CN102539609B - 瓶内甲酯化-顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用测定啤酒中游离脂肪酸的检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种瓶内甲酯化-顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用测定啤酒中游离脂肪酸的检测方法。本发明采用自动化进样技术，使甲酯化于SPME同时进行，实现了游离脂肪酸检测的高效、快速、准确。本发明采用固相微萃取气质联用，固相微萃取纤维有富集挥发性成分的作用，能萃取更多的微量成分，而质谱检测器具有选择性，比火焰离子化检测器更加灵敏。这使游离脂肪酸的检测范围扩展到C8:0～C22:0。前处理简单、快速、无需溶剂，安全环保，且样品用量少。该方法重线性好，最低检出限达0.01μg/L，线性范围可达5个数量级。适用范围广，本方法适用于水、啤酒、发酵液、麦汁、饮料、牛奶、油、糖浆等液体样品。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测啤酒中游离脂肪酸的检测方法。
背景资料
啤酒中游离脂肪酸主要来源于原料及酵母，其含量对风味稳定性、泡沫稳定性及啤酒整体风味的影响较大。不同原料及酿造工艺会造成啤酒中游离脂肪酸含量显著差异。短链脂肪酸是酵母代谢产物，在发酵过程中大量产生和分泌，啤酒中短链脂肪酸的含量明显高于对应的麦汁。另外，酵母自溶会导致大量游离脂肪酸产生，尤其是辛酸和癸酸是哈喇味、羊膻味的主要来源，因此酵母过度自溶会改变啤酒正常风味。长链脂肪酸是合成酵母细胞膜所需的关键物质，它的缺失会造成啤酒发酵过程迟缓。长链脂肪酸主要来自原料，在麦汁煮沸过程中与凝固物结合而下降，在发酵过程因被酵母代谢利用而进一步下降。长链脂肪酸在麦汁中含量过高会引起酒体浑浊，并能通过氧化作用形成氢过氧化物，成为成品酒中反-2-壬烯醛、己醛、戊醛等老化物质的前驱体；值得注意的是，长链脂肪酸含量过高会通过影响泡沫表面张力降低泡持，导致成品酒质量下降。
由于近几年我国啤酒产量不断增加，市场不断扩大，消费者对啤酒品质的要求也越来越高，酿酒企业为进一步提高自身产品质量，提升产品核心竞争力，不断开发新的指标监控酿造过程，游离脂肪酸逐渐成为人们关注的焦点。目前对啤酒中游离脂肪酸检测方法的研究主要有以下两个方面：
(1)常规游离脂肪酸的检测是通过脂肪酸甲酯化实现的，因为脂肪酸甲酯的沸点相对于脂肪酸本身较低且相对稳定，检出限也低，便于检测。脂肪酸甲酯化主要分为碱催化、酸催化及BF3催化反应，其中碱催化伴随皂化反应同时发生，会干扰检测结果；BF3催化甲酯化率高，但其毒性强，不利于检测人员操作；故人们对脂肪酸的检测多采用酸催化。目前啤酒中的游离脂肪酸的检测多采用液液萃取富集后进行盐酸/甲醇或硫酸/甲醇甲酯化衍生后气相-火焰离子化检测，该方法能实现啤酒中多种脂肪酸的检测，但此类方法操作繁琐、费时、重现性差、大量使用有机溶剂，对环境人体健康造成危害。如何实现甲酯化之前的游离脂肪酸高效、快速的富集是人们一直未攻克的难题，这制约了啤酒等复杂基体内微量游离脂肪酸的快速、准确检测。
(2)随着新型前处理技术如固相微萃取和磁力搅拌棒吸附的出现，人们利用这些新的前处理技术结合气相色谱-质谱联用仪对啤酒中游离脂肪酸进行直接测定(未甲酯化)。此类方法在自动化技术的支撑下，检测效率大幅提高，但由于脂肪酸极性强、沸点高、且在啤酒中含量低，造成其检测范围仅限于中短链、对C18:1、C20:0及C22:0等长链脂肪酸无能为力。
上述方法虽然众多，但还没有一个有效的方法快速、准确且高效的检测啤酒中游离脂肪酸。
发明内容
由于啤酒中游离脂肪酸的含量很低，且啤酒基质复杂，即使经过多次处理，许多干扰成分也无法去除，目前未发现有对啤酒中C8:0～C20:0游离脂肪酸快速、高效的检测方法。所以本发明提出了一种瓶内甲酯化-顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用测定啤酒中游离脂肪酸的检测方法。瓶内甲酯化使游离脂肪酸生成沸点与极性较低的甲酯。采用顶空固相微萃取(Headspace Solid-phase microextraction)-气相色谱质谱联用测定挥发性的甲酯成分，为微量游离脂肪酸的检测提供了可靠的方法。
本发明方法如下：
瓶内甲酯化-顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用测定啤酒中游离脂肪酸的检测方法，所述方法步骤如下：
(1)顶空瓶中加入被测样品及衍生试剂，盖上瓶盖轻轻摇晃，待用；
(2)开启固相微萃取自动进样器，将装有样品的顶空瓶放入样品托盘上，稳定后待用。
(3)老化：将萃取纤维装入适配器手柄中，组成SPME手动进样器，将进样器套管***250℃气相色谱进样口，推手柄杆伸出纤维，老化30分钟再收回手柄杆，将进样器拔出进样口。
(4)将老化完毕的纤维安装到自动进样器的适配器上，并用手持控制器调节纤维使其刚好进入保护套管。
(5)萃取：设置萃取温度为55℃，执行SPME自动进样器START命令，SPME套管将自动穿透样品瓶隔垫，***瓶中，纤维被推杆推出套管，但不与液面接触，并进行振动萃取60分钟。
(6)检测：萃取完毕，纤维自动缩回套管，并退出顶空瓶，然后***GC-MS进样口，纤维被推杆推出套管，解析3分钟，热脱附被测组分进入色谱柱；同时GC-MS采集数据，得到色谱图，根据标准谱库检索进行定性；解析完毕，收回纤维，拔出进样口。
(7)检测结果分析：根据确定的被测组分，样品中含有的辛酸(C8:0)，癸酸(C10:0)，月桂酸(C12:0)，肉豆蔻酸(C14:0)，棕榈酸(C16:0)，硬脂酸(C18:0)，油酸(C18:1)，亚油酸(C18:2)，亚麻酸(C18:3)，花生酸(C20:0)，山嵛酸(C22:0)采用标准品制定校准曲线，对被测组分进行定量分析。
在顶空模式中通过增加基体溶液离子强度，可降低挥发性成分在水溶液中的溶解度，从而更容易挥发至顶空，提高了分析的灵敏度。因此本发明在向顶空瓶中加入样品前，可先加入1.0g NaCl，改变基体溶液离子强度。
检测中，所述仪器的色谱条件为：
Stabilwax-DA毛细管柱(60m×320μm×0.50μm)；载气：氦气(纯度99.999％)；载气流量：1.2mL/min；进样口温度：250℃；升温程序：初始温度50℃，保持1分钟；以5℃/min升温至250℃，保持9min
质谱条件为：
接口温度：280℃；电子轰击电离源(EI)，离子源温度230℃；四极杆温度：180℃；扫描模式：全扫描模式，质量范围50au～300au；选择离子扫描模式m/z 74，67，79，87，143和81，溶剂延时：3min，程序升温结束时延迟结束。
本发明的检测原理：瓶内甲酯化-顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用测定啤酒中游离脂肪酸。甲酯化使游离脂肪酸生成相应的甲酯，从而降低了其沸点与极性。顶空固相微萃取富集挥发性游离脂肪酸甲酯，经GC分离，MS检测，定量分析啤酒中C8:0～C20:0游离脂肪酸。
本发明优点如下：
1、本发明采用自动化进样技术，使甲酯化于SPME同时进行，实现了游离脂肪酸检测的高效、快速、准确。
2、本发明采用固相微萃取气质联用，固相微萃取纤维有富集挥发性成分的作用，能萃取更多的微量成分，而质谱检测器具有选择性，比火焰离子化检测器更加灵敏。这使游离脂肪酸的检测范围扩展到C8:0～C22:0。
3、前处理简单、快速、无需溶剂，安全环保，且样品用量少。
4、该方法重线性好，最低检出限达0.01μg/L，线性范围可达5个数量级。
5、适用范围广，本方法适用于水、啤酒、发酵液、麦汁、饮料、牛奶、油、糖浆等液体样品。
附图说明
图1啤酒中游离脂肪酸色谱图
图2辛酸甲酯质谱图
图3癸酸甲酯质谱图
图4月桂酸甲酯质谱图
图5肉豆蔻酸甲酯质谱图
图6棕榈酸甲酯质谱图
图7硬脂酸甲酯质谱图
图8油酸甲酯质谱图
图9亚油酸甲酯质谱图
图10亚麻酸甲酯质谱图
图11花生酸甲酯质谱图
图12山嵛酸甲酯质谱图
具体实施方式
仪器与试剂
6890N-5973N GC-MS联用仪(Agilent，USA)
HS-100固相微萃取自动进样器(Alpha M.O.S，France)
20mL带四氯乙烯瓶盖的顶空瓶(SUPELCO，USA)
100μm PDMS(聚二甲基硅氧烷)固相微萃取纤维(SUPELCO，USA)
1、样品来源
麦汁发酵液及啤酒样品：啤酒酿造企业大生产过程样品及成品啤酒。
2、方法
样品制备：
(1)在20mL顶空瓶中，加入1.0g NaCl和2mL样品，再加入25μL HCl及0.5mL甲醇，盖上瓶盖轻轻摇晃，待用；
(2)开启固相微萃取自动进样器，将装有样品的顶空瓶放入样品托盘上，稳定后待用。
(3)老化：将萃取纤维装入适配器手柄中，组成SPME手动进样器，将进样器套管***250℃气相色谱进样口，推手柄杆伸出纤维，老化30分钟再收回手柄杆，将进样器拔出进样口。
(4)将老化完毕的纤维安装到自动进样器的适配器上，并用手持控制器调节纤维使其刚好进入保护套管。
(5)萃取：设置萃取温度为55℃，执行SPME自动进样器START命令，SPME套管将自动穿透样品瓶隔垫，***瓶中，纤维被推杆推出套管，但不与液面接触，并进行振动萃取60分钟。
(6)检测：萃取完毕，纤维自动缩回套管，并退出顶空瓶，然后***GC-MS进样口，纤维被推杆推出套管，解析3分钟，热脱附被测组分进入色谱柱；同时GC-MS采集数据，得到色谱图，根据标准谱库(NIST MS Search 2.0)检索进行定性，采用标准品制定校准曲线，对被测组分进行定量分析；解析完毕，收回纤维，拔出进样口。
色谱条件：Stabilwax-DA毛细管柱(60m×320μm×0.50μm)；载气：氦气(纯度99.999％)；载气流量：1.2mL/min，不分流；进样口温度：250℃；升温程序：初始温度50℃，保持1分钟；以5℃/min升温至250℃，保持9min。
质谱条件：接口温度：280℃；电子轰击电离源(EI)，离子源温度230℃；四极杆温度：180℃；扫描模式：全扫描模式，质量范围50au～300au；选择离子扫描模式m/z 74，67，79，87，143和81，溶剂延时：3min，程序升温结束时延迟结束。
优化实验
在萃取时间60min，NaCl添加量1.0g时，通过改变萃取衍生温度(50℃、55℃、60℃)来考察其对萃取效果的影响。通过实验对比发现，在55℃时，脂肪酸甲酯的响应值最大。本方法选择55℃为萃取衍生条件。
在萃取温度55℃，NaCl添加量1.0g时，通过改变萃取衍生时间(30分钟、60分钟、90分钟)来考察其对萃取效果的影响。通过实验对比发现，在60分钟时，脂肪酸甲酯的响应值最大。本方法选择60分钟为萃取衍生条件。
NaCl的添加对SPME萃取效果影响很大。通常向溶液中加入一定量NaCl，可使被测组分在水中的溶解度降低，更易被萃取。在萃取时间60min，萃取温度55℃时，通过改变NaCl的添加量(0g、0.5g、1.0g、1.5g)来考察其对萃取效果的影响。通过实验对比发现，在1.0g时，脂肪酸甲酯的响应值最大。本方法选择1.0g为萃取衍生条件。
盐酸作为甲酯化反应的催化剂，其用量多少直接关系到衍生反应速度。当盐酸用量增加时甲酯化反应速度在反应初级阶段明显加快，但使所有游离脂肪酸完全衍生所需时间不变。盐酸用量过多会稀释反应底物浓度降低酯化效果影响对游离脂肪酸的测定结果，而盐酸用量过少时，则可能导致甲酯化完成所需时间增加。本方法在萃取温度55℃，萃取时间为60分钟，NaCl添加量1.0g时，通过改变盐酸用量(10μL、25μL、50μL)，来考察其对萃取效果的影响。通过实验对比发现，在盐酸用量25μL时，脂肪酸甲酯的响应值最大。本方法以此为萃取衍生条件。
3、游离脂肪酸甲酯的保留时间及特征离子
测试结果分析
提取游离脂肪酸的特征离子，根据标准谱库(NIST MS Search 2.0)检索进行定性，采用标准品制定校准曲线，对被测组分进行定量分析。啤酒中游离脂肪酸主要受原料及发酵工艺等多方面的影响，成品酒中游离脂肪酸含量差异很大。采用不同原料配方、酵母菌株及工艺流程造成独特酒体风味。以下对7种啤酒样品和3种麦汁进行分析，结果见下表。其中啤酒3#样品其游离脂肪酸含量也明显偏高，经过检测其泡持性也明显低于其他样品，这与游离脂肪酸含量与泡持性具有负相关性相一致。
4、灵敏度、线性范围
11种游离脂肪酸在0.001～10mg/L范围内浓度与响应成良好线性关系，相关系数均大于0.99；对啤酒中游离脂肪酸方法检出限范围在0.001～0.024mg/L；加标回收率为66.7％～87.4％；连续5次测定同一样品，被测组分相对标准偏差(RSD％)均小于12％。
Claims (1)
1.瓶内甲酯化-顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用测定啤酒中游离脂肪酸的检测方法，所述方法步骤如下：
(1)在20mL顶空瓶中，先加入0.5g～1.5gNaCl，再加入2mL样品及15-50μL密度1.17g/mL的浓HCl和0.5mL色谱纯100％的甲醇，盖上瓶盖轻轻摇晃，待用；
(2)开启固相微萃取自动进样器，将装有样品的顶空瓶放入样品托盘上，稳定后待用；
(3)SPME纤维老化：将PDMS固相微萃取纤维装入适配器手柄中，组成SPME手动进样器，将进样器套管***250℃气相色谱进样口，推手柄杆伸出纤维，老化30分钟再收回手柄杆，将进样器拔出进样口；
(4)将老化完毕的纤维安装到自动进样器的适配器上，并用手持控制器调节纤维使其刚好进入保护套管；
(5)甲酯化萃取：设置萃取温度为45℃～65℃，执行SPME自动进样器程序命令，SPME套管将自动穿透样品瓶隔垫，***瓶中，纤维被推杆推出套管，但不与液面接触，并进行振动萃取30～90分钟；
(6)检测：萃取完毕，纤维自动缩回套管，并退出顶空瓶，然后***GC-MS进样口，纤维被推杆推出套管，解析3分钟，热脱附被测组分进入色谱柱；同时GC-MS采集数据，得到色谱图，根据标准谱库检索进行定性；解析完毕，收回纤维，拔出进样口；所述色谱条件为：Stabilwax-DA毛细管柱，所述毛细管柱的规格为60m×320μm×0.50μm；载气：氦气，所述氦气的纯度为99.999％；载气流量：1.2mL/min，不分流；进样口温度：250℃；升温程序：初始温度50℃，保持1分钟；以5℃/min升温至250℃，保持9min；所述质谱条件为：接口温度：280℃；电子轰击电离源，离子源温度230℃；四极杆温度：180℃；扫描模式：全扫描模式，质量范围50au～300au；选择离子扫描模式m/z74，67，79，87，143和81，溶剂延时：3min，程序升温结束时延迟结束；
(7)检测结果分析：根据确定的被测组分，样品中含有的辛酸(C8∶0)，癸酸(C10∶0)，月桂酸(C12∶0)，肉豆蔻酸(C14∶0)，棕榈酸(C16∶0)，硬脂酸(C18∶0)，油酸(C18∶1)，亚油酸(C18∶2)，亚麻酸(C18∶3)，花生酸(C20∶0)，山嵛酸(C22∶0)采用标准品制定校准曲线，对被测组分进行定量分析。
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