CN118064497A

CN118064497A - PfbZIP52基因的过表达载体及构建方法和在烟草中的应用

Info

Publication number: CN118064497A
Application number: CN202410401135.2A
Authority: CN
Inventors: 周雅莉; 黄旭升; 闻婧; 陈树溦; 胡婷; 王计平; 李润植
Original assignee: Shanxi Agricultural University
Current assignee: Shanxi Agricultural University
Priority date: 2024-04-03
Filing date: 2024-04-03
Publication date: 2024-05-24

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及PfbZIP52基因的过表达载体及构建方法和在烟草中的应用。所述PfbZIP52基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述过表达载体是将PfbZIP52基因与植物表达载体连接获得，所述植物表达载体包括XbaI和KpnI酶切位点，所述PfbZIP52基因连接在XbaI和Kpn I酶切位点之间，所述过表达载体能用于PfbZIP52基因功能研究，通过调控脂肪酸代谢提高烟草油脂含量。本发明提供的PfbZIP52基因能够通过调控脂肪酸代谢提高烟草油脂含量，改善其油脂品质，能够用于烟草的品种培育。

Description

PfbZIP52基因的过表达载体及构建方法和在烟草中的应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及PfbZIP52基因的过表达载体及构建方法和在烟草中的应用。

背景技术

紫苏(Perillafrutescens(L.)Britt.)为唇形科紫苏属一年生草本植物。紫苏种子富含油脂，出油率高达46％～58％，并且含有丰富的不饱和脂肪酸，特别是α-亚麻酸(α-LinolenicAcid，ALA)。研究发现α-亚麻酸对人体大脑神经功能及视网膜功能具有高度的保护作用，可以软化血管、促进血液循环、预防心血管疾病及冠心病，此外还有助于提高记忆力，延缓衰老等。

植物脂肪酸代谢是植物生长发育过程中的重要生物学过程，它涉及到能量的储存、细胞膜的构成以及信号转导等多个方面。近年来，随着分子生物学和基因编辑技术的飞速发展，人们开始尝试通过调控与脂肪酸代谢相关的基因来提高植物的生长和品质。

不少研究表明，植物的生长发育、非生物胁迫应答及营养物质代谢等均受到转录因子如MYB、WRI1、WRKY、bZIP和NAC等。其中，bZIP转录因子是广泛存在于植物中的一类数目多、种类广的转录因子家族。但在紫苏植物种子中调控不饱和脂肪酸高水平积累的调控因子及其详细功能目前尚不清楚，导致鲜有在分子层面构建相关载体用于调控植株生长的研究，因此限制了其在转基因植株中的应用。

烟草是茄科烟草属的一年生草本植物，也是一种重要的经济作物，其叶片可以用于制作香烟、雪茄和烟斗等烟草制品，烟草的内部香味和外观油分主要是来自所含的油脂，烟叶含油脂越高品质越好。然而，目前烟草在培育过程中存在油脂品质差的问题。

因此，如何在烟草培育过程中通过调控脂肪酸代谢提高烟草油脂含量，改善其油脂品质是目前亟待解决的问题。

发明内容

为提高烟草油脂含量，本发明提供了与植物脂肪酸代谢相关的转录因子PfbZIP52基因的过表达载体及构建方法和在烟草中的应用，本发明提供的PfbZIP52基因能够提高烟草植株中总油脂含量。

本发明提供了PfbZIP52基因的过表达载体，所述PfbZIP52基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述过表达载体是将PfbZIP52基因与植物表达载体连接获得，所述植物表达载体包括Xba I和Kpn I酶切位点，所述PfbZIP52基因连接在Xba I和Kpn I酶切位点之间，所述过表达载体能用于PfbZIP52基因功能研究，通过调控脂肪酸代谢提高烟草油脂含量。

进一步地，所述植物表达载体为pCAMBIA1303载体、pCAMBIA1391Z载体、pCAMBIA1302载体中的任意一种。

本发明还提供了所述的PfbZIP52基因的过表达载体的构建方法，包括如下步骤：

通过PCR扩增如SEQ ID NO.3所示的目的基因PfbZIP52；

将目的基因PfbZIP52进行回收、纯化，获得目的基因PfbZIP52片段；

将pCAMBIA1303载体质粒双酶切线性化并纯化、回收，获得pCAMBIA1303载体线性片段；

将回收的目的基因PfbZIP52片段和pCAMBIA1303载体线性化片段连接，得到重组产物pCAMBIA1303-PfbZIP52；

将重组产物pCAMBIA1303-PfbZIP52经DH5α感受态细胞转化，获得PfbZIP52基因的过表达载体。

进一步地，所述PCR扩增的反应体系为：FastPfu FlyPCRSuperMix 25μL，cDNA模板1μL，引物对PfbZIP52-1303(10μM)各1μL，无核酸酶水补足至50μL。

进一步地，连接获得所述重组产物pCAMBIA1303-PfbZIP52的体系为：目的基因PfbZIP52片段2μL、pCAMBIA1303载体线性化片段3μL、2×ClonExpress Mix 5μL。

本发明还提供了所述的PfbZIP52基因的过表达载体在提高烟草油脂品质中的应用。

进一步地，所述PfbZIP52基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述过表达载体是将PfbZIP52基因与植物表达载体连接获得，所述植物表达载体包括Xba I和Kpn I酶切位点，所述PfbZIP52基因连接在XbaI和Kpn I酶切位点之间，将所述过表达载体转入烟草构建获得转基因烟草，通过调控脂肪酸代谢提高烟草油脂含量。

进一步地，所述转基因烟草的构建步骤如下：

构建PfbZIP52基因的过表达载体；

将PfbZIP52基因的过表达载体转化农杆菌GV3101，获得农杆菌GV3101菌液；

将烟草叶片于烟草遗传转化预培养基上培养；

用农杆菌GV3101菌液侵染培养后的烟草叶片，获得转基因烟草叶片；

将转基因烟草叶片转至筛选培养基上培养，直到丛生芽长出；

将丛生芽转接到生根培养基中培养，待转基因烟草叶片长出根系获得阳性转基因烟草植株。

进一步地，所述预培养基配方为4.74g MS培养基粉末+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/LNAA；

所述共培养基配方为4.74g MS培养基粉末+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/LNAA。

进一步地，所述筛选培养基配方为4.74g MS培养基粉末+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/LNAA+500mg/LCef+5mg/LHyg；

所述生根培养基为2.37g MS培养基粉末+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+500mg/LCef。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供的PfbZIP52基因能够通过调控脂肪酸代谢提高烟草油脂含量，改善其油脂品质，能够用于烟草的品种培育。

(2)本发明提供的PfbZIP52基因能够促进紫苏油料作物油脂合成的积累，证明了该PfbZIP52基因与脂肪酸富集的调控相关，且在植物种子储藏油脂TAG合成过程中发挥重要作用。

(3)本发明提供的PfbZIP52基因，对其进行了在紫苏不同组织及种子发育不同时期的的时空表达分析，遗传转化烟草功能分析，为探讨PfbZIP52基因的调控机制及基因利用提供了理论依据。

(4)pCAMBIA1303载体、pCAMBIA1391Z载体、pCAMBIA1302载体具有的卡那抗性基因使其能够方便在大肠杆菌中进行载体筛选，同时具有潮霉素筛选标记基因，能够方便在植物转化株系中进行筛选鉴定。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1PfbZIP52基因PCR扩增产物电泳图；

图中，M：DL2000 marker，1：PfbZIP52基因扩增产物。

图2pCAMBIA1303-PfbZIP52重组子双酶切电泳图；

图中，M：DL15000 marker，1：pCAMBIA1303载体质粒，2：pCAMBIA1303-PfbZIP52重组子双酶切。

图3紫苏PfbZIP52基因编码蛋白的基本序列特征；

图中，A：PfbZIP52基因编码蛋白的功能结构域；

B：PfbZIP52基因结构；

C：PfbZIP52基因编码蛋白中保守Motif基序。

图4紫苏PfbZIP52基因的时空表达特性分析。

图5转基因烟草阳性植株检测电泳图；

图中，A：转基因烟草基因组水平PCR检测电泳图；

B：转基因烟草转录水平PCR检测电泳图；

M：DL2000 marker，1：pCAMBIA1303-PfbZIP52对照质粒，2：野生型烟草(WT)植株，3-7：转基因型(OE)烟草植株，扩增长度为1161bp(A)和250bp(B)。

图6转基因烟草总油脂及脂肪酸组分含量测定结果图；

图中，A：转基因烟草总油脂含量；

B：转基因烟草主要脂肪酸组分及含量；

WT：野生型烟草植株，OE-1/OE-2/OE-3：转基因烟草植株。

图7转基因烟草其他农艺性状检测结果图；

图中，A：转基因烟草可溶性糖含量；

B：转基因烟草总蛋白含量；

C：转基因烟草淀粉含量；

D：转基因烟草种子发芽率；

E：转基因烟草种子千粒重；

F：转基因烟草叶片光合速率。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：PfbZIP52基因及其过表达载体构建

一、实验材料

大肠杆菌菌株DH5α，根癌农杆菌菌株GV3101，pCAMBIA1303载体，均由山西农业大学分子农业与生物能源研究所提供。所有引物均由擎科生物科技(西安)股份有限公司合成。

紫苏材料为优选品种‘晋紫苏1号’，由山西农业大学分子农业与生物能源研究所提供。

所用试剂为高保真Mix(AS231，北京全式金生物技术股份有限公司)，琼脂凝胶DNA回收试剂盒(杭州新景生物试剂开发有限公司)，质粒提取试剂盒(杭州新景生物试剂开发有限公司)，限制性内切酶试剂(北京全式金生物技术股份有限公司)，PCR产物纯化回收试剂盒(EP101，北京全式金生物技术股份有限公司)，一步克隆试剂盒(C115，南京诺唯赞生物科技股份有限公司)，LB肉汤、LB营养琼脂、卡那霉素(Kan)(北京索莱宝科技有限公司)，2×E-Taq PCR MasterMix(杭州新景生物试剂开发有限公司)。所有引物均由擎科生物科技(西安)股份有限公司合成。

二、紫苏PfbZIP52基因的获得及其过表达载体构建

1、总RNA的提取

使用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)提取紫苏各组织的总RNA。将紫苏根、茎、叶、花和不同发育时期(开花后10d、20d、30d和40d，种a、种b、种c和种d)的种子的鲜样用液氮速冻，用研钵迅速研磨成粉末。在1.5mL无核酸酶离心管中加入750μL裂解液，加入75μL PLANTaid混合均匀备用；加入各研磨成粉末的样品50mg-100mg，立刻剧烈振荡混匀20s，使样品充***解；4℃，13000rpm，离心10min，吸取上清液转到一个新的1.5mL RNase free离心管中，加入上清体积一半的无水乙醇，立即吹吸混匀；将混合物吸到一个吸附柱RA(吸附柱放置在收集管中)中，13000rpm，离心2min，弃废液；向吸附柱中加入700μL去蛋白液RW1，室温静置1min，13000rpm，离心30s，弃废液；加入500μL漂洗液RW(使用前加入无水乙醇)，13000rpm，离心30s，弃废液，重复此步骤一次；将吸附柱RA放回收集管中，13000rpm，离心2min；将吸附柱放入一个新的无核酸酶离心管中，向吸附膜的中间部位加入30μL-50μL无核酸酶水(RNase free water)(使用前在70℃-90℃金属浴中加热)，室温静置1min，12000rpm，离心1min，得到紫苏各组织的总RNA，用于后续实验或存于-80℃超低温冰箱备用。

2、cDNA第一链合成

以提取的紫苏各组织总RNA为模板，使用StarScript II去基因组DNA反转录预混试剂(北京康润诚业生物科技有限公司)反转录合成cDNA第一链。

3、设计特异引物

从紫苏基因组和转录组数据库中筛选鉴定获得PfbZIP52基因的全长编码序列(CDS)(C2S51_035357)；

设计带有pCAMBIA1303载体同源臂的引物：由AACCTGCAGGTCGACTCTAGAATGGATGGAGGTTGTGAGCAA(SEQ ID NO.1)和GGTTTAAACGAGCTCGGTACCTCAGTAAGGACAGCTGAAACTCCTC(SEQID NO.2)的核苷酸序列组成的引物对，引物对命名为PfbZIP52-1303。

4、PCR扩增

以反转录后获得的紫苏各组织的cDNA混样为模板进行高保真PCR扩增获得PCR扩增产物；

PCR反应体系50μL：FastPfu Fly PCR SuperMix 25μL，cDNA模板1μL，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2(10μM)各1μL，无核酸酶水(Nuclease-free Water)补足至50μL；

PCR反应程序：98℃1min；98℃10s，60℃5s，72℃10s，35次循环；72℃1min。将PCR扩增产物于4℃保存或进行琼脂糖凝胶电泳检测。

琼脂糖凝胶电泳(图1)结合测序结果显示，PfbZIP52基因在1161bp处有清晰条带(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)。

5、PCR扩增产物回收、纯化

使用DNA纯化回收试剂盒，回收经琼脂糖凝胶电泳检测的PCR扩增产物的目的条带，得到目的基因PfbZIP52片段，-20℃保存备用。操作步骤如下：在紫外灯下将含有目的基因DNA片段的琼脂糖凝胶切下，转移到一个1.5mL离心管中；向离心管中加入500μL BufferG，50℃水浴直至凝胶完全溶解；加入200μL异丙醇，混合均匀；将溶胶液转移到核酸纯化柱中(核酸纯化柱置于2mL离心管中)，12000rpm离心30s，弃废液；在核酸纯化柱中加入500μLBufferWS，12000rpm离心30s，弃废液；加入700μLBufferWG，12000rpm离心30s，弃废液，重复此步骤一次；14000rpm离心1min，将核酸纯化柱置于一个洁净的1.5mL离心管(试剂盒提供)中，在纯化柱的膜中央加入25-30μLBufferTE，室温静置1min，12000rpm离心30s洗脱DNA，得到目的基因PfbZIP52片段。

6、双酶切获得pCAMBIA1303载体线性片段

将pCAMBIA1303载体用大肠杆菌DH5α感受态细胞进行转化，获得含有pCAMBIA1303载体的大肠杆菌DH5α菌株，于-80℃保存；然后将含有pCAMBIA1303载体的大肠杆菌DH5α菌株从-80℃中取出立即放于冰上解冻，接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃恒温摇床中振荡培养，获得含有pCAMBIA1303空载体的大肠杆菌菌液，备用；

提取pCAMBIA1303载体质粒：使用杭州新景生物试剂开发有限公司质粒提取试剂盒提取pCAMBIA1303载体质粒，方法如下：12000rpm离心30s收集3mL过夜培养的含有pCAMBIA1303空载体的大肠杆菌菌液，弃上清；加入250μL Buffer I(使用前加入RNaseA)，重悬菌体沉淀；加入250μLBuffer II，温和并充分地翻转离心管5次；加入350μLBufferN8，温和并充分地翻转离心管直至溶液中残留的蓝色沉淀全部转变为淡黄色沉淀；12000rpm离心2min；将核酸纯化柱置于2mL离心管中，将上清液倒入核酸纯化柱中，12000rpm离心30s，弃废液；在核酸纯化柱中加入800μLBufferW2，12000rpm离心30s，弃废液；将核酸纯化柱置回到2mL离心管中，12000rpm离心1min；将核酸纯化柱置于一个洁净的1.5mL离心管中，在纯化柱的膜中央加入60μLBuffer E，室温静置1min，12000rpm离心30s；弃纯化柱，将pCAMBIA1303载体质粒收集到离心管中，-20℃保存备用。

通过琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，pCAMBIA1303载体质粒在12kb处有清晰条带(图2的1)。

pCAMBIA1303载体质粒双酶切线性化：双酶切反应体系如下：pCAMBIA1303载体质粒2μg、10U/μL的Xba I 1μL、10U/μL的Kpn I 1μL、Buffer 5μL、无核酸酶水(Nuclease-free Water)补足至50μL；双酶切反应程序如下：37℃酶切2h，80℃失活20min。

pCAMBIA1303载体质粒线性片段纯化、回收：使用全氏金PCR产物纯化回收试剂盒对双酶切后的pCAMBIA1303载体线性片段进行纯化并回收，方法如下：取50μLPCR产物，加入5倍体积的溶液BB，混匀后加入离心柱中(为提高纯化产量可以选择静置1min)，10000g离心1min，弃废液；加入650μL溶液WB，10000g离心1min，弃废液；10000g离心1-2min，彻底去除残留的WB；将离心柱置于一个干净的离心管中，在柱的中央加入30-50μL EB(为提高纯化产量，选择65℃预热EB室温静置1min，10000g离心1min，洗脱DNA，获得pCAMBIA1303载体线性片段，-20℃保存备用。

7、获得连接产物pCAMBIA1303-PfbZIP52

按照ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)说明书操作方法，将回收的目的基因PfbZIP52片段和pCAMBIA1303载体线性化片段连接，得到重组产物pCAMBIA1303-PfbZIP52，保存备用；

重组体系10μL如下：目的基因PfbZIP52片段2μL、pCAMBIA1303载体线性化片段3μL、2×ClonExpress Mix 5μL；重组反应为：50℃反应5min。

8、质粒转化

将大肠杆菌DH5α感受态细胞从-80℃冰箱取出立即放于冰上解冻，取8μL的重组产物pCAMBIA1303-PfbZIP52加到100μL DH5α感受态细胞中，轻弹离心管管壁混匀，冰浴30min，连接产物的加入量不超过感受态细胞体积的十分之一；将离心管置于42℃金属浴热激90s，然后立即置于冰浴中放置3min；向离心管中加入900μL不添加抗生素的LB液体培养基，37℃、200rpm振荡培养1h；5000rpm，离心5min，弃掉900μL上清，用剩余LB培养基重悬菌体，吸取菌液用涂布器均匀涂到37℃预热的含Kan的LB平板培养基上；放入37℃恒温培养箱中，倒置培养12h左右；挑取白色单菌落于1mL含有50mg/mL Kan的LB液体培养基中，用封口膜封口，37℃、200rpm，过夜振荡培养，获得含有pCAMBIA1303-PfbZIP52的菌液备用；

9、重组子鉴定

取1μL获得的含有pCAMBIA1303-PfbZIP52的菌液作为模板进行PCR扩增，得到重组子质粒。用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物片段大小，同时对重组子质粒进行Xba I和KpnI双酶切鉴定。

PCR扩增体系10μL如下：PCR模板0.5μL、SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2引物各0.2μL、2×E-Taq PCR MasterMix 5μL、ddH₂O 4.1μL；

PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸80s，30个循环；72℃终延伸5min。

双酶切检测结果显示，产物为一条长度约为12kb和一条长度约为1161bp的条带(图2的2)。由此可知，目的基因PfbZIP52连接到pCAMBIA1303载体上获得pCAMBIA1303-PfbZIP52重组质粒，即PfbZIP52基因的过表达载体。

10、序列分析

将电泳检测为阳性的重组子质粒菌液送往擎科生物科技(西安)股份有限公司测序，然后将测序结果与转录组中PfbZIP52基因CDS序列进行比对，结果表明，PfbZIP52的CDS全长1161bp，编码386个氨基酸，该基因编码的蛋白质分子量为42.9kDa，理论等电点pI为7.76，通过NCBI-CDD功能结构域预测结果表明，该蛋白质中含有1个bZIP功能结构域(bZIP_plant_BZIP46)，位于第292-346位氨基酸残基之间，基因PfbZIP52所编码的蛋白质属于bZIP super family超家族中的成员(图3中的A)；PfbZIP52基因CDS序列包含4个外显子和3个内含子(图3中的B)；PfbZIP52编码蛋白含有3种主要的保守Motif基序，Motif 1、Motif2和Motif3(图3中的C)。

SEQ ID NO.3：

ATGGATGGAGGTTGTGAGCAAGAGCAAGAGCAAATAGAGCTAATGAAGAACCAGAGTTGGACATCATCATCAATACTAGGGCGTCAATCGACGATATACTCATTGACTCTTGATGAATTCCAACACACACTTTGTGAGAGTGGGAAGAATTTTGGGTCAATGAACATGGACGAATTCCTCAATAGCATATGGACTGCTGAAGAAAATGAAGCTCAAGCAAGTAATGTCAATAATGGCATTAATGTGATGCAGCAGCAGTTCCCTCTGCAGGATAGTAGTAACAGTAATGGAAAGGGATTAATAGCTAAGCAACCTAGCTTGCCGAGACAGGGTTCTCTCAGCATCCCAGAGCCTCTTTGCAGGAAAACTGTGGACCAAGTGTGGTCTGAGATTCACAAGGATGAGCAGCACCACCACCTTCATACCACATCATCAGCTCAGAAACAGGCTACATTCGGAGAGATGACACTCGAAGATTTCTTGGTACGTGCCGGGGTTGTAAGAGAACAGAATTACCCACCTCAACCTCCACCTCCACCCCCACCTAATAATTTTGGAATGTTCCACAACAACAACAATAACCATCCTAATAGTAATTTTGTTGCAAGCCCTCCTGTTGCTGTTGGGATCAACATTAATGTTGGGGGTTATCAACATCATCACCAGCCCCTCGGTGTAGGAATGAAGAGGGGCAATGGGTACTCATCACAATCACAATCACAACCCCTTCCTCCGGCTGCAGCCAATGGAGGAGGAGGAGGTACAGGTGGTGGTTTTGGGATGGGGTCGCCAGTAAGTCCTTTGTCAGATGGAATGGGTGCCAGAGGAGGACGGAAGCGGATGTCGGATGGCCCCGTGGAGAAGGTGGTGGAGAGGCGACAACGAAGAATGATCAAGAACAGAGAGTCTGCCGCACGATCAAGGGCAAGGAAGCAGGCTTACACGGTGGAGCTCGAAGCAGAACTGAACCAACTCAAGGAAGAGAATTTACACCTGAAGCAAGCTCTGGCTGAATCAGAGAGGAAAAGAAAACAGCAGTACTACGAGGAAGAGGAGGCGAGACAGGCACATGAGGTGCAGCAGATGCAAACAAAGTCGTCGTCATACAAAGCTAATGACAAATTACGAGCAATGAGGAGGAGTTTCAGCTGTCCTTACTGA

实施例2：PfbZIP52基因在紫苏不同组织及种子发育不同时期的表达分析。

一、实验方法

取紫苏根、茎、叶、花及开花后10、20、30、40d的种子(种a、种b、种c、种d)，提取总RNA，反转录成cDNA第一链，以PfActin作为内参基因，进行实时荧光定量PCR分析；

扩增所用引物为：GCTCAAGCAAGTAATGTCAA(SEQ ID NO.4)，CTCCGAATGTAGCCTGTT(SEQ ID NO.5)。

由图4分析可知，PfbZIP52基因在紫苏不同组织中均有表达，但在种子中的表达量最高，且随着紫苏种子成熟其表达水平逐渐升高，说明PfbZIP52基因在紫苏种子油脂合成积累过程中行使重要功能。

实施例3：转基因植株的构建。

一、实验材料

使用根癌农杆菌菌株GV3101，异源表达宿主植物普通烟草(Nicotiana tabacum)品种为Sumsun NN(SNN)，均由山西农业大学分子农业与生物能源研究所提供。所用试剂为2×E-TaqPCRMasterMix(杭州新景生物试剂开发有限公司)，LB肉汤、LB营养琼脂、卡那霉素(Kan)、利福平(Rif)、MS培养基(不含琼脂和蔗糖)、头孢霉素(Cef)、潮霉素(Hyg)、6-苄基氨基喋呤(6-BA)、α-萘乙酸(NAA)(北京索莱宝科技有限公司)。

二、农杆菌GV3101感受态细胞的制备

挑取根癌农杆菌的菌株，在含有50mg/mL利福平(Rif)的LB固体培养基上划板，28℃暗培养48h左右；挑取单菌落接种于含有50mg/mL Rif的50mL的LB液体培养基中，28℃，220rpm，振荡培养至OD₆₀₀约0.6；5000rpm，离心5min，弃上清，菌体用10mL 0.15mol/LNaCl溶液(4℃预冷)重悬；5000rpm，离心5min，弃上清，沉淀用1/50原体积的20mmol/L CaCl₂(含15％甘油)重悬，GV3101感受态制备好，备用。

三、农杆菌GV3101转化pCAMBIA1303-PfbZIP52

取3μg pCAMBIA1303-PfbZIP52重组质粒，加入200μL GV3101感受态细胞中；冰浴5min，液氮中冷冻5min(或-70℃放置10min)，37℃热激5min；加入800μL不加抗生素的LB液体培养基，28℃慢速(175rpm)振荡培养4h；3000rpm，离心4min，弃上清，留约200μL培养基重悬菌体沉淀，吸取适量菌液涂在含有相应抗生素的LB平板培养基上，28℃培养48h左右。

四、pCAMBIA1303-PfbZIP52重组质粒转化农杆菌GV3101的PCR鉴定

挑取单菌落接种于加有LB液体培养基(含50μg/mL Rif和50μg/mL Kan)的1.5mL离心管中，28℃，200rpm，过夜振荡培养。以培养好的菌液为模板，分别以实施例1中SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2为检测引物，使用2×E-TaqPCRMasterMix进行PCR反应，PCR扩增体系10μL如下：PCR模板0.5μL、SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2引物各0.2μL、2×E-TaqPCRMaster Mix5μL、ddH₂O 4.1μL；PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸80s，30个循环；72℃延伸5min后，用于琼脂糖凝胶电泳检测，产物长度为1161bp，说明转化成功。

农杆菌GV3101转化所用培养基如下：

LB液体培养基1L：LB肉汤20g，溶解于1L蒸馏水中。高温高压蒸汽灭菌，121℃15min。

LB固体培养基1L：LB营养琼脂32g，溶解于1L蒸馏水中。高温高压蒸汽灭菌，121℃15min。

五、烟草遗传转化

普通烟草无菌组培苗：取普通烟草种子置于1.5mL离心管中，用70％酒精颠倒混匀40s，无菌水冲洗3次；用0.01％的HgCl₂颠倒混匀6min，无菌水冲洗3次；把消毒后的烟草种子接种于萌发培养基上培养，放到光照培养箱中萌发生长；待烟草种子萌发、真叶长出，且稳定生长后获得烟草无菌组培苗；

萌发培养基：2.37g MS培养基粉末+30g/L蔗糖+7g/L琼脂。

烟草叶片预培养：取颜色鲜绿、长势健壮的普通烟草无菌组培苗的叶片切成约0.5cm²大小的方块，平铺于烟草遗传转化预培养基上培养2d。

烟草叶片共培养：将转有pCAMBIA1303-PfbZIP52重组质粒的农杆菌GV3101菌液接种于LB液体培养基(含50μg/mLRif和50μg/mLKan)中培养至OD₆₀₀达到0.8后，侵染烟草叶片，获得转基因烟草叶片。具体过程为：将预培养后的烟草叶片浸没于培养好的农杆菌GV3101菌液中，振荡侵染8min，灭菌水冲洗1min，将烟草叶片平铺于共培养基上暗培养2d，获得转基因烟草叶片。

愈伤组织诱导及筛选培养：将共培养后的转基因烟草叶片转至筛选培养基上诱导愈伤组织分化，直到丛生芽长出。

生根培养：将丛生芽转接到生根培养基中进一步培养，待转基因烟草叶片苗长出根系且生长稳定后鉴定阳性转基因型植株，并进行炼苗移栽。

烟草遗传转化所用培养基如下：

预培养基：4.74g MS培养基粉末+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+1.0mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)+0.1mg/Lα-萘乙酸(NAA)。

共培养基：4.74g MS培养基粉末+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+1.0mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)+0.1mg/Lα-萘乙酸(NAA)。

筛选培养基：4.74g MS培养基粉末+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+1.0mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)+0.1mg/Lα-萘乙酸(NAA)+500mg/L头孢霉素(Cef)+5mg/L潮霉素(Hyg)。

生根培养基：2.37g MS培养基粉末+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+500mg/L头孢霉素(Cef)。

六、阳性转基因烟草植株鉴定

阳性转基因烟草基因组水平鉴定：待转基因烟草无菌苗生根且生长健壮后，提取转基因烟草和野生烟草(WT)的DNA为模板，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为检测引物，使用2×E-TaqPCR MasterMix进行PCR反应，PCR扩增体系10μL如下：PCR模板0.5μL、SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2引物各0.2μL、2×E-Taq PCR MasterMix 5μL、ddH₂O 4.1μL。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸80s，30个循环；72℃延伸5min后，用于琼脂糖凝胶电泳检测。

琼脂糖凝胶电泳结果显示，产物长度为1161bp，说明PfbZIP52基因成功转入烟草中(图5的A)。

需要说明的是，PfbZIP52基因成功导入烟草后进行翻译、转录表达，提取上述基因组水平检测为阳性的PfbZIP52转基因烟草的RNA，反转录成cDNA后从转录水平进行PCR检测，引物可设置为包括PfbZIP52基因全长编码区在内的任意区域，本发明所设引物扩增长度为PfbZIP52基因的部分区域(250bp)。

阳性转基因烟草转录水平鉴定：提取基因组水平检测为阳性的转基因烟草和野生烟草(WT)的RNA，反转录合成cDNA后为模板，以实施例2中SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5为检测引物，使用2×E-TaqPCRMasterMix进行PCR反应，PCR扩增体系10μL如下：PCR模板0.5μL、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5引物各0.2μL、2×E-TaqPCRMasterMix 5μL、ddH₂O 4.1μL。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min后，用于琼脂糖凝胶电泳检测。

琼脂糖凝胶电泳结果显示，产物长度为250bp，说明PfbZIP52基因在烟草植株中能够有效转录表达(图5的B)。

根据以上方法，以根癌农杆菌GV3101作为菌种，制备农杆菌GV3101感受态细胞；然后以pCAMBIA1303-PfbZIP52重组质粒转化农杆菌GV3101感受态细胞，得到含有pCAMBIA1303-PfbZIP52的农杆菌GV3101；以烟草为异源宿主，将含有pCAMBIA1303-PfbZIP52的农杆菌GV3101侵染烟草，得到PfbZIP52基因过表达阳性转基因型(OE)烟草植株。

实施例4：PfbZIP52基因的功能验证。

一、实验材料

PfbZIP52基因过表达阳性转基因型(OE)烟草植株和野生型(WT)烟草植株；植物蛋白定量测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)、植物淀粉含量检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)、植物可溶性糖含量检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)。

二、转基因烟草总脂及主要脂肪酸组分含量测定与分析

取转基因烟草叶片，经真空冷冻干燥后充分研磨成粉末状，通过氯仿:甲醇法提取并测定转基因烟草叶片的总油脂含量。分别称量50mg样品置于50mL离心管中，各样品均设3次重复处理。在各离心管中加入氯仿:甲醇(V:V＝1:2)溶液7.5mL，吹吸混匀后置于37℃摇床中振荡抽提24h，4000rpm离心10min，小心吸取上清于另一新的离心管中。向剩余沉淀中再加入氯仿:甲醇溶液7.5mL，37℃继续抽提12h。将两次上清液合并，加入1％的NaCl溶液9mL，氯仿溶液5mL，使得氯仿:甲醇:水最终的体积比为2:2:1.8，混匀后4000rpm离心10min，吸取下层有机相于干净的指形管中(使用前称重m0)，使用氮气吹扫仪吹干后再次称量(m1)。各样品总油脂含量＝(m1m0)/0.05×100％。

通过氯仿:甲醇法制备烟草叶片的脂肪酸甲酯，使用GC气相色谱仪(安捷伦，7890B)测定烟草中的主要脂肪酸组分及其含量。具体操作如下：分别称取冷冻干燥后的转基因烟草叶片的粉末50mg于干净的指形管中，加入50μL的Tri 17:0烷酸(10mg/mL)，用作内标对照，各样品均设3次重复处理。加入氯仿:甲醇(V:V＝2:1)溶液1mL，涡旋混匀。再向其中依次加入500μL 0.9％的KCl溶液、1mL的氯仿溶液，涡旋混匀后4000rpm离心10min。吸取下层有机相至一个新的指形管中，待有机相完全蒸干后加入500μL甲醇(含有2.5％的浓硫酸)，振荡混匀后置于80℃水浴锅中反应2h。冷却后加入1mL 0.9％的KCl溶液、500μL正己烷溶液，混匀后4000rpm离心10min。小心吸取上清相于一新的指形管中，使用氮气吹扫仪吹干后再次加入500μL正己烷，充分溶解脂肪酸沉淀，吸取至GC小瓶中，存于-20℃用于后续脂肪酸组分及含量测定分析。

使用GC气相色谱仪测定紫苏种子主要脂肪酸组分及含量，GC反应程序为：初始温度50℃运行0.5min，按照30℃/min升温到194℃，运行3.5min，按照5℃/min升温到240℃，保持1min；FID检测器温度设置为280℃，氢气40mL/min，空气400mL/min，尾吹气氮气25mL/min；进样量1μL。通过内标法鉴定脂肪酸各组分并计算其含量，各脂肪酸组分的含量ki＝(Ai×ms)/(As×m)×100％。其中i为测定的各脂肪酸组分，Ai为各脂肪酸组分的峰面积，ms为内标(Tri 17:0烷酸)的质量，As为内标(Tri 17:0烷酸)的峰面积，m为称取样品的质量。

由图6的A结果表明，PfbZIP52转基因型(OE)烟草的总油脂含量显著高于野生型(WT)烟草的总油脂含量，由图6的B结果表明，PfbZIP52基因过表达使转基因烟草中C18:3和C16:0的含量分别显著提高了4.48％和3.52％，同时C18:1和C18:2的含量分别降低了2.71％和3.20％，而C18:0和C20:0的含量无明显变化(C16:0棕榈酸，C18:0硬脂酸，C18:1油酸，C18:2亚油酸，C18:3亚麻酸，C20:0花生酸)。以上结果表明PfbZIP52基因在烟草中过表达提高了转基因烟草的总油脂含量，改变了转基因烟草脂肪酸组分的富集及其含量，说明了PfbZIP52基因在植物油脂代谢中发挥功能。

三、转基因烟草其他农艺性状分析

转基因烟草可溶性糖含量测定：使用植物可溶性糖含量检测试剂盒测定紫苏转基因烟草的可溶性糖含量，具体操作如下：称取冷冻干燥后研磨成粉末的转基因烟草叶片样本100mg，加入1mL去离子水，充分研磨至匀浆状态，转至带盖的离心管中，沸水浴反应10min。冷却至室温后8000rpm离心10min，吸取上清液至10mL试管中，去离子水定容至10mL。吸取40μL样本液于一新的离心管中，加入20μL工作液(现用现配：向一瓶试剂一中加入5mL试剂二，使充分溶解)，混匀，95℃水浴反应10min。冷却至室温后使用分光光度计测定其在620nm波长下的吸光度值A，去离子水为空白参比。根据标准曲线得到的回归方程为y＝0.1329x+0.0085，其中x代表吸光度值，y代表标准品浓度(mg/mL)。各样本可溶性糖含量计算公式为：可溶性糖含量(mg/g)＝(y×V1)/(W×V1/V2)。其中，V1：样本液体积，40μL；V2：提取液体积，10mL；W：样本质量，0.1g。

转基因烟草总蛋白含量测定：使用植物蛋白定量测定试剂盒(南京建成)测定紫苏发育种子的蛋白含量，具体操作按照试剂盒说明书进行：称取待测转基因烟草叶片样本各100mg于1.5mL离心管，按照1:9(质量:体积＝g:mL)的比例向其中加入9倍体积的0.9％的NaCl溶液，在冰上充分研磨至匀浆状态，漩涡混匀，4000rpm离心10min，小心吸取上清液；上清液与0.9％NaCl溶液按1:4稀释成2％或按1:9稀释成1％的匀浆溶液，保存待测。在空白管、标准管及测定管中分别加入0.05mL去离子水，0.05mL蛋白标准液(mL，0.563g/L)，0.05mL样品匀浆，向每个管中加入3mL考马斯亮蓝显色液；将每个反应管中的试剂充分混匀，室温静置10min；设置分光光度计波长595nm，用去离子水作空白参比，测定各反应管中的OD值。转基因烟草总蛋白含量计算：样本蛋白浓度(g/L)＝[(OD测定OD空白)/(OD标准OD空白)]C标准。

转基因烟草淀粉含量测定：使用植物淀粉含量检测试剂盒(索莱宝)测定转基因烟草的淀粉含量，具体操作按照试剂盒说明书进行：称取冷冻干燥后研磨成粉末的转基因烟草叶片样本100mg于2mL离心管中，加入1mL试剂一充分混匀，置于水浴锅中80℃反应0.5h，3000g离心5min，弃上清；向剩余沉淀中加入500μL无菌水，置于沸水浴中糊化反应15min；待冷却至室温后加入试剂二350μL，再次置于沸水浴中糊化反应15min(期间颠倒混匀3～5次)；冷却后加入850μL无菌水，混匀，室温条件下8000g离心15min，留上清液(样本溶液)用于后续检测(100μL上清液+700μL无菌水)；吸取200μL样本液于一新的离心管中，加入1mL工作液(现用现配：向试剂三中先加入6.75mL蒸馏水，再加入38.25mL浓硫酸，使充分溶解)混匀，置于水浴锅中95℃反应10min；冷却至室温后使用分光光度计测定其在620nm波长下的吸光度值A，无菌水为空白参比。根据标准曲线得到的回归方程为y＝0.1031x+0.0009，其中x代表标准品浓度(mg/mL)，y代表吸光度值。各样本淀粉含量计算公式：淀粉含量(mg/g)＝x×稀释倍数×V提取/W。其中，V提取：提取后体积，1.7mL；W：样品质量，0.1g；稀释倍数：8倍。

结果如图7，转基因型(OE)烟草植株与野生型(WT)烟草植株相比，转基因型的可溶性糖含量显著升高(图7的A)，总蛋白含量未发生明显变化(图7的B)，淀粉含量显著降低(图7的C)，烟草可溶性糖和淀粉含量的变化说明了PfbZIP52基因的过表达改变了烟草植株中的碳通量进入油脂合成途径。此外，对PfbZIP52转基因烟草株系的种子发芽率、种子千粒重和叶片光合速率(Photosynthetic rate,Pn)进行分析，每个样品均进行3次重复。结果表明转基因型(OE)烟草植株的种子发芽率(图7的D)、种子千粒重(图7的E)和叶片光合速率(图7的F)与野生型(WT)烟草植株相比均无明显差异。因此，以上结果表明PfbZIP52基因的过表达促进了烟草中碳通量进入油脂/FA合成途径，具有促进烟草油脂合成的功能。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims

1.PfbZIP52基因的过表达载体，其特征在于，所述PfbZIP52基因的核苷酸序列如SEQID NO.3所示，所述过表达载体是将PfbZIP52基因与植物表达载体连接获得，所述植物表达载体包括Xba I和Kpn I酶切位点，所述PfbZIP52基因连接在Xba I和Kpn I酶切位点之间，所述过表达载体能用于PfbZIP52基因功能研究，通过调控脂肪酸代谢提高烟草油脂含量。

2.根据权利要求1所述的PfbZIP52基因的过表达载体，其特征在于，所述植物表达载体为pCAMBIA1303载体、pCAMBIA1391Z载体、pCAMBIA1302载体中的任意一种。

3.权利要求2所述的PfbZIP52基因的过表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

通过PCR扩增如SEQ ID NO.3所示的目的基因PfbZIP52；

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：2×FastPfu FlyPCR SuperMix 25μL，cDNA模板1μL，引物对PfbZIP52-1303各1μL，无核酸酶水补足至50μL。

5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，连接获得所述重组产物pCAMBIA1303-PfbZIP52的体系为：目的基因PfbZIP52片段2μL、pCAMBIA1303载体线性化片段3μL、2×ClonExpress Mix 5μL。

6.权利要求1所述的PfbZIP52基因的过表达载体在提高烟草油脂品质中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述PfbZIP52基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，所述过表达载体是将PfbZIP52基因与植物表达载体连接获得，所述植物表达载体包括Xba I和Kpn I酶切位点，所述PfbZIP52基因连接在Xba I和Kpn I酶切位点之间，将所述过表达载体转入烟草构建获得转基因烟草，通过调控脂肪酸代谢提高烟草油脂含量。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述转基因烟草的构建步骤如下：

构建PfbZIP52基因的过表达载体；

将烟草叶片于烟草遗传转化预培养基上培养；

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述预培养基配方为4.74gMS培养基粉末+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+1.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA；

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述筛选培养基配方为4.74g MS培养基粉末+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/LNAA+500mg/LCef+5mg/L Hyg；