CN102550920B - 双歧因子口服液及其制备方法 - Google Patents

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CN102550920B CN 201210036233 CN201210036233A CN102550920B CN 102550920 B CN102550920 B CN 102550920B CN 201210036233 CN201210036233 CN 201210036233 CN 201210036233 A CN201210036233 A CN 201210036233A CN 102550920 B CN102550920 B CN 102550920B
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Abstract

本发明是一种双歧因子口服液，主要由云芝、复合氨基酸粉、低聚木糖、牛磺酸、葡萄糖酸锌、阿斯巴甜、山梨酸钾按一定质量配比组成。其制备方法为：云芝经粉碎、脱酯、纤维素酶和微波处理，醇沉后得云芝多糖；云芝多糖和低聚木糖经DEAE-纤维素柱层析纯化后，与其余原辅料高压均质稀配，杀菌分装。本发明将低聚木糖与其他原辅料相配伍，不仅具有良好的增强免疫力的保健功能，还可调节肠道菌群，平衡机体营养，降低血压、血清胆固醇及血糖；且因为本生产工艺的科学合理性，使本发明具有易于吸收，稳定性高，适宜生产等优点。

Description

双歧因子口服液及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种保健口服液及其制备方法，具体涉及的是一种双歧因子口服液及其制备方法。
背景技术
双歧因子是能够使双歧杆菌在肠道内增殖，促进双歧杆菌生长繁殖的物质，主要包括低聚糖类、多糖类物质、短链脂肪酸类物质、蛋白水解产物及一些蛋白质类物质、天然植物及中草药的提取物。
目前已工业化生产的多数是低聚糖类。在所有功能性低聚糖中，低聚木糖是功能最强、有效剂量最小的一种，所以低聚木糖可广泛应用在食品、保健品中。因为低聚木糖具有功能强、有效剂量小（每天0．7—1．4克）、稳定性好的特有性能，在生产原料、操作等方面大大降低了生产成本，提高了产品的附加值，符合现代生产企业、消费者的需要。
口服液作为一种新剂型，吸收中药注射剂的工艺特点，将汤剂进一步精制、浓缩、灌封、灭菌而得，具有服用剂量小、吸收较快、质量稳定、携带和服用方便、易保存等优点，尤其适合工业化生产。但由于口服液中成分复杂，性能、提取工艺各异，导致市场上不少口服液存在久置出现浑浊甚至沉淀现象，这是因为其中含有大量杂质且各有效组分未充分混匀，这不仅影响了产品的稳定性，也大大降低了人体对口服液的吸收率。
发明内容
本发明的目的是提供一种由云芝、复合氨基酸粉、低聚木糖、牛磺酸、葡萄糖酸锌、阿斯巴甜、山梨酸钾、纯化水为主要原辅料制成的口服液，方便人体服用，对人体具有调节肠道菌群，促进双岐杆菌增殖；增强免疫力；均衡机体营养等的保健功能。
由于经各工艺提取的低聚木糖和云芝多糖均混有蛋白、色素和小分子物质等杂质，这不仅影响产品纯度、稳定性，还大大制约了它们功效的发挥。
为解决上述问题，本发明的另一目的还在于：提供了该双歧因子口服液的制备工艺，以确保产品的有效成分纯度高、稳定性高，易于人体吸收。
本发明是通过以下技术方案实现的：
双歧因子口服液，由下述重量配比的原辅料制成：
云芝10-20g、复合氨基酸粉 60-80g、低聚木糖45-55g、牛磺酸7.5-8.5g、葡萄糖酸锌5-8g、阿斯巴甜4-6g、山梨酸钾1-3g；
以上共制成1000ml。
本发明的双歧因子口服液制备工艺流程如下：
一、     云芝多糖的提取
a、粉碎：云芝子实体粉碎后过80目筛；
b、脱脂：以80-95%乙醇脱脂回流3次，滤过，合并滤液；
c、除细胞壁：滤液加纤维素酶3-5g，于55℃酶解15-30min，反应完后沸水灭酶5min；
d、微波处理：再加云芝重量20倍的蒸馏水，于90℃，300-500w的微波中处理10-30min；
e、醇沉：过滤得滤液，滤液以50-70%乙醇沉淀，沉淀物真空干燥得云芝多糖a。
二、低聚木糖和云芝多糖的除杂纯化
a、溶解：按配方准确称量低聚木糖，将低聚木糖和（一）中提取的云芝多糖a溶于20ml磷酸钠缓冲液中；
b、DEAE-纤维素柱层析纯化：将上述缓冲液上DEAE-纤维素柱，用0.3mol/LNaCl溶液以流速3BV/h洗脱，收集洗脱液b。
三、原辅料均质稀配
a、按配方准确称量其他原辅料，将纯化水在浓配灌加热至80℃左右，加入原辅料和洗脱液b搅拌溶解；
b、高压均质：于50-80Mpa高压均质处理15-30min，使原辅料细化、均匀混合，从而提高人体的吸收率；
c、将药液通过过滤器过滤到稀配灌；在稀配罐中加入配制量0.3%的氢氧化钠调节药液PH值为7.5，并加纯化水至配制量，分装灭菌；
其中，复合氨基酸粉包含：L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸，且
各氨基酸的质量比为，L-亮氨酸：L-异亮氨酸：L-赖氨酸盐酸盐：L-苯丙氨酸：L-苏氨酸：L-缬氨酸：L-色氨酸：L-蛋氨酸=18:6:25:5:4:7:5:18。
其中，阿斯巴甜为口服液的矫味剂，山梨酸钾为口服液的防腐剂，纯化水为稀释剂。
本品具有如下保健功能：
1、调节肠道菌群，促进双岐杆菌增殖；
2、提高机体免疫，平衡机体营养；
3、降低血压、血清胆固醇及血糖；
4、改善内分泌状态；
5、低热量；
6、生成营养物质。
以下结合具体实施例对本发明进一步说明。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，以助于理解本发明的内容。
实施例1：
双歧因子口服液，由下述重量配比的原辅料制成：
云芝20g、复合氨基酸粉 60g、低聚木糖50g、牛磺酸8g、葡萄糖酸锌6g、阿斯巴甜5g、山梨酸钾2g；
以上共制成1000ml。
本发明的双歧因子口服液制备工艺流程如下：
一、     云芝多糖的提取
a、粉碎：云芝子实体粉碎后过80目筛；
b、脱脂：以90%乙醇脱脂回流3次，滤过，合并滤液；
c、除细胞壁：滤液加纤维素酶5g，于55℃酶解20min，反应完后沸水灭酶5min；
d、微波处理：再加云芝重量20倍的蒸馏水，于90℃，400w的微波中处理15min；
e、醇沉：过滤得滤液，滤液以60%乙醇沉淀，沉淀物真空干燥得云芝多糖a。
二、低聚木糖和云芝多糖的除杂纯化
a、溶解：按配方准确称量低聚木糖，将低聚木糖和（一）中提取的云芝多糖a溶于20ml磷酸钠缓冲液中；
b、DEAE-纤维素柱层析纯化：将上述缓冲液上DEAE-纤维素柱，用0.3mol/LNaCl溶液以流速3BV/h洗脱，收集洗脱液b。
三、原辅料均质稀配：
a、按配方准确称量其他原辅料，将纯化水在浓配灌加热至80℃左右，加入原辅料和洗脱液b搅拌溶解；
b、高压均质：于60Mpa高压均质处理20min，使原辅料细化、均匀混合，从而提高人体的吸收率；
c、将药液通过过滤器过滤到稀配灌；在稀配罐中加入配制量0.3%的氢氧化钠调节药液PH值为7.5，并加纯化水至配制量，分装灭菌；
其中，复合氨基酸粉包含：L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸，且各氨基酸的质量比为，L-亮氨酸：L-异亮氨酸：L-赖氨酸盐酸盐：L-苯丙氨酸：L-苏氨酸：L-缬氨酸：L-色氨酸：L-蛋氨酸=18:6:25:5:4:7:5:18。
其中，阿斯巴甜为口服液的矫味剂，山梨酸钾为口服液的防腐剂，纯化水为稀释剂。
实施例2
双歧因子口服液，由下述重量配比的原辅料制成：
云芝15g、复合氨基酸粉 70g、低聚木糖55g、牛磺酸8.5g、葡萄糖酸锌7g、阿斯巴甜6g、山梨酸钾3g；
以上共制成1000ml。
本发明的双歧因子口服液制备工艺流程如下：
一、     云芝多糖的提取：
a、粉碎：云芝子实体粉碎后过80目筛；
b、脱脂：以85%乙醇脱脂回流3次，滤过，合并滤液；
c、除细胞壁：滤液加纤维素酶4g，于55℃酶解30min，反应完后沸水灭酶5min；
d、微波处理：再加云芝重量20倍的蒸馏水，于90℃，350w的微波中处理20min；
e、醇沉：过滤得滤液，滤液以70%乙醇沉淀，沉淀物真空干燥得云芝多糖a。
二、低聚木糖和云芝多糖的除杂纯化：
a、溶解：按配方准确称量低聚木糖，将低聚木糖和（一）中提取的云芝多糖a溶于20ml磷酸钠缓冲液中；
b、DEAE-纤维素柱层析纯化：将上述缓冲液上DEAE-纤维素柱，用0.3mol/LNaCl溶液以流速3BV/h洗脱，收集洗脱液b。
三、原辅料均质稀配：
a、按配方准确称量其他原辅料，将纯化水在浓配灌加热至80℃左右，加入原辅料和洗脱液b搅拌溶解；
b、高压均质：于70Mpa高压均质处理15min，使原辅料细化、均匀混合，从而提高人体的吸收率；
c、将药液通过过滤器过滤到稀配灌；在稀配罐中加入配制量0.3%的氢氧化钠调节药液pH值为7.5，并加纯化水至配制量，分装灭菌；
其中，复合氨基酸粉包含：L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸，且各氨基酸的质量比为，L-亮氨酸：L-异亮氨酸：L-赖氨酸盐酸盐：L-苯丙氨酸：L-苏氨酸：L-缬氨酸：L-色氨酸：L-蛋氨酸=18:6:25:5:4:7:5:18。
其中，阿斯巴甜为口服液的矫味剂，山梨酸钾为口服液的防腐剂，纯化水为稀释剂。
实施例3
双歧因子口服液，由下述重量配比的原辅料制成：
云芝10g、复合氨基酸粉 75g、低聚木糖55g、牛磺酸8g、葡萄糖酸锌7g、阿斯巴甜6g、山梨酸钾3g；
以上共制成1000ml。
本发明的双歧因子口服液制备工艺流程如下：
一、     云芝多糖的提取
a、粉碎：云芝子实体粉碎后过80目筛；
b、脱脂：以95%乙醇脱脂回流3次，滤过，合并滤液；
c、除细胞壁：滤液加纤维素酶5g，于55℃酶解25min，反应完后沸水灭酶5min；
d、微波处理：再加云芝重量20倍的蒸馏水，于90℃，500w的微波中处理10min；
e、醇沉：过滤得滤液，滤液以70%乙醇沉淀，沉淀物真空干燥得云芝多糖a。
二、低聚木糖和云芝多糖的除杂纯化
a、溶解：按配方准确称量低聚木糖，将低聚木糖和（一）中提取的云芝多糖a溶于20ml磷酸钠缓冲液中；
b、DEAE-纤维素柱层析纯化：将上述缓冲液上DEAE-纤维素柱，用0.3mol/LNaCl溶液以流速3BV/h洗脱，收集洗脱液b。
三、原辅料均质稀配
a、按配方准确称量其他原辅料，将纯化水在浓配灌加热至80℃左右，加入原辅料和洗脱液b搅拌溶解；
b、高压均质：于80Mpa高压均质处理15min，使原辅料细化、均匀混合，从而提高人体的吸收率；
c、将药液通过过滤器过滤到稀配灌；在稀配罐中加入配制量0.3%的氢氧化钠调节药液PH值为7.5，并加纯化水至配制量，分装灭菌；
其中，复合氨基酸粉包含：L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸，且各氨基酸的质量比为，L-亮氨酸：L-异亮氨酸：L-赖氨酸盐酸盐：L-苯丙氨酸：L-苏氨酸：L-缬氨酸：L-色氨酸：L-蛋氨酸=18:6:25:5:4:7:5:18。
其中，阿斯巴甜为口服液的矫味剂，山梨酸钾为口服液的防腐剂，纯化水为稀释剂。
实施例4
双歧因子口服液，由下述重量配比的原辅料制成：
云芝20g、复合氨基酸粉 60g、低聚木糖50g、牛磺酸8g、葡萄糖酸锌6g、阿斯巴甜5g、山梨酸钾2g；
以上共制成1000ml。
本发明的双歧因子口服液制备工艺中，仅对云芝多糖进行DEAE-纤维素柱层析纯化，具体操作如下：将云芝多糖a溶于20ml磷酸钠缓冲液中，上DEAE-纤维素柱，用0.3mol/LNaCl溶液以流速3BV/h洗脱，收集洗脱液b；
其余同实施例1。
实施例5
双歧因子口服液，由下述重量配比的原辅料制成：
云芝20g、复合氨基酸粉 60g、低聚木糖50g、牛磺酸8g、葡萄糖酸锌6g、阿斯巴甜5g、山梨酸钾2g；
以上共制成1000ml。
本发明的双歧因子口服液制备工艺中，对云芝多糖和低聚木糖都不进行DEAE-纤维素柱层析纯化；
其余同实施例1。
实施例6
双歧因子口服液，由下述重量配比的原辅料制成：
云芝20g、复合氨基酸粉 60g、低聚木糖50g、牛磺酸8g、葡萄糖酸锌6g、阿斯巴甜5g、山梨酸钾2g；
以上共制成1000ml。
本发明的双歧因子口服液制备工艺中，不对口服液进行高压均质，仅对其进行原辅料稀配，具体操作如下：
a、按配方准确称量其他原辅料，将纯化水在浓配灌加热至80℃左右，加入原辅料和洗脱液b搅拌溶解；
b、将药液通过过滤器过滤到稀配灌；在稀配罐中加入配制量0.3%的氢氧化钠调节药液PH值为7.5，并加纯化水至配制量，分装灭菌；
其余同实施例1。
对比例1
双歧因子口服液，由下述重量配比的原辅料制成：
云芝20g、复合氨基酸粉 60g、低聚木糖50g、牛磺酸8g、葡萄糖酸锌6g、阿斯巴甜5g、山梨酸钾2g；
以上共制成1000ml。
本发明的双歧因子口服液制备工艺流程如下：
一、     云芝多糖的提取
a、粉碎：云芝子实体粉碎后过80目筛；
b、脱脂：以90%乙醇脱脂回流3次，滤过，合并滤液；
c、除细胞壁：滤液加纤维素酶5g，于55℃酶解20min，反应完后沸水灭酶5min；
d、微波处理：再加云芝重量20倍的蒸馏水，于90℃，400w的微波中处理15min；
e、醇沉：过滤得滤液，滤液以60%乙醇沉淀，沉淀物真空干燥得云芝多糖a。
二、原辅料稀配
a、按配方准确称量其他原辅料，将纯化水在浓配灌加热至80℃左右，加入原辅料和云芝多糖a搅拌溶解；
b、将药液通过过滤器过滤到稀配灌；在稀配罐中加入配制量0.3%的氢氧化钠调节药液PH值为7.5，并加纯化水至配制量，分装灭菌；
其余同实施例1。
对比例2
双歧因子口服液，由下述重量配比的原辅料制成：
云芝20g、复合氨基酸粉 60g、低聚木糖50g、牛磺酸8g、葡萄糖酸锌6g、阿斯巴甜5g、山梨酸钾2g；
以上共制成1000ml。
本发明的双歧因子口服液制备工艺流程如下：
一、     云芝多糖的提取
a、粉碎：云芝子实体粉碎后过80目筛；
b、脱脂：以90%乙醇脱脂回流3次，滤过，合并滤液；
c、除细胞壁：滤液加纤维素酶5g，于55℃酶解20min，反应完后沸水灭酶5min；
d、微波处理：再加云芝重量20倍的蒸馏水，于90℃，200w的微波中处理30min；
e、醇沉：过滤得滤液，滤液以60%乙醇沉淀，沉淀物真空干燥得云芝多糖a。
二、低聚木糖和云芝多糖的除杂纯化
a、溶解：按配方准确称量低聚木糖，将低聚木糖和（一）中提取的云芝多糖a溶于20ml磷酸钠缓冲液中；
b、DEAE-纤维素柱层析纯化：将上述缓冲液上DEAE-纤维素柱，用0.3mol/LNaCl溶液以流速3BV/h洗脱，收集洗脱液b。
三、原辅料均质稀配：
a、按配方准确称量其他原辅料，将纯化水在浓配灌加热至80℃左右，加入原辅料和洗脱液b搅拌溶解；
b、高压均质：于40Mpa高压均质处理30min，使原辅料细化、均匀混合，从而提高人体的吸收率；
c、将药液通过过滤器过滤到稀配灌；在稀配罐中加入配制量0.3%的氢氧化钠调节药液PH值为7.5，并加纯化水至配制量，分装灭菌；
其余同实施例1。
对比例3
双歧因子口服液，由下述重量配比的原辅料制成：
云芝20g、复合氨基酸粉 60g、低聚木糖50g、牛磺酸8g、葡萄糖酸锌6g、阿斯巴甜5g、山梨酸钾2g；
以上共制成1000ml。
本发明的双歧因子口服液制备工艺流程如下：
一、     云芝多糖的提取
a、粉碎：云芝子实体粉碎后过80目筛；
b、脱脂：以90%乙醇脱脂回流3次，滤过，合并滤液；
c、除细胞壁：滤液加纤维素酶5g，于55℃酶解20min，反应完后沸水灭酶5min；
d、微波处理：再加云芝重量20倍的蒸馏水，于90℃，600w的微波中处理15min；
e、醇沉：过滤得滤液，滤液以60%乙醇沉淀，沉淀物真空干燥得云芝多糖a。
二、低聚木糖和云芝多糖的除杂纯化
a、溶解：按配方准确称量低聚木糖，将低聚木糖和（一）中提取的云芝多糖a溶于20ml磷酸钠缓冲液中；
b、DEAE-纤维素柱层析纯化：将上述缓冲液上DEAE-纤维素柱，用0.3mol/LNaCl溶液以流速3BV/h洗脱，收集洗脱液b。
三、原辅料均质稀配
a、按配方准确称量其他原辅料，将纯化水在浓配灌加热至80℃左右，加入原辅料和洗脱液b搅拌溶解；
b、高压均质：于90Mpa高压均质处理30min，使原辅料细化、均匀混合，从而提高人体的吸收率；
c、将药液通过过滤器过滤到稀配灌；在稀配罐中加入配制量0.3%的氢氧化钠调节药液PH值为7.5，并加纯化水至配制量，分装灭菌；
其余同实施例1。
对比例4 
选用下述重量配比的原辅料：红枣60g、生姜50g、低聚木糖40g、口服葡萄糖100g；
工艺采用公开号为CN101396115A专利中的实施例1，步骤如下：红枣提取液的制备：选用新鲜洁净红枣60g，清水冲洗，沥干水分，
进入蒸煮罐，加入120g净化水100℃蒸煮15分钟，冷却至50℃以下打浆，进入贮存罐浸提30分钟，板框过滤，上清液加入80g净化水搅拌均匀，贮存待用。
生姜提取液的制备：选用新鲜洁净生姜50g，清水冲洗，沥干水分，切片，加入100g净化水100℃蒸煮5分钟，冷却至50℃以下打浆，进入贮存罐浸提30分钟，板框过滤，上清液加入60g净化水搅拌均匀，贮存待用。
在配料罐中，加入低聚木糖70糖浆40g，红枣提取液200g，生姜提取液100g，口服葡萄糖100g，加入净化水补齐1000ml，搅拌均匀，板框过滤，罐装，灭菌，检验，入库。
试验例1
双歧因子口服液的主要成分为水苏糖，由灯经水提而成。水苏糖具有使肠道内双歧杆菌成倍增生，调节肠道微生态平衡，降低血内毒素等功效。现采用高效液相色谱测定水苏糖含量，其中水苏糖对照品(自制，纯度 > 98 %) 。
试验方法：色谱柱为国产Spherisorb NH2 柱 ,流动相乙腈-水(70∶30)，柱温室温，流速 1.2ml/min。精密量取实施例1-6和对比例1-3制得的双歧因子口服液 5ml，置100ml 量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，取少量离心 5min ，10000r/min，取上清液作为样品溶液。分别精密吸取对照品溶液和实施例制得溶液10～20微升，注入高效液相色谱仪，外标法计算，即得。其中水苏糖含量列于表 1：
表1 水苏糖含量比较
实施例 1 2 3 4 5 6 对比例1 对比例2 对比例3 对比例4
含量　 mg/ ml 384.7 355.2 361.4 302.9 305.8 350.6 264.1 301.1 289.2 212.3
经水苏糖含量比较，可见低聚木糖经DEAE-纤维素柱层析纯化处理的实施例1-3和实施例6，所得有效成分含量明显高于其他实施例和对比例，其中以实施例1效果最好。
试验例2 加速试验
将实施例1-6和对比例1-3制得的双歧因子口服液，分别置于温度40℃，相对湿度75%的环境中保存6个月，在试验期间3个月、6个月末分别取样一次，分别测定其沉淀量和澄清度，结果见表2：
表2 沉淀量和澄清度的比较
                                                 
Figure 975212DEST_PATH_IMAGE001
高压均质能增强各组分间的亲和力，同时可提高口服液的稳定性，减少组分间间的粒度及密度差，防止口服液分层沉淀，并使组织均匀黏稠，口感细腻。经高压均质的实施例1-5在加速试验中，澄清无沉淀，且口感较好，其中以实施例1质量最稳定。
实验例
选取SPF级昆明种小鼠，由山东大学动物实验中心提供。实验环境温度22℃±2℃，相对湿度50%±10%。
剂量选择及样品处理：分别给予实施例1-6和对比例1-3所制双歧因子口服液，且受试物的浓度为166.7ml/L，对照组以等体积的蒸馏水代替受试物，连续给予30d后测各项免疫指标。每组随即选择11只实验小鼠，并以小鼠专用饲料喂饲。
实验例1
ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验（MTT法）：无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank液的小平皿中，制成细胞悬液，经200目筛网过滤后用Hank液洗2次，每次1000r/min离心10min。然后将细胞悬浮于1mlRPM640的完全培养液中，计数活细胞数，调整细胞浓度为3000000个/ml。将细胞悬浮分两孔加入24孔培养板中，每孔1ml，在其中一孔加75微升ConA液，另一孔作为对照，置5%CO2,38℃孵箱培养68h后，每孔轻轻吸去上清液0.7ml，加入0.7ml不含小牛血清的RPM640培养液，同时每孔加入50微升MTT，继续培养4h。每孔加入1ml酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解，然后将液体移入比色杯中，用紫外分光光度计，在570nm波长处测定其光密度值（OD值）。计算试验孔OD值之差，以此表示淋巴细胞的增殖能力。
所得数据为计量资料，结果见表3：
表3 双歧因子口服液对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验的影响
组别 动物数（只） 淋巴细胞增殖能力（OD值）
水对照组 11 0.065±0.030
实施例1 11 0.114±0.024
实施例2 11 0.108±0.022
实施例3 11 0.111±0.025
实施例4 11 0.086±0.024
实施例5 11 0.079±0.031
实施例6 11 0.101±0.026
对比例1 11 0.074±0.019
对比例2 11 0.090±0.030
对比例3 11 0.089±0.021
对比例4 11 0.068±0.042
由表3可见：经口给予小鼠不同实施例或对比例制得的双歧因子口服液30天，其淋巴细胞增殖能力与水对照组有显著性提高，即其对小鼠淋巴细胞转化能力有增强作用，且实施例1-3效果明显比对比例4要好，其中又以实施例1效果最好。
实验例2
抗体生成细胞测定：取脱纤维羊血，用生理盐水洗涤3次，每只鼠经腹腔注射2%压积SRBC（2000r/min，10min）0.2ml，将SRBC免疫5天后的小鼠处死，取脾，制成细胞悬液。将10g/l琼脂糖加热溶解后，与等量双倍Hank液混合，分装小试管，每管0.5ml，再向管内加10%压积SRBC50微升，脾细胞悬液20微升，迅速混匀后，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入CO2培养箱孵育1.5h，然后将补体（用SA缓冲液按1:8稀释）加入玻片架凹槽内，继续温育1.5h后，计数溶血空斑数。
所得数据为计量资料，结果见表4：
表4 双歧因子口服液对小鼠抗体生成细胞数的影响
组别 动物数（只） 溶血空斑数（1000/全脾）
水对照组 11 56.18±16.20
实施例1 11 76.02±20.34
实施例2 11 74.84±24.44
实施例3 11 75.78±21.38
实施例4 11 66.25±19.41
实施例5 11 64.03±20.15
实施例6 11 70.36±21.57
对比例1 11 62.74±18.36
对比例2 11 68.44±21.39
对比例3 11 63.59±16.83
对比例4 11 60.48±18.37
由表4可见，经口给予小鼠各实施例或对比例所制得的双歧因子口服液30天，实施例1-3所对应的小鼠组别抗体生成细胞数与水对照组和其他组别比较，均有显著性差异，即该口服液可增强小鼠抗体生成细胞数，且实施例1所制得的双歧因子效果最优。
实验例3
小鼠血清溶血素的测定：取脱纤维羊血，用生理盐水洗涤3次，每只鼠经腹腔注射2%压积SRBC(2000r/min，10min)0.2ml，免疫5天后，摘除小鼠眼球取血于离心管内，放置约1h，将凝固血与管壁剥离，离心，收集血清。用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度血清分别置于微量血凝试验板内，每孔100微升，再加入0.5%SRBC悬液100微升，混匀，置湿盒内，于37℃温箱孵育3h，记录血球凝集程度。计算抗体积数。
所得数据为计量资料，结果见表5：
表5 双歧因子口服液对小鼠小鼠血清溶血素水平的影响
组别 动物数（只） 抗体积数
水对照组 11 101.4±29.1
实施例1 11 134.9±30.8
实施例2 11 127.8±23.9
实施例3 11 132.5±21.4
实施例4 11 120.1±25.6
实施例5 11 116.3±22.3
实施例6 11 130.5±24.4
对比例1 11 108.0±28.2
对比例2 11 119.4±23.3
对比例3 11 112.6±26.5
对比例4 11 106.5±21.7
由表5可见，经口给予小鼠各实施例或对比例所制得的双歧因子口服液30天，实施例1-3组的小鼠抗体积数与水对照组和其他组别相比，均有显著性差异，即该口服液可提高小鼠血清溶血素水平，且实施例1效果最佳。
实施例4
小鼠NK细胞活性测定（乳酸脱氢酶LDH测定法）：试验前24h将YAC-1细胞进行传代培养，用前以Hank液洗3次，用RPM640完全培养液调整细胞浓度为400000个/ml。将小鼠脱臼处死，无菌取脾，制备脾细胞悬液，用Hank液洗3次，每次1000rpm离心10min。再加1ml含10%小牛血清的RPM640完全培养液重悬，用酚兰染色计数（活细胞数应在95%以上），调整细胞浓度为20000000个/ml，使效靶比为50:1。
取靶细胞和脾细胞各100微升，加入U型96孔培养板，靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100微升，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1%NP40各100微升，上述各项均设三个平行孔，37℃、5%CO2培养箱培养4h，将96孔板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清液100微升转入酶标板中，同时加入LDH基质液100微升，反应10min，然后每孔加入1mol/l的Hcl30微升终止反应，用酶标仪在490nm处测定OD值。按公式计算NK细胞活性：NK细胞活性%=(反应孔OD-自然释放孔OD)/（最大释放孔OD-自然释放孔OD）×100，结果见表6：
表6  双歧因子口服液对小鼠NK细胞活性的影响
组别 动物数（只） NK细胞活性（%）
水对照组 11 23.47±8.67
实施例1 11 47.00±11.62
实施例2 11 43.40±10.75
实施例3 11 45.40±10.16
实施例4 11 40.36±9.57
实施例5 11 38.22±10.34
实施例6 11 46.13±11.27
对比例1 11 37.57±9.46
对比例2 11 40.12±10.39
对比例3 11 36.25±11.08
对比例4 11 27.31±10.85
由表6可见，经口给予小鼠各实施例或对比例所制得的双歧因子口服液30天，其NK细胞活性与对照组间比较均有显著性差异，即该口服液可增强小鼠的NK细胞活性，且实施例1-3优于其他实施例和对比例，而实施例1效果最佳。
由以上实验例可以看出，本发明制得的双歧因子口服液可以增强小鼠淋巴细胞转化能力，增强小鼠抗体生成细胞数，提高小鼠血清溶血素水平，增强小鼠的NK细胞活性，具有方便服用，产品纯度高，便于吸收的特性，并具有增强机体免疫，平衡体内营养的功效。

Claims (2)

1.双歧因子口服液，其特征在于，由下述重量配比的原辅料制成：云芝10-20g、复合氨基酸粉 60-80g、低聚木糖45-55g、牛磺酸7.5-8.5g、葡萄糖酸锌5-8g、阿斯巴甜4-6g、山梨酸钾1-3g；
制备方法为：
一、云芝多糖的提取：
a、粉碎：云芝子实体粉碎后过80目筛；
b、脱脂：以80-95%乙醇脱脂回流3次，滤过，合并滤液；
c、除细胞壁：滤液加纤维素酶3-5g，于55℃酶解15-30min，反应完后沸水灭酶5min；
d、微波处理：再加云芝重量20倍的蒸馏水，于90℃，300-500w的微波中处理10-30min；
e、醇沉：过滤得滤液，滤液以50-70%乙醇沉淀，沉淀物真空干燥得云芝多糖a；
二、低聚木糖和云芝多糖的除杂纯化：
a、溶解：按配方准确称量低聚木糖，将低聚木糖和（一）中提取的云芝多糖a溶于20ml磷酸钠缓冲液中；
b、DEAE-纤维素柱层析纯化：将上述缓冲液上DEAE-纤维素柱，用0.3mol/LNaCl溶液以流速3BV/h洗脱，收集洗脱液b；
三、原辅料均质稀配：
a、按配方准确称量其他原辅料，将纯化水在浓配灌加热至80℃，加入原辅料和洗脱液b搅拌溶解；
b、高压均质：于50-80Mpa高压均质处理15-30min，使原辅料细化、均匀混合，从而提高人体的吸收率；
c、将药液通过过滤器过滤到稀配灌；在稀配罐中加入配制量0.3%的氢氧化钠调节药液pH值为7.5，并加纯化水至配制量，分装灭菌；
    其中，复合氨基酸粉包含：L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸，且L-亮氨酸︰L-异亮氨酸︰L-赖氨酸盐酸盐︰L-苯丙氨酸︰L-苏氨酸︰L-缬氨酸︰L-色氨酸︰L-蛋氨酸=18:6:25:5:4:7:5:18。
2.如权利要求1所述的双歧因子口服液，其特征在于，由下述重量配比的原辅料制成：云芝20g、复合氨基酸粉 60g、低聚木糖50g、牛磺酸8g、葡萄糖酸锌6g、阿斯巴甜5g、山梨酸钾2g；
制备方法为：
一、云芝多糖的提取：
a、粉碎：云芝子实体粉碎后过80目筛；
b、脱脂：以90%乙醇脱脂回流3次，滤过，合并滤液；
c、除细胞壁：滤液加纤维素酶5g，于55℃酶解20min，反应完后沸水灭酶5min；
d、微波处理：再加云芝重量20倍的蒸馏水，于90℃，400w的微波中处理15min；
e、醇沉：过滤得滤液，滤液以60%乙醇沉淀，沉淀物真空干燥得云芝多糖a；
二、低聚木糖和云芝多糖的除杂纯化：
a、溶解：按配方准确称量低聚木糖，将低聚木糖和（一）中提取的云芝多糖a溶于20ml磷酸钠缓冲液中；
b、DEAE-纤维素柱层析纯化：将上述缓冲液上DEAE-纤维素柱，用0.3mol/LNaCl溶液以流速3BV/h洗脱，收集洗脱液b；
三、原辅料均质稀配：
a、按配方准确称量其他原辅料，将纯化水在浓配灌加热至80℃，加入原辅料和洗脱液b搅拌溶解；
b、高压均质：于60Mpa高压均质处理20min，使原辅料细化、均匀混合，从而提高人体的吸收率；
c、将药液通过过滤器过滤到稀配灌；在稀配罐中加入配制量0.3%的氢氧化钠调节药液pH值为7.5，并加纯化水至配制量，分装灭菌；
    其中，复合氨基酸粉包含：L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸，且L-亮氨酸︰L-异亮氨酸︰L-赖氨酸盐酸盐︰L-苯丙氨酸︰L-苏氨酸︰L-缬氨酸︰L-色氨酸︰L-蛋氨酸=18:6:25:5:4:7:5:18。
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