CN102565020A

CN102565020A - 一种利用量子点共振散射定量检测蛋白质的方法

Info

Publication number: CN102565020A
Application number: CN2012100103117A
Authority: CN
Inventors: 开国银; 罗秀芹; 鞠冠华; 刘聪; 肖建波; 余锡宾
Original assignee: Shanghai Normal University
Current assignee: Shanghai Normal University; University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2012-01-13
Filing date: 2012-01-13
Publication date: 2012-07-11

Abstract

本发明公开了一种利用量子点共振散射定量检测蛋白质的方法，是对蛋白质检测方法的补充。本发明利用量子点通过静电作用吸附蛋白质，在可见光波长范围内能产生共振散射光来检测标准牛血清蛋白(BSA)和γ-球蛋白，以蛋白浓度(mol/L)为横坐标，以散射波长最大强度变化为纵坐标绘制标准曲线，通过散射强度变化可以由回归方程计算出蛋白质浓度。本发明还利用不同粒径大小的量子点对BSA和γ-球蛋白等进行了检测，发现蛋白质浓度与散射强度都存在较好的相关性，相关系数达到0.95-0.99，斜率都达到10⁷，灵敏度较高，且稳定性好，检测时间对结果影响不大，为定量检测生物大分子蛋白质的浓度开创了一种实用的新方法。

Description

一种利用量子点共振散射定量检测蛋白质的方法

技术领域

本发明属于蛋白质检测技术领域，具体说，涉及量子点共振散射方法检测分析蛋白质含量的应用的方法。

背景技术

蛋白质是一种由氨基酸组成的生物大分子，是生命活动的物质基础，没有蛋白质就没有生命。蛋白质的定量测定对于生化分析和临床医学具有重要的意义。常用的蛋白质测定方法有分光光度法(凯氏定氮法、双缩脲法和考马斯亮蓝法)和荧光光度法，但这些方法大多灵敏度不高，稳定性较差。随着蛋白质组学的发展，人们需要定量分析浓度更低的生物样品或提纯的蛋白质，因此寻找新的检测方法提高蛋白质测定的灵敏度具有重要的意义。

光散射是指一束光线通过介质时在入射光以外的方向上观察的光现象，它是电磁辐射与物质相互作用的一种表现形式。光散射技术在物理化学、胶体化学、高分子化学研究中具有十分重要的地位。由于传统的光散射技术不能满足定量分析在准确度和精密度方面的要求，未能在分析化学中推广应用。1993年Pasternack等用特殊的共振光散射技术研究了卟啉类化合物在核酸上的聚集，从而首次将该技术与化学过程联系起来。黄承志等利用这种技术研究了生物大分子体系的散射光谱，建立了共振光散射技术定量测定生物大分子的新的高灵敏度分析方法。目前这种技术被广泛应用于核酸、蛋白质、肝素、多糖等生物大分子的研究和测定。

量子点有独特的光学特性，量子点独特的性质基于它自身的量子效应，当颗粒大小到达纳米级时，尺寸限域将引起尺寸效应、量子限域效应、宏观量子隧道效应和表面效应，从而派生出与常观体系和微观体系不同的低维物性的纳米体系，展现出许多不同于宏观体材料的物理化学性质。这些特性在非线性光学、磁介质、生物、医药及功能材料等方面具有极为广阔的应用前景。

对现有文献的报道中，虽然分别有有机染料或金属离子指示剂对生物大分子蛋白质和核酸结合的共振散射光谱分析，以及量子点共振散射特性的分析，但是至今尚未未有过利用量子点共振散射来定量检测蛋白质的文献报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用量子点定量检测蛋白质的方法，能够灵敏地检测出蛋白质含量。

量子点颗粒具有散射性质及光学特性，通过静电引力和范德华力吸附不同浓度的蛋白质，在可见光波长范围内能产生共振散射光，并有最大吸收波长。本发明利用上述特性和原理，在可见光波长范围内进行同步荧光检测，在一定的蛋白质浓度范围内，最大吸收波长的散射强度变化存在相关性，能够检测出很低浓度的蛋白质。

技术方案为，一种利用量子点定量检测蛋白质的方法，包括如下步骤：

将量子点悬浮分散于蛋白质溶液中，在456～466nm下进行同步荧光检测，测定散射强度，并与标准曲线对比得到蛋白质浓度；量子点与蛋白质溶液的用量比为5～10×10^-7mol/ml。优选的，量子点与蛋白质溶液的用量比为7～9×10^-7mol/ml。荧光检测条件为：发射和散射光栅为5nm，电压为400V。

所检测的蛋白质为BSA或γ-球蛋白。

所述量子点结构包括内核和表面包被的SiO₂外壳；内核粒径为3～10nm，为ZnS/ZnO量子点异质结构。这种量子点的制备方法包括如下步骤：

(1)将Zn(Ac)₂和CH₃CSNH₂加入1，4-丁二醇中，超声分散直至形成透明前驱体溶液；Zn(Ac)₂与CH₃CSNH₂摩尔比为1∶0.25～0.7；Zn(Ac)₂与1，4-丁二醇用量比为0.1～0.4mol/L；

(2)步骤(1)所得到的前驱体溶液转移至水热反应釜中，190～220℃下反应16～20h；冷却至室温后，加入蒸馏水混匀，离心分离取沉淀洗涤干燥即得ZnS/ZnO量子点异质结构；

(3)ZnS/ZnO量子点异质结构溶解于乙醇中，加入氨水，搅拌下加入正硅酸乙酯溶液，继续反应10～15小时，取沉淀洗涤干燥；ZnS/ZnO量子点异质结构与乙醇、正硅酸乙酯用量比为1mmol∶300～600ml∶1～2ml。

标准曲线的构建方法包括以下步骤：

将量子点加入蛋白质含量为0～0.4μM的溶液中分散均匀，检测散射强度，以蛋白质浓度为横坐标，散射强度变化为纵坐标绘制标准曲线。

本发明利用量子点通过静电作用吸附蛋白质，在可见光波长范围内能产生共振散射光来检测标准牛血清蛋白(BSA)和γ-球蛋白，以蛋白浓度(mol/L)为横坐标，以散射波长最大强度变化为纵坐标绘制标准曲线，通过散射强度变化可以由回归方程计算出蛋白质浓度。本发明还利用不同粒径大小的量子点对BSA和γ-球蛋白等进行了检测，发现蛋白质浓度与散射强度都存在较好的相关性，相关系数达到0.95～0.99，斜率都达到10⁷，灵敏度较高，且稳定性好，检测时间对结果影响不大，为定量检测生物大分子蛋白质的浓度开创了一种实用的新方法。

在可见光范围内先测定不同空量子点的同步散射，再配制较低浓度的标准蛋白溶液，加入到不同量子点溶液中并吸附在量子点颗粒表面进行测定。以蛋白质浓度为横坐标，以最大散射强度变化为纵坐标绘制标准曲线，进而通过回归方程可以用计算蛋白质的浓度，从而为蛋白质检测提供了灵敏的检测方法。

本发明的有益效果是，结合量子点的荧光特性以及生物学技术原理，利用荧光检测蛋白质的方法，具有灵敏度高、稳定性好、经济实用等特点，能够广泛应用于生物学蛋白质微量定量检测领域，为农业质量检测、食品营养标准检测、转基因检测领域中蛋白质含量的检测提供了很好的方法，能够快速而准确地得到结果。

附图说明

图1为1号量子点检测BSA的共振散射图图谱

图2为1号量子点检测BSA的标准曲线

图3为2号量子点检测BSA的共振散射图图谱

图4为2号量子点检测BSA的标准曲线

图5为3号量子点检测BSA的共振散射图图谱

图6为3号量子点检测BSA的标准曲线

图7为4号量子点检测BSA的共振散射图图谱

图8为4号量子点检测BSA的标准曲线

图9为1号量子点检测γ-球蛋白的共振散射图图谱

图10为1号量子点检测γ-球蛋白的标准曲线

图11为2号量子点检测γ-球蛋白的共振散射图图谱

图12为2号量子点检测γ-球蛋白的标准曲线

图13为3号量子点检测γ-球蛋白的共振散射图图谱

图14为3号量子点检测γ-球蛋白的标准曲线

图15为4号量子点检测γ-球蛋白的共振散射图图谱

图16为4号量子点检测γ-球蛋白的标准曲线

具体实施方式

实施例1

1)ZnS/ZnO量子点异质结构制备：首先将2mmol Zn(Ac)₂和1.4mmolCH₃CSNH₂加入20ml 1，4-丁二醇中，超声分散直至形成透明前驱体溶液；然后将得到的溶液转移至30mL水热反应釜(内衬聚四氟乙烯)中，200℃下反应18h；待水热反应釜自然冷却至室温后，在所得产物中加入10～20ml蒸馏水混匀，8000rpm离心分离，所得沉淀用乙醇清洗三次除去杂质，60℃干燥5h即得ZnS/ZnO量子点异质结构，粒径为3～4nm。

2)包硅步骤：将0.1mmol ZnS/ZnO量子点溶于40mL乙醇中，加入0.5mL28wt％氨水混匀，然后在持续搅拌状态下缓慢加入0.1mL TEOS，继续搅拌反应12h。离心分离得沉淀，蒸馏水清洗两次即得SiO₂包裹的ZnS/ZnO量子点异质结构，粒径基本不变。

所得到的SiO₂包裹的ZnS/ZnO量子点用1号量子点表示。

步骤1)中加入的2mM Zn(Ac)₂和分别为4、6、8mmol，其余条件不变，得到的ZnS/ZnO量子点异质结构粒径分别为5～6、7～8和9～10nm；包硅的方法同步骤2)，所得到的SiO₂包裹的ZnS/ZnO量子点分别用2、3、和4号量子点表示。

实施例2以牛血清蛋白(BSA)的检测为例

(一)量子点溶液和蛋白质溶液的配制

1～4号量子点原浓度均为为5×10^-5mol/L，用双蒸水进行60倍稀释，使用前进行15min的超声使其均匀悬浮。

BSA配成浓度为10^-4mol/L，备用。BSA购自北京索莱宝生物科技公司。

(二)检测与绘制标准曲线

待仪器预热平稳后，取3mL其中一种粒径的纯量子点于比色皿中，在250-750nm处进行荧光同步检测，发射光栅和散射光栅都为5nm，电压为400V，散射强度为F₀。

然后再分别加10、20、30、40、50、60、70、80、90和100μL浓度为10^-4mol/L的BSA溶液；每一步都进行归零的检测，散射强度为F_n。发现这种ZnS和ZnO量子点的最大散射波长大约都在461±5nm左右，以蛋白质浓度为横坐标，取最强散射处波长的散射强度变化F_n-F₀为纵坐标绘制标准曲线。依次对不同粒径的量子点进行检测比较。

1～4号量子点检测BSA的共振散射图谱及标准曲线图如图1～8所示。1～4号量子点检测BSA的共振散射图谱如图1、3、5、7所示，曲线自下而上分别为BSA浓度为0及加入上述不同量BSA溶液的图谱。1～4号量子点检测BSA的标准曲线图如图2、4、6、8所示。

实施例3检测γ-球蛋白

(一)量子点溶液和蛋白质溶液的配制

1～4号量子点原浓度均为为5×10^-5mol/L，用双蒸水进行60倍稀释，用前进行15min的超声使其均匀悬浮。

γ-球蛋白配成浓度为10^-4mol/L，备用。γ-球蛋白购自北京索莱宝生物科技公司。

(二)检测与绘制标准曲线

待仪器预热平稳后，取3mL其中一种粒径的纯量子点于比色皿中，在250-750nm处进行荧光同步检测，发射光栅和散射光栅都为5nm，电压为400V，散射强度为F₀。然后再加分别10、20、30、40、50、60、70和80μL浓度为10^-4mol/L的γ-球蛋白，每一步都进行归零的检测，散射强度为F_n。发现这种ZnS/ZnO量子点的最大散射波长大约都在461nm左右，以蛋白质浓度为横坐标，取最强散射处波长的散射强度变化F_n-F₀为纵坐标绘制标准曲线。依次对不同粒径的量子点进行检测比较。

1～4号量子点检测γ-球蛋白的共振散射图谱及标准曲线图如图9～16所示。

1～4号量子点检测γ-球蛋白的共振散射图谱如图9、11、13和15所示，曲线自下而上分别为γ-球蛋白为0及加入上述不同量γ-球蛋白溶液的图谱。1～4号量子点检测γ-球蛋白的标准曲线图如图10、12、14和16所示。

通过检测与绘制标准曲线可以看出，在蛋白质含量一定范围内，共振散射强度变化与蛋白质浓度有较好的相关性，蛋白质浓度越大，散射强度变化就越明显。根据样品中散射强度的变化可以在标准曲线上查出蛋白质的含量。

检测分析时，可以检测到很微量的蛋白质，达到10^-8mol/L的数量级，对于一些蛋白质含量比较低的样品能够快速地检测出来，通过量子点共振散射来定量检测蛋白质，具有灵敏度高、稳定性好、经济实用等优点为为农业质量检测、食品营养标准检测、转基因检测领域中蛋白质含量的检测提供了很好的方法。

Claims

1.一种利用量子点定量检测蛋白质的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将量子点悬浮分散于蛋白质溶液中，在456～466nm下进行同步荧光检测，测定散射强度，并与标准曲线对比得到蛋白质浓度；量子点与蛋白质溶液的用量比为5～10×10^-7mol/ml。

2.权利要求1所述利用量子点定量检测蛋白质的方法，其特征在于，所述量子点结构包括内核和表面包被的SiO₂外壳；内核粒径为3～10nm，为ZnS/ZnO量子点异质结构。

3.权利要求1或2所述利用量子点定量检测蛋白质的方法，其特征在于，所述量子点的制备方法包括如下步骤：

(1)将Zn(Ac)₂和CH₃CSNH₂加入1，4-丁二醇中，超声分散直至形成透明前驱体溶液；Zn(Ac)₂与CH₃CSNH₂摩尔比为1∶0.25～0.7；

(3)ZnS/ZnO量子点异质结构溶解于乙醇中，加入氨水，搅拌下加入正硅酸乙酯，继续搅拌反应10～15小时，取沉淀洗涤干燥；ZnS/ZnO量子点异质结构与乙醇、正硅酸乙酯用量比为1mol∶300～600ml∶1～2ml。

4.权利要求3所述利用量子点定量检测蛋白质的方法，其特征在于，所述Zn(Ac)₂与1，4-丁二醇用量比为0.1～0.4mol/L。

5.权利要求1所述利用量子点定量检测蛋白质的方法，其特征在于，所述蛋白质为BSA或γ-球蛋白。

6.权利要求1所述利用量子点定量检测蛋白质的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，荧光检测条件为：发射和散射光栅为5nm，电压为400V。

7.权利要求1所述利用量子点定量检测蛋白质的方法，其特征在于，所述标准曲线的构建方法包括以下步骤：