CN102586451A

CN102586451A - 一种建鲤配组繁殖的方法

Info

Publication number: CN102586451A
Application number: CN2012100607072A
Authority: CN
Inventors: 李建林; 俞菊华; 唐永凯; 李红霞
Original assignee: Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2012-03-09
Filing date: 2012-03-09
Publication date: 2012-07-18
Anticipated expiration: 2032-03-09
Also published as: CN102586451B

Abstract

本发明涉及一种建鲤配组繁殖的方法，过程如下：对建鲤繁殖群体采样血液或鳍条，提取基因组DNA，根据6个与建鲤增重相关的SNP位点，以提取的基因组DNA为模板，构建PCR-RFLP法对其SNPs进行基因型检测。用琼脂糖凝胶电泳检测酶切条带，进行基因型判定。选择含有4个以上增重较快基因型基的个体作为侯选亲本，对侯选亲本PCR-RFLP法电泳检测酶切条带进行数字化处理，用遗传分析软件进行分析，获得每个个体之间的遗传距离，并构建进化树。选择侯选亲本遗传距离较大、性腺发育较好以及配组的后代能富集4个以上体重增重较快基因型的个体进行配组繁殖。有助于提高建鲤生产性能、避免近亲交配、加快建鲤的选育进程。

Description

一种建鲤配组繁殖的方法

技术领域

本发明属于鱼类分子标记辅助育种领域，涉及一种建鲤配组繁殖的方法。

背景技术

建鲤(Cyprinus carplo vat.jian)具有生长快、体型好、青灰色、肉质肉味好、饲料转化率高、适应性抗逆能力强等优点，它是通过家系选育，多系杂交及雌核发育相结合的综合育种技术所培育成功的遗传性状稳定的一个鲤鱼品种。建鲤虽然有较全面的优良性状，但由于养殖面的扩大和繁育技术不规范，使得建鲤出现近交衰退现象，如生长减慢、抗病力下降、性成熟个体变小等。分子标记辅助选择，是在分子遗传标记的辅助下，综合利用遗传标记信息、个体数量性状信息、遗传距离等通过连锁分析，来选配亲本组合，可以提高生产性能、避免近亲交配，能缩短育种进程。

发明内容

本发明的目的是提供一种建鲤配组繁殖的方法，有助于提高建鲤生产性能、避免近亲交配、维持较高的遗传多样性，在建鲤育种和种质保护中有极大的应用价值。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案为：一种建鲤配组繁殖的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)对建鲤繁殖群体采血液或鳍条，采用DNA提取法提取基因组DNA；

(2)根据6个与建鲤增重相关的SNP位点，用步骤(1)的基因组DNA为模板，构建PCR-RFLP法对其SNPs进行基因型检测；

(3)选择含有4～6个增重较快基因型的个体作为侯选亲本；

(4)对侯选亲本PCR-RFLP法电泳检测酶切条带，用遗传分析软件进行进行数字化分析处理，获得每个个体之间的遗传距离，并构建进化树；

(5)选择侯选亲本遗传距离大于群体平均遗传距离、性腺发育成熟以及配组的后代能富集4个以上体重增重较快基因型的个体进行配组繁殖。

所述步骤(2)PCR-RFLP法中，PCR扩增条件为：总体积12.5μL，内含基因组DNA 50～100ng，其余组份按照Taq酶说明书添加，反应结束取3～5μL PCR液在1.0％琼脂糖凝胶电泳检测其浓度和条带单一性。

步骤(2)PCR-RFLP法中，PCR扩增程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，退火40s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸8分钟，4℃保存。

步骤(2)PCR-RFLP法中，RFLP检测条件为：5μL PCR液在总体积10μL中进行酶切，内含限制性内切酶2U，根据使用说明推荐的温度酶切3～5h，然后终止酶切反应，用1.2～2.0％琼脂糖凝胶电泳检测酶切条带，进行基因型判定。

步骤(4)中，使用的遗传分析软件为populations软件和MEGA软件。

步骤(2)PCR-RFLP法中，6个与建鲤增重相关SNP位点名称、引物序列、限制性内切酶和酶切产物条带以及步骤(3)中，6个与建鲤增重相关SNP位点增重较快的基因型选择如下表所示：

有益效果：采用本发明提供的建鲤配组繁殖方法，有助于避免建鲤近亲交配，维持建鲤较高的遗传多样性，提高建鲤生产性能，加快建鲤的选育进程。

附图说明

图1为建鲤候选亲鱼220尾(雄107尾，雌113尾)用MEGA软件根据D_A遗传距离构建的进化树。

具体实施方式

下列实施例中基因组DNA参照文献(萨姆布鲁克J，拉塞尔D W著.分子克隆试验指南[M].3版.黄培堂，王嘉玺，朱厚础，等，译.北京：科学出版社，2002：463-471)提取。

其中6个与建鲤增重相关SNP位点名称、检测引物序列、限制性内切酶和酶切产物条带以及增重较快基因型选择如下表所示：

实施例1：建鲤候选亲本选择及进化树的构建

建鲤繁殖群体937尾(雄486尾，雌451尾)，为中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴渔场培育。从每尾鱼的尾静脉采血0.5mL，取30μL血细胞抽提基因组DNA。以所取基因组DNA为模板，运用PCR-RFLP法对每个个体6个与建鲤增重相关的SNP位点进行基因型检测。PCR总体积12.5μL，内含基因组DNA 50～100ng，其余组份按照Taq酶说明书添加，PCR反应条件为：94℃2min；94℃30s，退火40s，72℃1min，30个循环；72℃延伸8分钟，4℃保存。。反应结束取3～5μL PCR液在1.0％琼脂糖凝胶电泳检测其浓度和条带单一性，然后取5μLPCR液在总体积10μL中进行酶切，内含限制性内切酶2U，根据使用说明推荐的温度酶切3～5h，然后终止酶切反应，于1.2～2.0％琼脂糖凝胶电泳检测酶切条带，进行基因型判定，选出含有4～6个增重较快基因型基的个体220尾(雄107尾，雌113尾)作为候选亲本。将220尾候选亲本的PCR-RFLP法电泳检测酶切条带进行数字化处理，用populations软件分析，获得每个个体之间的D_A遗传距离在0.0451～0.4747之间，平均为0.1794，用MEGA软件根据D_A遗传距离构建进化树(图1)。

实施例2：

建鲤候选亲本选择及进化树的构建同实施例1，从中选择出遗传距离在0.3以上、处于进化树不同的分枝上、性腺发育成熟以及配组的后代富集5～6个增重较快基因型的雌、雄个体和10尾，进行一对一配组繁殖，对它们后代的检测结果表明，平均遗传距离为0.3978，富集增重较快基因型5～6个。

实施例3：

建鲤候选亲本选择及进化树的构建同实施例1，从中选择出遗传距离在0.3以上、性腺发育成熟以及配组的后代富集4～6个体重增重较快基因型的雌鱼40、雄鱼30尾，进行群体配组繁殖(实验组)，同时从非候选亲本中随机选取雌鱼10、雄鱼10尾，进行群体配组繁殖(对照组)，在相同的养殖条件下，实验组比对照组平均生长快13.52％。

实施例4：

建鲤候选亲本选择及进化树的构建同实施例1，从中选择出遗传距离在0.3以上、性腺发育成熟以及配组的后代富集6个重增重较快基因型的雌、雄个体各5尾，进行一对一配组繁殖(实验组)，另外选择选择出遗传距离在0.1以下、性腺发育成熟以及配组的后代富集6个重增重较快基因型的雌、雄个体各5尾进行一对一配组繁殖(对照组)。对所配组的后代进行检测分析，结果表明，实验组后代的平均D_A遗传距离0.3541，对照组后代的平均D_A遗传距离0.0901。

序列表

<110> 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心

<120> 一种建鲤配组繁殖的方法

<130>

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caattcgcat cctgctatat attcg 25

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttagtatccc acgagtttgt ccca 24

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tggtttgggt ctccagcatc ttt 23

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgtggatttg gagatcaggt aacg 24

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tcagaccttc caaagctgcc at 22

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cacactgaga gcagtgatgt tcaga 25

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

acagcagtat tccttttaca tagtagtagc ag 32

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cacaatactg ttactttaat agctgcctag 30

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aaacaaccct cgtactctgt ttttagagca 30

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

agctagcacg acccgaatcg ttgtc 25

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ggcaatagag accatagatc ctatgcgg 28

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

caaacatgtc aggagactgg agacac 26

Claims

1.一种建鲤配组繁殖的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）对建鲤繁殖群体采血液或鳍条，采用DNA提取法提取基因组DNA；

（2）根据6个与建鲤增重相关的SNP位点，用步骤（1）的基因组DNA为模板，构建PCR-RFLP法对其SNPs进行基因型检测；

（3）选择含有4~6个增重较快基因型的个体作为侯选亲本；

（4）对侯选亲本PCR-RFLP法电泳检测酶切条带，用遗传分析软件进行数字化分析处理，获得每个个体之间的遗传距离，并构建进化树；

（5）选择侯选亲本遗传距离大于群体平均遗传距离、性腺发育成熟以及配组的后代能富集4个以上体重增重较快基因型的个体进行配组繁殖。

2.根据权利要求1所述的建鲤配组繁殖的方法，其特征在于：所述步骤（2）PCR-RFLP法中，PCR扩增条件为：总体积12.5 μL，内含基因组DNA 50~100 ng，其余组份按照Taq酶说明书添加，反应结束取3~5 μL PCR液在1.0%琼脂糖凝胶电泳检测其浓度和条带单一性。

3.根据权利要求1所述的建鲤配组繁殖的方法，其特征在于：所述步骤（2）PCR-RFLP法中，PCR扩增程序为：94℃预变性 2min；94℃变性30s，退火 40s，72℃延伸 1min，30个循环；72℃ 延伸8分钟，4℃保存。

4.根据权利要求1所述的建鲤配组繁殖的方法，其特征在于，所述步骤（2）PCR-RFLP法中，RFLP检测条件为： 5 μL PCR液在总体积10 μL中进行酶切，内含限制性内切酶 2 U，根据使用说明推荐的温度酶切3~5 h，然后终止酶切反应，用1.2～2.0%琼脂糖凝胶电泳检测酶切条带，进行基因型判定。

5.根据权利要求1所述的建鲤配组繁殖的方法，其特征在于：所述步骤（2）PCR-RFLP法中，与6个与建鲤增重相关SNP位点名称、引物序列分别为：

位点(1) jlGHSR1a E1-A450C，上游引物：CAATTCGCATCCTGCTATATATTCG

下游引物：TTAGTATCCCACGAGTTTGTCCCA，

位点(2) jlGHSR1a I-C386T，上游引物：TGGTTTGGGTCTCCAGCATCTTT

下游引物：TGTGGATTTGGAGATCAGGTAACG，

位点(3) jlGHSR1b E1-G159T，上游引物：TCAGACCTTCCAAAGCTGCCAT

下游引物：CACACTGAGAGCAGTGATGTTCAGA，

位点(4) jlGHR1aI3-A43G ，上游引物：ACAGCAGTATTCCTTTTACATAGTAGTAGCAG

下游引物：CACAATACTGTTACTTTAATAGCTGCCTAG，

位点(5) jlGHR1Be8-C12T ，上游引物：AAACAACCCTCGTACTCTGTTTTTAGAGCA

下游引物：AGCTAGCACGACCCGAATCGTTGTC，

位点(6) JlIGFBP3bI2-G30T ，上游引物：GGCAATAGAGACCATAGATCCTATGCGG

下游引物：TGTGGATTTGGAGATCAGGTAACG。

6.根据权利要求1所述的建鲤配组繁殖的方法，其特征在于：步骤（4）中使用的遗传分析软件为populations软件和MEGA软件。