CN101434930B - 一种棒状链霉菌、其制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物工程领域，提供了一种耗氧量低、发酵产率高的棒状链霉菌菌株LNSC、制备该菌株的方法及应用，具体涉及利用基因工程的方法，对透明颤菌血红蛋白基因(vhb)进行了应用方面的研究，将该基因转入生产克拉维酸的菌种棒状链霉菌，使VHB蛋白在其中大量表达，从而改良棒状链霉菌的生产特性，降低发酵生产能耗。

Description

一种棒状链霉菌、其制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及一种棒状链霉菌，特别是一种通过基因工程方法构建的棒状链霉菌。本发明还涉及所述棒状链霉菌的制备方法及应用。

背景技术

β-内酰胺类抗生素，如青霉素、头孢菌素、头霉素，是临床上应用最广泛的抗生素品种。但是，由于病原菌耐药性的出现，此类抗生素的使用大受影响。病原菌出现耐药性的主要原因是其产生的β-内酰胺酶，β-内酰胺酶通过破坏β-内酰胺类抗生素的β-内酰胺环而使其失活。克拉维酸是棒状链霉菌产生的天然β-内酰胺酶抑制剂，能够不可逆的结合β-内酰胺酶的丝氨酸活性位点而保护β-内酰胺类抗生素的活性。临床上克拉维酸常与β-内酰胺类抗生素复配使用，能够有效地增强β-内酰胺类抗生素的抗菌活性及扩大抗菌谱。其中以阿莫西林/克拉维酸钾复方制剂应用的最为广泛，曾经连续13年位列世界畅销药排行榜。

克拉维酸的生产菌为棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)，在发酵过程中由于其发酵液逐渐变得粘稠从而导致溶氧较差。在发酵工业中，氧的供给一直是好氧发酵产量提高的一个限制性因素。氧通过溶解、传递等许多环节才能被细胞所利用，为增加氧的可供给性，必须通过增加通气量、加快搅拌转速等方法来增加溶氧，这一切使得发酵产业成为高能耗产业。随着基因工程技术的发展，使得利用此技术改良工业生产菌种的特性、降低发酵生产能耗成为可能。

血红蛋白(Hemoglobin)在动物体内执行重要的生理功能，也是研究最深入的蛋白家族之一，然而研究发现在植物和微生物中也存在血红蛋白。上世纪70年代美国科学家在专性好氧的透明颤菌(Vitreoscilla sp.)中发现的血红蛋白，是至今为止研究最为深入的原核生物血红蛋白。透明颤菌是一种专性好氧的革兰氏阴性丝状菌，通常生活在沼泽、泥潭等贫氧的环境中，在低氧环境中诱导生成一种可溶性的血红蛋白(Vitreoscilla Hemoglobin，VHB)，该蛋白具有氧结合与传递功能，这使得透明颤菌能够生存于贫氧环境。VHB蛋白是由两个完全相同的亚基和两分子b型血红素组成的同型二聚体，亚基的分子量为15.7KD左右。该蛋白146个氨基酸序列与其它动植物血红蛋白相比较发现，它与真核生物的血红蛋白具有较高的同源性，它们的主要区别在于N端的某些结构差异，缺少螺旋，其中与黄羽扇豆血红蛋白的同源性最高，达到24％。

由于透明颤菌血红蛋白具有具有氧结合与传递功能，使得透明颤菌能够在贫氧环境中生长，但其作用机制目前还不完全清楚。Khosla等提出了两种假说：扩散促进假说和氧化还原效应物假说。扩散促进假说认为，在低氧条件下，血红蛋白能够大量积累，有近一半的血红蛋白分布于细胞周质中，以活性的氧合血红蛋白形式存在，加速氧在低氧条件下向胞内传递，构造一个有机体可直接利用的蓄氧仓库，此外，氧合血红蛋白能提高氧在呼吸链上的传递效率，加快了质子传递，促进了ATP的合成，提高了整个能量代谢水平。VHB蛋白的N端具有部分信号肽功能，它使VHB蛋白部分运输到细胞周质中，从在大肠杆菌中表达的VHB蛋白的分布来看，发现有35—45％的VHB蛋白分泌到细胞周质中，从而有力的支持了该假说。氧化还原假说认为，氧合型VHB蛋白可能影响了细胞内某些关键性的氧化还原敏感分子的活性，它们可能是传感器、调控子，可能是呼吸链上的某个关键酶，这种影响是通过提高能量转换效率逐级传递的。

1988年，美国伊利诺理工大学Weber实验室与瑞士苏黎士生物技术研究所Bailey实验室分别独立的从透明颤菌染色体上克隆到完整的vhb基因。vhb基因自身启动子受氧调控，通过序列分析发现vhb基因含有P1和P2两个启动子，二者在结构基因上游150bp的区域内相互重叠，P1和P2都是在低氧的条件下被诱导，因此具有相同的调控机制。

目前，对透明颤菌血红蛋白的研究主要是分子生物学性质、作用机制等等，在应用方面的研究较少，特别是在工业生产菌种的改造方面。

发明内容

在发酵过程中，为了解决棒状链霉菌在较低的溶氧量情况下其发酵单位不受影响，本发明对棒状链霉菌菌株的基因做了改造，使其在发酵产率不变的情况下所消耗的氧气量大幅度减少。

本发明的目的之一是提供一种耗氧量低、发酵产率高的棒状链霉菌菌株。为此，本发明人利用基因工程的方法，对透明颤菌血红蛋白基因(vhb)进行了应用方面的研究，将该基因转入生产克拉维酸的菌种棒状链霉菌，使VHB蛋白在其中大量表达，从而改良棒状链霉菌的生产特性，降低发酵生产能耗。

本发明的第二个目的是提供一种制备上述棒状链霉菌的方法。

本发明的第三个目的是提供上述棒状链霉菌菌株在降低克拉维酸生产能耗中的应用。

本发明的棒状链霉菌LNSC已经于2008年7月7日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，并收到保藏登记号CGMCC No.2576.

发明人通过基因***的方法将透明颤菌血红蛋白基因转入棒状链霉菌，得到一种耗氧量低、发酵产率高的棒状链霉菌LNSC，其步骤是：

a.从透明颤菌的基因组中PCR扩取vhb基因，或把vhb基因***到带有噬菌体接合点attP位点的载体中，从而得到含有vhb基因片断的重组载体；

b.将a步所得的重组载体转化到制备好的棒状链霉菌原生质中，抗性筛选得到转化菌株；

c.检测b步骤得到的棒状链霉菌菌株的产克拉维酸的能力，得到克拉维酸生产能耗的棒状链霉菌LNSC。

根据本发明的棒状链霉菌LNSC(CGMCC No.2576)具有以下微生物学特性：

棒状链霉菌LNSC(Streptomyces clavuligerus LNSC)属于放线菌，链霉菌属是最高等的放线菌。革兰氏阳性，有发育良好的分枝菌丝，菌丝纤细无横隔，宽度近于杆状细菌，约0.5～1微米。菌丝分化为营养菌丝、气生菌丝、孢子丝。孢子丝再形成分生孢子。孢子丝和孢子的形态、颜色因种而异，是分种的主要识别性状之一。

棒状链霉菌LNSC在YD(酵母提取物麦芽提取物葡萄糖琼脂粉培养基)上白色，微有***，呈菊花状，瓣状均匀，菌落中间有圆形凹面，25℃在YD上12天左右直径达1cm；中间***部分稍有凹陷，四周有整齐均匀的褶皱，开始为白色，后期因产孢而逐渐变为灰白、灰色；背面无色素产生。菌丝无横隔，宽度小于1微米，生殖方式以孢子丝横割***形成成串的分生孢子，孢子呈球状。

只要获得的本发明的棒状链霉菌LNSC，并根据本发明提供的棒状链霉菌LNSC的特性，大量培养棒状链霉菌LNSC以及使其产生大量孢子的方法是本技术领域技术人员所熟悉的。

适用于培养棒状链霉菌LNSC-2的培养基是多种多样的，应理解，只要能够为棒状链霉菌提供生长和繁殖所必需的营养成分的培养基都是可用的。现有技术中用于培养其他各种棒状链霉菌的培养基都适用于本发明的棒状链霉菌LNSC的培养，比如可以采用葡萄糖、牛肉膏、酵母膏、琼脂制成的培养基。

本发明利用基因工程技术改良工业菌种的生产特性，具有十分重要的工业应用价值。VHB蛋白能在低氧条件下增强氧的传递效率，改善细胞在低氧环境中的生长条件，提高目的产物的产量，使生产菌能在限氧条件下正常生长和合成目的产物。透明颤菌血红蛋白基因应用于发酵产业，可以在不需要对已有设备进行再投资的前提下提高产量，降低能耗，具有非常重要的意义。

附图说明

附图1为本发明质粒pSET152的限制图

附图2为本发明重组质粒pLN02的构建过程图

附图3为本发明PCR扩增vhb基因片段电泳图

附图4为正常通气量时，原始菌株发酵液中克拉维酸含量的HPLC图谱

附图5为通气量减少30％时，棒状链霉菌LNSC发酵液中克拉维酸含量的HPLC图谱

具体实施方式

通过借助以下实施例将更详细说明本发明。以下实施例仅是说明性的，应该理解为，本发明并不受这些实施例的限制。

实施例1

vhb基因整合型载体的构建

根据透明颤菌(Vitreoscilla stercoraria)vhb基因(M27061)的DNA序列设计引物，并以透明颤菌总DNA为模板PCR体外扩增vhb基因片断，并对PCR产物进行纯化。

根据透明颤菌编码vhb基因序列的分析设计PCR扩增vhb基因的两引物，分别如下：

vhb-up：CGCGGATCCAAGCTTACAGGACGCTGGGG

vhb-down：CCGGAATTCATGCCAAGGCACACCTGAAG

用BamHI和EcoRI双酶切PCR产物，然后***到同样双酶切的pSET152质粒中，通过蓝白斑筛选得到阳性克隆，提取质粒，进行BamHI和EcoRI双酶切验证，电泳检测其双酶切产物片段大小为所期望的1.4kb左右，得到构建好的***载体pLN02。

实施例2原生质体筛选转化菌株

链霉菌原生质体的制备

在装有不銹钢弹簧的250ml三角瓶中加入100ml YEME+TSBY(1:1)，并加入0.2％的甘氨酸，接种100ul的孢子悬液体，于30℃摇床200rpm培养36h-40h。然后收集菌丝体，并用10.3％的蔗糖溶液洗涤收集的菌丝体，共洗涤三次，并于3000rpm离心10min收集菌丝体。取菌丝体，加入溶菌酶的P buffer，在30℃水浴30—60min，至上清呈乳状。用装有脱脂棉的试管过滤，滤液转入无菌的universal中，并于3000rpm离心7min，收集原生质体沉淀，此为黄色。轻柔打散原生质体，再用P buffer洗涤去除溶菌酶，同样条件下离心，收集原生质体，去上清，用枪打散原生质体，分装，于—70℃保存。

链霉菌原生质体的转化

取5ul的DNA，加入到50ul的原生质体管中，吸取200ul的25％的PEG4000，将DNA冲入原生质体中，小心抽吸几次，混合均匀。然后将混合物涂布于R5平板(不含抗生素)，于30℃培养14—20h后，加入20ul/ml的抗生素(Apr)，再继续培养，可看到较小的转化子。此转化子即为已经转入质粒的棒状链霉菌LNSC。

实施例3

基因工程菌的发酵检测

对筛选到工程菌进行发酵罐实验，检测其在降低通气量的情况下产克拉维酸的能力。以原始菌株为对照菌株，选用大豆培养基为发酵培养基，30L发酵罐接种量为5％，28℃培养，于通气量减少30％的情况下进行发酵。在发酵结束后取样，HPLC检测克拉维酸含量。检测结果表明，棒状链霉菌LNSC与原始菌株相比，在通气量减少30％的情况下，保持同样的发酵水平。

表1HPLC检测发酵液中克拉维酸的含量

Claims (2)

1.棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)菌株LNSC：CGMCC No.2576。

2.棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)菌株LNSC：CGMCC No.2576在降低克拉维酸生产耗氧中的应用。

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