CN102618544A - 一种植物光诱导型基因启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学领域，涉及一种植物光诱导型基因启动子及其应用，本发明具体提供了一种植物光诱导型启动子，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸形成的由SEQ ID No.1衍生的核苷酸序列。本发明利用诱导型启动子代替组成型启动子，可以获得光诱导的特异表达的启动子；利用遗传转化技术将其导入到植物基因组中，可以实现对目的基因的定向操作，获得光诱导表达目的基因的转基因植株；这不仅可以实现目的基因在转基因植株中的定时、定点、定量三维调控，而且为植物转基因应用提供强有力的工具。

Description

一种植物光诱导型基因启动子及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种启动子及其应用。

背景技术

植物的生长发育和生命周期是不同的基因在时间和空间上有序表达的结果。高等植物基因表达调控主要发生在转录水平上，受多种顺式作用元件和反式作用因子的相互作用。启动子是一段位于基因5’端上游区的DNA序列，它包含有增强或阻遏基因表达的序列和对激素或外界胁迫有应答作用的序列，即顺式作用元件，转录调控是通过其与转录因子之间的相互作用来实现的。

植物启动子按其转录方式可以分为组成型、组织特异型和诱导型启动子，但不具有绝对性。组成型启动子广泛应用于植物转基因，如常用于转Bt基因抗虫水稻的CaMV 35S启动子，ubiquitin启动子和actin启动子，它能高效、持续和非特异的启动外源基因表达，但外源蛋白在转基因植物中组成型表达也会带来很多负面影响。例如，持续合成外源基因产物会增加植物的代谢负担，并且这种高效表达经常是以大量的营养消耗为代价，从而直接影响了植株的生长发育，表现为植物生长延滞、植株矮小、产量降低等；另外，利用组成型启动子可能诱发基因沉默，影响转基因技术应用；并且，随着人们对于转基因植物食品安全问题的越来越多的关注，组成型启动子也越来越不能满足现代基因工程育种的要求。与组成型启动子相比，诱导型启动子只在某些物理或化学信号的刺激下或者植物发育到特定的阶段，才启动外源基因的转录。它不仅能使目的基因的表达产物在一定时空积累，增加区域表达量，提高植株的抗逆性，同时可避免由组成型启动子启动外源基因超表达引起的对植株发育的负面影响，也可以在一定程度上解决转基因应用中的基因沉默和食品安全性问题，是应用植物转基因技术进行基因工程育种的理想启动子。

光是影响植物生长发育最重要的因素之一，因为它不仅作为植物感知环境的信号来源，还作为光合作用的能量来源。因此，对光诱导型启动子的研究有助于了解植物基因光下的转录调控表达模式及其调控机制，并应用于基因工程中使外源基因伴随植物生理状态适度表达，同时维持转基因植株的健康生长。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是解决目前分子育种过程中，因使用组成型启动子，使得外源基因持续大量表达，而破坏了植物的代谢平衡，阻碍植物正常生长发育的问题，提供一种新的植物光诱导型启动子序列及其应用。

为了实现本发明目的，本发明一种植物光诱导型启动子，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，全长序列为1691bp；或该序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸形成的由SEQ ID No.1衍生的核苷酸序列。

本发明还提供了上述光诱导型启动子的构建方法，具体步骤为：

(1)根据拟南芥Col-0在一天中不同时间点以及光和黑暗条件下各器官中AtRBCS-1A基因的定量PCR数据，分析光诱导型基因AtRBCS-1A的表达谱；

(2)根据AtRBCS-1A基因序列设计基因特异性引物，克隆权利要求1所述光诱导型启动子。

其中，步骤(2)中所述特异性引物的核苷酸序列为：

5’-CGCGGATCCTCCGTGGTCGAGATTGTGTA-3’；

5’-CATGCCATGGTCTTTGTGTGACTGAGGTTTGG-3’。

本发明还提供了扩增植物光诱导型启动子的引物，其核苷酸序列为：5，-CGCGGATCCTCCGTGGTCGAGATTGTGTA-3’；

5’-CATGCCATGGTCTTTGTGTGACTGAGGTTTGG-3’。

本发明还提供了含上述启动子的植物表达载体，优选为pAtRBCS-1A。

本发明还提供上述启动子在植物基因工程中获得光诱导表达目的基因的转基因植株中的应用。

本发明还提供上述启动子在培育拟南芥中的应用。

本发明利用诱导型启动子代替组成型启动子，可以获得光诱导的特异表达的启动子；利用遗传转化技术将其导入到植物基因组中，可以实现对目的基因的定向操作，获得光诱导表达目的基因的转基因植株；这不仅可以实现目的基因在转基因植株中的定时、定点、定量三维调控，而且为植物转基因应用提供强有力的工具。

附图说明

图1为本发明野生型拟南芥Col-0AtRBCS-1A基因一天中表达量变化图，描述野生型拟南芥Col-0在长日条件下一天中AtRBCS-1A基因表达模式，每两小时取材料，采用实时荧光定量PCR的方法，拟南芥ACTIN基因作为内参；

图2为本发明长日下生长的野生型拟南芥Col-0在光和黑暗条件下根、茎、叶、花和果荚中AtRBCS-1A基因的实时荧光定量PCR分析。其中，ACTIN为内参；

图3为本发明pAtRBCS-1A：GUS表达载体图谱；

图4为本发明转化pAtRBCS-1A：GUS的转基因拟南芥GUS染色结果。其中，A：黑暗中生长3天的拟南芥转到光下生长1天的GUS染色结果，以黑暗生长4天的拟南芥GUS染色作为对照；B：光下生长3天的拟南芥转到黑暗生长1天的GUS染色结果，以光下生长4天的拟南芥GUS染色作为对照。C为长日条件生长的光和黑暗下转基因植株根、茎、叶、花和果荚的GUS染色结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1、拟南芥光诱导型基因AtRBCS-1A的表达分析

1.1材料处理

长日条件(16h光照/8h黑暗)下生长三周的野生型拟南芥Col-0，每两小时取材料，立刻放入液氮中，连续取24h，然后放入-80℃保存备用。

长日条件下成苗期野生型拟南芥Col-0，分别取其根、茎、叶、花和果荚，立刻放入液氮中，于-80℃保存备用。

1.2TRIzol法提取拟南芥总RNA

1)将组织材料放入液氮预冷的研钵中，在液氮中充分研磨成粉状；

2)待液氮挥发干，立即转移到1.5ml的离心管中，每100mg材料约加入1ml的Invitrogen公司的TRIzol提取液，剧烈振荡混匀样品，使样品充***解，室温放置5min；

3)加入0.2ml氯仿，剧烈振荡混匀15s，室温放置10min；

4)4℃，12000rpm离心15min；

5)用移液器小心吸出上层水相，加入新的1.5ml的离心管中，加入500μl的异丙醇(1∶1体积)，充分混匀，-20℃，沉淀30min；

6)4℃，12000rpm离心10min，小心弃去上清液；

7)RNA沉淀用1ml的75％乙醇洗涤。4℃，8000rpm离心10min收集沉淀；

8)重复用75％乙醇洗涤一次RNA沉淀；

9)去上清，RNA沉淀于无菌操作台上晾干约10-15min至RNA略显透明，加入适当体积(30-50μl)的RNase-free水充分溶解(可放于-80℃长期保存)；

10)紫外分光光度计及1％Agrose凝胶电泳检测RNA浓度及质量。

11)对提取的总RNA进行DNase消化，去除含有的基因组DNA，电泳检测确保RNA样品中DNA已去除干净。

1.3第一链cDNA的合成

采用RevertAid^TM First Strand cDNA Synthesis Kit进行。反应步骤如下：

1)在1.5ml离心管中配置下列混合液。

总RNA               1μg

Oligo dT(2.5μM)    1μl

RNase free water    to 12μl

2)在水浴锅内进行变性、退火反应。

65℃5min

冰上1min

3)12000rpm离心5s使RNA引物等的混合液聚集于离心管底部。

4)在上述离心管中配制下列反转录反应液。

5)混匀后在水浴锅内按下列条件进行反转录反应

42℃    60min

70℃    5min

反应完成后置冰上。

1.4定量PCR反应(图1)

1)以cDNA为模板，进行PCR反应。引物如下：

RBCS-1A  Atrq-F：   5’-CATCACAAGCAACGGCGGAAG-3’

         Atrq-R：   5’-CGGAATCGGTAAGGTCAGGAAGG-3’

ACTIN    ACT2-537F：5’-TCTTGACCTTGCTGGACG-3’

         ACT2-805R：5’-CAAACGAGGGCTGGAACA-3’

2)按照全式金Trans Start Green qPCR SuperMix试剂盒的说明书，PCR体系：

3)PCR程序：95℃3min；40个循环，95℃10s，60℃20s；融解曲线，95℃20s，60℃-95℃每上升5℃读一次板，20s；50℃30s。

定量PCR结果表明，在接近生产实践的长日光照条件下，AtRBCS-1A在转为光照后表达量迅速上升，而转为黑暗后其表达量则迅速下降，并且在一天中，白天AtRBCS-1A表达量总体高于黑夜的表达量。

实施例2拟南芥光诱导型基因AtRBCS-1A启动子的克隆

2.1拟南芥基因组DNA的提取

2.1.1采用CTAB法提取野生型拟南芥Col-0基因组DNA。步骤为：

1)取拟南芥叶片约0.5g在液氮中磨碎，置于1.5ml离心管中，加入700μl提取缓冲液(100mmol/L Tris-HCl，50mmol/LEDTA-Na₂，100mmol/L NaCl，1.5％CTAB，2％巯基乙醇)，65℃水浴中温育30-60min，其间颠倒混匀3次；

2)取出离心管，向每管中加入700μl苯酚∶氯仿∶异戊醇(体积比25∶24∶1)溶液，混匀10min；

3)10000rpm离心10min；

4)用枪头缓缓抽取上清液至另一1.5ml离心管中；

5)加入等体积的氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)重复上述抽提过程。缓缓取出上清液；

6)加入等体积的异丙醇沉淀，轻轻混匀，冰上静置30min；

7)12000rpm离心10min，弃上清；

8)75％乙醇冲洗2次，DNA在室温干燥10min；

9)加入500μl去离子水，在4℃溶解。

2.1.2拟南芥基因组DNA的纯化

1)在溶解的DNA中加入2μl RNA酶(10mg/ml)，37℃保温1h；

2)加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(体积比25∶24∶1)溶液，混匀；

3)10000rpm离心10min；

4)取上清液到另一离心管中；

5)加入等体积氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)重复上述抽提过程；

6)取上清液移到一新的1.5ml离心管；

7)加入1/10体积的3mol/L NaAC，混匀后加入2倍体积的冷无水乙醇，轻轻混匀；

8)冰上静置30min，12000rpm离心10min，弃上清；

9)75％乙醇冲洗2次，室温放置至无酒精味；

10)DNA加入100μl去离子水溶解，用紫外分光光度计测定DNA浓度，并通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，样品在-20℃保存。最后根据DNA浓度，将一部分稀释，4℃保持待用。

2.2拟南芥光诱导型基因(AtRBCS-1A)启动子的克隆

设计基因特异性引物，上游引物中引入BamH I酶切位点，下游引物中引入Nco I酶切位点，序列为：

Atrp-1F：5’-CGCGGATCCTCCGTGGTCGAGATTGTGTA-3’

Atrp-1691R：5’-CATGCCATGGTCTTTGTGTGACTGAGGTTTGG-3’

2.3PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测及回收

PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测发现扩增出一条约1.7kb的条带，对扩增条带采用Biomed公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒，步骤按说明书进行。

2.4PCR产物与pMD18-T Vector(TaKaRa公司提供)载体连接在PCR管中依次加入下列组分：

于16℃水浴连接过夜。

2.5回收片段的克隆与测序

2.5.1连接产物的转化

1)从-80℃冰箱中取出1管(50μl)全式金公司Trans 5α感受态细胞，置冰上缓缓解冻。

2)超净工作台上向管中加入5μl连接反应物，轻轻摇匀，置冰上30min。

3)42℃水浴热激90s，迅速置冰上3-5min。

4)在超净工作台向离心管中加入500μl LB液体培养基(不含氨苄青霉素Amp)，混匀后37℃振荡培养45min(220rpm)。

5)室温下5000rpm离心5min，弃掉400μl上清液，将剩余100μl上清液重新悬浮菌体，加入40μl的X-gal和4μl的IPTG，混匀，然后用涂布器将其均匀涂到准备的平板上，放置30min。

6)倒置平板于37℃恒温培养箱中过夜，待出现明显单菌落时拿出。

7)放入4℃冰箱数小时，使蓝白斑颜色分明。

8)用灭菌的牙签挑取白斑于装有10ml LB液体培养基(含100μg/ml Amp)的离心管中，37℃摇菌过夜。

2.5.2重组质粒的PCR和酶切鉴定及测序

质粒提取采用Biomed公司高纯度质粒小量快速提取试剂盒，步骤按说明书进行。

利用所设计的引物对***片段扩增，对重组质粒进行鉴定；并且由于在设计引物时分别在两条引物的5’端加入BamH I和Nco I酶切位点，也可利用酶切反应对重组质粒进行鉴定，酶切体系如下：

PCR扩增产物用1％琼脂糖电泳检测，取阳性克隆的菌液送公司进行测序，其启动子序列为1691bp，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

实施例3拟南芥光诱导型基因AtRBCS-1A启动子表达载体(pAtRBCS-1A：GUS)的构建(图3)

用BamH I和Nco I分别对pCAMBIA1301载体(http://www.cambia.org/daisy/cambia/585.html，Cambia，Australia)和含有AtRBCS-1A启动子的pMD18-T载体进行双酶切，分别回收pCAMBIA1301载体大片段和AtRBCS-1A启动子小片段，用T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌Trans 5α(购自北京全式金生物技术有限公司)感受态细胞，提取重组质粒后进行酶切鉴定重组子，酶切产物经电泳检测后可见合适大小的目的启动子条带和切开的载体条带，表明所构建的植物表达载体正确。

3.1质粒pCAMBIA1301载体和含有AtRBCS-1A启动子的pMD18-T载体的BamH I和Nco I双酶切

质粒提取采用Biomed公司高纯度质粒小量快速提取试剂盒，步骤按说明书进行。

取41.5μl质粒酶切，酶切体系如下：

于37℃恒温水浴锅酶切4h。双酶切后以1×TAE为电泳缓冲液，将酶切产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。在紫外透射仪下用洁净刀片切下pCAMBIA1301载体大片段和含有AtRBCS-1A启动子的pMD18-T载体中大约1.7kb的目的基因条带，回收该条带。

3.2酶切产物的连接

经酶切的pCAMBIA1301载体片段和含有AtRBCS-1A启动子的pMD18-T载体中大约1.7kb的目的基因片段以摩尔比1∶4的比例进行16℃连接过夜。

3.3连接产物的转化

连接产物热激法转化大肠杆菌Trans 5α感受态细胞，转化菌在含Kan 50μg/ml的LB固体平板上37℃培养16h左右。

3.4重组子的鉴定

质粒酶切鉴定

提取阳性克隆质粒，对质粒进行BamH I和Nco I双酶切，酶切体系同实施例3中的20μl体系。0.8％琼脂糖凝胶电泳检测被切开的启动子目的条带和切开的载体片段，两条带大小正确，表明pAtRBCS-1A：GUS载体构建正确。

实施例4农杆菌感受态的制备和转化

4.1农杆菌GV3101感受态的制备

1)从LB平板(含50μg/ml利福平和40μg/ml庆大霉素)上挑取农杆菌单菌落，接种于50μg/ml利福平和40μg/ml庆大霉素的LB液体培养基中，200rpm/min，28℃培养过夜。

2)取2ml过夜培养液接种于50ml含相同抗生素的LB液体培养基中在相同条件下培养至OD600达0.5。

3)菌液冰浴30min，4℃，5000rpm离心10min，收集菌体。

4)将菌体重悬于冰浴的10ml 0.15mol/L的NaCl中，离心收集菌体。

5)在悬浮于1ml 20mmol/L冰浴冷的CaCl₂溶液中，以200μl/管将菌液分装在1.5ml离心管中，置液氮中速冻1min，-70保存备用。

4.2电击法转化农杆菌GV3101

1)用清水将点击杯稍冲3遍。

2)向电击杯中加入75％酒精，浸泡30min，弃去酒精，于超净工作台内挥发干乙醇，紫外杀菌20min。将清洗好的电击杯放冰上，待用。

3)取2μl重组质粒至50μl GV3101感受态细胞中，轻打混匀，然后转移至电击杯中，置冰上30min。

4)准备好电击装置(BioRad)，在1800V高压下电击。

5)迅速放冰上，冰浴2min。

6)加入800μl LB培养液，28℃200rpm培养2h。

7)取100μl菌液涂板(含50μg/ml利福平、40μg/ml庆大霉素和50μg/ml卡那霉素)。

4.3菌体PCR鉴定及电泳

超净工作台上用移液器取单菌落作为模板进行PCR，反应体系和反应条件同上。

实施例5启动子的功能验证-拟南芥转化及转基因株系的鉴定

5.1拟南芥种植

向拟南芥种子中加入消毒液(其中每50ml消毒液中含有15ml龙安84消毒液，35ml双蒸水和50μl 20％Triton X-100)，于百向摇床上充分消毒15min，吸出消毒液，用双蒸水漂洗5次，于4℃春化3d，后点播在MS平板上。然后移植到营养钵中(营养土与蛭石按等比例混合)，23℃培养，16h光照/8h黑暗光周期，光强30-40μmolm^-2s^-1。待植株开花后，剪去其主枝顶端，促进侧枝发展。在剪枝后的4-6d内，进行农杆菌转化。

5.2农杆菌的制备

接种含有pAtRBCS-1A：GUS载体的GV3101农杆菌于10ml LB培养基(50μg/ml利福平、40μg/ml庆大霉素和50μg/ml卡那霉素)中，28℃培养振荡过夜。然后转接于500ml含相同抗生素的LB培养基中扩大培养。5000rpm离心15min沉淀菌体。将农杆菌重悬于200ml转化缓冲液(MS大量元素，3％蔗糖，0.03％Silwet-77)中，OD₆₀₀≈1。

5.3拟南芥转化

把200ml菌液倒入浅盘中。将修剪好的拟南芥倒扣并使所有花序浸入悬浮菌液中，轻轻搅动沾花30s。取出花盆侧放于托盘中，用保鲜袋包裹以保湿。将托盘置暗处理培养24h，然后取出营养钵并直立放置，恢复光照，继续培养植株至成熟。

5.4阳性植株的筛选

T₀代种子用消毒液(其中每50ml消毒液中含有15ml龙安84消毒液，35ml双蒸水和50μl 20％Triton X-100)消毒后，点播在MS选择培养板(25mg/L潮霉素)上。于4℃下春化3d。移入培养室中培养。大约7d左右，挑选潮霉素抗性植株(根伸长至培养基中)并移栽到营养钵中。培养直至种子成熟。同样方法筛选至得到T₃代种子。

5.5GUS染色

取材：

黑暗中生长3d的拟南芥转到光下生长1d，以黑暗生长4d的拟南芥作为对照；光下生长3d的拟南芥转到黑暗生长1d，以光下生长4d的拟南芥作为对照。野生型拟南芥Col-0作为转基因植株的对照。

长日条件下生长的成苗期转基因植株光和黑暗中根、茎、叶、花和果荚各器官。

将材料转入预冷的不含X-gluc的染色缓冲液(0.2％Triton X-100，2mmol/L亚铁***，2mmol/L铁***，50μmol/L磷酸钠缓冲液，pH 7.2)中洗涤。

染色：去除洗涤染色缓冲液，加入含X-gluc的染色缓冲液(0.2％Triton X-100，2mmol/L亚铁***，2mmol/L铁***，2mmol/LX-gluc，50μmol/L磷酸钠缓冲液，pH 7.2)并将样品放到冰上真空抽滤15-20min，直至所有材料都浸没在溶液中。

将材料转移到37℃染色数小时至过夜。

脱色：等组织出现蓝色时，去除染色液，用75％乙醇脱色。

直接在显微镜下观察材料并照相。染色结果表明：在黑暗与白光中生长4d的转基因拟南芥幼苗中均能观察到显示GUS活性的蓝色，并且与持续黑暗生长4d的转基因拟南芥幼苗子叶中的蓝色相比，持续白光生长4d的颜色更深，甚至其下胚轴中也能观察到较深的蓝色(图4-A，B)。以持续黑暗生长4d的拟南芥幼苗作为对照，持续黑暗生长3d的拟南芥幼苗转至光照条件下1d后，转基因幼苗子叶中的蓝色加深不明显，但是其下胚轴显著变蓝(图4-A)；而以持续白光生长4d的拟南芥幼苗作为对照，持续白光生长3d的拟南芥幼苗转至黑暗条件下1d后，转基因幼苗子叶中的蓝色显著变浅(图4-B)。我们进一步观察了长日条件下生长的成苗期转基因拟南芥各组织器官的GUS染色情况。结果表明，在黑暗和白光中，根系组织都没有观察到显示GUS活性的蓝色；而地上部分的绿色组织，包括茎、叶、花和果荚均有蓝色显示(图4-C)。另外，白光中绿色组织染色所显示的蓝色明显深于黑暗条件下的染色结果，尤其以叶中表现的突出(图4-C)。以上的结果说明虽然GUS在黑暗中也有表达，但光诱导能增强GUS表达；并且从组织特异性看，GUS在拟南芥地上部分绿色组织中特异性表达。

以上研究结果表明，在转基因拟南芥中AtRBCS-1A启动子能够驱动外源基因受光诱导表达，并且能够较强地驱动外源基因在植物绿色组织中表达，这与利用野生型拟南芥Col-0进行的定量PCR分析结果基本一致。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种植物光诱导型启动子，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸形成的由SEQID No.1衍生的核苷酸序列。

2.一种植物光诱导型启动子的构建方法，具体步骤为：

(1)根据拟南芥在一天中不同时间点以及光和黑暗条件下各器官中AtRBCS-1A基因的定量PCR数据，分析光诱导型基因AtRBCS-1A的表达谱；

(2)根据AtRBCS-1A基因序列设计基因特异性引物，克隆权利要求1所述光诱导型启动子。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述拟南芥为拟南芥Col-0。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述特异性引物的核苷酸序列为：

5’-CGCGGATCCTCCGTGGTCGAGATTGTGTA-3’；

5’-CATGCCATGGTCTTTGTGTGACTGAGGTTTGG-3’。

5.扩增植物光诱导型启动子的引物，其核苷酸序列为：

5’-CGCGGATCCTCCGTGGTCGAGATTGTGTA-3’；

5’-CATGCCATGGTCTTTGTGTGACTGAGGTTTGG-3’。

6.含权利要求1所述启动子的植物表达载体。

7.如权利要求6所述的表达载体，其为pAtRBCS-1A。

8.权利要求1所述启动子在植物基因工程中获得光诱导表达目的基因的转基因植株中的应用。

9.权利要求1所述启动子在培育拟南芥中的应用。

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