CN102600120B - 肉桂酸在制备防治畜禽病毒感染的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及肉桂酸在制备防治畜禽病毒感染的药物中的应用。肉桂酸具有抗家禽病毒病的活性，能有效防治禽流感H9亚型病毒、禽流感H5亚型病毒、法氏囊病毒LX毒株、肾型传染性支气管炎病毒以及鸡传染性喉气管炎病毒的感染，从而降低发病鸡群的死亡率，有效提高家禽的成活率和生产性能。
Description
技术领域
本发明涉及肉桂酸的新用途，具体涉及肉桂酸在制备防治畜禽病毒感染的药物中的应用。
背景技术
酚酸类化合物在药用植物中分布广泛，如蔷薇科的乌梅，忍冬科的金银花，伞形科的当归、川芎等。各种酚酸类成分具有广泛的药理学活性，如清除自由基、抗炎、抗病毒、免疫调节、抗凝血及抗肿瘤等作用。同时研究表明，阿魏酸对感冒病毒、呼吸道合胞体病毒和艾滋病病毒都有显著抑制作用。Eich教授在研究植物此生代谢产物作为抗逆转录病毒剂时发现，绿原酸是有希望的抗艾滋病毒(HIV)的先导化合物。在研究鼠掌老鹳草的过程中发现从其乙醇提取物中分得的原儿茶酸、没食子酸、鞣花酸、短叶苏木酚均有抗菌活性，其中以柯里拉京为最强对金黄色葡萄球菌的抑菌浓度为25ug/ml，短叶苏木酚对金葡菌和大肠杆菌的抑菌浓度为0.125mg/ml和0.5mg/ml。总之，这类物质是一种具有极大开发价值的天然产物，将其应用于畜禽疾病领域，有着十分广阔的前景。
2005年农业部发文规定禁止把广谱抗病毒药物(吗啉胍、金刚烷胺、金刚乙胺、阿昔洛伟、利巴韦林等及其盐、酯的单方、复方等制剂)应用到畜禽药物中，防治抗病毒药物耐药性从畜禽向人类传递。这无疑是对脆弱畜禽饲养业一个重拳出击，直接威胁着畜禽业的生存和发展。中国巨大的市场需要迅速开发一些有效的能替代抗病毒药物的替代品，来弥补市场的空缺，对抗病毒药物的开发正是满足这个巨大的市场需求。
肉桂酸，又名β-苯丙烯酸、3-苯基-2-丙烯酸，是从肉桂皮或安息香分离出的酚酸类化合物，体内、外实验表明肉桂酸具有抗肿瘤、抗菌、消炎作用和抑制黄嘌呤氧化酶的活性，广泛用于香精、香料、食品添加剂、医药工业、美容、农药、有机合成等方面。
Chia-Jui Weng(2011)等报道，肉桂酸具有抗分支杆菌活性，同时能作为协同剂开发成一种抗结核病药物。
中国专利申请200710018104.5(公开号为CN 101084885A)、名称为“抗柯萨奇病毒的两种肉桂酸缓释制剂及其制备工艺”，该专利描述了两种具有抗柯萨奇病毒作用的肉桂酸缓释制剂及其制剂工艺，包括缓释片剂和缓释胶囊剂。其技术要点是：利用肉桂酸具有抗柯萨奇病毒和抗氧化、改善心肌缺血等药理活性，以肉桂酸为药用原料制成缓释片剂和胶囊剂两种缓释制剂，用于治疗由于柯萨奇病毒感染引起的相关疾病，包括病毒性心肌炎、病毒性心肌病、病毒性心肌炎所致心律失常、病毒性脑炎和糖尿病。可解决因肉桂酸半衰期短，药效不稳定的问题。
中国专利申请99115661.7(公开号为CN 1303671A)，名称为“肉桂酸用于制备治疗糖尿病的药物”声明肉桂酸作为药物，对糖尿病具有良好的治疗效果。
中国专利申请00113309.8(公开号为CN 1312070A)公开了肉桂酸和肉桂酸盐及其衍生物在制药中的应用，主要涉及抗心血管疾病、抗肥胖症、镇痛、抑菌、利胆、生白细胞、抗氧化及提高机体免疫力等方面。
中国专利申请200680020563.0(公开号为CN 101193854A)，名称为“可用作抗肿瘤剂的肉桂酸、苯丙炔酸和苯丙酸衍生物”，该专利中公开了肉桂酸可与其他药物合用抗肿瘤。
中国专利申请201010109913.9(公开号为CN 101780064A)对羟基肉桂酸在制备防治畜禽病毒病或细菌病药物。该发明专利显示对羟基肉桂酸具有抑制家禽法氏囊病毒、禽流感H9亚型的作用。
目前，尚未见到肉桂酸在畜禽抗病毒方面的应用。
发明内容
本发明目的是提供肉桂酸的新用途。
本发明提供的肉桂酸在制备防治畜禽病毒感染的药物中的应用。
所述病毒感染为传染性法氏囊病毒、禽流感病毒、传染性支气管炎病毒和传染性喉气管炎感染；
所述禽流感病毒为H9、H5亚型病毒，所述H9病毒为H9N2病毒；
所述传染性支气管炎病毒为肾型传染性支气管炎病毒。
该病毒感染包括单独感染、混合感染以及病毒感染的疾病所引起的继发感染。
所述肉桂酸为单独给药，或与辅料制成制剂给药。
所述制剂为颗粒剂、口服液、粉剂或者片剂。
所述辅料选自无水乙醇、吐温-80、乳糖、可溶性淀粉和麸皮中的一种或几种。
另外，本发明提供的肉桂酸的新用途中，肉桂酸还可以与其它药物联合给药。
所述其他药物为酚磺乙胺。
所述肉桂酸与酚磺乙胺的重量比为7-10∶1.0-5.0。
优选地，所述肉桂酸与酚磺乙胺的重量比为10∶1.0-3.0。
进一步优选，所述肉桂酸与酚磺乙胺的重量比为10∶3.0。
本发明所述的重量份可以是μg、mg、g、kg等医药领域公知的重量单位。
上述制剂采用药学上常规的制剂方法制备而成。
肉桂酸的有效剂量是5-50毫克/公斤体重，直接给药或制备成制剂给药，也可以单独或制成制剂后添加到饲料中或者饮水中给药。
本发明提供的肉桂酸具有以下优点：
1、大量试验研究表明，肉桂酸具有抗家禽病毒病的活性，能有效防治禽流感H9亚型病毒、禽流感H5亚型病毒、法氏囊病毒LX毒株以及肾型传染性支气管炎病毒的感染，从而降低发病鸡群的死亡率，有效提高家禽的成活率和生产性能。
2、动物试验显示：与对羟基肉桂酸相比，肉桂酸抗家禽禽流感H9亚型病毒、禽流感H5亚型病毒、法氏囊病毒LX毒株效果更好，成本更低，同时，对于家禽肾型传染性支气管炎和传染性喉气管炎也具有良好的治疗效果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
肉桂酸购自湖北武汉远城科技有限公司，批号20100305，含量为99.5％；酚磺乙胺购自北京双鹤药业股份有限公司，批号20100606，含量为99.8％。对羟基肉桂酸购自湖北武汉远城科技有限公司，批号20110608，含量为99.0％。
实施例1：肉桂酸口服液(肉桂酸浓度为100mg/ml)
1、组成：肉桂酸10g、无水乙醇25ml、吐温-8025ml、注射用水加至100ml。
2、制备方法：先将肉桂酸溶于无水乙醇中，接着加入吐温80，最后缓慢加入注射用水，补足至100ml。
实施例2：肉桂酸口服液(肉桂酸浓度为90mg/ml)
1、组成：肉桂酸9g、无水乙醇20ml、吐温-8030ml、注射用水加至100ml。
2、制备方法：先将肉桂酸溶于无水乙醇中，接着加入吐温80，最后缓慢加入注射用水，补足至100ml。
实施例3：肉桂酸口服液(肉桂酸浓度为100mg/ml)
1、组成：肉桂酸10g、无水乙醇30ml、吐温-80溶液30ml、注射用水加至100ml。
2、制备方法：先将肉桂酸溶于无水乙醇中，接着加入吐温80，最后缓慢加入注射用水，补足至100ml。
实施例4：肉桂酸口服液(肉桂酸浓度为100mg/ml)
1、组成：肉桂酸10g、无水乙醇40ml、吐温-8025ml、注射用水加至100ml。
2、制备方法：先将肉桂酸溶于无水乙醇中，接着加入吐温80，最后缓慢加入注射用水，补足至100ml。
实施例5：肉桂酸口服液(肉桂酸浓度为100mg/ml)
1、组成：肉桂酸10g、无水乙醇40ml、吐温-8010ml注射用水加至100ml。
2、制备方法：先将肉桂酸溶于无水乙醇中，接着加入吐温80，最后缓慢加入注射用水，补足至100ml。
实施例6：肉桂酸颗粒(肉桂酸含量为50％)
1、组成：50g肉桂酸、10g乳糖、25g可溶性淀粉。
2、制备方法：将肉桂酸、乳糖、可溶性淀粉混合制粒，烘干整粒，分装，即得。
实施例7：肉桂酸粉剂(肉桂酸含量为50％)
1、组成：50g肉桂酸、35g可溶性淀粉。
2、方法：将肉桂酸粉碎，过60目筛，然后与可溶性淀粉混合均匀，分装，即得。
实施例8：复方肉桂酸口服液(肉桂酸浓度为100mg/ml，酚磺乙胺浓度为3％)
1、组成：肉桂酸10g、无水乙醇5025ml、吐温-804025ml、酚磺乙胺3g、注射用水加至100ml。
2、制备方法：先将肉桂酸溶于无水乙醇中，接着加入吐温80，最后缓慢加入注射用水，溶解酚磺乙胺后，补足至100ml。
如未特别说明，下述实验例提到的肉桂酸口服液为按照实施例3方法制备而成的口服液，所提到的肉桂酸颗粒为按照实施例6方法制备而成的颗粒，所提到的肉桂酸口服液是按照实施例8方法制备而成的粉剂。
实验例1：对人工感染鸡法氏囊病的治疗试验
试验目的：通过试验研究肉桂酸对鸡传染性法氏囊病的治疗效果。
1、材料与方法
1.1试验动物：24日龄SPF鸡。
1.2试验菌株：法氏囊超强毒IBDV LX株，0.2ml含104.0ELD50，由北京市农林科学院畜牧兽医研究所提供。
1.3试验药品：实施例1制备的肉桂酸口服液。
1.4分组：分为8组：病毒感染组、空白对照组、黄芪多糖对照组(即阳性药物对照组)、对羟基肉桂酸组、肉桂酸高剂量组、中剂量组和低剂量组，复方肉桂酸组，每组10-15只24日龄的SPF鸡。
1.5给药剂量和处理方式：
黄芪多糖组，给予黄芪多糖，250mg/kg；
肉桂酸高剂量组，给予实施例1的口服液，40mg/kg；
肉桂酸中剂量组，给予实施例1的口服液，20mg/kg；
肉桂酸低剂量组，给予实施例1的口服液，10mg/kg；
复方肉桂酸组，给予实施例8的口服液，20mg/kg；
对羟基肉桂酸组，给予口服液，20mg/kg；
给药方式：饮水方式给药；
病毒感染组，给予稀释液组，只攻毒，不给药；
空白对照组：不攻毒，也不给药。
1.6攻毒方法：
病毒稀释液制备：取第3代人工感染传染性法氏囊病毒SPF鸡的法氏囊组织，用玻璃研磨器研磨，1个法氏囊加入1mL生理盐水稀释，制成组织匀浆，反复冻融三次，离心取上清，上清液用生理盐水进行1∶10稀释，稀释液中按照4000u/ml加入庆大霉素作用半小时后使用。除空白对照组外，其它各组均攻毒，每只鸡进行点眼、滴鼻，各0.1ml。
1.7给药方案：攻毒24小时后连续给药5天，一天2次，具体见表1。
表1：治疗试验分组情况及处理
| 分组 | 数量(只) | 给药剂量 | 给药次数 |
| 肉桂酸高剂量组 | 15 | 40mg/kg体重 | 2次/天 |
| 肉桂酸中剂量组 | 15 | 20mg/kg体重 | 2次/天 |
| 肉桂酸低剂量组 | 15 | 10mg/kg体重 | 2次/天 |
| 对羟基肉桂酸组 | 15 | 20mg/kg体重 | 2次/天 |
| 黄芪多糖对照组 | 14 | 250mg/kg体重 | 2次/天 |
| 复方肉桂酸组 | 15 | 20mg/kg体重 | 2次/天 |
| 病毒感染组 | 14 | 攻毒，不给药 | - |
| 空白对照组 | 10 | 不攻毒，不给药 | - |
2、试验指标
2.1整体观察指标：精神状态、增重率、鸡只的死亡率以及药物保护率。
2.2免疫器官指数：试验结束后采取鸡只的免疫器官(脾脏、法氏囊)进行称重，并计算法氏囊和脾脏指数。脏器指数＝脏器重量/体重
2.3法氏囊眼观病变的指标：法氏囊的病变情况，是否肿大或萎缩，颜色，表面是否有胶冻样渗出物。
2.4其它组织的病理解剖学变化：胸肌和腿肌的出血情况，肾肿的情况，肌胃和腺胃交界处的变化情况。
3、试验结果：见表2
表2：肉桂酸治疗效果
注：同一列中a-b，b-cP＜0.05，a-c，b-d，a-dP＜0.01
表2结果显示：
从死亡率来看，肉桂酸高、中、低三个组的成活率分别为93.3％、86.7％和87.6％，显著高于黄芪多糖对照组的66.6％以及对羟基肉桂酸组的80％；肉桂酸高剂量组与复方肉桂酸组相比，成活率差异不显著，但显著性高于肉桂酸中剂量组、低剂量组和对羟基肉桂酸组。
从相对增重率来看，肉桂酸高、中、低三个组增重分别为96.2％、97.2％和87.2％，而对羟基肉桂酸和黄芪多糖对照组分别为73.0％和63.6％，肉桂酸各测试组显著性高于黄芪多糖组和对羟基肉桂酸组。肉桂酸中剂量组与复方肉桂酸组相比，相对增重率差异也不显著。
从法氏囊指数来看，肉桂酸高、中、低剂量组分别为0.30、0.33和0.29，各测试组显著性高于黄芪多糖对照组和对羟基肉桂酸组。肉桂酸中剂量组与复方肉桂酸组相比，法氏囊指数小于后者，但差异不显著。
从脾脏指数来看，肉桂酸中剂量和高剂量组显著性高于黄芪多糖对照组。肉桂酸中剂量组与复方肉桂酸组相比，脾脏指数小于复方肉桂酸，这提示肉桂酸及复方肉桂酸可以显著降低病毒对法氏囊和脾脏的损伤。
虽然在增重率方面、法氏囊指数和脾脏指数方面，同等剂量的肉桂酸与复方肉桂酸组差异不显著，但复方肉桂酸的成活率优于同剂量的肉桂酸组和对羟基肉桂酸。
4、结论：肉桂酸以20mg/kg体重连续口服5天，可以有效的提高人工感染法氏囊鸡的存活率，改善生产性能，增强免疫力，且添加止血敏的复方肉桂酸口服液效果更佳。
综合分析，肉桂酸抗法氏囊的活性优于黄芪多糖和对羟基肉桂酸组，能显著性的降低死亡率，提高生产性能，有望开发成一种抗病毒新药。
实验例2：对人工感染H9N2流感病毒小鼠的治疗试验
试验目的：测定肉桂酸是否可以防治禽流感病毒H9N2感染。
1、材料与方法
1.1实验动物：6周龄雌雄BALB/c小鼠，购自军事医学科学院实验动物中心。
1.2试验毒株：禽流感A/Chicken/HB/4/2008(H9N2)(Genbankaccession # FJ499463-FJ499470)，BALB/c小鼠的LD 50＝10-4.25/0.1ml(Guangcun Deng，等.Acute Respiratory Distress Syndrome Induced by AvianInfluenza A(H9N2)Virus in Mice.Archives of Virology，2010，155：187-195).
1.3实验分组和处理，见表3，其中肉桂酸各组给药为实施例1制备的口服液。
表3：试验分组及处理
| 分组 | 数量(只) | 给药浓度 | 给药途径 | 给药次数 |
| 肉桂酸高剂量组 | 10 | 40mg/kg | 口服 | 2/天 |
| 肉桂酸中剂量组 | 10 | 20mg/kg | 口服 | 2/天 |
| 肉桂酸低剂量组 | 10 | 10mg/kg | 口服 | 2/天 |
| 对羟基肉桂酸组 | 10 | 20mg/kg | 口服 | 2/天 |
| 金刚烷胺对照组 | 10 | 20mg/kg | 口服 | 2/天 |
| 复方肉桂酸组 | 10 | 20mg/kg | 口服 | 2/天 |
| 病毒对照组 | 10 | 0 | - | - |
| 空白对照组 | 10 | 0 | - | - |
1.4攻毒方法：除空白对照组外，其它各组均攻毒，100LD50(100倍的LD50)滴鼻0.1ml/只。
攻毒96h后，等50％小鼠出现发病症状：呼吸困难和皮毛竖立时，开始给药，连续给药5天，给药结束后观察5天，共计10天。
1.5观察指标：分别称取每只小鼠的初始体重和末体重；发病率、死亡率；肺指数(肺重：体重)、肺出血指数(肺出血面积：肺总面积)；测定存活小鼠肺脏禽流感病毒含量。
2、测定指标
相对增重率＝相对增重/健康对照体重增重×100％
肺脏指数＝肺脏重/试验末体重×100％
病毒分离率＝肺脏/接种样品×100％
肺指数抑制率＝病毒对照组平均肺指数-实验组平均肺指数)/病毒对照组平均肺指数×100％
平均存活时间＝总的存活天数/只数
3、试验结果
3.1禽流感攻毒后药物对小鼠死亡率以及体重的影响：见表4
表4：攻毒后小鼠体重的影响
| 分组 | 数量(只) | 初始体重(g) | 终末体重(g) | 相对增重率％ | 存活率(％) |
| 肉桂酸高剂量 | 10 | 17.8±0.45 | 18.21±2.21 | 16.4a | 90.0a |
| 肉桂酸中剂量 | 10 | 18.5±0.40 | 18.88±3.37 | 15.2a | 90.0a |
| 肉桂酸低剂量 | 10 | 18.3±0.51 | 18.65±4.12 | 14.0a | 80.0b |
| 对羟基肉桂酸组 | 10 | 18.0±0.35 | 18.32±5.11 | 14.3a | 80.0b |
| 金刚烷胺对照组 | 10 | 17.3±0.59 | 17.58±2.04 | 11.2b | 50.0c |
| 复方肉桂酸组 | 10 | 16.80±0.31 | 18.15±3.12 | 54.0c | 90.0a |
| 病毒对照组 | 10 | 18.2±0.78 | 16.22±3.15 | -79.2d | 60.0c |
| 空白对照组 | 10 | 17.8±1.24 | 20.03±1.42 | 100.0 | 100.0 |
注：同一列中a-b，b-cP＜0.05，a-c，b-d，a-dP＜0.01；
表4结果显示：
从小鼠存活率来看，肉桂酸高、中、低三个剂量组分别为90％、90％和80％，显著性高于金刚烷胺对照组和病毒对照组，肉桂酸低剂量组与对羟基肉桂酸组相比差异不显著(P＞0.05)，但复方肉桂酸存活率显著性高于对羟基肉桂酸和肉桂酸低剂量组(P＜0.05)。
从增重率来看，肉桂酸高、中剂量组和低剂量组显著高于金刚烷胺对照组(P＜0.05)，极显著性高于病毒对照组(P＜0.01)，但复方肉桂酸极显著性高于金刚对照组。同时复方肉桂酸组的、增重率优于同剂量的肉桂酸组。
3.2禽流感攻毒后对小鼠平均生存时间的影响：见表5
表5：小鼠存活时间和存活率
| 分组 | 存活数量(只) | 平均存活时间 |
| 肉桂酸高剂量组 | 9 | 8.5 |
| 肉桂酸中剂量组 | 9 | 8.0 |
| 肉桂酸低剂量组 | 8 | 6.2 |
| 对羟基肉桂酸组 | 8 | 6.0 |
| 金刚烷胺对照组 | 5 | 6.5 |
| 复方肉桂酸组 | 9 | 8.5 |
| 病毒对照组 | 6 | 4.5 |
| 空白对照组 | 10 | 10.0 |
表5结果显示：攻毒感染后，肉桂酸高剂量组、中剂量组的存活时间分别为8.5天和8天，金刚烷胺对照组为6.5天，因此，肉桂酸高剂量组和中剂量组均显著性高于金刚烷胺对照组和对羟基肉桂酸组，但低剂量组肉桂酸组与对羟基肉桂酸、金刚烷胺差异不显著。复方肉桂酸组的存活数量及存活时间优于同剂量的肉桂酸组。
3.3给药后禽流感病毒在肺脏组织上含量测定：见表6
表6：小鼠病变指数和病毒含量测定结果
| 分组 | 数量(只) | 肺脏指数(％) | 肺出血面积(％) | 肺脏病毒测定 |
| 肉桂酸高剂量 | 9 | 0.85±0.12a | 18.0a | 102.7ELD50/0.1ml |
| 肉桂酸中剂量 | 9 | 0.79±0.11a | 12.0b | 102.3ELD50/0.1ml |
| 肉桂酸低剂量 | 8 | 0.90±0.25a | 20.0a | 103.0ELD50/0.1ml |
| 对羟基肉桂酸组 | 8 | 0.89±0.11a | 19.5a | 103.4ELD50/0.1ml |
| 金刚烷胺对照组 | 5 | 1.17±0.09b | 50.0c | 105.5ELD50/0.1ml |
| 复方肉桂酸组 | 9 | 0.80±0.08a | 10.0b | 101.8ELD50/0.1ml |
| 病毒对照组 | 6 | 1.27±0.13c | 70.0d | 106.8ELD50/0.1ml |
| 空白对照组 | 10 | 0.78±0.08 | 0.0 | 0 |
注：同一列中a-b，b-c，c-dP＜0.05，a-c，a-d，b-dP＜0.01；
表6结果显示：感染后第10天，剖检存活小鼠，称取肺脏重量，肉桂酸高、中、低剂量组肺脏指数分别为0.85，0.79和0.90，对羟基肉桂酸为0.89，金刚烷胺对照组为1.17，肉桂酸三个剂量组显著性低于金刚烷胺对照组。但复方肉桂酸肺脏指数与肉桂酸三个剂量组、对羟基肉桂酸组相比差异不显著。
从肺脏出血面积来看，肉桂酸三个剂量组分别为18％、12％和20％，极显著低于金刚烷胺组(50％)和病毒对照组(70％)。肉桂酸中剂量组与复方肉桂酸相比，出血面积差异不显著。
攻毒后第10天从肺脏H9N2病毒含量测定来看，肉桂酸三个剂量组都极显著低于金刚烷胺组和病毒对照组，但肉桂酸低剂量组与对羟基肉桂酸相比差异不显著。复方肉桂酸与同剂量的肉桂酸相比，病毒含量显著性降低且差异显著。
因此，复方肉桂酸组肺出血面积、攻毒后第10天从肺脏中检测H9N2病毒的测定优于同剂量的肉桂酸组。
4、结论：肉桂酸和复方肉桂酸以不低于20mg/kg口服后，可以有效保护禽流感病毒H9N2的攻击，保护率达到90％，同时能增加体重、极显著性降低肺脏的病变指数，减少病毒在肺脏组织中的感染。
综合分析，肉桂酸可以有效提高禽流感病毒感染小鼠的成活率，延长存活时间。同时，可以降低肺脏指数、减少出血面积和病毒残留，促进小鼠恢复。
实验例3：对人工感染鸡传染性支气管炎病毒保护效果
试验目的：通过实验评价肉桂酸对人工感染SPF鸡传染性支气管炎(肾型)的治疗效果
1、材料与方法
1.1试验动物：3周龄SPF鸡，购自北京维通梅利亚实验动物有限公司。
1.2试验药物：黄芪多糖粉，购自北京生泰尔生物科技有限公司，批号20100605；实施例3、8制备的口服液为试验药物。
1.3试验分组：肉桂酸高、中、低剂量组(分别给予肉桂酸40、20和10mg/kg体重)、对羟基肉桂酸20mg/kg体重、黄芪多糖250mg/kg、复方肉桂酸组10mg/kg体重、病毒对照组和空白对照组，每组15只鸡。
1.4病毒株：传染性支气管病毒BJ1株，西北农林大学王晶钰副教授赠送(王晶钰，李鹏，倪斌等.鸡肾型传染性支气管炎病毒18株的分离及鉴定.中国兽医杂志，2006，42：19-20)。10日龄SPF鸡胚的ELD50为107.0/0.2ml。10日龄SPF鸡LD50＝103ELD50/0.2ml。
1.5给药方式：药物分别口服灌胃，每天给药一次。其他各组饮水给药，每天两次。病毒对照组：只攻毒，不给药。空白对照组：不攻毒，也不给药。
2、试验指标
整体观察指标：精神状态、增重率、鸡只的死亡率。
肾脏眼观病变的指标：重点观察肾脏病变，是否肿大出血，呈花斑肾，是否出现白色尿酸盐沉积。
肾脏病变指数为：
1分-单侧单列肾脏肿胀；
2分-单侧2列肾脏肿胀；
3分-单侧3列肾脏肿胀；
4分-双侧2列肾脏肿胀；
6分-双侧3列肾脏肿胀。
3、试验结果
3.1肉桂酸对试验鸡群体重和成活率的影响：见表7：
表7：体重变化情况
| 组别 | 只数 | 初体重(g/只) | 末体重(g/只) | 相对增重率(％) | 存活率(％) |
| 肉桂酸高剂量 | 15 | 138.7±18.15 | 237.20±18.2 | 85.13a | 93.3a |
| 肉桂酸中剂量 | 15 | 147.1±14.92 | 258.5±46.03 | 96.3b | 86.6b |
| 肉桂酸低剂量 | 15 | 132.1±21.42 | 245.7±32.15 | 98.2b | 80.0b |
| 对羟基肉桂酸 | 15 | 139.2±27.50 | 250.1±25.21 | 95.8b | 86.6b |
| 黄芪多糖组 | 15 | 145.8±12.78 | 251.3±55.19 | 91.2b | 60.0c |
| 复方肉桂酸组 | 15 | 145.2±12.10 | 259.1±17.30 | 98.5a | 100.0a |
| 病毒对照组 | 15 | 140.2±14.42 | 225.7±43.43 | 73.8c | 53.3c |
| 健康对照组 | 15 | 146.5±14.90 | 262.2±28.33 | 100.0 | 100.0 |
注：同一列中a-b，b-c，c-dP＜0.05，a-c，a-d，b-dP＜0.01；
表7结果显示：从存活率来看，肉桂酸高、中、低剂量三个组的存活率分别为93.3％、86.6％和80％，显著性高于黄芪多糖对照组(60％)和病毒对照组(53.3％)。复方肉桂酸存活率显著性高于肉桂酸中剂量组和低剂量组、黄芪多糖对照组。
从相对增重率来看，肉桂酸中剂量组和低剂量组分别达到96.3％和98.2％，黄芪多糖组为91.2％，复方肉桂酸组为98.5％，对羟基肉桂酸为95.8％，但五个组差异不显著。与病毒对照组相比，肉桂酸三个剂量组显著性高于病毒对照组。
3.2肉桂酸对试验鸡群病理学变化的影响：见表8
表8：治疗后鸡只临床病变和剖检情况
平均肾脏病变指数＝肾脏病变指数综合/存活鸡数
注：同一列中a-b，b-c，c-dP＜0.05，a-c，a-d，b-dP＜0.01；
表8结果显示：感染后肉桂酸三个剂量组临床腹泻率分别为7.1％，7.6％和16.6％，黄芪多糖对照组为33.3％。经统计学比较分析，肉桂酸三个剂量组都显著性低于黄芪多糖对照组，极显著性低于病毒对照组。
此外，剖检后肉桂酸三个剂量组肾脏病变指数分别为5.5，6.3和9.8，显著性低于黄芪多糖组。复方肉桂酸的腹泻率、肾脏病变指数优于同剂量的肉桂酸组和对羟基肉桂酸。
4、讨论：肉桂酸以不低于20mg/kg口服可以有效治疗鸡肾型传染性支气管炎病毒引起的感染，效果优于250mg/kg的黄芪多糖，复方肉桂酸的效果更佳。
综合分析，攻毒后第5天试验鸡群出现死亡，剖检见攻毒后的鸡的肾脏有严重病变发生，说明本试验模型成立。攻毒后给予20mg/kg和40mg/kg肉桂酸，发现人工感染肾传支有一定的保护作用，且中剂量和高剂量组显著性高于黄芪多糖对照组，且病理剖检后发现肾脏病变程度较轻。
实验例4：对人工感染鸡传染性喉气管炎病毒保护效果
试验目的：通过实验评价肉桂酸对人工感染SPF鸡传染性喉气管炎的治疗效果
1、材料与方法
1.1试验动物：3周龄SPF鸡，购自北京维通梅利亚实验动物有限公司。
1.2试验药物：黄芪多糖粉，购自北京生泰尔生物科技有限公司，批号20100605；肉桂酸高、中、低剂量组药物来自实施例6制备的口服液为试验药物。复方肉桂酸来自实施例8制备的试验药物。
1.3试验分组：肉桂酸颗粒高、中、低剂量组(分别给予肉桂酸40、20和10mg/kg体重)、对羟基肉桂酸口服剂量为20mg/kg体重、黄芪多糖250mg/kg、复方肉桂酸组口服剂量为20mg/kg体重、病毒对照组和空白对照组，每组12只鸡。
1.4病毒株：
鸡传染性喉支气管病毒ILT/13株，购自中国兽药监察所(病毒编号AV1231)。10日龄SPF鸡胚的ELD50为107.0/0.2ml，经过静脉注射测定22日龄SPF鸡龄LD50＝102.3ELD50/0.1ml。
1.5给药方式：攻毒后48小时待50％的鸡只出现打蔫、张口喘气症状，开始给药，每天给药2次。其他各组饮水给药。病毒对照组：只攻毒，不给药。空白对照组：不攻毒，也不给药。
2、试验指标
整体观察指标：精神状态、增重率和鸡只的死亡率。
3、试验结果：
3.1肉桂酸对试验鸡群体重影响：见表9
表9：人工感染后试验鸡体重的变化情况
注：同一列中a-b，b-cP＜0.05，a-cP＜0.01；
表9结果显示：从相对增重率来看，肉桂酸高剂量、中剂量组和低剂量组分别为67.05％、67.92％和60.15％，对羟基肉桂酸为56.65％，黄芪多糖组为58.5％，复方肉桂酸为80.52％，经过统计学分析复方肉桂酸显著性高于肉桂酸三个剂量组和对羟基肉桂酸，极显著性高于黄芪多糖组。
3.2肉桂酸对试验鸡成活率的影响：
表10结果显示：肉桂酸高、中、低剂量三个组的存活率分别为91.6％、83.3％和75.0％，显著性高于对羟基肉桂酸和黄芪多糖对照组。同时复方肉桂酸的存活率优于同剂量的肉桂酸。
表10：人工感染后试验鸡成活率
| 分组 | 数量(只) | 死亡数(只) | 存活数(只) | 成活率(％) |
| 肉桂酸高剂量组 | 12 | 1 | 11 | 91.6a |
| 肉桂酸中剂量组 | 12 | 3 | 10 | 83.3b |
| 肉桂酸低剂量组 | 12 | 3 | 9 | 75.0c |
| 复方肉桂酸组 | 12 | 1 | 11 | 91.6a |
| 对羟基肉桂酸组 | 12 | 4 | 8 | 66.7c |
| 黄芪多糖对照组 | 12 | 6 | 6 | 50.0d |
| 病毒对照组 | 12 | 7 | 5 | 41.7d |
| 空白组 | 12 | 0 | 12 | 100 |
注：同一列中a-b，b-c，c-dP＜0.05，a-c，b-dP＜0.01；
4、讨论：肉桂酸以不低于20mg/kg口服可以有效治疗鸡传染性喉支气管炎病毒引起的感染，保护率达到83.3％，效果优于250mg/kg口服的黄芪多糖和20mg/kg对羟基肉桂酸，复方肉桂酸效果更佳。
实验小结
通过观察肉桂酸口服液对传染性法氏囊病、禽流感H9N2亚型、传染性喉气管炎和传染性支气管炎治疗效果，以上四种病毒均属于RNA病毒，因此结果显示肉桂酸对家禽RNA病毒感染性疾病有较好的治疗作用。与20mg/kg对羟基肉桂酸相比，肉桂酸疗效优于后者。同时，肉桂酸成本为对羟基肉桂酸的1/6，容易为用户接受。因此，综合成本和疗效考虑，肉桂酸可以有效治疗家禽出血性疾病，具有疗效确实、成本低廉的优势。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (5)
1.肉桂酸作为唯一活性成分在制备防治畜禽病毒感染的药物中的应用，该病毒感染为传染性法氏囊病毒、禽流感病毒、传染性支气管炎病毒和传染性喉气管炎病毒的感染，所述禽流感病毒为H9N2型，所述传染性法氏囊病毒为IBDV LX株，所述传染性支气管炎病毒为BJ1株，所述传染性喉气管炎病毒为ILT/13株。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肉桂酸为单独给药，或与各种辅料组成的制剂给药，或放到饲料或饮水中给药。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述制剂为颗粒剂、口服液、粉剂或者片剂。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肉桂酸的给药剂量5-50毫克/公斤体重。
5.肉桂酸与酚磺乙胺作为仅有的两种活性成分在制备防治畜禽病毒感染的药物中的应用，该病毒感染为传染性法氏囊病毒、禽流感病毒、传染性支气管炎病毒和传染性喉气管炎病毒的感染，所述禽流感病毒为H9N2型，所述传染性法氏囊病毒为IBDV LX株，所述传染性支气管炎病毒为BJ1株，所述传染性喉气管炎病毒为ILT/13株，所述肉桂酸与酚磺乙胺的重量比为7-10：1.0-5.0。
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