CN102533669A - 鸭byd病毒灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种预防BYD病毒感染引起的鸭产蛋下降综合征的疫苗及其制备方法。本发明提供了鸭BYD病毒(FamilyFlaviviridae，Genus Flavivirus，Ntaya virus group，Duck BYD virus)JXSP株，保藏编号CGMCC No.5266。本发明提供的毒株为具有优良免疫原性的鸭BYD病毒毒株。将该毒株接种到敏感细胞上，收获细胞液，灭活后乳化，可以得到一种安全、有效、可控的鸭BYD病毒灭活疫苗，有利于鸭产蛋下降综合征的防控。

Description

鸭BYD病毒灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及兽医生物制品技术领域，具体地，涉及鸭BYD病毒疫苗及其制备方法。

背景技术

从2010年4月以来，中国东南部分省份的鸭场流行一种严重的疾病，该疾病迅速蔓延至中国各主要养鸭重省市，包括浙江、福建、江西、山东、河北、江苏和北京。疾病影响包括北京鸭和麻鸭在内的多种产蛋鸭，感染鸭呈现出最突出的临床症状就是采食量忽然下降伴随产蛋率的骤降，产蛋率在5天内可降至10％，剖检可见卵巢发生出血、萎缩、破裂等严重病变。初期可见部分卵泡有出血点或出血斑，随着病程的发展，卵泡严重的出血和变性，卵泡破裂和腹膜炎，部分病例可见有脾脏肿大。组织病变主要表现为卵巢出血、卵泡发育停止、闭锁或崩解，可见大量大小不等的圆形或颗粒状红染小体，充满已崩解的卵泡或间质。个别病例脑可见小胶质细胞浸润灶，脑蛛网膜下充血、炎性细胞浸润。在一些感染严重的鸭场种蛋几乎绝产，发病后期种鸭死亡率为5％-30％不等，给养鸭业造成了巨大的经济损失。

经***的流行病学调查和病原分离鉴定，研究证实了该疾病的元凶是一种新的黄病毒，命名为BYD病毒。BYD病毒的发现一方面解释了这场不明原因的鸭场疾病，另一方面由于黄病毒本身的特点(黄病毒属的大部分成员是重要的人畜共患性病原，可以通过吸血昆虫等媒介传播给人，引起人的感染和发病)，因此鸭黄病毒的公共卫生学意义应引起业界的高度重视。

由于之前在鸭群中尚未发现过黄病毒的感染，本次鸭BYD病毒感染尚属首次爆发和流行，而国内外对黄病毒感染尚缺乏有效地治疗药物，尚无疫苗能够对其进行保护，因此目前还没有有效地治疗和免疫预防措施。

发明内容

本发明的目的在于提供一种预防BYD病毒感染引起鸭产蛋下降综合征的灭活疫苗及其制备方法。

本发明提供了鸭BYD病毒(Family Flaviviridae，GenusFlavivirus，Ntaya virus group，Duck BYD virus)JXSP株，分离自中国河北省白洋淀某鸭场发病鸭脑组织。JXSP株已于2011年9月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，分类命名：鸭BYD病毒，保藏编号为CGMCC No.5266。

本发明的鸭BYD病毒JXSP株属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(flavivirus)。电镜下，病毒粒子呈球形，大小约45-60nm，有一直径约30nm的电子致密的核芯和包裹核芯的脂质囊膜。主要在感染细胞的胞质内复制。病毒基因组为单股正链RNA，大小为10990nt。基因组5’和3’端各有一段非编码区(NCR)，整个基因的编码顺序为5’-NCR-C-PrM-E-NS1-NS2A2B-NS3-NS4A4B-NS5-NCR-3’。

本发明提供了鸭BYD病毒JXSP株在制备疫苗中的应用。

本发明提供了利用鸭BYD病毒JXSP株制备的疫苗。

本发明提供了一种制备鸭BYD病毒JXSP株病毒液的方法，包括如下步骤：

1)将扩大培养的细胞按培养液的1％加入JXSP株病毒种子，37℃，吸附1小时；

2)加入1％胎牛血清维持液，37℃下培养，当细胞病变达75％以上时收获，冻融3次；

3)离心或过滤除去细胞碎片，收集上清液，该上清液即为鸭BYD病毒JXSP株病毒液。

鸭BYD病毒JXSP株可在鸭胚成纤维细胞(DEFs)中培养增殖，并产生CPE(细胞变圆、皱缩、核固缩，呈灶状脱落)，病毒亦能感染BHK-21、Vero细胞并产生CPE，但在PK-15、ST、MDCK等其他细胞上均不产生CPE。因此，上述细胞可选择为BHK-21、Vero和/或鸭胚成纤维细胞。

在本发明的一个实施例中，选择BHK-21细胞进行鸭BYD病毒JXSP株的毒种繁殖实验，具体为：将BYDV-JXSP第2代鸭胚尿囊液毒以无血清DMEM培养基5倍稀释后接种至BHK-21细胞培养中，于5％CO₂培养箱中，37℃静置培养，待75％细胞出现病变时，收获细胞液，冻融2次后取上清100倍稀释后感染接种BHK-21细胞，如此传至第8代，收获细胞液于-70℃保存作为种毒，病毒含量≥10^5.5TCID₅₀/mL。

用BHK-21细胞繁殖病毒时，接种前可进行扩大培养：取液氮保存的BHK-21细胞，立即置于37℃水浴融化后，800r/min离心5min，弃上清，加入含10％胎牛血清的DMEM细胞生长液悬浮细胞沉淀，转入细胞培养瓶中，于5％CO₂培养箱中，37℃静置培养，待细胞单层形成后进行细胞传代。弃去细胞培养液，加入适量灭菌PBS轻轻清洗细胞表面2次，弃PBS，加入37℃预热的胰酶消化液(0.25％)静置5～10min，倒置显微镜下观察细胞间隙明显扩大、细胞形态变圆时，轻轻倾弃胰酶液，加入含10％胎牛血清的DMEM吹打分散细胞，并按1∶3的比例分装到新的细胞培养瓶培养，于5％CO₂培养箱中，37℃静置培养。

本发明还提供了制备鸭BYD病毒灭活疫苗的方法，是将上述制备的鸭BYD病毒JXSP株病毒液作为制苗用病毒液依次进行灭活和乳化，得到鸭BYD病毒灭活疫苗。

所述病毒液病毒含量≥10^5.5TCID₅₀/mL。

所述的灭活是将病毒液按终浓度为0.2％(V/V)比例加入甲醛溶液(甲醛含量为37％)，充分混匀，置37℃作用24h灭活病毒。

所述的乳化是以灭活后的病毒液作为水相，按照水相油相体积比4∶6混合后，10000～12000r/min乳化2min，终止搅拌前加入硫柳汞溶液，使终浓度达到0.01％体积比。

本发明中油相制备方法为取注射用白油94份(mL)，加硬脂酸铝2g，边加边搅拌，直至完全透明，再加入6份(mL)司本-80，充分混匀，高压灭菌，得到100mL油相；水相的制备方法为取灭活的细胞培养病毒液100份(mL)加入4份(mL)灭菌的吐温-80，充分摇动直到吐温-80完全溶解，得到104mL水相。

本发明制备的鸭BYD-JXSP病毒灭活疫苗外观是乳白色乳剂。

本发明疫苗的可用于对5～7日龄的健康鸭进行颈部皮下接种，每只0.5mL疫苗。

在本发明的实施例中，对制得的BYD-JXSP病毒灭活疫苗的安全性检验发现，5～7日龄的健康易感鸭(HI抗体效价≤1∶20)经颈部皮下注射疫苗1mL，观察期内没有发生因注射疫苗而出现的局部和全身的不良反应；对制得的BYD-JXSP病毒灭活疫苗的效力检验中，用5～7日龄或产蛋率达60％以上的健康易感鸭(HI抗体效价≤1∶20)，每只经颈部皮下注射疫苗0.5mL，接种后3周脑内接种JXSP强毒(病毒滴度≥10^5.5TCID₅₀/mL，0.1mL/只)，观察期内，疫苗对免疫鸭的保护率达到90％以上。

本发明提供的鸭BYD病毒JXSP株具有优良免疫原性，将该毒株接种到敏感宿主细胞上，收获细胞液，灭活后乳化，得到一种安全、有效、可控的鸭BYD病毒灭活疫苗。该疫苗接种鸭后，未见不良反应，剖检接种部位，未见红肿、化脓等症状，且疫苗被完全吸收，安全性好，免疫效果好，能抵抗鸭BYD强毒的感染，有利于规模化养殖中鸭产蛋下降综合征的防控。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的鸭由广东大华农动物保健品股份有限公司提供，实施例中所用的化学试剂、原料、器材为可以购买得到的市售产品，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 病毒分离与致病性

1、分离鉴定 该病毒分离自中国河北省白洋淀某鸭场发病鸭脑组织。将病鸭脑组织样品用无菌PBS制成10％匀浆，3000r/min离心20min，过滤除菌后经尿囊腔途径接种9～12日龄无母源抗体鸭胚后，37℃孵化5天，收获尿囊液并在鸭胚中传代。将第2代尿囊液毒接种在BHK-21细胞单层上，于5％二氧化碳培养箱中静置培养、观察7天，待出现细胞病变时收获培养物，-70℃保存。

制备感染细胞的超薄切片透射电镜下观察，在感染后24小时以上的细胞胞质或小泡内可见大量直径约50nm、球形有囊膜病毒粒子聚堆或散在，大部分病毒粒子可见有直径约30nm的电子致密的核芯。超速离心浓缩的病毒培养液，经磷钨酸负染，透射电镜下观察可见直径约50nm、有囊膜的球形病毒粒子。

全基因组序列测定结果表明，病毒基因组为单股正链RNA，大小为10990nt。基因组5’和3’端各有一段非编码区(NCR)，整个基因的编码顺序为5’-NCR-C-PrM-E-NS1-NS2A2B-NS3-NS4A4B-NS5-NCR-3’。在利用有序列数据的黄病毒全基因组制作的种系发生进化树中，BYD病毒(JXSP株)与巴格扎病毒(Bagaza Virus)进化关系最近，同源性约为72％。JXSP株已于2011年9月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，分类命名：鸭BYD病毒。保藏编号为CGMCC No.5266。

2、致病性 病毒接种产蛋鸭，临床表现为采食下降和产蛋量急剧下降。在感染后6天中产蛋率从60.9％下降至了12％以下，直至停产。感染后3天剖检可见卵泡出血，随着病程的发展出现卵巢的退行性变化，卵泡变性和萎缩。组织检查可见病鸭卵巢出血，卵泡发育停止、闭锁或崩解，并有大量大小不等的圆形或颗粒状红染小体，充满已崩解的卵泡或间质。部分病例脑可见小胶质细胞浸润灶，小血管周炎细胞形成袖套样结构(血管套)，呈非化脓性脑炎病变。组织病理学变化和大体剖检所见及发病鸭临床症状基本相符，用荧光RT-PCR和病毒分离试验可以检测和回收到病毒。

病毒脑内接种1～7周龄鸭可引起明显的神经症状，表现为采食下降、瘫软、转圈运动、瘫痪和死亡，死亡率为40％～60％。组织学检查表现为典型的非化脓性脑炎病变。

实施例2 鸭BYD病毒JXSP株病毒液的制备

1、毒种繁殖 将BYDV-JXSP第2代尿囊鸭胚液毒5倍稀释后接种至BHK-21细胞培养中，于5％二氧化碳培养箱中，37℃静置培养待75％细胞出现病变时，收获细胞液，冻融2次后取上清100倍稀释后感染接种BHK-21细胞，如此传至第8代，收获细胞液于-70℃保存作为毒种，病毒含量≥10^5.5TCID₅₀/mL。

2、细胞种子繁殖  取液氮保存的BHK-21细胞，立即置于37℃水浴融化后，800r/min离心5min，弃上清，加入含10％胎牛血清的DMEM细胞生长液悬浮细胞沉淀，转入细胞培养瓶中，于5％二氧化碳培养箱中，37℃静置培养，待细胞单层形成后进行细胞传代。弃去细胞培养液，加入适量灭菌PBS轻轻清洗细胞表面2次，弃PBS，加入37℃预热的胰酶消化液(0.25％)静置5～10min，倒置显微镜下观察细胞间隙明显扩大、细胞形态变圆时，轻轻倾弃胰酶液，加入含10％胎牛血清的DMEM吹打分散细胞，并按1∶3的比例分装到新的细胞培养瓶培养，于5％二氧化碳培养箱中，37℃静置培养。

3、制备病毒液  待BHK-21细胞单层形成后，弃去细胞培养液，加入适量灭菌PBS轻轻清洗细胞表面2次，弃PBS；将种毒用DMEM基础液作100倍稀释，按细胞培养液的终体积的10％(V/V)接种到细胞单层，使液体均匀覆盖细胞表面，于5％二氧化碳培养箱中，37℃静置1小时，然后加入含有1％胎牛血清的DMEM，置5％二氧化碳培养箱中，37℃培养96小时，75％以上的细胞出现病变(表现为细胞圆缩和脱落)时，收获，反复冻融3次，经离心或过滤除去细胞碎片，收集细胞培养液(病毒滴度≥10^5.5TCID₅₀/mL)，即为制备疫苗用的病毒液，-20℃以下保存。，

实施例3 鸭BYD病毒灭活疫苗的制备

1、病毒液的灭活

将实施例2中制备的病毒液按终浓度为0.2％(体积比)的比例加入甲醛溶液，混匀，充分摇匀后于37℃作用24小时，灭活病毒。

2、灭活效果检验

BHK-21细胞在24孔板上培养至单层，将步骤1中甲醛灭活处理的10倍稀释的BYDV-JXSP病毒液按0.2mL/孔接种于BHK-21细胞单层上，每个样品接种3孔，孵育1小时后弃去样品液，用维持液洗涤后继续维持培养，同时设阳性对照和空白孔对照；48小时后观察阳性对照孔可见细胞病变，样品和空白对照孔为阴性；盲传2代，同样观察，若实验孔和空白对照孔的细胞没有出现CPE而阳性孔出现CPE，则说明灭活效果良好。

3、疫苗的制备

(1)100mL油相制备  取注射用白油94mL，加硬脂酸铝2g，边加边搅拌，直至完全透明，再加入6mL司本-80，充分混匀，高压灭菌备用；

(2)水相制备 取灭活的细胞培养病毒液100份(mL)加入4份(mL)灭菌的吐温-80，充分摇动直到吐温-80完全溶解；

(3)配苗 取6份油相放入胶体磨或乳剂缸内，慢速搅动，同时缓慢加入4份水相，加完水相后以10000～12000r/min乳化2min；在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，终浓度达到0.01％。乳化后，取样5～10mL，以3000r/min离心15min，若有分层现象，应重新乳化。

(4)分装 将乳化好的疫苗定量分装，加盖密封。

实施例4 疫苗的安全性检验

1、疫苗与实验动物

取三批实施例3制备的鸭BYD病毒灭活疫苗，批号分别为2011001、2011002、2011003。健康鸭由广东大华农动物保健品股份有限公司提供。

2、疫苗对最小日龄动物使用一次单剂量接种

每批疫苗分别免疫5～7日龄健康鸭10只，每只颈部皮下注射疫苗0.5mL；注射后继续观察饲养14天，观察免疫后动物的反应，每组对部分鸭进行解剖，观察注射部位疫苗的吸收情况。

3、疫苗对靶动物单剂量重复接种

每批疫苗分别免疫5～7日龄健康鸭10只，每只颈部皮下注射疫苗0.5mL；在第一次免疫后2周，进行二免，每只再次颈部皮下注射疫苗0.5mL；注射后继续观察饲养14天，观察免疫后动物的反应，每组对部分鸭进行解剖，观察注射部位疫苗的吸收情况。

4、疫苗对靶动物一次超剂量接种

每批疫苗分别免疫5～7日龄健康鸭10只，每只颈部皮下注射疫苗1mL；注射后继续观察饲养14天，观察免疫后动物的反应，每组对部分鸭进行解剖，观察注射部位疫苗的吸收情况。

5、试验结果

以上各组试验鸭均未出现局部和全身不良反应，接种疫苗后动物的精神状态和食欲良好，对部分鸭进行解剖观察表明；疫苗注射部位未见红肿、化脓等症状，疫苗完全吸收，结果见表1。因此，本发明实施例3制备的三批疫苗在单剂量、超剂量、多次接种的情况下均对鸭安全。

表1 安全性试验结果

实施例5 疫苗的效力检验

1、疫苗与实验动物

取实施例3制得的三批鸭BYD病毒(JXSP株)灭活疫苗，批号为2011001、2011002、2011003。健康鸭由广东大华农动物保健品股份有限公司提供。

2、疫苗免疫接种

每批疫苗分别免疫5～7日龄健康鸭10只，每只颈部皮下注射疫苗0.5mL；同时设非免疫对照组鸭10只。

3、血清抗体检测

免疫后21天采血分离血清采用间接ELISA方法检测抗体水平。具体操作方法如下：

①病毒抗原繁殖与纯化将BYD病毒(JXSP株)用DMEM基础液作100倍稀释后接种到已长成单层的鸭胚成纤维细胞上，37℃吸附1h后吸弃病毒液，加入维持液继续培养，每天观察，待75％～90％的细胞出现病变，收集病毒液，于4℃，10,000r/min高速离心45min后取上清，上清于4℃，40,000r/min超速离心2.5h，弃上清，按原体积的1/100用灭菌PBS悬浮沉淀，之后将悬浮液置于20％(W/V)和50％(W/V)的蔗糖层上于4℃，40,000r/min超速离心3h，取两个蔗糖层之间的浓缩病毒带于-80℃保存，作为ELISA检测的包被用抗原。

②将上述纯化抗原用碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释至6μg/mL，加入到96孔酶联反应板中(100μL/孔)，4℃过夜包被酶联反应板；

③取包被好的酶联反应板，倾弃包被液，用含0.05％吐温-20的PBS(pH7.4)洗涤液(PBST)洗涤3次，每次3分钟；

④每孔加入150μL封闭液(5％的脱脂奶，PBST)，37℃作用2小时，倾弃各孔液体，参照步骤③洗涤3次；

⑤每孔加入100μL待检鸭血清(1∶200)稀释，37℃作用1小时。同时每个反应板各设立2阳性和阴性血清对照孔。倾弃各孔液体，参照步骤③洗涤3次；

⑥每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗鸭IgG(H+L)(1∶500稀释，美国KPL公司生产)，37℃作用1小时。倾弃各孔液体，参照步骤③洗涤3次；

⑦每孔加TMB底物液100μL，37℃避光感作15min，加入50μL 2M硫酸溶液终止反应，用酶标仪测定OD_450nm值，记录结果。

4、血清抗体检测结果

抗体检测结果均达到0.85以上，对照组血清均为阴性(结果见表2)。血清抗体检测结果表明，鸭免疫接种该疫苗后可诱导产生良好的免疫反应。

采用固定病毒-稀释血清中和试验对血清进行平行检测，鸭血清ELISA抗体效价OD_450nm≥0.85时，病毒中和效价≥1∶100。对强毒攻毒的保护率可达到90％以上。

表2 血清抗体检测结果

试验分组	疫苗批号	检测结果
			免疫一组	2011001	OD450＞1.05
免疫二组	2011002	OD450＞0.89
			免疫三组	2011003	OD450＞0.95
非免疫对照组	/	OD450＜0.2

5、攻毒试验

实验鸭免疫后3周脑内接种检验用强毒(实施例2制得的BYD-JXSP株BHK-21细胞培养第3代病毒液，其病毒滴度≥10^5.5TCID₅₀/mL，0.1mL/只)，继续观察14天，记录各组动物的反应，包括食欲、临床症状、剖检大体病理变化。对病死鸭和攻毒后第14天扑杀的试验鸭，用荧光RT-PCR方法检测脑和脾组织内的BYD-JXSP病毒。

6、攻毒试验结果

(1)攻毒对照鸭  攻毒后9/10只鸭发病，5/10只鸭死亡。

病鸭表现为：①临床观察见采食减少、缩脖、震颤、行走步态不正常、运动失调和瘫痪等；②大体剖检自然死亡鸭脾肿大、淤血，观察至14天扑杀鸭肉眼未见明显病变；③组织病理学观察可见脑小血管袖套样胶质细胞浸润、胶质细胞浸润灶等非化脓性脑炎变化。

对病死鸭和攻毒后14天扑杀的对照鸭，取脑和脾用荧光RT-PCR方法检测BYD病毒(JXSP株)均为阳性。详见表3。

表3 对照鸭攻毒试验结果表

(2)疫苗免疫鸭

三批灭活疫苗免疫组，大部分免疫鸭免疫后临床表现正常，每组有部分鸭在攻毒后4～8天可出现一过性减食、缩脖、摇晃等临床症状，免疫三组1只鸭于攻毒后第8天死亡，个别鸭可见共济失调。大体剖检未见异常，组织病理学观察偶见胶质细胞呈小灶性增生。脑和脾用荧光RT-PCR方法检测BYD病毒(JXSP株)三组仅4个样品为阳性。

结果见表4。

由实验结果可见，本发明实施例3制得的三批疫苗免疫鸭后，能够使鸭抵抗鸭BYD病毒的感染，没有引起不良反应，具有很好的保护效力。

表4 疫苗免疫组攻毒后结果汇总表

实施例6 疫苗免疫效果的综合检验

1、疫苗与实验动物

取实施例3制得的鸭BYD病毒灭活疫苗1批，批号为2011001。健康鸭由广东大华农动物保健品股份有限公司提供。

2、疫苗的安全性检验

5～7日龄健康鸭10只，每只颈部皮下注射疫苗1mL；注射后继续观察饲养14天，未见局部和全身不良反应，接种鸭采食正常。

3、效力检验

①疫苗免疫接种将疫苗接种5日龄健康鸭10只，每只颈部皮下注射疫苗0.5mL；同时设非免疫对照组鸭10只。

②攻毒保护试验 免疫后3周脑内接种检验用强毒(实施例2制得的BYD-JXSP株BHK-21细胞培养第3代病毒液，其病毒滴度≥10^5.5TCID₅₀/mL，0.1mL/只)，继续观察14天。4/10只鸭在免疫后3～8天出现一过性减食、缩脖、摇晃等临床症状，至攻毒后14天无死亡，全部存活。扑杀后大体剖检未见明显异常。脑和脾用荧光RT-PCR方法检测BYD病毒(JXSP株)0/10只和1/10只为阳性。

未免疫的对照鸭攻毒后9/10只鸭发病，5/10只鸭死亡。

病鸭表现为：①临床观察见采食减少、缩脖、震颤、行走步态不正常、运动失调和瘫痪等；②大体剖检自然死亡鸭脾肿大、淤血，观察至14天扑杀鸭肉眼未见明显病变；③组织病理学观察可见血管袖套样胶质细胞浸润、胶质细胞浸润灶等非化脓性脑炎变化。

对病死鸭和14天扑杀的对照鸭，脑和脾用荧光RT-PCR方法检测BYD病毒(JXSP株)8/10只和9/10只为阳性。详见表5。

表5 效力检验结果

4、确定鸭发病标准为

下列3项指标符合2项，可判定为发病鸭：

①死亡；

②临床观察见采食减少；出现缩脖、震颤、行走步态不正常、运动失调和瘫痪等神经症状；产蛋鸭产蛋数明显下降，甚至为0；

③8/10只以上脑和脾荧光RT-PCR检测BYD病毒阳性。

根据实验结果，可见本发明提供的BYD-JXSP病毒株具有良好的免疫原性，利用其制备的鸭BYD病毒灭活疫苗应用于鸭，能够有效帮助宿主鸭抵抗BYD病毒的感染，且安全性好，不会引起不良反应，可广泛应用于鸭BYD病毒的感染引起的鸭产蛋下降综合征的防控。

Claims (10)

1.鸭BYD病毒(Family Flaviviridae，Genus Flavivirus，Ntayavirus group，Duck BYD virus)JXSP株，其保藏编号为CGMCC No.5266。

2.权利要求1所述的鸭BYD病毒JXSP株在制备预防BYD病毒感染引起的鸭产蛋下降综合征疫苗中的应用。

3.含有权利要求1所述的鸭BYD病毒JXSP株的疫苗。

4.一种制备权利要求1所述的鸭BYD病毒JXSP株病毒液的方法，包括如下步骤：

1)将扩大培养的细胞按培养液体积的1％加入权利要求1所述的JXSP株病毒种子，37℃，吸附1小时；

2)加入1％胎牛血清维持液，37℃下培养，当细胞病变达75％以上时收获，冻融3次；

3)离心或过滤除去细胞碎片，收集上清液，该上清液即为鸭BYD病毒JXSP株病毒液。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的细胞为BHK-21、Vero和/或鸭胚成纤维细胞。

6.一种制备鸭BYD病毒灭活疫苗的方法，是将权利要求4所述方法制备的鸭BYD病毒JXSP株病毒液作为制苗用病毒液依次进行灭活和乳化，得到鸭BYD病毒灭活疫苗。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述病毒液病毒含量≥10^5.5TCID₅₀/mL。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的灭活是将病毒液按终浓度为0.2％体积比加入甲醛溶液，混匀，37℃作用24h。

9.如权利要求6-8任一所述的制备方法，所述的乳化是以灭活后的病毒液作为水相，按照水相油相体积比4∶6混合后，10000～12000r/min乳化2min，终止搅拌前加入硫柳汞溶液，使终浓度达到0.01％体积比。

10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，取注射用白油94mL，加硬脂酸铝2g，边加边搅拌，直至完全透明，再加入6mL司本-80，充分混匀，高压灭菌得到100mL油相；取灭活的细胞培养病毒液100mL加入4mL灭菌的吐温-80，充分摇动直到吐温-80完全溶解，得到104mL水相。