CN102558355A - 基于电荷网络的异二聚体fc改造方法及异二聚体蛋白的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于电荷网络的异二聚体FC改造方法及制备异二聚体蛋白的方法。所述的异二聚体FC改造方法基于FC重链CH3两臂氨基酸的相互作用，建立电荷相互作用网络并突变一个或多个界面氨基酸，通过电荷效应修改CH3区域氨基酸，从而减弱区域自身相互作用（有利于形成同二聚体）并增强区域之间的相互作用（有利于形成异二聚体），最终选择有义突变。本发明还涉及所述的方法制得的异二聚体蛋白、组成异二聚体FC的单独的多肽以及编码这些多肽的核苷酸序列。

Description

基于电荷网络的异二聚体FC改造方法及异二聚体蛋白的制备方法

技术领域

本发明涉及一种制备异二聚体抗体FC相关的蛋白和多肽的方法，也涉及异二聚体抗体FC蛋白及多肽本身，包括组成异二聚体抗体FC的单独的多肽；本发明还涉及编码这些多肽的核酸序列，以及包含一个或者多个异质FC蛋白或者多肽的药物组份。

技术背景

单克隆抗体药物在近十五年内增长迅速，成为制药行业的成长点。自1996年起，一共有30个左右单抗药物被批准上市。其中有九个单抗药物年销售超过十亿美元。2010年单抗药物总销售超过300亿美元，并且年增长率超过10％。由于单克隆抗体的靶标特异性强，只能抑制单一靶点。而在多种疾病中，包括肿瘤，自体免疫，需要抑制多重信号通路来避免代偿效应。对于病毒感染疾病，由于病毒的高突变率，往往需要抑制多抗原位点来防止逃逸。另外，双功能抗体、蛋白被用于特异激活人体免疫***(Wolf，Hofmeister et al.″BiTEs：bispecific antibody constructs with unique anti-tumor activity.″Drug Discov Today 10(18)：1237-1244.2005)。抗体的Fc区形成同二聚体，同时Fc对维持抗体和Fc融合蛋白的体内稳定性起关键作用。通过改造Fc使之形成异二聚体是产生多功能抗体、蛋白，并且维持其体内稳定性的有效方法。

异二聚体的一个典型应用的例子是双特异抗体，双特异抗体(Bispecific antiboy，BsAbs)是含有两个不同配体结合位点的免疫球蛋白分子。双特异抗体至少可以对两个不同抗原具有活性(Carter，P.″Bispecific human IgG by design.″J Immunol Methods 248(1-2)：7-15.2001)，它取代了经典的抗体fab两臂相同的序列，而是用两个不同的fab序列，因此Y型两臂可以结合不同的抗原。双特异抗体在癌症治疗中的应用已经被多篇文献所综述(Carter 2001；Chamesand Baty.″Bispecific antibodies for cancer therapy.″Curr Opin Drug Discov Devel 12(2)：276-283.2009；Chames and Baty.″Bispecific antibodies for cancer therapy：the light at the end ofthe tunnel？″MAbs 1(6)：539-547.2009)。BsAbs的一臂可以连接肿瘤细胞表面的相关抗原而另外一臂则可以触发免疫效应细胞进一步杀伤细胞，通过免疫体系来杀死癌症肿瘤细胞。其他双特异抗体的应用可以查看美国专利U.S.Pat.Nos 5,731,168和7,183,076。

自然状态下不存在双特异性抗体，只能通过特殊方法进行制备。以往双特异抗体的制备方法有化学交联法，杂合F(ab′)2分子法和鼠杂交瘤法等。化学交联法生产双特异抗体的异源性，批与批之间的不稳定性，以及抗体特异性易受某些修饰或不当连接而改变的特性，使得该法生产的双特异抗体不适于体内使用。以巯基交联蛋白酶消化片断F(ab′)生产的双特异杂交分子，成分虽较均一，但费时费力，且产量很低。杂交瘤法生产的双特异抗体，来源可靠，但由轻链、重链随机配对产生的多种可能抗体形式，使得双特异抗体生产、纯化变得非常困难。

早在90年代，Carter等人用“把手-孔洞”(knob into hole)模型改造抗体重链的部分氨基酸，比较成功的实现了双特异抗体(Ridgway，Presta et al.″′Knobs-into-holes′engineering ofantibody CH3domains for heavy chain heterodimeriz ation.″Protein Eng 9(7)：617-621.1996；Carter 2001)。“把手-孔洞”模型最初是由Crick提出用来解决相邻的α-螺旋之间的氨基酸侧链折叠问题的(Crick，F. H.″Is alpha-keratin a coiled coil？″Nature 170(4334)：882-883.1952)。Carter等在FC第一条重链的CH3区域上通过将一个侧链小的氨基酸突变成了一个侧链大的氨基酸从而创造出了一个“把手”(如T366Y)，并将第二条重链上的CH3上的某些氨基酸突变成了侧链小的氨基酸创造出了“孔洞”(Y407T等)。“把手-孔洞”模型的原理是“把手-孔洞”相互作用是支持异二聚体形成的，而“把手-把手”模型及“孔洞-孔洞”模型是阻碍同二聚体的形成的。他们进一步在“把手-孔洞”突变的基础上引入了CH3区域内二硫键来进一步巩固异二聚体的结合能力。然而在他们的研究结果中，“孔洞-孔洞”模型对阻碍同二聚体的形成的能力仍然不够，依旧遗留了大概有5％的同二聚体。之后该研究组通过随机突变-噬菌体展示等方法一步提高异二聚体的含量。但结果也没有解决根本问题。

US 2010/286374A公开了一种FC异二聚体蛋白或多肽的制备方法，所涉及的异二聚体蛋白包括第一个包含CH3区域的多肽和第二个包含CH3区域的多肽，它们相互接触形成促使异二聚体形成的界面，即在第一个包含CH3区域的多肽和第二个包含CH3区域的多肽在界面上包含一个或多个带电荷的氨基酸，带电荷的氨基酸间的静电作用不利于同二聚体的形成但有利于异二聚体的形成，具体是将第一个或第二个包含CH3区域中的多肽中带电荷的氨基酸替换为相反电荷的氨基酸，利用静电作用促进异二聚体的形成。该发明方法存在两个缺陷，其一是该技术方案缺乏完整性，界面氨基酸之间的作用并不局限于一对氨基酸之间，界面氨基酸替换为相反电荷，特别是多个氨基酸突变的情况下，基于界面氨基酸之间复杂的作用关系，静电作用并不总是能抑制同二聚体或有利于异二聚体的形成，虽然该专利中包括部分具体的替换方案的确有利于异二聚体的形成，但其技术方案中缺少对此进行评价和筛选的策略或方法，在界面氨基酸作用复杂或多点突变的情形下，为获得有义突变，该专利对本领域技术人员无法予以指导；其二是该技术方案局限于电荷氨基酸作相反电性的替换，实际上，界面氨基酸之间形成一个电荷作用网络，任何一个氨基酸(电荷或非电荷氨基酸)电性的变化均会引起两条多肽链之间静电作用的改变，局限于将电荷氨基酸作相反电性的替换会忽略可能存在的大量的有义突变。

发明内容

本发明的目的在于提供一种异二聚体抗体FC的改造方法。

本发明的另一目的在于提供一种基于异二聚体抗体FC的改造进一步制备异二聚体抗体FC相关的蛋白和多肽的方法。

本发明的另一目的还在于提供所述的方法制备的异二聚体抗体FC蛋白及多肽本身，包括组成异二聚体抗体FC的单独的多肽。

本发明的另一目的还在于提供编码这些多肽的核酸序列。

本发明的目的是基于FC重链CH3两臂氨基酸的电荷相互作用网络，通过电荷排斥效应修改CH3区域氨基酸从而减少CH3区域之间自身结合的能力(形成同二聚体)，从而获得异二聚体。一般来说，在CH3-CH3接触面，修改相关氨基酸为带电荷氨基酸就会形成电荷排斥效应，在某些情况下突变接触面上某个带正电氨基酸(赖氨酸，精氨酸)为负电氨基酸(天冬氨酸，谷氨酸)或相反，就能形成排斥作用。

本发明描述了一个修改FC的CH3氨基酸来减弱区域自身相互作用(有利于形成同二聚体)并增强区域之间的相互作用(有利于形成异二聚体)的方法。通过建立CH3-CH3作用表面的氨基酸相互作用网络，获得网络中电荷氨基酸之间的作用情况，选择任意一个或者多个氨基酸，分析所选氨基酸对同二聚体及异二聚体的影响情况，将所选氨基酸突变为带电氨基酸，考察突变后对于同二聚体及异二聚体的影响情况，将突变后与突变前进行对比，如果突变合适，那么将会产生增强异二聚体及削弱同二聚体形成的作用。最后考察所有的氨基酸组合及邻近氨基酸的数目(数目越大，则突变导致原属性的变化越大)，选择合理的氨基酸突变，最大化的增强异二聚体及削弱同二聚体的作用。

本发明采用如下技术方案：

一种基于电荷网络的异二聚体FC改造方法，其特征在于，在FC的第一个包含CH3区域的多肽和/或第二个包含CH3区域的多肽上，一个或多个氨基酸突变为正电荷或负电荷氨基酸，它们相互接触形成促使异二聚体形成的界面，突变为按以下方法选择得到的有义突变之一：

1)随机突变抗体FC的CH3区域的一个或多个界面氨基酸为带有正电荷或负电荷的氨基酸；

2)基于界面氨基酸之间的电荷网络作用，计算突变对于同二聚体及异二聚体的影响值：

突变影响值＝突变后电荷总数-突变前电荷总数

电荷总数＝所突变的氨基酸的子网络(包含突变氨基酸及与其相互作用的接触氨基酸的最小氨基酸网络)电荷之和

其中，正正电荷相互作用为1，负负电荷相互作用为1，正负电荷相互作用为-1，正/非电荷或者负/非电荷作用为0；

3)筛选对于同二聚体影响值大于等于0的突变，或对异二聚体影响值小于等于0的突变。

US 2010/286374A记载的FC异二聚体蛋白或多肽的制备方法中，部分涉及到上述方法中电荷氨基酸作电性相反突变所得到的有义突变，但即使是对电荷氨基酸作电性相反突变，US 2010/286374A也无法得到与本发明方法完全相同的结果，US 2010/286374A既不包括全部的有义突变，也不能排除突变后不利于异二聚体形成的方案。

上述异二聚体FC改造方法，包括了对于包含CH3区域的多肽上非电荷氨基酸的突变，可以极大地扩展有义突变的范围，作为上述方法具有丰富成果的一个具体应用，采用的技术方案为：

一种基于电荷网络的异二聚体FC改造方法，其特征在于，在FC的第一个包含CH3区域的多肽和/或第二个包含CH3区域的多肽上，一个或多个不带电氨基酸突变为正电荷或负电荷氨基酸，它们相互接触形成促使异二聚体形成的界面，突变为按以下方法选择得到的有义突变之一：

1)随机突变抗体FC的CH3区域的一个或多个不带电界面氨基酸为带有正电荷或负电荷的氨基酸；

2)基于界面氨基酸之间的电荷网络作用，计算突变对于同二聚体及异二聚体的影响值：

突变影响值＝突变后电荷总数-突变前电荷总数

电荷总数＝所突变的氨基酸的子网络正负电荷之和

其中，正正电荷相互作用为1，负负电荷相互作用为1，正负电荷相互作用为-1，正/非电荷或者负/非电荷作用为0；

3)筛选对于同二聚体影响值大于等于0的突变，或对异二聚体影响值小于等于0的突变。

所述的方法基于界面氨基酸之间的电荷网络作用，对异二聚体FC进行改造，筛选有义突变以抑制同二聚体的形成或有助于异二聚体的形成，所述的方法具体包括以下步骤：

1)FC的CH3区域氨基酸序列及结构获得；

2)界面氨基酸获取；

3)构建电荷相互作用网络；

4)相互作用网络中节点(氨基酸)度的计算；

5)随机突变CH3区域的一个或多个界面氨基酸，筛选有义突变。

在CH3-CH3界面氨基酸的相互作用网络中，随机突变第一链和/或第二链上的一个或多个界面氨基酸(包括随机单点突变、随机双点突变等)，计算包含所突变氨基酸的子网络突变前及突变后电荷总和，并计算突变对于同二聚体及异二聚体的影响值：

电荷总数＝所突变的氨基酸的子网络正负电荷之和

其中，正正电荷相互作用为1，负负电荷相互作用为1，正负电荷相互作用为-1，正/非电荷或者负/非电荷作用为0；

突变对同二聚体和异二聚体的形成在电荷意义上所带来的影响值，按以下方法计算：

突变影响值＝突变后电荷总数-突变前电荷总数

筛选对于对同二聚体影响大于等于0的突变(即影响值＞＝0)，对异二聚体影响小于等于0的突变(影响值＝＜0)。

所述的异二聚体FC包括人免疫球蛋白FC。

所述的突变优选单点突变或双点突变。

所述的突变后正电荷氨基酸为赖氨酸或精氨酸，突变后负电氨基酸为天冬氨酸或谷氨酸。

本发明也可以通过引入电荷效应来改善“把手-孔洞”模型抑制同二聚体的缺陷，在“孔洞”链的基础上，进一步通过所述的方法对异二聚体FC进行改造，引入电荷排斥作用，则“孔洞-孔洞”链的排斥作用将加强，最终完全的抑制“孔洞-孔洞”同二聚体的形成。

在某些方面，本发明还提供了一个获取异二聚体蛋白的方法。异二聚体蛋白包含了一个CH3区域的多肽和另外一个包含CH3区域的多肽相互作用表面。第一个包含CH3区域的多肽和第二个包含CH3区域的多肽通过本发明的异二聚体FC改造方法，设计成包含CH3-CH3作用表面的带电氨基酸使之抑制同二聚体而支持异二聚体的形成。

一种异二聚体蛋白的制备方法，所述的异二聚体蛋白包括第一个包含CH3区域的多肽和第二个包含CH3区域的多肽，包括以下步骤：1)培养宿主细胞，宿主细胞包含编码第一个包含CH3区域多肽的核酸和第二个包含CH3区域多肽的核酸，其中培养的宿主细胞表达第一和第二个包含CH3区域的多肽；2)从宿主细胞培养物中提取异二聚体蛋白；其特征在于：

所述的第一个包含CH3区域的多肽和/或所述的第二个包含CH3区域的多肽在界面上包含一个或多个突变产生的氨基酸，它们相互接触形成促使异二聚体形成的界面，突变由不带电界面氨基酸突变为正电荷或负电荷氨基酸，并符合按以下方法选择得到的有义突变之一：

1)随机突变CH3区域上的一个或多个不带电界面氨基酸为带有正电荷或负电荷的氨基酸；

2)基于界面氨基酸之间的电荷网络作用，计算突变对于同二聚体及异二聚体的影响值：

突变影响值＝突变后电荷总数-突变前电荷总数

电荷总数＝所突变的氨基酸的子网络正负电荷之和

其中，正正电荷相互作用为1，负负电荷相互作用为1，正负电荷相互作用为1，正/非电荷或者负/非电荷作用为0；

3)筛选对于对同二聚体影响值大于等于0的突变，或对异二聚体影响值小于等于0的突变。

异二聚体分子可以用标准的实验手段从宿主细胞中纯化。例如，当异二聚体蛋白包含了FC，蛋白则可以用蛋白A来纯化。纯化方法包括但不限于色谱技术如体积排阻、离子交换、亲和色谱法及超滤法。本发明的异二聚体的分离纯化方法也包括上述各种方法的适当组合。

所述的异二聚体蛋白包括FC，优选人免疫球蛋白FC。在一般情况下，人免疫球蛋白FC区域的CH3区域多肽来源于野生型的人免疫球蛋白FC区域。野生型的人免疫球蛋白FC指发生在人群中的氨基酸序列，当然FC序列在个体中会有一些细微的差异。本发明中人免疫球蛋白FC也包括对于野生型人免疫球蛋白FC序列的氨基酸个别的改变，比如，FC区域局部某些氨基酸的改变，如包括某些在糖基化位点突变的氨基酸，或者其他无义的突变；也包括根据“把手-孔洞”模型突变的个别氨基酸的改变。

术语“人免疫球蛋白FC”指的是人免疫球蛋白链恒定区，特别是免疫球蛋白重链恒定区的羧基端或其中的一部分。例如，免疫球蛋白FC区可包括重链CH1、CH2、CH3、CH4的两个或更多结构域与免疫球蛋白铰链区的组合。根据重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类，主要有5类免疫球蛋白：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG-1，IgG-2，IgG-3，IgG-4，IgA-1和IgA-2。从特定的免疫球蛋白类别和亚类中选择特定的免疫球蛋白FC区在本领域技术人员所掌握的范围之内。

在具体实施方式中，本发明所用的人免疫球蛋白FC包括至少一个免疫球蛋白绞链区，一个CH2结构域和一个CH3结构域，具体为人IgG1FC(图1)。在实施例中，所述人免疫球蛋白FC区域的CH3则由SEQ ID N0：1所示的序列编码。

本发明涉及的哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO，293，骨髓瘤细胞。宿主细胞也可以是酵母或者原核细胞如E. Coli。

本发明所述的异二聚体蛋白不仅仅是抗体，也可以是双特异性抗体，单一的单价型抗体，单域抗体，多肽型抗体，双特异性多肽型抗体等(见图2)。

本发明还涉及按照上述方法突变产生的异二聚体蛋白，以及组成异二聚体抗体FC的单独的多肽。

本发明还进一步涉及编码这些多肽的核酸序列。

本发明更进一步涉及包含突变产生的组成异二聚体抗体FC的单独的多肽的药物组合物。

本发明提供了一个增加异二聚体含量的同时降低其他不需要的产物如同源二聚体的方法。所获得的异二聚体蛋白主要用于医疗领域，在某些情况下，异二聚体蛋白可以将药物、标记物、细胞毒细胞、T细胞等靶向导至肿瘤细胞，从而更有效地发挥杀伤作用，在肿瘤的免疫诊断及免疫治疗方面提供新的方法和途径。

附图说明

图1.IgG1抗体结构及不同区域示意图。

图2.包含FC单链的不同异二聚体蛋白组合现象。

图3.人IgG1FC的CH3-CH3作用界面上氨基酸的相互作用网络图。

图4.基于电荷网络改造FC制备异二聚体的SDS-PAGE分析检测结果。

具体实施方式

本发明提供了一种修改CH3氨基酸对FC进行改造，来减弱区域自身相互作用(同二聚体)并增强区域之间的相互作用(异二聚体)，并进一步获得异二聚体的方法，所述方法的步骤描述如下：

1.序列及结构获得

从蛋白质数据库(PDB，www.pdb.org)共获得48个包含FC区域的抗体晶体结构，通过结构相似性搜索算法(Ye and Godzik 2004)。FC同二聚体结构来自1DN2(PDB编号)。两个筛选策略可用来识别CH3-CH3之间的氨基酸接触：(i)氨基酸作用的距离(ii)溶剂可及区域分析。这里根据氨基酸作用距离进行筛选。

2.界面氨基酸获取

根据氨基酸接触规则，界面氨基酸指侧链重原子与另外一条链的任何一个氨基酸的重原子之间的距离小于一个阈值的那些氨基酸。在这里阈值选择为

在某些文献中也可以选择(Bahar and Jernigan 1997)。表1为抗体第一链及抗体第二链的CH3相互作用的氨基酸列表。从此结果可以看出，第一链及抗体第二链CH3氨基酸的相互作用不仅仅是一对一的关系，而是一对多或者是多对多的关系，此结论也可以从氨基酸作用网络图(图2)更直观地看出。表1所列的为通过氨基酸接触筛选规则所筛选出的34个界面氨基酸。

表1CH3-CH3界面氨基酸列表

3.构建氨基酸相互作用网络

在CH3-CH3界面氨基酸的基础上，对氨基酸之间的相互作用配对构建氨基酸相互作用网络(见图2)。氨基酸作用网络由所有CH3-CH3界面氨基酸及任何一个界面氨基酸所包含的与其它界面氨基酸之间的相互作用所构成。网络图中，分别对带电氨基酸进行电荷属性标注，天冬氨酸、谷氨酸为负，精氨酸、赖氨酸为正。

4.相互作用网络中节点(氨基酸)度的计算

节点度是指一个节点(氨基酸)拥有相邻节点(相互作用的氨基酸)的数目，基于电荷相互作用网络，分别计算每个节点临近氨基酸的个数(见表2)。任何一个界面氨基酸(节点)与其相互作用的氨基酸(相邻节点)构成该界面氨基酸的子网络。一般来说如果，某个氨基酸临近的氨基酸越多的话，则突变此氨基酸更容易对蛋白稳定性产生影响。

表2CH3-CH3界面氨基酸节点度列表

5.随机突变及筛选有义突变

在CH3-CH3界面氨基酸的相互作用网络图中，随机突变第一链和/或第二链上的一个或多个氨基酸，包括随机单点突变、随机双点突变及多点突变。计算包含所突变氨基酸的子网络的突变前电荷总和，及突变后电荷总和。

电荷总和＝所突变的氨基酸的子网络正负电荷之和

其中，正正电荷相互作用为1，负负电荷相互作用为1，正负电荷相互作用为-1，正/非电荷或者负/非电荷作用为0。

计算突变对同二聚体和异二聚体的形成在电荷意义上所带来的影响：

突变影响＝突变后电荷总数-突变前电荷总数。

筛选对于对同二聚体影响大于等于0的突变(即影响值＞＝0)，对异二聚体影响小于等于0的突变(影响值＜＝0)。

综合氨基酸度(氨基酸度越小越好)和有利突变(对异二聚体所造成有利影响及对同二聚体所造成的不利影响)，选择合理突变。

本专利中突变后的正电荷氨基酸为赖氨酸和精氨酸，突变后的负电氨基酸为天冬氨酸和谷氨酸。

单点突变

在CH3-CH3接触界面上选择氨基酸突变为正电荷，对同二聚体有负面影响的突变(影响值≥0)见表3。

表3单点突变为正电荷氨基酸所造成的影响

序号1-6为负电荷氨基酸突变为正电荷氨基酸，已为US 2010/286374A所披露。7-22为不带电氨基酸突变为正电荷氨基酸。可见，根据本发明的方法，通过不带电氨基酸单点突变抑制同二聚体，可以选择以下任一方法，即在包含CH3区域的多肽第一链，选择突变为带正电的氨基酸为PHE405、SER364、TYR407、VAL397、SER400、GLN362、VAL363或LEU398。

在CH3-CH3接触界面上选择氨基酸突变为负电荷，对同二聚体有负面影响的突变(影响值≥0)见表4。

表4单点突变为负电荷氨基酸所造成的影响

序号1-4为正电荷氨基酸突变为负电荷氨基酸，已为US 2010/286374A所披露。5-10为不带电氨基酸突变为负电荷氨基酸。可见，根据本发明的方法，通过不带电氨基酸单点突变抑制同二聚体，可以选择以下任一方法，即在包含CH3区域的多肽第一链，选择突变为带负电的氨基酸为VAL348、TYR349或THR350。

双点突变

在CH3-CH3接触界面上随机突变两个氨基酸，选择氨基酸突变为对同二聚体有负面影响的突变(影响值＞＝0)和/或对异二聚体有正面影响的突变(影响值＜＝0)，见表5。

表5双点突变氨基酸所造成的影响

^a：突变为带电氨基酸的电荷(正电荷为1，负电荷为-1)

序号1-11包括正电荷氨基酸突变为负电荷氨基酸或作相反突变，其中部分带电氨基酸突变已为US 2010/286374A所披露(如1、2、3、5和9)，但是其实施只限制在在Fc上与这些氨基酸相接触的带电荷氨基酸改编为相反电荷的氨基酸。12-33为两个不带电氨基酸分别突变为正电或负电荷氨基酸。可见，根据本发明的方法，通过不带电氨基酸双点突变制备异二聚体蛋白，有以下两种选择：

1、IgG1FC包括第一个包含CH3区域的多肽和第二个包含CH3区域的多肽的序列有别于野生型的人免疫球蛋白序列，它是由第一链上CH3区域一个不带电氨基酸替换为负电荷的氨基酸和第二链上CH3区域一个不带电氨基酸替换为正电荷的IgG序列所组成的。具体包括以下方式之一：

在包含CH3区域的多肽第一链突变TYR349为负电荷，在包含CH3区域的多肽第二链突变SER354为正电荷；

在包含CH3区域的多肽第一链突变THR350为负电荷，在包含CH3区域的多肽第二链突变SER354为正电荷；

在包含CH3区域的多肽第一链突变SER408为负电荷，在包含CH3区域的多肽第二链突变TYR407为正电荷；

在包含CH3区域的多肽第一链突变THR366为负电荷，在包含CH3区域的多肽第二链突变TYR407为正电荷；

在包含CH3区域的多肽第一链突变ASN390为负电荷，在包含CH3区域的多肽第二链突变SER400为正电荷；

在包含CH3区域的多肽第一链突变THR399为负电荷，在包含CH3区域的多肽第二链突变VAL397为正电荷；

在包含CH3区域的多肽第一链突变PRO395为负电荷，在包含CH3区域的多肽第二链突变VAL397为正电荷；

在包含CH3区域的多肽第一链突变THR394为负电荷，在包含CH3区域的多肽第二链突变TYR407为正电荷；

在包含CH3区域的多肽第一链突变LEU365为负电荷，在包含CH3区域的多肽第二链突变TYR407为正电荷；

在包含CH3区域的多肽第一链突变LEU368为负电荷，在包含CH3区域的多肽第二链突变SER364为正电荷。

2、IgG1FC包括第一个包含CH3区域的多肽和第二个包含CH3区域的多肽的序列有别于野生型的人免疫球蛋白序列，它是由第一链上CH3区域一个不带电氨基酸替换为正电荷的氨基酸和第二链上CH3区域一个不带电氨基酸替换为负电荷的IgG序列所组成的。具体包括以下方式之一：

在包含CH3区域的多肽第一链突变SER364为正电荷，在包含CH3区域的多肽第二链突变LEU368为负电荷；

在包含CH3区域的多肽第一链突变VAL397为正电荷，在包含CH3区域的多肽第二链突变PRO395为负电荷；

在包含CH3区域的多肽第一链突变VAL397为正电荷，在包含CH3区域的多肽第二链突变PRO395为负电荷；

在包含CH3区域的多肽第一链突变TRY407为正电荷，在包含CH3区域的多肽第二链突变SER408为负电荷；

在包含CH3区域的多肽第一链突变TRY407为正电荷，在包含CH3区域的多肽第二链突变THR366为负电荷；

在包含CH3区域的多肽第一链突变SER400为正电荷，在包含CH3区域的多肽第二链突变ASN390为负电荷；

在包含CH3区域的多肽第一链突变TYR407为正电荷，在包含CH3区域的多肽第二链突变LEU365为负电荷；

在包含CH3区域的多肽第一链突变TYR407为正电荷，在包含CH3区域的多肽第二链突变THR394为负电荷；

在包含CH3区域的多肽第一链突变VAL397为正电荷，在包含CH3区域的多肽第二链突变THR394为负电荷；

在包含CH3区域的多肽第一链突变VAL397为正电荷，在包含CH3区域的多肽第二链突变THR393为负电荷；

在包含CH3区域的多肽第一链突变SER354为正电荷，在包含CH3区域的多肽第二链突变TYR349为负电荷；

在包含CH3区域的多肽第一链突变SER354为正电荷，在包含CH3区域的多肽第二链突变THR350为负电荷。

此外，在更为复杂的情况下，可以根据本发明的方法，对CH3-CH3接触界面上随机突变3个以上、至少包括1个不带电氨基酸的电荷，选择氨基酸突变后对同二聚体有负面影响的突变(影响值＞＝0)和/或对异二聚体有正面影响的突变(影响值＜＝0)，以制备异二聚体蛋白。

根据本发明方案对异二聚体FC进行改造，并制备异二聚体抗体的方法，并不局限于上文所述的单点突变和双点突变，本领域技术人员可根据本发明的宗旨，对3个以上氨基酸进行突变，以形成异二聚体蛋白。

实施例1

该实施例将证明通过基于相互作用网络的电荷分析改造CH3结构域可以在形成异二聚体的同时抑制同二聚体。

融合蛋白IL-1R-Fc和Fc按以下方式构建：

同二聚体和异二聚体的表达情况用SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)进行检测。检测的原理是融合蛋白IL-1R-Fc比Fc具有更大的分子量，那么在IL-1R-Fc和Fc混合过程中，同二聚体(IL-1R-Fc/IL-1R-Fc，Fc/Fc)和异二聚体((IL-1R-Fc/Fc)在SDS-PAGE则具有不同的条带位置，通过这个原理就可以检测同二聚体与异二聚体的比例情况，检测结果见图4。

根据基因库中搜索到的人IgG1的Fc片段(hing-CH2-CH3)基因序列，人工合成方法获得人的Fc基因，合成好的Fc(SEQ ID NO：1)亚克隆到哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1中，测序验证构建质粒的准确性；采用天根的中抽试剂盒，按照说明书获得重组质粒DNA即pcDNA3.1-Fc。

人IgG1Fc序列如下所示(SEQ ID NO：1)，编码该序列的核苷酸序列见SEQ ID NO：2：DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

根据基因库中搜索到的人细胞白介素受体(IL-1R)基因序列，人工合成方法获得人的IL-1R基因，合成好的IL-1R基因亚克隆到重组表达载体pcDNA3.1-Fc中，获得IL-1R-Fc融合蛋白(SEQ ID NO：2，下划线部分表示Fc)，测序验证构建质粒的准确性；采用天根的中抽试剂盒，按照说明书获得重组质粒DNA即pcDNA3.1-IL-1R-Fc。

IL-1R-Fc序列如下所示(SEQ ID NO：3，下划线部分表示Fc)，编码该序列的核苷酸序列见SEQ ID NO：4：DKCKEREEKIILVSSANEIDVRPCPLNPNEHKGTITWYKDDSKTPVSTEQASRIHQHKEKLWFVPAKVEDSGHYYCVVRNSSYCLRIKISAKFVENEPNLCYNAQAIFKQKLPVAGDGGLVCPYMEFFKNENNELPKLQWYKDCKPLLLDNIHF SGVKDRLIVMNVAEKHRGNYTCHASYTYLGKQYPITRVIEFITLEENKPTRPVIVSPANETMEVDLGSQIQLICNVTGQLSDIAYWKWNGSVIDEDDPVLGEDYYSVENPANKRRSTLITVLNISEIESRFYKHPFTCFAKNTHGIDAAYIQLIYPVTNGSGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

重组质粒pcDNA3.1-Fc和pcDNA3.1-IL-1R-Fc共同转染至悬浮培养的293H细胞，培养3-4天后，收集细胞上清。将上清液与proteinA琼脂糖树脂进行免疫沉淀反应，通过非还原条件下SDS-PAGE电泳检测同二聚体(IL-1R-Fc/IL-1R-Fc，Fc/Fc)和异二聚体((IL-1R-Fc/Fc)的形成情况。

通过分析电荷相互作用网络修改IL-1R-Fc或Fc的CH3氨基酸来减弱同二聚体的形成，并增强异二聚体的形成，具体的突变位点详见表6，突变体是通过重叠PCR的方法获得的。

表6.突变体的具体突变位点

IL-1R-FC和FC表达载体共转染，最终会同时出现同二聚体(IL-1R-Fc/IL-1R-FC，FC/FC)和异二聚体(IL-1R-Fc/FC)，在野生型的情况下是IL-1R-Fc/IL-1R-FC，FC/FC和IL-1R-Fc/FC的比例接近1∶1∶1。

当在FC上引入E356K，IL-1R-Fc融合蛋白上引入K439D突变位点后，IL-1R-FC/FC异二聚体的比例有大幅度的上升，而同二聚体(IL-1R-Fc/IL-1R-FC，FC/FC)比例则大幅度下降(见图4)；当在FC上引入两个突变位点E356K/F405K，IL-1R-Fc融合蛋白上引入K439D，表达后蛋白基本上以IL-1R-FC/FC异二聚体的形式存在，进一步证明电荷作用对于异二聚体的形成至关重要。

Claims (24)

1.一种基于电荷网络的异二聚体FC改造方法，其特征在于，在FC的第一个包含CH3区域的多肽和/或第二个包含CH3区域的多肽上，一个或多个氨基酸突变为正电荷或负电荷氨基酸，它们相互接触形成促使异二聚体形成的界面，突变为按以下方法选择得到的有义突变之一：

1)随机突变抗体FC的CH3区域的一个或多个界面氨基酸为带有正电荷或负电荷的氨基酸；

2)基于界面氨基酸之间的电荷网络作用，计算突变对于同二聚体及异二聚体的影响值：

突变影响值＝突变后电荷总数-突变前电荷总数

电荷总数＝所突变的氨基酸的子网络电荷之和

其中，正正电荷相互作用为1，负负电荷相互作用为1，正负电荷相互作用为-1，正/非电荷或者负/非电荷作用为0；

3)筛选对于同二聚体影响值大于等于0的突变，或对异二聚体影响值小于等于0的突变。

2.根据权利要求1所述的异二聚体FC改造方法，其特征在于，在FC的第一个包含CH3区域的多肽和/或第二个包含CH3区域的多肽上，一个或多个不带电氨基酸突变为正电荷或负电荷氨基酸，它们相互接触形成促使异二聚体形成的界面，突变为按以下方法选择得到的有义突变之一：

1)随机突变抗体FC的CH3区域的一个或多个不带电界面氨基酸为带有正电荷或负电荷的氨基酸；

2)基于界面氨基酸之间的电荷网络作用，计算突变对于同二聚体及异二聚体的影响值：

突变影响值＝突变后电荷总数-突变前电荷总数

电荷总数＝所突变的氨基酸的子网络电荷之和

其中，正正电荷相互作用为1，负负电荷相互作用为1，正负电荷相互作用为-1，正/非电荷或者负/非电荷作用为0；

3)筛选对于同二聚体影响值大于等于0的突变，或对异二聚体影响值小于等于0的突变。

3.根据权利要求1或2所述的异二聚体FC改造方法，其特征在于，所述的方法具体包括以下步骤：

1)FC的CH3区域氨基酸序列及结构获得；

2)界面氨基酸获取；

3)构建电荷相互作用网络；

4)相互作用网络中节点度的计算；

5)随机突变CH3区域的一个或多个界面氨基酸，筛选有义突变。

4.根据权利要求1或2所述的异二聚体FC改造方法，其特征在于，所述的异二聚体FC包括人免疫球蛋白FC。

5.根据权利要求4所述的异二聚体FC改造方法，其特征在于，所述的异二聚体FC包括人免疫球蛋白IgGFC。

6.根据权利要求1或2所述的异二聚体FC改造方法，其特征在于，所述的突变为单点突变或双点突变。

7.根据权利要求1或2所述的异二聚体FC改造方法，其特征在于，所述的突变后正电荷氨基酸为赖氨酸或精氨酸，突变后负电氨基酸为天冬氨酸或谷氨酸。

8.一种异二聚体蛋白的制备方法，所述的异二聚体蛋白包括第一个包含CH3区域的多肽和第二个包含CH3区域的多肽，包括以下步骤：1)培养宿主细胞，宿主细胞包含编码第一个包含CH3区域多肽的核酸和第二个包含CH3区域多肽的核酸，其中培养的宿主细胞表达第一和第二个包含CH3区域的多肽；2)从宿主细胞培养物中提取异二聚体蛋白；

其特征在于：所述的第一个包含CH3区域的多肽和/或所述的第二个包含CH3区域的多肽在界面上包含一个或多个突变产生的氨基酸，它们相互接触形成促使异二聚体形成的界面，突变由不带电氨基酸突变为正电荷或负电荷氨基酸，并符合按以下方法选择得到的有义突变之一：

1)随机突变CH3区域上的一个或多个不带电界面氨基酸为带有正电荷或负电荷的氨基酸；

2)基于界面氨基酸之间的电荷网络作用，计算突变对于同二聚体及异二聚体的影响值：

突变影响值＝突变后电荷总数-突变前电荷总数

电荷总数＝所突变的氨基酸的子网络电荷之和

其中，正正电荷相互作用为1，负负电荷相互作用为1，正负电荷相互作用为-1，正/非电荷或者负/非电荷作用为0；

3)筛选对于同二聚体影响值大于等于0的突变，或对异二聚体影响值小于等于0的突变。

9.根据权利要求8所述的异二聚体蛋白的制备方法，其特征在于，所述的异二聚体蛋白包括人免疫球蛋白IgA，IgD，IgE，IgG或IgM FC。

10.根据权利要求9所述的异二聚体蛋白的制备方法，其特征在于，所述的异二聚体蛋白包括人免疫球蛋白IgG1FC。

11.根据权利要求10所述的异二聚体蛋白的制备方法，其特征在于，所述IgG1FC包括第一个包含CH3区域的多肽或者第二个包含CH3区域的多肽的序列有别于野生型的人免疫球蛋白序列，它是由CH3区域上的一个不带电氨基酸突变为正电荷或负电荷的氨基酸的IgG序列所组成的，选择突变为带正电的氨基酸为PHE405、SER364、TYR407、VAL397、SER400、GLN362、VAL363、LEU398；或者选择突变为带负电的氨基酸为VAL348、TYR349、THR350。

12.根据权利要求10所述的异二聚体蛋白的制备方法，其特征在于，所述的IgG1FC包括第一个包含CH3区域的多肽和第二个包含CH3区域的多肽的序列有别于野生型的人免疫球蛋白序列，它是由第一链上CH3区域一个不带电氨基酸突变为负电荷的氨基酸和第二链上CH3区域一个不带电氨基酸突变为正电荷的IgG序列所组成。

13.根据权利要求10所述的异二聚体蛋白的制备方法，其特征在于，所述的IgG1FC包括第一个包含CH3区域的多肽和第二个包含CH3区域的多肽的序列有别于野生型的人免疫球蛋白序列，它是由第一链上CH3区域一个不带电氨基酸突变为正电荷的氨基酸和第二链上CH3区域一个不带电氨基酸突变为负电荷的IgG序列所组成。

14.根据权利要求8所述的异二聚体蛋白的制备方法，其特征在于，所述的异二聚体蛋白为抗体、双特异性抗体、单一的单价型抗体、单域抗体、多肽型抗体或双特异性多肽型抗体。

15.一种异二聚体蛋白，包括第一个包含CH3区域的多肽和第二个包含CH3区域的多肽，其特征在于，所述的第一个包含CH3区域的多肽和/或所述的第二个包含CH3区域的多肽在界面上包含一个或多个突变氨基酸，它们相互接触形成促使异二聚体形成的界面，突变由不带电界面氨基酸突变为正电荷或负电荷氨基酸，并且对于同二聚体影响值大于等于0，或对异二聚体影响值小于等于0，影响值按以下方法计算：

突变影响值＝突变后电荷总数-突变前电荷总数

电荷总数＝所突变的氨基酸的子网络电荷之和

其中，正正电荷相互作用为1，负负电荷相互作用为1，正负电荷相互作用为-1，正/非电荷或者负/非电荷作用为0。

16.根据权利要求15所述的异二聚体蛋白，其特征在于，所述的异二聚体蛋白包括人免疫球蛋白IgA，IgE，IgD或者IgM的FC区域。

17.根据权利要求16所述的异二聚体蛋白，其特征在于，所述的FC区域包括人免疫球蛋白IgG1FC。

18.根据权利要求17所述的异二聚体蛋白，其特征在于，所述的IgG1FC第一个包含CH3区域的多肽或者第二个包含CH3区域的多肽的序列有别于野生型的人免疫球蛋白序列，它是由CH3区域上的一个不带电氨基酸替换为正电荷或负电荷的氨基酸的IgG序列所组成的，选择突变为带正电的氨基酸为PHE405、SER364、TYR407、VAL397、SER400、GLN362、VAL363、LEU398；或者选择突变为带负电的氨基酸为VAL348、TYR349、THR350。

19.根据权利要求17所述的异二聚体蛋白，其特征在于，所述的IgG1FC包括第一个包含CH3区域的多肽和第二个包含CH3区域的多肽的序列有别于野生型的人免疫球蛋白序列，它是由第一链上CH3区域一个不带电氨基酸替换为负电荷的氨基酸和第二链上CH3区域一个不带电氨基酸替换为正电荷的IgG序列所组成的。

20.根据权利要求17所述的异二聚体蛋白，其特征在于，所述的IgG1FC包括第一个包含CH3区域的多肽和第二个包含CH3区域的多肽的序列有别于野生型的人免疫球蛋白序列，它是由第一链上CH3区域一个不带电氨基酸替换为正电荷的氨基酸和第二链上CH3区域一个不带电氨基酸替换为负电荷的IgG序列所组成的。

21.根据权利要求15所述的异二聚体蛋白，其特征在于，所述的异二聚体蛋白是抗体、双特异性抗体、单一的单价型抗体、单域抗体、多肽型抗体或双特异性多肽型抗体。

22.一种多肽，包括抗体的CH3区域，其特征在于所述的CH3区域包含不同于野生型CH3区域的多肽序列，由野生型CH3区域中的一个或多个不带电荷的氨基酸突变为带正电荷氨基酸或负电荷的氨基酸所形成，突变对于同二聚体影响值大于等于0，或对异二聚体影响值小于等于0，影响值按以下方法计算：

突变影响值＝突变后电荷总数-突变前电荷总数

电荷总数＝所突变的氨基酸的子网络电荷之和

其中，正正电荷相互作用为1，负负电荷相互作用为1，正负电荷相互作用为-1，正/非电荷或者负/非电荷作用为0。

23.编码权利要求22所述多肽的核苷酸序列。

24.一种药物组合物，其特征在于其中包含权利要求22所述的多肽。

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