皂素产品质量越来越受关注，其中皂苷含量已成为国内外贸易的主要定价依据。为满足出口市场需求，国家质量监督检验检疫总局于2006年颁布了《中华人民共和国出入境检疫检疫行业标准：出口茶皂素中皂苷含量的测定》（下称《SN/T 1852-2006标准》），但该标准所采用的重量分析法（化学法）只适用于皂苷含量为30%～70%的茶皂素产品，不适用于皂苷含量较低的油茶籽粕中提取的茶皂素的检测，且该方法不具有检测内销产品的强制效力。因此，目前国内市场茶皂素的定量检测尚缺乏国家标准，也缺乏相关行业标准和地方标准。

过去文献报道的茶皂素中皂苷的定量检测方法主要有：重量分析法、香草醛-浓硫酸比色法、荧光光度法、速差分光光度法、薄层扫描法、HPLC法和液相色谱—飞行时间质谱（LC/TOF-MS）联用仪法等，但对这些方法的适用范围和精确性比较迄今未见专门研究。而从油茶饼粕中提取茶皂素，历史上已有许多研究研究报道和专利技术公布，如：“溶剂提取和选择性分离一体化制备茶皂素的新工艺”（公开发明专利号：200710168737.4, 2007, 颜流水、罗旭彪、邰建东、涂新满、俞斌，2007），“一种茶皂素的提取方法”（授权发明专利号：ZL99115525.4, 方夏敏，2008），但相关专利一般只涉及提取精制利用，而没有适合于油茶籽粕、茶皂素粗提物和高纯度茶皂素检测方法。近年来，用正丁醇等从茶粕中提取残油工艺已非常成熟，在许多油脂企业形成规模化，但尚未见有茶皂素定量测定的报道。同时，从油茶籽粕中提取茶皂素时，因含有油脂、树脂、蛋白质、多糖、丹宁酸等许多杂质，使得茶皂素产品粘度大、含量不高、色泽深黑，茶籽中皂素的含量因品种、栽培环境以及定量方法的不同而存在差异，给茶皂素的定量分析造成很多困难，因此迄今国内外尚未见统一的成熟检测方法。而在茶皂素研究和生产过程中，定量测定非常重要，不仅要求检测方法不仅精确度高、简单、便于操作，而且适用面要广，尤其要适用于缺乏检测设备的地区和企业。为此，我们进行了油茶籽粕中提取的茶皂素中的皂苷含量的检测方法研究，以期为制订检测方法标准提供科学依据。

发明内容

鉴于现茶皂素定量测定存在的上述问题，本发明的目的在于提供一种茶皂素中皂苷的定量检测方法，该方法不仅精确度高、简单、便于操作，而且适用面要广，尤其适用于缺乏检测设备的地区和企业。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种茶皂素中皂苷的定量检测方法，该方法包括以下步骤：

（1）称取粉状油茶籽粕样品3.0~3.5g，置于三角烧瓶中，加入25 mL氢氧化钠甲醇溶液，上接蛇形冷凝管，置通风橱中沸水浴中回流2 h，取出冷却至室温；所述氢氧化钠甲醇溶液由氢氧化钠10 g溶于20 mL水后加入80 mL甲醇制备得到；

（2）用质量百分比为20%的盐酸溶液调节步骤1制备的溶液至pH约等于7，加入20 mL甲醇，然后缓慢加入7 mL盐酸（ρ=1.18 g/mL），置沸水浴中回流1 h，移去冷凝管，置通风橱中，水浴30 min挥去甲醇至终体积约30 mL；

（3）将步骤2制备的溶液立即倾注于1000 mL烧杯中，加入500 mL蒸馏水混匀，另用煮沸的蒸馏水洗涤三角烧瓶，并入烧杯中，待充分冷却、沉淀后，过滤；

（4）滤渣用蒸馏水洗至中性，烘干，置于滤纸筒内，以105±2℃下恒重的索氏抽提浸瓶接收，用丙酮作助剂于75℃水浴上用索氏抽提法抽提2h，回收丙酮；

（5）将索氏抽提浸瓶和瓶塞置烘箱中105℃±2℃干燥2h，取出、加塞，放入干燥器中冷却0.5 h后称量；重复，直至恒重；

（6）空白试验：随同试样做空白试验；

（7）皂苷含量（即质量分数）按SN/T 1852-2006规定的以下公式计算得到：

；

式中，w为皂苷含量（%），m₁为样品的质量（g），m₂为索氏抽提浸瓶的质量（g），m₃为恒重后索氏抽提浸瓶与抽提物质量（g），m₀为空白残留物质量（g），1223.54为茶皂苷的理论平均分子量，501为皂苷元的理论平均分子量。

本发明的有益效果是：

（1）本发明提供了一种油茶籽粕中皂苷含量的定量检测方法，相比于《SN/T 1852-2006标准》只适用于皂苷含量为30%-70%的茶皂素产品的定量检测，本发明不受皂苷含量的限制。

（2）本发明具有设备简单，成本低、操作简便，重复性精确度高，可直接测定的特点。该方法对缺少仪器设备、检测人员文化水平较低的创业中小企业非常适用。

附图说明

图1是油茶籽粕茶皂素标准品的紫外吸收光谱（香草醛浓硫酸法）；

图2是油茶皂素的标准曲线（香草醛-浓硫酸显色法）；

图3是油茶皂苷标准品的光谱；

图4是油茶皂苷的标准曲线（HPLC法）；

图5是茶皂素标准品甲醇溶液色谱图；

图6是油茶籽粕经甲醇振荡抽提处理后甲醇溶液色谱图；

图7是油茶籽粕经索氏抽提处理后甲醇溶液色谱图；

图8是茶皂素粗提物及高纯度茶皂素样品甲醇溶液色谱图。

具体实施方式

本发明茶皂素中皂苷的定量检测方法，包括以下步骤：

1、称取粉状油茶籽粕样品3.0~3.5g，置于三角烧瓶中，加入25 mL氢氧化钠甲醇溶液（称取氢氧化钠10 g，溶于20 mL水中，加入80 mL甲醇），上接蛇形冷凝管，置通风橱中沸水浴中回流2 h，取出冷却至室温；

2、用20%盐酸溶液调节上述溶液pH约等于7，加入20 mL甲醇，然后缓慢加入7 mL盐酸（ρ=1.18 g/mL），置沸水浴中回流1 h，移去冷凝管，置通风橱中，水浴30 min中挥去甲醇至终体积约30 mL；

3、将上述溶液立即倾注于1000 mL烧杯中，加入500 mL蒸馏水混匀，另用煮沸的蒸馏水洗涤三角烧瓶，并入烧杯中，待充分冷却、沉淀后，过滤；

4、滤渣用蒸馏水洗至中性，烘干，置于滤纸筒内，以105±2℃下恒重的索氏抽提浸瓶接收，用丙酮作助剂于75℃水浴上用索氏抽提法抽提2h，回收丙酮；

5、将索氏抽提浸瓶和瓶塞置烘箱中105℃±2℃干燥2h，取出、加塞，放入干燥器中冷却0.5 h后称量；重复，直至恒重；

6、空白试验

   随同试样做空白试验。

7、皂苷含量（即质量分数）按SN/T 1852-2006规定的以下公式计算得到：

式中，w为皂苷含量（%），m₁为样品的质量（g），m₂为索氏抽提浸瓶的质量（g），m₃为恒重后索氏抽提浸瓶与抽提物质量（g），m₀为空白残留物质量（g），1223.54为茶皂苷的理论平均分子量，501为皂苷元的理论平均分子量。

通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明并不受这些内容所限制。

实施例1：油茶籽粕皂苷的重量法、香草醛-浓硫酸法及HPLC法定量检测

（1）重量法定量检测

准备好以下试剂：（1）甲醇（分析纯），盐酸（ρ=1.18 g/mL）， 氢氧化钠（分析纯），丙酮（分析纯），20%盐酸溶液（量取504 mL盐酸，加水稀释至1000 mL），氢氧化钠甲醇溶液（称取氢氧化钠10 g，溶于20 mL水中，加入80 mL甲醇）混匀。称取粉状油茶籽粕样品3.0~3.5g（精确到0.0001 g），置于三角烧瓶中，加入25 mL氢氧化钠甲醇溶液，上接蛇形冷凝管，置通风橱中沸水浴回流2 h，取出冷却至室温。用20%盐酸溶液调节上述溶液至pH 7，加入甲醇20 mL，然后缓慢加入20%盐酸，置沸水浴中回流1 h，移去冷凝管，置通风橱于水浴中挥去甲醇置约30 min。将溶液立即倾注于1000 mL烧杯中，加入500 mL蒸馏中混匀，另用少量煮沸的蒸馏水洗涤三角烧瓶，洗涤并入烧杯中，待充分冷却、沉淀后，过滤。滤渣用蒸馏水洗至中性后烘干，置于滤纸筒内，以105℃下恒重的索氏抽提浸瓶接收，用丙酮75 ℃抽提2 h，回收丙酮。将接收瓶和瓶塞置烘箱中105 ℃干燥2 h，取出、加塞，放入干燥器中冷却0.5 h后称量；再放入105 ℃烘箱中干燥0.5 h，取出、加塞，放入干燥器冷却0.5 h后称量。随同试样做空白试验。同一试样需做两次平行试验。皂苷含量（即质量分数）按SN/T 1852-2006规定的公式计算。

式中：w为皂苷质量分数/%，m ₁ 为样品质量/g，m ₂ 为接收瓶质量/g，m ₃ 为恒重后接收瓶与抽提物质量/g，m ₀ 为空白残留物质量/g，1223.54为茶皂苷的理论平均分子质量，501为皂苷元的理论平均分子质量。

（2）香草醛-浓硫酸定量检测

①建立标准曲线：准确称取香草醛0.8~1.0g溶于10 mL无水乙醇，配制成香草醛溶液。取浓硫酸（分析纯）77 mL，与23 mL去离子水混匀备用。称取茶皂素标准品25.0 mg，用80%乙醇溶液溶于50 mL容量瓶中，定容、摇匀，即得标准溶液。取标准溶液0.5 mL，准确加入80 g/L香草醛溶液0.5 mL，于冰水中加入77%硫酸溶液4 mL，摇匀，于60℃加热15 min，然后置于冰水浴中冷却10 min，取出置于室温下，以试剂为空白，用1 cm比色皿在紫外-可见分光光度计上扫描，得出最大吸收波长（图1）。分别取茶皂素标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，置于带塞试管中，加水定容至溶液体积为1.0 mL，按上述方法加试剂反应后，在最大吸收波长下测定吸光度，并以吸光度对浓度值绘制标准曲线，建立回归方程：Y=38.766X-0.0333 ，R²=0.9968（图2）。

②油茶籽粕测定：将经研磨的粉状试样用滤纸包好，置60 ℃烘箱保温4 h，烘干至恒重，过60目筛，准确称取4.5~5.5g放入索氏提取器中，用150 mL乙醇回流提取4 h，控制提取速度回流8 min。提取液冷却后，放入500 mL容量瓶中，用80%乙醇定容。取1.0 mL测定吸光度，兑入相应回归方程，根据标准曲线计算皂苷质量分数。

（3）反相高效液相色谱法（HPLC）定量检测

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18（4.6×250 mm, 5 μm）；流动相：甲醇；流速：1 mL/min；紫外扫描结果显示，茶皂素标样在280 nm处出现最大吸收峰值（图3），检测波长：280 nm；柱温：30℃。标样处理：准确称取茶皂素标准品45.0 mg置于50 mL容量瓶中，水定容即为茶皂素标准溶液；取1 mL溶液于样品瓶1；准确移取12.5 mL至25 mL容量瓶中，加水定容；取1 mL溶液于样品瓶2。按照上述方法制备得样品瓶3、4、5。取样品瓶中的溶液经0.45 μm微孔滤膜过滤，用高效液相色谱仪进行分析，标准品为一单一峰（图3）。标准曲线方程y=0.0028x+0.0199（R²=0.9999，图4）。

两种样品前处理方法效果比较：①甲醇振荡法：称取烘干至恒重的油茶籽粕粉1.5~2.5 g于100 mL具塞三角瓶中，加入甲醇50 mL，在往复式振荡器中提取24 h，提取液过滤，滤渣用20 mL甲醇洗2次，合并提取液于500 mL容量瓶中，用甲醇定容。图6为采用甲醇振荡处理后油茶籽粕样品甲醇溶液的HPLC图。②索氏萃取法：将经研磨的粉状试样用滤纸包好，置60 ℃烘箱保温4 h，烘干至恒重，过60目筛，准确称取4.5~5.5g放入索氏提取器中，用150 mL甲醇回流提取4 h，控制提取速度回流8 min。提取液冷却后，放入500 mL容量瓶中，用甲醇定容。取1.0 mL定容甲醇溶液，经0.45 μm微孔滤膜过滤，分别用高效液相色谱仪进行分析。图7为索氏抽提处理后的油茶籽粕样品甲醇溶液的HPLC图。结果显示，不同前处理方法的HPLC图（图6、图7）差别很大，其中用索氏抽提法处理的样品甲醇溶液色谱图（图7）与标准品比较一致；而用甲醇振荡处理样品的杂质峰与主峰不容易分离，杂质峰十分明显（图6），对测定结果干较扰大。实验结果表明应该采用索氏抽法处理样品。

表1 油茶籽粕皂苷的重量法与香草醛-浓硫酸法及HPLC法效果对比

* 显著性统计P≥0.05。

 

以香草醛-浓硫酸法和HPLC法测定结果为参照，将重量法测定结果进行方差分析，结果（表1）显示，重量法测定的皂苷质量分数结果与香草醛-浓硫酸法及HPLC法十分接近，三者的皂苷质量分数分别为16.20%、16.08%和16.21%，统计结果无显著差异（P≥0.05）。表明改进后重量法可用于测定油茶籽粕中皂苷质量分数。

实施例2：高纯度茶皂素及茶皂素粗提物的重量法、香草醛-浓硫酸法及HPLC法定量检测

（1）重量法定量检测

准备好以下试剂：（1）甲醇（分析纯），盐酸（ρ=1.18 g/mL）， 氢氧化钠（分析纯），丙酮（分析纯），20%盐酸溶液（量取504 mL盐酸，加水稀释至1000 mL），氢氧化钠甲醇溶液（称取氢氧化钠10 g，溶于20 mL水中，加入80 mL甲醇）混匀。称取高纯度茶皂素及茶皂素粗提物样品3.0~3.5 g，置于三角烧瓶中，加入25 m L氢氧化钠甲醇溶液，上接蛇形冷凝管，置通风橱中沸水浴回流2 h，取出冷却至室温。用20%盐酸溶液调节上述溶液至pH值为 7，加入甲醇20 mL。然后缓慢加入盐酸，置沸水浴中回流1 h，移去冷凝管，置通风橱于水浴中挥去甲醇至终体积为约30 mL。将溶液立即倾注于1000 mL烧杯中，加入500 mL蒸馏中混匀，另用少量煮沸的蒸馏水洗涤三角烧瓶，洗涤并入烧杯中，待充分冷却、沉淀后，过滤。滤渣用蒸馏水洗至中性后烘干，置于滤纸筒内，以恒重（105 ±2 ℃）的索氏抽提浸瓶接收，用丙酮（75 ℃）抽提2 h，回收丙酮。将接收瓶和瓶塞置烘箱中（105±2 ℃）干燥2 h，取出、加塞，放入干燥器中冷却0.5 h后称量；再放入烘箱中（105±2 ℃）干燥0.5 h，取出、加塞，放入干燥器冷却0.5 h后称量。重复上述步骤至前后两次质量差不超过2 mg，即为恒重。随同试样做空白试验。

（2）香草醛-浓硫酸法测定

①标准曲线建立：准确称取香草醛0.8 g~1.0 g溶于10 mL无水乙醇，配制成香草醛溶液。取浓硫酸77 mL，与23 mL去离子水混匀备用。称取茶皂素标准品25.0 mg，用80%乙醇溶液溶于50 mL容量瓶中，定容、摇匀，即得标准溶液。取标准溶液0.5 mL，准确加入80 g/L香草醛溶液0.5 mL，于冰水中加入77%硫酸溶液4 mL，摇匀，于60℃加热15 min，然后置于冰水浴中冷却10 min，取出置于室温下，以试剂为空白，用1 cm比色皿在紫外-可见分光光度计上扫描，得出最大吸收波长。按上述方法加试剂反应后，在最大吸收波长下测定吸光度，茶皂素标准品在紫外-可见分光光度计上扫描所得的最大吸收波长451 nm光谱见图1。分别取茶皂素标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，置于带塞试管中，加水定容至溶液体积为1.0 mL，按上述方法加试剂反应后，在最大吸收波长下测定吸光度，并以吸光度对浓度值绘制标准曲线，建立回归方程。并以吸光度对浓度值绘制标准曲线，建立回归方程：Y=38.766X-0.0333，R²= 0.9968（图2）。

②高纯度茶皂素及茶皂素粗提物的测定：分别称取试样65.0 mg左右，用80%乙醇定容至25 mL，取1.0 mL测定吸光度，兑入相应的回归方程，根据标准曲线计算皂苷质量分数。

（2）反相高效液相色谱法（HPLC）测定

①进样条件：色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18（4.6×250 mm, 5 μm）；流动相：甲醇；流速：1 mL/min；紫外扫描结果显示，茶皂素标样在280 nm处出现最大吸收峰值（图3），检测波长：280 nm；柱温：30℃。标样处理：准确称取茶皂素标准品45.0 ~50.0 mg置于50 mL容量瓶中，水定容即为茶皂素标准溶液；取1 mL溶液于样品瓶1；准确移取12.5 mL至25 mL容量瓶中，水定容；取1 mL溶液于样品瓶2。按照上述方法制备得样品瓶3、4、5。取样品瓶中的溶液经0.45 μm微孔滤膜过滤，用高效液相色谱仪进行分析。因茶皂素是多种皂苷单体的混合物，各单体峰均会在色谱图显示，计算总皂苷质量分数需将各单体的峰面累加起来，再与对照品峰面积比对后得出。图5为茶皂素标准品甲醇溶液的HPLC图，标准曲线回归方程为：y=0.0028x+0.0199，R₂=0.9999（图4）。

②高纯度茶皂素及茶皂素粗提物的测定：分别称取试样50~60 mg，放入50 mL容量瓶中，用甲醇定容，用移液管各移取1.0 mL于样品瓶中，经0.45 μm微孔滤膜过滤，用高效液相色谱仪进行分析。图8为茶皂素粗提物及高纯度茶皂素甲醇溶液的HPLC图，结果显示，这两类样品的HPLC图与标准品（图5）均较为一致。

表2 高纯度茶皂素及茶皂素粗提物的重量法与香草醛-浓硫酸法及HPLC法效果对比

* 显著性统计P≥0.05。

以香草醛-浓硫酸法和HPLC法测定结果为参照，与重量法测定结果进行方差分析比较。结果（表2）显示，三种方法测定的茶皂素粗提物的皂苷质量分数测定结果无显著差异（P≥0.05）；三种方法测定的高纯度油茶皂素数值也比较接近。因此，重量法适用于茶皂素粗提物及高纯度油茶皂素中皂苷质量分数测定。

Claims (1)

1.一种茶皂素中皂苷的定量检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）称取粉状油茶籽粕样品3.0~3.5g，置于三角烧瓶中，加入25 mL氢氧化钠甲醇溶液，上接蛇形冷凝管，置通风橱中沸水浴中回流2 h，取出冷却至室温；所述氢氧化钠甲醇溶液由氢氧化钠10 g溶于20 mL水后加入80 mL甲醇制备得到；

（2）用质量百分比为20%的盐酸溶液调节步骤1制备的溶液至pH约等于7，加入20 mL甲醇，然后缓慢加入7 mL盐酸（ρ=1.18 g/mL），置沸水浴中回流1 h，移去冷凝管，置通风橱中，水浴30 min挥去甲醇至终体积约30 mL；

（3）将步骤2制备的溶液立即倾注于1000 mL烧杯中，加入500 mL蒸馏水混匀，另用煮沸的蒸馏水洗涤三角烧瓶，并入烧杯中，待充分冷却、沉淀后，过滤；

（4）滤渣用蒸馏水洗至中性，烘干，置于滤纸筒内，以105±2℃下恒重的索氏抽提浸瓶接收，用丙酮作助剂于75℃水浴上用索氏抽提法抽提2h，回收丙酮；

（5）将索氏抽提浸瓶和瓶塞置烘箱中105℃±2℃干燥2h，取出、加塞，放入干燥器中冷却0.5 h后称量；重复，直至恒重，得到恒重后索氏抽提浸瓶与抽提物质量；

（6）空白试验：随同试样做空白试验，得到空白残留物质量；

（7）皂苷含量（即质量分数）按SN/T 1852-2006规定的以下公式计算得到：

；

式中，w为皂苷含量（%），m₁为样品的质量（g），m₂为索氏抽提浸瓶的质量（g），m₃为恒重后索氏抽提浸瓶与抽提物质量（g），m₀为空白残留物质量（g），1223.54为茶皂苷的理论平均分子量，501为皂苷元的理论平均分子量。

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