CN102550920B - 双歧因子口服液及其制备方法 - Google Patents
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Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明是一种双歧因子口服液,主要由云芝、复合氨基酸粉、低聚木糖、牛磺酸、葡萄糖酸锌、阿斯巴甜、山梨酸钾按一定质量配比组成。其制备方法为:云芝经粉碎、脱酯、纤维素酶和微波处理,醇沉后得云芝多糖;云芝多糖和低聚木糖经DEAE-纤维素柱层析纯化后,与其余原辅料高压均质稀配,杀菌分装。本发明将低聚木糖与其他原辅料相配伍,不仅具有良好的增强免疫力的保健功能,还可调节肠道菌群,平衡机体营养,降低血压、血清胆固醇及血糖;且因为本生产工艺的科学合理性,使本发明具有易于吸收,稳定性高,适宜生产等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种保健口服液及其制备方法,具体涉及的是一种双歧因子口服液及其制备方法。
背景技术
双歧因子是能够使双歧杆菌在肠道内增殖,促进双歧杆菌生长繁殖的物质,主要包括低聚糖类、多糖类物质、短链脂肪酸类物质、蛋白水解产物及一些蛋白质类物质、天然植物及中草药的提取物。
目前已工业化生产的多数是低聚糖类。在所有功能性低聚糖中,低聚木糖是功能最强、有效剂量最小的一种,所以低聚木糖可广泛应用在食品、保健品中。因为低聚木糖具有功能强、有效剂量小(每天0.7—1.4克)、稳定性好的特有性能,在生产原料、操作等方面大大降低了生产成本,提高了产品的附加值,符合现代生产企业、消费者的需要。
口服液作为一种新剂型,吸收中药注射剂的工艺特点,将汤剂进一步精制、浓缩、灌封、灭菌而得,具有服用剂量小、吸收较快、质量稳定、携带和服用方便、易保存等优点,尤其适合工业化生产。但由于口服液中成分复杂,性能、提取工艺各异,导致市场上不少口服液存在久置出现浑浊甚至沉淀现象,这是因为其中含有大量杂质且各有效组分未充分混匀,这不仅影响了产品的稳定性,也大大降低了人体对口服液的吸收率。
发明内容
本发明的目的是提供一种由云芝、复合氨基酸粉、低聚木糖、牛磺酸、葡萄糖酸锌、阿斯巴甜、山梨酸钾、纯化水为主要原辅料制成的口服液,方便人体服用,对人体具有调节肠道菌群,促进双岐杆菌增殖;增强免疫力;均衡机体营养等的保健功能。
由于经各工艺提取的低聚木糖和云芝多糖均混有蛋白、色素和小分子物质等杂质,这不仅影响产品纯度、稳定性,还大大制约了它们功效的发挥。
为解决上述问题,本发明的另一目的还在于:提供了该双歧因子口服液的制备工艺,以确保产品的有效成分纯度高、稳定性高,易于人体吸收。
本发明是通过以下技术方案实现的:
双歧因子口服液,由下述重量配比的原辅料制成:
云芝10-20g、复合氨基酸粉 60-80g、低聚木糖45-55g、牛磺酸7.5-8.5g、葡萄糖酸锌5-8g、阿斯巴甜4-6g、山梨酸钾1-3g;
以上共制成1000ml。
本发明的双歧因子口服液制备工艺流程如下:
一、 云芝多糖的提取
a、粉碎:云芝子实体粉碎后过80目筛;
b、脱脂:以80-95%乙醇脱脂回流3次,滤过,合并滤液;
c、除细胞壁:滤液加纤维素酶3-5g,于55℃酶解15-30min,反应完后沸水灭酶5min;
d、微波处理:再加云芝重量20倍的蒸馏水,于90℃,300-500w的微波中处理10-30min;
e、醇沉:过滤得滤液,滤液以50-70%乙醇沉淀,沉淀物真空干燥得云芝多糖a。
二、低聚木糖和云芝多糖的除杂纯化
a、溶解:按配方准确称量低聚木糖,将低聚木糖和(一)中提取的云芝多糖a溶于20ml磷酸钠缓冲液中;
b、DEAE-纤维素柱层析纯化:将上述缓冲液上DEAE-纤维素柱,用0.3mol/LNaCl溶液以流速3BV/h洗脱,收集洗脱液b。
三、原辅料均质稀配
a、按配方准确称量其他原辅料,将纯化水在浓配灌加热至80℃左右,加入原辅料和洗脱液b搅拌溶解;
b、高压均质:于50-80Mpa高压均质处理15-30min,使原辅料细化、均匀混合,从而提高人体的吸收率;
c、将药液通过过滤器过滤到稀配灌;在稀配罐中加入配制量0.3%的氢氧化钠调节药液PH值为7.5,并加纯化水至配制量,分装灭菌;
其中,复合氨基酸粉包含:L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸,且
各氨基酸的质量比为,L-亮氨酸:L-异亮氨酸:L-赖氨酸盐酸盐:L-苯丙氨酸:L-苏氨酸:L-缬氨酸:L-色氨酸:L-蛋氨酸=18:6:25:5:4:7:5:18。
其中,阿斯巴甜为口服液的矫味剂,山梨酸钾为口服液的防腐剂,纯化水为稀释剂。
本品具有如下保健功能:
1、调节肠道菌群,促进双岐杆菌增殖;
2、提高机体免疫,平衡机体营养;
3、降低血压、血清胆固醇及血糖;
4、改善内分泌状态;
5、低热量;
6、生成营养物质。
以下结合具体实施例对本发明进一步说明。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明,以助于理解本发明的内容。
实施例1:
双歧因子口服液,由下述重量配比的原辅料制成:
云芝20g、复合氨基酸粉 60g、低聚木糖50g、牛磺酸8g、葡萄糖酸锌6g、阿斯巴甜5g、山梨酸钾2g;
以上共制成1000ml。
本发明的双歧因子口服液制备工艺流程如下:
一、 云芝多糖的提取
a、粉碎:云芝子实体粉碎后过80目筛;
b、脱脂:以90%乙醇脱脂回流3次,滤过,合并滤液;
c、除细胞壁:滤液加纤维素酶5g,于55℃酶解20min,反应完后沸水灭酶5min;
d、微波处理:再加云芝重量20倍的蒸馏水,于90℃,400w的微波中处理15min;
e、醇沉:过滤得滤液,滤液以60%乙醇沉淀,沉淀物真空干燥得云芝多糖a。
二、低聚木糖和云芝多糖的除杂纯化
a、溶解:按配方准确称量低聚木糖,将低聚木糖和(一)中提取的云芝多糖a溶于20ml磷酸钠缓冲液中;
b、DEAE-纤维素柱层析纯化:将上述缓冲液上DEAE-纤维素柱,用0.3mol/LNaCl溶液以流速3BV/h洗脱,收集洗脱液b。
三、原辅料均质稀配:
a、按配方准确称量其他原辅料,将纯化水在浓配灌加热至80℃左右,加入原辅料和洗脱液b搅拌溶解;
b、高压均质:于60Mpa高压均质处理20min,使原辅料细化、均匀混合,从而提高人体的吸收率;
c、将药液通过过滤器过滤到稀配灌;在稀配罐中加入配制量0.3%的氢氧化钠调节药液PH值为7.5,并加纯化水至配制量,分装灭菌;
其中,复合氨基酸粉包含:L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸,且各氨基酸的质量比为,L-亮氨酸:L-异亮氨酸:L-赖氨酸盐酸盐:L-苯丙氨酸:L-苏氨酸:L-缬氨酸:L-色氨酸:L-蛋氨酸=18:6:25:5:4:7:5:18。
其中,阿斯巴甜为口服液的矫味剂,山梨酸钾为口服液的防腐剂,纯化水为稀释剂。
实施例2
双歧因子口服液,由下述重量配比的原辅料制成:
云芝15g、复合氨基酸粉 70g、低聚木糖55g、牛磺酸8.5g、葡萄糖酸锌7g、阿斯巴甜6g、山梨酸钾3g;
以上共制成1000ml。
本发明的双歧因子口服液制备工艺流程如下:
一、 云芝多糖的提取:
a、粉碎:云芝子实体粉碎后过80目筛;
b、脱脂:以85%乙醇脱脂回流3次,滤过,合并滤液;
c、除细胞壁:滤液加纤维素酶4g,于55℃酶解30min,反应完后沸水灭酶5min;
d、微波处理:再加云芝重量20倍的蒸馏水,于90℃,350w的微波中处理20min;
e、醇沉:过滤得滤液,滤液以70%乙醇沉淀,沉淀物真空干燥得云芝多糖a。
二、低聚木糖和云芝多糖的除杂纯化:
a、溶解:按配方准确称量低聚木糖,将低聚木糖和(一)中提取的云芝多糖a溶于20ml磷酸钠缓冲液中;
b、DEAE-纤维素柱层析纯化:将上述缓冲液上DEAE-纤维素柱,用0.3mol/LNaCl溶液以流速3BV/h洗脱,收集洗脱液b。
三、原辅料均质稀配:
a、按配方准确称量其他原辅料,将纯化水在浓配灌加热至80℃左右,加入原辅料和洗脱液b搅拌溶解;
b、高压均质:于70Mpa高压均质处理15min,使原辅料细化、均匀混合,从而提高人体的吸收率;
c、将药液通过过滤器过滤到稀配灌;在稀配罐中加入配制量0.3%的氢氧化钠调节药液pH值为7.5,并加纯化水至配制量,分装灭菌;
其中,复合氨基酸粉包含:L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸,且各氨基酸的质量比为,L-亮氨酸:L-异亮氨酸:L-赖氨酸盐酸盐:L-苯丙氨酸:L-苏氨酸:L-缬氨酸:L-色氨酸:L-蛋氨酸=18:6:25:5:4:7:5:18。
其中,阿斯巴甜为口服液的矫味剂,山梨酸钾为口服液的防腐剂,纯化水为稀释剂。
实施例3
双歧因子口服液,由下述重量配比的原辅料制成:
云芝10g、复合氨基酸粉 75g、低聚木糖55g、牛磺酸8g、葡萄糖酸锌7g、阿斯巴甜6g、山梨酸钾3g;
以上共制成1000ml。
本发明的双歧因子口服液制备工艺流程如下:
一、 云芝多糖的提取
a、粉碎:云芝子实体粉碎后过80目筛;
b、脱脂:以95%乙醇脱脂回流3次,滤过,合并滤液;
c、除细胞壁:滤液加纤维素酶5g,于55℃酶解25min,反应完后沸水灭酶5min;
d、微波处理:再加云芝重量20倍的蒸馏水,于90℃,500w的微波中处理10min;
e、醇沉:过滤得滤液,滤液以70%乙醇沉淀,沉淀物真空干燥得云芝多糖a。
二、低聚木糖和云芝多糖的除杂纯化
a、溶解:按配方准确称量低聚木糖,将低聚木糖和(一)中提取的云芝多糖a溶于20ml磷酸钠缓冲液中;
b、DEAE-纤维素柱层析纯化:将上述缓冲液上DEAE-纤维素柱,用0.3mol/LNaCl溶液以流速3BV/h洗脱,收集洗脱液b。
三、原辅料均质稀配
a、按配方准确称量其他原辅料,将纯化水在浓配灌加热至80℃左右,加入原辅料和洗脱液b搅拌溶解;
b、高压均质:于80Mpa高压均质处理15min,使原辅料细化、均匀混合,从而提高人体的吸收率;
c、将药液通过过滤器过滤到稀配灌;在稀配罐中加入配制量0.3%的氢氧化钠调节药液PH值为7.5,并加纯化水至配制量,分装灭菌;
其中,复合氨基酸粉包含:L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸,且各氨基酸的质量比为,L-亮氨酸:L-异亮氨酸:L-赖氨酸盐酸盐:L-苯丙氨酸:L-苏氨酸:L-缬氨酸:L-色氨酸:L-蛋氨酸=18:6:25:5:4:7:5:18。
其中,阿斯巴甜为口服液的矫味剂,山梨酸钾为口服液的防腐剂,纯化水为稀释剂。
实施例4
双歧因子口服液,由下述重量配比的原辅料制成:
云芝20g、复合氨基酸粉 60g、低聚木糖50g、牛磺酸8g、葡萄糖酸锌6g、阿斯巴甜5g、山梨酸钾2g;
以上共制成1000ml。
本发明的双歧因子口服液制备工艺中,仅对云芝多糖进行DEAE-纤维素柱层析纯化,具体操作如下:将云芝多糖a溶于20ml磷酸钠缓冲液中,上DEAE-纤维素柱,用0.3mol/LNaCl溶液以流速3BV/h洗脱,收集洗脱液b;
其余同实施例1。
实施例5
双歧因子口服液,由下述重量配比的原辅料制成:
云芝20g、复合氨基酸粉 60g、低聚木糖50g、牛磺酸8g、葡萄糖酸锌6g、阿斯巴甜5g、山梨酸钾2g;
以上共制成1000ml。
本发明的双歧因子口服液制备工艺中,对云芝多糖和低聚木糖都不进行DEAE-纤维素柱层析纯化;
其余同实施例1。
实施例6
双歧因子口服液,由下述重量配比的原辅料制成:
云芝20g、复合氨基酸粉 60g、低聚木糖50g、牛磺酸8g、葡萄糖酸锌6g、阿斯巴甜5g、山梨酸钾2g;
以上共制成1000ml。
本发明的双歧因子口服液制备工艺中,不对口服液进行高压均质,仅对其进行原辅料稀配,具体操作如下:
a、按配方准确称量其他原辅料,将纯化水在浓配灌加热至80℃左右,加入原辅料和洗脱液b搅拌溶解;
b、将药液通过过滤器过滤到稀配灌;在稀配罐中加入配制量0.3%的氢氧化钠调节药液PH值为7.5,并加纯化水至配制量,分装灭菌;
其余同实施例1。
对比例1
双歧因子口服液,由下述重量配比的原辅料制成:
云芝20g、复合氨基酸粉 60g、低聚木糖50g、牛磺酸8g、葡萄糖酸锌6g、阿斯巴甜5g、山梨酸钾2g;
以上共制成1000ml。
本发明的双歧因子口服液制备工艺流程如下:
一、 云芝多糖的提取
a、粉碎:云芝子实体粉碎后过80目筛;
b、脱脂:以90%乙醇脱脂回流3次,滤过,合并滤液;
c、除细胞壁:滤液加纤维素酶5g,于55℃酶解20min,反应完后沸水灭酶5min;
d、微波处理:再加云芝重量20倍的蒸馏水,于90℃,400w的微波中处理15min;
e、醇沉:过滤得滤液,滤液以60%乙醇沉淀,沉淀物真空干燥得云芝多糖a。
二、原辅料稀配
a、按配方准确称量其他原辅料,将纯化水在浓配灌加热至80℃左右,加入原辅料和云芝多糖a搅拌溶解;
b、将药液通过过滤器过滤到稀配灌;在稀配罐中加入配制量0.3%的氢氧化钠调节药液PH值为7.5,并加纯化水至配制量,分装灭菌;
其余同实施例1。
对比例2
双歧因子口服液,由下述重量配比的原辅料制成:
云芝20g、复合氨基酸粉 60g、低聚木糖50g、牛磺酸8g、葡萄糖酸锌6g、阿斯巴甜5g、山梨酸钾2g;
以上共制成1000ml。
本发明的双歧因子口服液制备工艺流程如下:
一、 云芝多糖的提取
a、粉碎:云芝子实体粉碎后过80目筛;
b、脱脂:以90%乙醇脱脂回流3次,滤过,合并滤液;
c、除细胞壁:滤液加纤维素酶5g,于55℃酶解20min,反应完后沸水灭酶5min;
d、微波处理:再加云芝重量20倍的蒸馏水,于90℃,200w的微波中处理30min;
e、醇沉:过滤得滤液,滤液以60%乙醇沉淀,沉淀物真空干燥得云芝多糖a。
二、低聚木糖和云芝多糖的除杂纯化
a、溶解:按配方准确称量低聚木糖,将低聚木糖和(一)中提取的云芝多糖a溶于20ml磷酸钠缓冲液中;
b、DEAE-纤维素柱层析纯化:将上述缓冲液上DEAE-纤维素柱,用0.3mol/LNaCl溶液以流速3BV/h洗脱,收集洗脱液b。
三、原辅料均质稀配:
a、按配方准确称量其他原辅料,将纯化水在浓配灌加热至80℃左右,加入原辅料和洗脱液b搅拌溶解;
b、高压均质:于40Mpa高压均质处理30min,使原辅料细化、均匀混合,从而提高人体的吸收率;
c、将药液通过过滤器过滤到稀配灌;在稀配罐中加入配制量0.3%的氢氧化钠调节药液PH值为7.5,并加纯化水至配制量,分装灭菌;
其余同实施例1。
对比例3
双歧因子口服液,由下述重量配比的原辅料制成:
云芝20g、复合氨基酸粉 60g、低聚木糖50g、牛磺酸8g、葡萄糖酸锌6g、阿斯巴甜5g、山梨酸钾2g;
以上共制成1000ml。
本发明的双歧因子口服液制备工艺流程如下:
一、 云芝多糖的提取
a、粉碎:云芝子实体粉碎后过80目筛;
b、脱脂:以90%乙醇脱脂回流3次,滤过,合并滤液;
c、除细胞壁:滤液加纤维素酶5g,于55℃酶解20min,反应完后沸水灭酶5min;
d、微波处理:再加云芝重量20倍的蒸馏水,于90℃,600w的微波中处理15min;
e、醇沉:过滤得滤液,滤液以60%乙醇沉淀,沉淀物真空干燥得云芝多糖a。
二、低聚木糖和云芝多糖的除杂纯化
a、溶解:按配方准确称量低聚木糖,将低聚木糖和(一)中提取的云芝多糖a溶于20ml磷酸钠缓冲液中;
b、DEAE-纤维素柱层析纯化:将上述缓冲液上DEAE-纤维素柱,用0.3mol/LNaCl溶液以流速3BV/h洗脱,收集洗脱液b。
三、原辅料均质稀配
a、按配方准确称量其他原辅料,将纯化水在浓配灌加热至80℃左右,加入原辅料和洗脱液b搅拌溶解;
b、高压均质:于90Mpa高压均质处理30min,使原辅料细化、均匀混合,从而提高人体的吸收率;
c、将药液通过过滤器过滤到稀配灌;在稀配罐中加入配制量0.3%的氢氧化钠调节药液PH值为7.5,并加纯化水至配制量,分装灭菌;
其余同实施例1。
对比例4
选用下述重量配比的原辅料:红枣60g、生姜50g、低聚木糖40g、口服葡萄糖100g;
工艺采用公开号为CN101396115A专利中的实施例1,步骤如下:红枣提取液的制备:选用新鲜洁净红枣60g,清水冲洗,沥干水分,
进入蒸煮罐,加入120g净化水100℃蒸煮15分钟,冷却至50℃以下打浆,进入贮存罐浸提30分钟,板框过滤,上清液加入80g净化水搅拌均匀,贮存待用。
生姜提取液的制备:选用新鲜洁净生姜50g,清水冲洗,沥干水分,切片,加入100g净化水100℃蒸煮5分钟,冷却至50℃以下打浆,进入贮存罐浸提30分钟,板框过滤,上清液加入60g净化水搅拌均匀,贮存待用。
在配料罐中,加入低聚木糖70糖浆40g,红枣提取液200g,生姜提取液100g,口服葡萄糖100g,加入净化水补齐1000ml,搅拌均匀,板框过滤,罐装,灭菌,检验,入库。
试验例1
双歧因子口服液的主要成分为水苏糖,由灯经水提而成。水苏糖具有使肠道内双歧杆菌成倍增生,调节肠道微生态平衡,降低血内毒素等功效。现采用高效液相色谱测定水苏糖含量,其中水苏糖对照品(自制,纯度 > 98 %) 。
试验方法:色谱柱为国产Spherisorb NH2 柱 ,流动相乙腈-水(70∶30),柱温室温,流速 1.2ml/min。精密量取实施例1-6和对比例1-3制得的双歧因子口服液 5ml,置100ml 量瓶中,加水稀释至刻度,混匀,取少量离心 5min ,10000r/min,取上清液作为样品溶液。分别精密吸取对照品溶液和实施例制得溶液10~20微升,注入高效液相色谱仪,外标法计算,即得。其中水苏糖含量列于表 1:
表1 水苏糖含量比较
实施例 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 | 对比例4 |
含量 mg/ ml | 384.7 | 355.2 | 361.4 | 302.9 | 305.8 | 350.6 | 264.1 | 301.1 | 289.2 | 212.3 |
经水苏糖含量比较,可见低聚木糖经DEAE-纤维素柱层析纯化处理的实施例1-3和实施例6,所得有效成分含量明显高于其他实施例和对比例,其中以实施例1效果最好。
试验例2 加速试验
将实施例1-6和对比例1-3制得的双歧因子口服液,分别置于温度40℃,相对湿度75%的环境中保存6个月,在试验期间3个月、6个月末分别取样一次,分别测定其沉淀量和澄清度,结果见表2:
表2 沉淀量和澄清度的比较
高压均质能增强各组分间的亲和力,同时可提高口服液的稳定性,减少组分间间的粒度及密度差,防止口服液分层沉淀,并使组织均匀黏稠,口感细腻。经高压均质的实施例1-5在加速试验中,澄清无沉淀,且口感较好,其中以实施例1质量最稳定。
实验例
选取SPF级昆明种小鼠,由山东大学动物实验中心提供。实验环境温度22℃±2℃,相对湿度50%±10%。
剂量选择及样品处理:分别给予实施例1-6和对比例1-3所制双歧因子口服液,且受试物的浓度为166.7ml/L,对照组以等体积的蒸馏水代替受试物,连续给予30d后测各项免疫指标。每组随即选择11只实验小鼠,并以小鼠专用饲料喂饲。
实验例1
ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验(MTT法):无菌取脾,置于盛有适量无菌Hank液的小平皿中,制成细胞悬液,经200目筛网过滤后用Hank液洗2次,每次1000r/min离心10min。然后将细胞悬浮于1mlRPM640的完全培养液中,计数活细胞数,调整细胞浓度为3000000个/ml。将细胞悬浮分两孔加入24孔培养板中,每孔1ml,在其中一孔加75微升ConA液,另一孔作为对照,置5%CO2,38℃孵箱培养68h后,每孔轻轻吸去上清液0.7ml,加入0.7ml不含小牛血清的RPM640培养液,同时每孔加入50微升MTT,继续培养4h。每孔加入1ml酸性异丙醇,吹打混匀,使紫色结晶完全溶解,然后将液体移入比色杯中,用紫外分光光度计,在570nm波长处测定其光密度值(OD值)。计算试验孔OD值之差,以此表示淋巴细胞的增殖能力。
所得数据为计量资料,结果见表3:
表3 双歧因子口服液对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验的影响
组别 | 动物数(只) | 淋巴细胞增殖能力(OD值) |
水对照组 | 11 | 0.065±0.030 |
实施例1 | 11 | 0.114±0.024 |
实施例2 | 11 | 0.108±0.022 |
实施例3 | 11 | 0.111±0.025 |
实施例4 | 11 | 0.086±0.024 |
实施例5 | 11 | 0.079±0.031 |
实施例6 | 11 | 0.101±0.026 |
对比例1 | 11 | 0.074±0.019 |
对比例2 | 11 | 0.090±0.030 |
对比例3 | 11 | 0.089±0.021 |
对比例4 | 11 | 0.068±0.042 |
由表3可见:经口给予小鼠不同实施例或对比例制得的双歧因子口服液30天,其淋巴细胞增殖能力与水对照组有显著性提高,即其对小鼠淋巴细胞转化能力有增强作用,且实施例1-3效果明显比对比例4要好,其中又以实施例1效果最好。
实验例2
抗体生成细胞测定:取脱纤维羊血,用生理盐水洗涤3次,每只鼠经腹腔注射2%压积SRBC(2000r/min,10min)0.2ml,将SRBC免疫5天后的小鼠处死,取脾,制成细胞悬液。将10g/l琼脂糖加热溶解后,与等量双倍Hank液混合,分装小试管,每管0.5ml,再向管内加10%压积SRBC50微升,脾细胞悬液20微升,迅速混匀后,倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上,待琼脂凝固后,将玻片水平扣放在片架上,放入CO2培养箱孵育1.5h,然后将补体(用SA缓冲液按1:8稀释)加入玻片架凹槽内,继续温育1.5h后,计数溶血空斑数。
所得数据为计量资料,结果见表4:
表4 双歧因子口服液对小鼠抗体生成细胞数的影响
组别 | 动物数(只) | 溶血空斑数(1000/全脾) |
水对照组 | 11 | 56.18±16.20 |
实施例1 | 11 | 76.02±20.34 |
实施例2 | 11 | 74.84±24.44 |
实施例3 | 11 | 75.78±21.38 |
实施例4 | 11 | 66.25±19.41 |
实施例5 | 11 | 64.03±20.15 |
实施例6 | 11 | 70.36±21.57 |
对比例1 | 11 | 62.74±18.36 |
对比例2 | 11 | 68.44±21.39 |
对比例3 | 11 | 63.59±16.83 |
对比例4 | 11 | 60.48±18.37 |
由表4可见,经口给予小鼠各实施例或对比例所制得的双歧因子口服液30天,实施例1-3所对应的小鼠组别抗体生成细胞数与水对照组和其他组别比较,均有显著性差异,即该口服液可增强小鼠抗体生成细胞数,且实施例1所制得的双歧因子效果最优。
实验例3
小鼠血清溶血素的测定:取脱纤维羊血,用生理盐水洗涤3次,每只鼠经腹腔注射2%压积SRBC(2000r/min,10min)0.2ml,免疫5天后,摘除小鼠眼球取血于离心管内,放置约1h,将凝固血与管壁剥离,离心,收集血清。用生理盐水将血清倍比稀释,将不同稀释度血清分别置于微量血凝试验板内,每孔100微升,再加入0.5%SRBC悬液100微升,混匀,置湿盒内,于37℃温箱孵育3h,记录血球凝集程度。计算抗体积数。
所得数据为计量资料,结果见表5:
表5 双歧因子口服液对小鼠小鼠血清溶血素水平的影响
组别 | 动物数(只) | 抗体积数 |
水对照组 | 11 | 101.4±29.1 |
实施例1 | 11 | 134.9±30.8 |
实施例2 | 11 | 127.8±23.9 |
实施例3 | 11 | 132.5±21.4 |
实施例4 | 11 | 120.1±25.6 |
实施例5 | 11 | 116.3±22.3 |
实施例6 | 11 | 130.5±24.4 |
对比例1 | 11 | 108.0±28.2 |
对比例2 | 11 | 119.4±23.3 |
对比例3 | 11 | 112.6±26.5 |
对比例4 | 11 | 106.5±21.7 |
由表5可见,经口给予小鼠各实施例或对比例所制得的双歧因子口服液30天,实施例1-3组的小鼠抗体积数与水对照组和其他组别相比,均有显著性差异,即该口服液可提高小鼠血清溶血素水平,且实施例1效果最佳。
实施例4
小鼠NK细胞活性测定(乳酸脱氢酶LDH测定法):试验前24h将YAC-1细胞进行传代培养,用前以Hank液洗3次,用RPM640完全培养液调整细胞浓度为400000个/ml。将小鼠脱臼处死,无菌取脾,制备脾细胞悬液,用Hank液洗3次,每次1000rpm离心10min。再加1ml含10%小牛血清的RPM640完全培养液重悬,用酚兰染色计数(活细胞数应在95%以上),调整细胞浓度为20000000个/ml,使效靶比为50:1。
取靶细胞和脾细胞各100微升,加入U型96孔培养板,靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100微升,靶细胞最大释放孔加靶细胞和1%NP40各100微升,上述各项均设三个平行孔,37℃、5%CO2培养箱培养4h,将96孔板以1500r/min离心5min,每孔吸取上清液100微升转入酶标板中,同时加入LDH基质液100微升,反应10min,然后每孔加入1mol/l的Hcl30微升终止反应,用酶标仪在490nm处测定OD值。按公式计算NK细胞活性:NK细胞活性%=(反应孔OD-自然释放孔OD)/(最大释放孔OD-自然释放孔OD)×100,结果见表6:
表6 双歧因子口服液对小鼠NK细胞活性的影响
组别 | 动物数(只) | NK细胞活性(%) |
水对照组 | 11 | 23.47±8.67 |
实施例1 | 11 | 47.00±11.62 |
实施例2 | 11 | 43.40±10.75 |
实施例3 | 11 | 45.40±10.16 |
实施例4 | 11 | 40.36±9.57 |
实施例5 | 11 | 38.22±10.34 |
实施例6 | 11 | 46.13±11.27 |
对比例1 | 11 | 37.57±9.46 |
对比例2 | 11 | 40.12±10.39 |
对比例3 | 11 | 36.25±11.08 |
对比例4 | 11 | 27.31±10.85 |
由表6可见,经口给予小鼠各实施例或对比例所制得的双歧因子口服液30天,其NK细胞活性与对照组间比较均有显著性差异,即该口服液可增强小鼠的NK细胞活性,且实施例1-3优于其他实施例和对比例,而实施例1效果最佳。
由以上实验例可以看出,本发明制得的双歧因子口服液可以增强小鼠淋巴细胞转化能力,增强小鼠抗体生成细胞数,提高小鼠血清溶血素水平,增强小鼠的NK细胞活性,具有方便服用,产品纯度高,便于吸收的特性,并具有增强机体免疫,平衡体内营养的功效。
Claims (2)
1.双歧因子口服液,其特征在于,由下述重量配比的原辅料制成:云芝10-20g、复合氨基酸粉 60-80g、低聚木糖45-55g、牛磺酸7.5-8.5g、葡萄糖酸锌5-8g、阿斯巴甜4-6g、山梨酸钾1-3g;
制备方法为:
一、云芝多糖的提取:
a、粉碎:云芝子实体粉碎后过80目筛;
b、脱脂:以80-95%乙醇脱脂回流3次,滤过,合并滤液;
c、除细胞壁:滤液加纤维素酶3-5g,于55℃酶解15-30min,反应完后沸水灭酶5min;
d、微波处理:再加云芝重量20倍的蒸馏水,于90℃,300-500w的微波中处理10-30min;
e、醇沉:过滤得滤液,滤液以50-70%乙醇沉淀,沉淀物真空干燥得云芝多糖a;
二、低聚木糖和云芝多糖的除杂纯化:
a、溶解:按配方准确称量低聚木糖,将低聚木糖和(一)中提取的云芝多糖a溶于20ml磷酸钠缓冲液中;
b、DEAE-纤维素柱层析纯化:将上述缓冲液上DEAE-纤维素柱,用0.3mol/LNaCl溶液以流速3BV/h洗脱,收集洗脱液b;
三、原辅料均质稀配:
a、按配方准确称量其他原辅料,将纯化水在浓配灌加热至80℃,加入原辅料和洗脱液b搅拌溶解;
b、高压均质:于50-80Mpa高压均质处理15-30min,使原辅料细化、均匀混合,从而提高人体的吸收率;
c、将药液通过过滤器过滤到稀配灌;在稀配罐中加入配制量0.3%的氢氧化钠调节药液pH值为7.5,并加纯化水至配制量,分装灭菌;
其中,复合氨基酸粉包含:L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸,且L-亮氨酸︰L-异亮氨酸︰L-赖氨酸盐酸盐︰L-苯丙氨酸︰L-苏氨酸︰L-缬氨酸︰L-色氨酸︰L-蛋氨酸=18:6:25:5:4:7:5:18。
2.如权利要求1所述的双歧因子口服液,其特征在于,由下述重量配比的原辅料制成:云芝20g、复合氨基酸粉 60g、低聚木糖50g、牛磺酸8g、葡萄糖酸锌6g、阿斯巴甜5g、山梨酸钾2g;
制备方法为:
一、云芝多糖的提取:
a、粉碎:云芝子实体粉碎后过80目筛;
b、脱脂:以90%乙醇脱脂回流3次,滤过,合并滤液;
c、除细胞壁:滤液加纤维素酶5g,于55℃酶解20min,反应完后沸水灭酶5min;
d、微波处理:再加云芝重量20倍的蒸馏水,于90℃,400w的微波中处理15min;
e、醇沉:过滤得滤液,滤液以60%乙醇沉淀,沉淀物真空干燥得云芝多糖a;
二、低聚木糖和云芝多糖的除杂纯化:
a、溶解:按配方准确称量低聚木糖,将低聚木糖和(一)中提取的云芝多糖a溶于20ml磷酸钠缓冲液中;
b、DEAE-纤维素柱层析纯化:将上述缓冲液上DEAE-纤维素柱,用0.3mol/LNaCl溶液以流速3BV/h洗脱,收集洗脱液b;
三、原辅料均质稀配:
a、按配方准确称量其他原辅料,将纯化水在浓配灌加热至80℃,加入原辅料和洗脱液b搅拌溶解;
b、高压均质:于60Mpa高压均质处理20min,使原辅料细化、均匀混合,从而提高人体的吸收率;
c、将药液通过过滤器过滤到稀配灌;在稀配罐中加入配制量0.3%的氢氧化钠调节药液pH值为7.5,并加纯化水至配制量,分装灭菌;
其中,复合氨基酸粉包含:L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸,且L-亮氨酸︰L-异亮氨酸︰L-赖氨酸盐酸盐︰L-苯丙氨酸︰L-苏氨酸︰L-缬氨酸︰L-色氨酸︰L-蛋氨酸=18:6:25:5:4:7:5:18。
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