CN102559569B - 可增强氧吸收能力的多杀菌素工程菌及其构建与发酵方法 - Google Patents
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Abstract
可增强氧吸收能力的多杀菌素工程菌及其构建与发酵方法，该可增强氧吸收能力的多杀菌素工程菌是利用基因重组技术，将透明颤菌血红蛋白基因（vgb）整合到刺糖多孢菌染色体组构建的基因重组多杀菌素工程菌，其分类名称为放线菌刺糖多孢菌S078-1011，保藏编号：CCTCCNO:2011400。本发明还包括所述多杀菌素工程菌的构建方法及利用所述多杀菌素工程菌进行多杀菌素生产的发酵方法。本发明放线菌刺糖多孢菌S078-101能改善菌体对溶氧的吸收性能，在正常溶氧与限氧条件下均可显著促进多杀菌素的生物合成。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因重组多杀菌素工程菌放线菌刺糖多孢菌及其构建与发酵方法，尤其是涉及一种可增强氧吸收能力的基因重组多杀菌素工程菌及其构建与发酵方法。
背景技术
化学农药已经应用了半个多世纪，给农业带来了巨大的经济效益。然而，在农作物种植中滥用化学农药，引起有害昆虫的抗药性日益增强，使农药防治各种害虫的效果明显下降，同时残留量大，威胁人类健康，造成环境污染。生物农药或绿色农药是未来农药发展的必然趋势，也是农业可持续发展的一项基本保证。 生物农药的优势在于：1）有很高的生物活性，药效高，单位面积使用量少；2）选择性强，对益虫和非靶标生物无毒或毒性很小；3）对农作物无害；4）使用后在农作物体内外、农产品以及土壤、大气、水体无残留或即使有微量残留也可在短期内降解，生成无毒的天然物质而对环境无害。
多杀菌素是刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）经有氧发酵产生次生代谢产物，它是一类大环内酯物质，在功能上具有杀虫的重要作用，最初被命名为A83543因子。Spinosyn家族化合物中主要的活性组份为 Spinosyn A和Spinosyn D（合称spinosad）。前人研究表明，多杀菌素与鳞翅目、缨翅目等靶标害虫有2个作用位点即γ-氨基丁酸受体（Gamma-amino butyric acid receptors， GABARs）和烟碱乙酰胆碱受体(Nicotinic acetylcholine receptors， nAchRs)，具有摄食毒性和快速触杀双重作用，对非靶标生物的毒性很低， 对人和其他哺乳动物非常安全，迄今为止没有发现与其他杀虫剂有交叉抗性。多杀菌素因兼具化学农药的快速性与生物农药的安全性，已被广泛用于农业害虫与动物寄生虫病防治，成为目前国际上极具发展前景的生物杀虫剂。
然而，野生型刺糖多孢菌的多杀菌素生物合成量很低，为提高其产量的菌种遗传改良成为当前的研究热点，已有利用传统的理化诱变结合高通量筛选，原生质体再生，原生质体属间融合，多杀菌素生物合成相关基因加倍等方法进行其菌种遗传改良的相关报道。刺糖多孢菌发酵过程中菌体呈丝状增长，且多杀菌素的生物合成需要脂肪酸作为前体，发酵生产中常添加一定量的油脂，导致菌体发酵液十分粘稠，供氧不足，成为限制多杀菌素生物合成的主要因素之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多杀菌素生物合成效率高的可增强氧吸收能力的多杀菌素工程菌及其构建与发酵方法。
本发明的技术方案是：
本发明之可增强氧吸收能力的多杀菌素工程菌系应用基因重组技术，将透明颤菌血红蛋白基因（vgb）整合到刺糖多孢菌染色体组构建的基因重组多杀菌素工程菌，其分类名称为放线菌刺糖多孢菌S078-1011（Saccharopolyspora. spinosa S078-1011），于2011年11月18日保藏在中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC；地址：湖北省武汉市珞珈山武汉大学），保藏编号为CCTCC NO:M2011400。
本发明之多杀菌素工程菌的构建方法包括以下步骤：
（1）采用重叠PCR方法，将透明颤菌血红蛋白基因vgb的ORF置于PermE之下，连接至pSET152载体，获得整合型载体pSET152EVHB；
（2）整合型载体pSET152EVHB热激转化E. coli ET12567 /pUZ8002，获得转化子E.coli ET12567 (pUZ8002，pSET152EVHB)；
（3）供体菌E.coli ET12567 (pUZ8002，pSET152EVHB)与受体菌刺糖多孢菌SP06081属间接合转移，获得重组菌株，命名为放线菌刺糖多孢菌Saccharopolyspora. spinosa S078-1011。
（4）重组菌株放线菌刺糖多孢菌Saccharopolyspora. spinosa S078-1011的PCR 与 Southern blotting 鉴定；
（5）VHb在重组刺糖多孢菌内生物学活性进行检测；
（6）检测VHb 表达对刺糖多孢菌生长与多杀菌素合成的影响；
（7）对不同溶氧条件下，重组菌株多杀菌素产量进行分析；
（8）对重组菌株的遗传稳定性进行分析。
本发明之利用所述多杀菌素工程菌放线菌刺糖多孢菌S078-1011进行发酵的方法：
（1）菌种活化
将保藏的增强氧吸收能力的放线菌刺糖多孢菌Saccharopolyspora. spinosa S078-1011划线接种于固体种子培养基斜面上，30℃培养5-7天，配制孢子悬液，按体积比4-6%接种量转接种子活化培养基，在30℃条件下300rpm摇瓶振荡培养48h，以体积比10%的接种量用于种子罐接种；
（2）灭菌及培养条件
上述灭菌采用高压蒸汽灭菌，即在121℃，压力0.3-0.5 kg/cm2条件下灭菌30 min；
（3）种子罐发酵
先将一级种子罐灭菌，装入培养基后再灭菌，冷却至30℃，将孢子液接入培养液中，通入无菌空气培养，可得一级种子罐发酵菌液；将二级种子罐在121℃灭菌30min， 装入培养基后再灭菌，冷却至30℃，将一级种子罐发酵液按体积比10%接种量接入二级种子罐，通入无菌空气和搅拌进行培养，可得二级种子罐发酵菌液；
（4）生产发酵罐
培养前先将发酵罐灭菌，装入培养基后再灭菌，保压降温至25~30℃，按10%的接种量将二级种子罐发酵液接入发酵罐中培养，通过无菌空气；
（5）浓缩
发酵罐中发酵结束后，将菌液通过超滤进行浓缩，补加增效添加剂、随后装瓶；
（6）培养基配方：
1）种子斜面培养基（g / L）：酪蛋白胨30，酵母提取物3，MgSO4·7H2O 2，葡萄糖5，麦芽糖 4，琼脂 18；121℃ 灭菌20 min；
2）种子活化培养基（g / L）: 葡萄糖 10， 酪蛋白胨 3， 酵母提取物 10，磷酸二氢钾 0.5；115℃ 灭菌25 min；
3）20L发酵罐培养基(g / L)：葡萄糖 100，豆饼粉 6，棉子粉 10，豆油5，玉米粉 8，碳酸钙 4，酵母粉 1，消前pH 7.0。培养温度为24~33 ℃，而合成多杀菌素的最适宜温度为30~32℃；发酵时用通气量和搅拌速率来维持溶氧在50%以上；罐压为0.034Mpa。
透明颤菌血红蛋白基因（Vitreoscilla hemoglobin gene，vgb）来源于专性好氧的丝状革兰氏阴性菌透明颤菌（Vitreoscilla stercoraria）的基因组。研究表明，在贫氧条件下能被大量诱导合成一种可溶性血红蛋白—透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin， VHb)，以满足菌体对溶氧的需求。VHb最初被认为是具有末端氧化酶性质的“细胞色素o”（cytochrome o， Cyo）。光谱学分析表明，VHb在氧结合动力学性质上与氧合肌红、血红蛋白相似，在不同的溶氧条件下可在氧化态、还原态和氧合态三种状态之间相互转化；超微结构研究显示，VHb 主要分布于细胞质中并聚集在细胞膜附近，在氧限条件下能捕捉分子氧，并协助其转移到生命力旺盛的呼吸膜上；早期的作用机制研究表明，VHb 与细胞色素bo 末端氧化酶相互作用，通过提高电子传递链的周转率发挥它对氧的富集、运输功能，使细胞适应贫氧的生活环境；近年VHb相关的代谢调控与蛋白质组研究显示，它还具有过氧化物酶活性，其表达能改善菌体的生理功能，消除发酵过程中有机酸等副产物对菌体的影响，并对能量代谢、中心中间体代谢等有调控作用。VHb已被广泛应用于易受氧限制的微生物高密度发酵生产过程，其最新的应用研究包括：促进二羟基丙酮 (Dihydroxyacetone DHA)等生化药物原料与药物前体的生产；改善生物修复功能，如：加强红串红球菌（Rhodococcus erythropolis）的生物脱硫作用；提高D-氨基酸氧化酶（D-amino acid oxidase）等重要酶的合成；促进抗生素及生物杀虫剂生物合成；增强聚γ—谷氨酸 (Poly-γ-glutamic acid， γ-PGA) 等生物高分子的合成。
本发明之多杀菌素工程菌放线菌刺糖多孢菌S. spinosa S078-1011可以增强氧吸收能力。vgb的表达在正常溶氧与限氧条件下均显著促进了多杀菌素的生物合成，且vgb整合进刺糖多孢菌染色体，无抗性压力选择下连续传代5代多杀菌素生产性能仍然稳定。这说明vgb在刺糖多孢菌中的整合表达能改善了菌体对溶氧的吸收性能。试验证明，利用本发明构建之多杀菌素工程菌放线菌刺糖多孢菌进行多杀菌素发酵生产，在三种不同的溶氧情况下多杀菌素产量比原始菌S.spinosa SP06081分别提高了86%、38%和144%。
附图说明
图1：本发明多杀菌素工程菌构建流程图；
图2：红霉素抗性基因启动子示意图；
图3：透明颤菌血红蛋白基因示意图；
图4：整合型载体pSET152EVHB构建图；
图5：pSET152EVHB整合至刺糖多孢菌染色体组上示意图；
图6：本发明工程菌多杀菌素发酵工艺流程图；
图7：VHb的CO差光谱图；
图8：VHb 表达对刺糖多孢菌生长与多杀菌素合成的影响曲线图。
具体实施方式
本发明之多杀菌素工程菌系应用基因重组技术，将透明颤菌血红蛋白基因（vgb）整合到刺糖多孢菌染色体组构建的基因重组多杀菌素工程菌，其分类名称为放线菌刺糖多孢菌S078-1011（Saccharopolyspora spinosa S078-1011），于2011年11月18日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC;地址：湖北省武汉市珞珈山武汉大学），保藏编号：CCTCC NO:M2011400。
下面结合附图及实施例对本发明作进一步详细说明。
本发明以红色糖多孢菌基因组为模板，根据GenBank上公布的序列(gi:152688)，设计一对引物P1/P2，其中在P1的5’端引入EcoRⅠ酶切位点，P2引入突变位点CAGCAC，扩增红霉素抗性基因启动子PermE，以pRK404-VHb质粒为模板，根据GenBank上公布的序列(gi:155317)，设计一对引物P3/P4，其中在P4的5’端引入XbaⅠ酶切位点，P3引入突变位点GTGCTG，扩增vgb基因的开放阅读框（ORF），以上述2种PCR回收产物为模板，P1/P4为引物，采用重叠PCR (Splicing by overlap extension PCR， SOE-PCR )方法，将vgb的ORF置于PermE之下，TA克隆测序确证后，EcoRⅠ/ XbaⅠ双酶切，连接至经同样双酶切的pSET152载体，获得整合型载体pSET152EVHB。通过接合转移方式将其导入刺糖多孢菌SP06081中，利用载体上ΦC31整合性位点通过同源重组将vgb定点整合到刺糖多孢菌SP06081菌株染色体上，获得一株遗传性能稳定的重组菌株Saccharopolyspora spinosa S078-1011；对重组工程菌的PCR与Southern blotting检测显示vgb已整合到染色体上，CO结合差光谱分析表明在SP-VHb工程菌中表达了有活性的透明颤菌血红蛋白（VHb）；摇瓶发酵结果显示，在正常溶氧与中度限氧状态下，vgb的表达均可显著促进多杀菌素的生物合成（p＜0.01）。这说明vgb在刺糖多孢菌中的整合表达改善了菌体对溶氧的吸收性能，是一种有效的定向遗传改良手段。
一、增强氧吸收能力的多杀菌素工程菌Saccharopolyspora spinosa S078-1011的构建（参照图1）：
（1）整合型载体pSET152EVHB的构建（参照图2）
以红色糖多胞菌基因组为模板，根据GenBank上公布的序列(gi:152688)，设计一对引物P1/P2，
P1：GAATTC GGT ACC AGC CCG ACC CGA GCA C
P2：GAT GTT AAT GGT TTG CTG GTC CAGCAC CGC TGG ATC CTA CCA
其中在P1的5’端引入EcoRⅠ酶切位点（斜体部分），P2引入突变位点CAGCAC，扩增红霉素抗性基因（图3）启动子PermE，PCR反应总体系50 μL（纯水16.8 μL， 2×GC buffer 25 uL，10 mmol/L dNTP 2 μL，引物P1和P2各2 μL，DNA模板2 μL，La Taq酶0.2 μL），循环参数为: 94℃预变性2 min 后开始以下循环：94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，28 cycles，72℃延伸5 min；
以pRK404-VHb质粒为模板，根据GenBank上公布的序列(gi:155317)，设计一对引物P3/P4，
P3：TGG TAG GAT CCA GCG GTGCTG GAC CAG CAA ACC ATT AAC ATC
P4：TCTAGA ATG CCA AGG CAC ACC TGA AG
其中在P3引入突变位点GTGCTG， P4的5’端引入XbaⅠ酶切位点，扩增vgb基因（图4）的开放阅读框（ORF），PCR反应总体系50μL（纯水35.5μL， 10× buffer 5uL，2.5 mM dNTP 3 μL，引物P3和P4各2 μL，DNA模板2 μL，Cas Taq酶0.5 μL），循环参数为: 94℃预变性2 min 后开始以下循环：94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1min，28 cycles，72℃延伸5 min。
以所述2种PCR回收产物为模板，P1/P4为引物，采用重叠PCR(Splicing by overlap extension PCR， SOE-PCR )方法，将vgb的ORF置于PermE之下，TA克隆测序确证后，EcoRⅠ/ XbaⅠ双酶切，连接至经同样双酶切的pSET152载体，获得整合型载体pSET152EVHB；
（2）重组菌株放线菌刺糖多孢菌Saccharopolyspora spinosa S078-1011的构建 （图5）
首先将目的质粒pSET152EVHB热激转化E. coli ET12567 (pUZ8002)，经Apr抗性筛选阳性转化子，提取质粒酶切鉴定获得转化子E.coli ET12567 (pUZ8002，pSET152EVHB) 并进行菌种保藏。大肠杆菌-刺糖多孢菌属间接合转移参考文献 [Matsushima P, Broughton M C, Turner J R, et al. Conjugal transfer of cosmid DNA from Escherichia coli to Saccharopolyspora spinosa: effects of chromosomal insertions on macrolide A83543 production. Gene, 1994, 146: 39—45；Bierman M, Logan R, O’Brien K, et al. Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA from Escherichia coli to Streptomyces spp. Gene, 1992, 116: 43—49]，略做修改：将受体菌S spinosa SP06081在CSM 培养基(g / L: Tryptic Soy Broth 30，酵母提取物3，葡萄糖5，麦芽糖4 ) 内活化48 h后，玻璃匀浆器研磨碎断菌丝体，按10% 接种量转接TSB液体培养基（g / L: Tryptic Soy Broth 30 ），30℃，300 rpm振荡培养16 h；再以25% 接种量二次转接菌丝体于TSB培养基，继续培养6 h后，收集菌丝体并重悬于2 mL TSB中。同时，用TSB将过夜培养的供体菌E.coli ET12567 (pUZ8002，pSET152EVHB) 洗涤2次以去除抗生素，再重悬于5 mL TSB中。供体-受体（E. coli - S. spinosa）按1:3比例（250 μL : 750 μL）混合加入无菌的离心管，然后将1mL 混合物涂布R6平板，超净工作台内静置30 min使其充分吸收。接合平板30 oC倒置培养16 h后，覆盖Apr和NA，使终浓度分别达到50 μg/mL 和 25 μg/mL。30 oC继续培养10 — 14 d后，挑取单克隆转接至含Apr和NA的BHI平板（g / L: Brain Heart Infusion[Difco]37，agar 15），培养3 - 4 d，待BHI平板上的菌落长充分之后，挑取部分菌体转接于装有15 mL TSB液体培养基的250 mL摇瓶中，同时加入Apr（50 μg/mL）和NA（25 μg/mL），30oC培养3-4天， 菌液PCR扩增检测Apr和vgb基因阳性的为接合子，命名为放线菌刺糖多孢菌Saccharopolyspora spinosa S078-1011，菌种保藏号：CCTCC NO：M2011400），菌种 -80℃ 甘油保藏以备后续检测分析；
（3）重组菌株的鉴定
1）VHb蛋白在刺糖多孢菌内表达的生物学活性测定
采用一氧化碳差光谱法分析VHb的生物学活性，方法参照文献[冯亮. 透明颤菌血红蛋白基因在苏云金芽胞杆菌中的表达及对其发酵特性的影响[D].武汉：华中农业大学.2006]，略做修改。收集发酵培养5d 的菌丝体，预冷的缓冲液（10 mmol Tris-HCl pH 7.0/ 60 mmol NH4Cl/ 10 mmol CH3COOMg/ 1 mmol DTT/ 1 mmol PMSF）洗涤菌丝体2遍，4℃离心，重悬菌丝体于10 mL 缓冲液中；冰水混合物上超声波破碎菌体，功率100 W， 超声5s，间隔15s，循环30次。重复3次。4℃，以3000 rpm离心去除沉淀，上清中加入连二亚硫酸钠0.4 g，使达到饱和浓度，室温还原20-30 min，然后等分为两份，一份直接加入比色皿放入参比池，另一份通入一氧化碳3 min，避光静置10-15 min后加入比色皿放入检测池，400-500 nm光谱扫描；
2）VHb表达对刺糖多孢菌生长的影响
刺糖多孢菌在种子活化培养基CSM内的生长测定采用光密度(OD600) 法；在发酵培养基内的生物量测定采用菌体核酸值间接法测定；
3）不同溶氧条件下原始菌株与本发明重组菌株多杀菌素发酵产量比较分析
不同培养基装量与转速条件下，采用摇床（温度30℃）摇瓶发酵生产多杀菌素。采用AKTA Purifier10高效液相色谱仪测定多杀菌素产量，方法参照文献[罗玉双, 丁学知, 夏立秋, 等. 多杀菌素生产菌原生质体的制备条件及其再生菌株生理特性.生物工程学报, 2009, 25: 360—367]。每组实验设置3个生物学重复。数据以均数±标准差( ±s)表示，采用SPSS 15.0统计软件进行方差分析；
4）本发明放线菌刺糖多孢菌S078-1011遗传稳定性检测
将本发明放线菌刺糖多孢菌 S078-1011菌株 -80℃ 保藏液用不加抗生素的CSM液体培养基活化48 h，梯度稀释后涂布于无抗生素的R6平板，30℃ 培养5-7 d；挑取100个单菌落转接含Apr （50 mg/L）R6平板，30℃ 培养3-4 d，计数抗性克隆数；并从中随机挑取20个单菌落，于无抗的CSM活化48 h后做菌液PCR扩增检测vgb基因，同时转接无抗发酵培养基摇瓶发酵9 d，HPLC检测多杀菌素含量。以此方法传代5代，以第1代工程菌的多杀菌素含量为100% 做为对照计算每一代的相对生产效价，考察重组菌株的遗传稳定性。
二、本发明放线菌刺糖多孢菌S078-1011菌剂的发酵生产（图6）
通过优化发酵培养基配方、筛选最佳发酵条件生产工程菌菌剂：
（1）菌种活化
将保藏的增强氧吸收能力的本发明多杀菌素工程菌放线菌刺糖多孢菌 S078-1011划线接种于固体种子培养基斜面上，30℃培养6天，配制孢子悬液，按体积比5%接种量转接种子活化培养基，在30℃条件下300rpm摇瓶振荡培养48h，，以体积比10%的接种量用于种子罐接种；
（2）灭菌及培养条件
采用高压蒸汽灭菌，即在121℃，压力0.4 kg/cm2条件下灭菌30 min；
（3）种子罐发酵
先将一级种子罐灭菌，装入培养基后再灭菌，冷却至30℃，将孢子液接入培养液中，通入无菌空气培养，得一级种子罐发酵菌液；将二级种子罐在121℃灭菌30min， 装入培养基后再灭菌，冷却至30℃，将一级种子罐发酵液按体积比10%接种量接入二级种子罐，通入无菌空气和搅拌进行培养，得二级种子罐发酵菌液；
（4）生产发酵罐
培养前先将发酵罐灭菌，装入培养基后再灭菌，保压降温至28℃，按10%的接种量将二级种子罐发酵液接入发酵罐中培养，通过无菌空气；
（5）浓缩
发酵罐中发酵结束后，将菌液通过超滤进行浓缩，补加增效添加剂，随后装瓶；
（6）培养基配方：
1）种子斜面培养基（g / L）：酪蛋白胨 30，酵母提取物 3，葡萄糖5，麦芽糖4，琼脂粉18。121℃ 灭菌20 min；
2）种子活化培养基（g / L）: 葡萄糖 10， 酪蛋白胨 3， 酵母提取物 10，磷酸二氢钾 0.5。115℃ 灭菌25 min；
3） 20L发酵罐培养基(g / L)：葡萄糖 100，豆饼粉 6，棉子粉 10，豆油5，玉米粉 8，碳酸钙 4，酵母粉 1，消前pH 7.0；培养温度为26 ℃，合成多杀菌素的最适宜温度为31℃，发酵时用通气量和搅拌速率来维持溶氧在50%以上；罐压为0.034Mpa。
通过实验证明：
1、在本发明放线菌刺糖多孢菌S078-101内表达了有生物学活性的VHb，结果见图7
采用本发明放线菌刺糖多孢菌S078-101发酵 5 d 的细胞破碎粗提液进行 CO 差光谱分析，结果显示：本发明放线菌刺糖多孢菌S078-101菌体细胞与 CO 结合后在 420 nm 处产生了明显的吸收峰，说明本发明放线菌刺糖多孢菌S078-101细胞中表达了 VHb，能够吸收 CO 形成 CO 结合性的血红蛋白，具有生物学活性。
2、VHb 表达对刺糖多孢菌生长与多杀菌素合成的影响结果见图8
图2a和2b说明vgb ***刺糖多孢菌染色体组在一定程度上限制了刺糖多孢菌的生长。图2c说明VHb的表达显著促进了刺糖多孢菌的多杀菌素生物合成能力。
3、不同溶氧条件下，重组菌株多杀菌素产量分析
以不同的培养基装量与摇床转速模拟不同的溶解氧状况来考察vgb表达对刺糖多孢菌多杀菌素合成的影响（表1），
结果表明：溶氧水平对菌体多杀菌素合成有显著影响，但无论是正常溶氧还是中度氧限制条件下，本发明放线菌刺糖多孢菌S078-101的多杀菌素产量均显著高于原始菌株（p＜0.01）。在高度氧限制条件下，两菌株多杀菌素产量下降幅度高达97%以上，虽然本发明放线菌刺糖多孢菌S078-101的多杀菌素产量高于刺糖多孢菌SP06081，但两菌株之间多杀菌素生物合成没有显著差异。
注：ａ—显著差异；ｂ—为极显著差异
4、本发明放线菌刺糖多孢菌S078-101的遗传稳定性分析
在无抗性选择压力下，将本发明放线菌刺糖多孢菌S078-101连续传代5代，98%以上的单克隆仍能保持阿泊拉抗性，说明在传代的过程中，整合的外源基因没有丢失。进一步的vgb 基因PCR检测及无抗压力下摇瓶发酵结果显示多杀菌素生物合成相对效价稳定在95%以上，说明整合在刺糖多孢菌染色体上的vgb能稳定遗传，各代之间多杀菌素产量无显著差异，说明本发明放线菌刺糖多孢菌S078-101遗传稳定性良好。
本发明放线菌刺糖多孢菌S078-101具备的重要优点为，vgb的表达在正常溶氧与限氧条件下均显著促进了多杀菌素的生物合成，且vgb整合进刺糖多孢菌染色体，无抗性压力选择下连续传代5代多杀菌素生产性能仍然稳定。这说明vgb在刺糖多孢菌中的整合表达能改善菌体对溶氧的吸收性能，促进多杀菌素的生物合成。
<110> 湖南师范大学
<120>可增强氧吸收能力的多杀菌素工程菌及其构建与发酵方法
<160> 4
<170>
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>
<222>
<400>
GAATTCGGTAC CAGCCCGACC CGAGCAC 27
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>
<222>
<400>
GATGTTAATG GTTTGCTGGT CCAGCACCGC TGGATCCTAC CA 42
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>
<222>
<400>
TGGTAGGATC CAGCGGTGCT GGACCAGCAA ACCATTAACA TC 42
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>
<222>
<400>
TCTAGAATGC CAAGGCACAC CTGAAG 26
Claims (2)
1. 一种可增强氧吸收能力的多杀菌素工程菌，其特征是，利用基因重组技术，将透明颤菌血红蛋白基因（vgb）整合到刺糖多孢菌染色体组构建的基因重组多杀菌素工程菌，其分类名称为放线菌刺糖多孢菌S078-1011（Saccharopolyspora. spinosa S078-1011），保藏编号为CCTCC NO：M2011400。
2.一种利用权利要求1所述多杀菌素工程菌放线菌刺糖多孢菌S078-1011进行发酵的方法，其特征是，包括以下步骤：
（1）菌种活化
将保藏的增强氧吸收能力的放线菌刺糖多孢菌Saccharopolyspora. spinosa S078-1011划线接种个于固体种子培养基斜面上，30℃培养5-7天，配制孢子悬液，按体积比4-6%接种量转接种子活化培养基，在30℃条件下300rpm摇瓶振荡培养48h，以体积比10%的接种量用于种子罐接种；
（2）灭菌及培养条件
上述灭菌采用高压蒸汽灭菌，即在121℃，压力0.3-0.5 kg/cm2条件下灭菌30 min；
（3）种子罐发酵
先将一级种子罐灭菌，装入培养基后再灭菌，冷却至30℃，将孢子液接入培养液中，通入无菌空气培养，可得一级种子罐发酵菌液；将二级种子罐在121℃灭菌30min， 装入培养基后再灭菌，冷却至30℃，将一级种子罐发酵液按体积比10%接种量接入二级种子罐，通入无菌空气和搅拌进行培养，可得二级种子罐发酵菌液；
（4）生产发酵罐
培养前先将发酵罐灭菌，装入培养基后再灭菌，保压降温至25~30℃，按体积比10%的接种量将二级种子罐发酵液接入发酵罐中培养，通过无菌空气；
（5）浓缩
发酵罐中发酵结束后，将菌液通过超滤进行浓缩，补加增效添加剂、随后装瓶；
（6）培养基配方：
1）种子斜面培养基：酪蛋白胨30，酵母提取物3，MgSO4·7H2O 2，葡萄糖5，麦芽糖 4，琼脂 18，单位均为g / L；121℃ 灭菌20 min；
2）种子活化培养基：葡萄糖 10， 酪蛋白胨 3， 酵母提取物 10，磷酸二氢钾 0.5，单位均为g / L；115℃ 灭菌25 min；
3）20L发酵罐培养基：葡萄糖 100，豆饼粉 6，棉子粉 10，豆油5，玉米粉 8，碳酸钙 4，酵母粉 1，单位均为g / L；调pH 7.0，培养温度为24~33 ℃，而合成 多杀菌素的最适宜温度为30~32℃；发酵时用通气量和搅拌速率来维持溶氧在50%以上；罐压为0.034Mpa。
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