发明内容
本发明的目的在于提供一种预防BYD病毒感染引起鸭产蛋下降综合征的灭活疫苗及其制备方法。
本发明提供了鸭BYD病毒(Family Flaviviridae,GenusFlavivirus,Ntaya virus group,Duck BYD virus)JXSP株,分离自中国河北省白洋淀某鸭场发病鸭脑组织。JXSP株已于2011年9月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,分类命名:鸭BYD病毒,保藏编号为CGMCC No.5266。
本发明的鸭BYD病毒JXSP株属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(flavivirus)。电镜下,病毒粒子呈球形,大小约45-60nm,有一直径约30nm的电子致密的核芯和包裹核芯的脂质囊膜。主要在感染细胞的胞质内复制。病毒基因组为单股正链RNA,大小为10990nt。基因组5’和3’端各有一段非编码区(NCR),整个基因的编码顺序为5’-NCR-C-PrM-E-NS1-NS2A2B-NS3-NS4A4B-NS5-NCR-3’。
本发明提供了鸭BYD病毒JXSP株在制备疫苗中的应用。
本发明提供了利用鸭BYD病毒JXSP株制备的疫苗。
本发明提供了一种制备鸭BYD病毒JXSP株病毒液的方法,包括如下步骤:
1)将扩大培养的细胞按培养液的1%加入JXSP株病毒种子,37℃,吸附1小时;
2)加入1%胎牛血清维持液,37℃下培养,当细胞病变达75%以上时收获,冻融3次;
3)离心或过滤除去细胞碎片,收集上清液,该上清液即为鸭BYD病毒JXSP株病毒液。
鸭BYD病毒JXSP株可在鸭胚成纤维细胞(DEFs)中培养增殖,并产生CPE(细胞变圆、皱缩、核固缩,呈灶状脱落),病毒亦能感染BHK-21、Vero细胞并产生CPE,但在PK-15、ST、MDCK等其他细胞上均不产生CPE。因此,上述细胞可选择为BHK-21、Vero和/或鸭胚成纤维细胞。
在本发明的一个实施例中,选择BHK-21细胞进行鸭BYD病毒JXSP株的毒种繁殖实验,具体为:将BYDV-JXSP第2代鸭胚尿囊液毒以无血清DMEM培养基5倍稀释后接种至BHK-21细胞培养中,于5%CO2培养箱中,37℃静置培养,待75%细胞出现病变时,收获细胞液,冻融2次后取上清100倍稀释后感染接种BHK-21细胞,如此传至第8代,收获细胞液于-70℃保存作为种毒,病毒含量≥105.5TCID50/mL。
用BHK-21细胞繁殖病毒时,接种前可进行扩大培养:取液氮保存的BHK-21细胞,立即置于37℃水浴融化后,800r/min离心5min,弃上清,加入含10%胎牛血清的DMEM细胞生长液悬浮细胞沉淀,转入细胞培养瓶中,于5%CO2培养箱中,37℃静置培养,待细胞单层形成后进行细胞传代。弃去细胞培养液,加入适量灭菌PBS轻轻清洗细胞表面2次,弃PBS,加入37℃预热的胰酶消化液(0.25%)静置5~10min,倒置显微镜下观察细胞间隙明显扩大、细胞形态变圆时,轻轻倾弃胰酶液,加入含10%胎牛血清的DMEM吹打分散细胞,并按1∶3的比例分装到新的细胞培养瓶培养,于5%CO2培养箱中,37℃静置培养。
本发明还提供了制备鸭BYD病毒灭活疫苗的方法,是将上述制备的鸭BYD病毒JXSP株病毒液作为制苗用病毒液依次进行灭活和乳化,得到鸭BYD病毒灭活疫苗。
所述病毒液病毒含量≥105.5TCID50/mL。
所述的灭活是将病毒液按终浓度为0.2%(V/V)比例加入甲醛溶液(甲醛含量为37%),充分混匀,置37℃作用24h灭活病毒。
所述的乳化是以灭活后的病毒液作为水相,按照水相油相体积比4∶6混合后,10000~12000r/min乳化2min,终止搅拌前加入硫柳汞溶液,使终浓度达到0.01%体积比。
本发明中油相制备方法为取注射用白油94份(mL),加硬脂酸铝2g,边加边搅拌,直至完全透明,再加入6份(mL)司本-80,充分混匀,高压灭菌,得到100mL油相;水相的制备方法为取灭活的细胞培养病毒液100份(mL)加入4份(mL)灭菌的吐温-80,充分摇动直到吐温-80完全溶解,得到104mL水相。
本发明制备的鸭BYD-JXSP病毒灭活疫苗外观是乳白色乳剂。
本发明疫苗的可用于对5~7日龄的健康鸭进行颈部皮下接种,每只0.5mL疫苗。
在本发明的实施例中,对制得的BYD-JXSP病毒灭活疫苗的安全性检验发现,5~7日龄的健康易感鸭(HI抗体效价≤1∶20)经颈部皮下注射疫苗1mL,观察期内没有发生因注射疫苗而出现的局部和全身的不良反应;对制得的BYD-JXSP病毒灭活疫苗的效力检验中,用5~7日龄或产蛋率达60%以上的健康易感鸭(HI抗体效价≤1∶20),每只经颈部皮下注射疫苗0.5mL,接种后3周脑内接种JXSP强毒(病毒滴度≥105.5TCID50/mL,0.1mL/只),观察期内,疫苗对免疫鸭的保护率达到90%以上。
本发明提供的鸭BYD病毒JXSP株具有优良免疫原性,将该毒株接种到敏感宿主细胞上,收获细胞液,灭活后乳化,得到一种安全、有效、可控的鸭BYD病毒灭活疫苗。该疫苗接种鸭后,未见不良反应,剖检接种部位,未见红肿、化脓等症状,且疫苗被完全吸收,安全性好,免疫效果好,能抵抗鸭BYD强毒的感染,有利于规模化养殖中鸭产蛋下降综合征的防控。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。
若未特别指明,实施例中所用的鸭由广东大华农动物保健品股份有限公司提供,实施例中所用的化学试剂、原料、器材为可以购买得到的市售产品,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1 病毒分离与致病性
1、分离鉴定 该病毒分离自中国河北省白洋淀某鸭场发病鸭脑组织。将病鸭脑组织样品用无菌PBS制成10%匀浆,3000r/min离心20min,过滤除菌后经尿囊腔途径接种9~12日龄无母源抗体鸭胚后,37℃孵化5天,收获尿囊液并在鸭胚中传代。将第2代尿囊液毒接种在BHK-21细胞单层上,于5%二氧化碳培养箱中静置培养、观察7天,待出现细胞病变时收获培养物,-70℃保存。
制备感染细胞的超薄切片透射电镜下观察,在感染后24小时以上的细胞胞质或小泡内可见大量直径约50nm、球形有囊膜病毒粒子聚堆或散在,大部分病毒粒子可见有直径约30nm的电子致密的核芯。超速离心浓缩的病毒培养液,经磷钨酸负染,透射电镜下观察可见直径约50nm、有囊膜的球形病毒粒子。
全基因组序列测定结果表明,病毒基因组为单股正链RNA,大小为10990nt。基因组5’和3’端各有一段非编码区(NCR),整个基因的编码顺序为5’-NCR-C-PrM-E-NS1-NS2A2B-NS3-NS4A4B-NS5-NCR-3’。在利用有序列数据的黄病毒全基因组制作的种系发生进化树中,BYD病毒(JXSP株)与巴格扎病毒(Bagaza Virus)进化关系最近,同源性约为72%。JXSP株已于2011年9月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,分类命名:鸭BYD病毒。保藏编号为CGMCC No.5266。
2、致病性 病毒接种产蛋鸭,临床表现为采食下降和产蛋量急剧下降。在感染后6天中产蛋率从60.9%下降至了12%以下,直至停产。感染后3天剖检可见卵泡出血,随着病程的发展出现卵巢的退行性变化,卵泡变性和萎缩。组织检查可见病鸭卵巢出血,卵泡发育停止、闭锁或崩解,并有大量大小不等的圆形或颗粒状红染小体,充满已崩解的卵泡或间质。部分病例脑可见小胶质细胞浸润灶,小血管周炎细胞形成袖套样结构(血管套),呈非化脓性脑炎病变。组织病理学变化和大体剖检所见及发病鸭临床症状基本相符,用荧光RT-PCR和病毒分离试验可以检测和回收到病毒。
病毒脑内接种1~7周龄鸭可引起明显的神经症状,表现为采食下降、瘫软、转圈运动、瘫痪和死亡,死亡率为40%~60%。组织学检查表现为典型的非化脓性脑炎病变。
实施例2 鸭BYD病毒JXSP株病毒液的制备
1、毒种繁殖 将BYDV-JXSP第2代尿囊鸭胚液毒5倍稀释后接种至BHK-21细胞培养中,于5%二氧化碳培养箱中,37℃静置培养待75%细胞出现病变时,收获细胞液,冻融2次后取上清100倍稀释后感染接种BHK-21细胞,如此传至第8代,收获细胞液于-70℃保存作为毒种,病毒含量≥105.5TCID50/mL。
2、细胞种子繁殖 取液氮保存的BHK-21细胞,立即置于37℃水浴融化后,800r/min离心5min,弃上清,加入含10%胎牛血清的DMEM细胞生长液悬浮细胞沉淀,转入细胞培养瓶中,于5%二氧化碳培养箱中,37℃静置培养,待细胞单层形成后进行细胞传代。弃去细胞培养液,加入适量灭菌PBS轻轻清洗细胞表面2次,弃PBS,加入37℃预热的胰酶消化液(0.25%)静置5~10min,倒置显微镜下观察细胞间隙明显扩大、细胞形态变圆时,轻轻倾弃胰酶液,加入含10%胎牛血清的DMEM吹打分散细胞,并按1∶3的比例分装到新的细胞培养瓶培养,于5%二氧化碳培养箱中,37℃静置培养。
3、制备病毒液 待BHK-21细胞单层形成后,弃去细胞培养液,加入适量灭菌PBS轻轻清洗细胞表面2次,弃PBS;将种毒用DMEM基础液作100倍稀释,按细胞培养液的终体积的10%(V/V)接种到细胞单层,使液体均匀覆盖细胞表面,于5%二氧化碳培养箱中,37℃静置1小时,然后加入含有1%胎牛血清的DMEM,置5%二氧化碳培养箱中,37℃培养96小时,75%以上的细胞出现病变(表现为细胞圆缩和脱落)时,收获,反复冻融3次,经离心或过滤除去细胞碎片,收集细胞培养液(病毒滴度≥105.5TCID50/mL),即为制备疫苗用的病毒液,-20℃以下保存。,
实施例3 鸭BYD病毒灭活疫苗的制备
1、病毒液的灭活
将实施例2中制备的病毒液按终浓度为0.2%(体积比)的比例加入甲醛溶液,混匀,充分摇匀后于37℃作用24小时,灭活病毒。
2、灭活效果检验
BHK-21细胞在24孔板上培养至单层,将步骤1中甲醛灭活处理的10倍稀释的BYDV-JXSP病毒液按0.2mL/孔接种于BHK-21细胞单层上,每个样品接种3孔,孵育1小时后弃去样品液,用维持液洗涤后继续维持培养,同时设阳性对照和空白孔对照;48小时后观察阳性对照孔可见细胞病变,样品和空白对照孔为阴性;盲传2代,同样观察,若实验孔和空白对照孔的细胞没有出现CPE而阳性孔出现CPE,则说明灭活效果良好。
3、疫苗的制备
(1)100mL油相制备 取注射用白油94mL,加硬脂酸铝2g,边加边搅拌,直至完全透明,再加入6mL司本-80,充分混匀,高压灭菌备用;
(2)水相制备 取灭活的细胞培养病毒液100份(mL)加入4份(mL)灭菌的吐温-80,充分摇动直到吐温-80完全溶解;
(3)配苗 取6份油相放入胶体磨或乳剂缸内,慢速搅动,同时缓慢加入4份水相,加完水相后以10000~12000r/min乳化2min;在终止搅拌前加入1%硫柳汞溶液,终浓度达到0.01%。乳化后,取样5~10mL,以3000r/min离心15min,若有分层现象,应重新乳化。
(4)分装 将乳化好的疫苗定量分装,加盖密封。
实施例4 疫苗的安全性检验
1、疫苗与实验动物
取三批实施例3制备的鸭BYD病毒灭活疫苗,批号分别为2011001、2011002、2011003。健康鸭由广东大华农动物保健品股份有限公司提供。
2、疫苗对最小日龄动物使用一次单剂量接种
每批疫苗分别免疫5~7日龄健康鸭10只,每只颈部皮下注射疫苗0.5mL;注射后继续观察饲养14天,观察免疫后动物的反应,每组对部分鸭进行解剖,观察注射部位疫苗的吸收情况。
3、疫苗对靶动物单剂量重复接种
每批疫苗分别免疫5~7日龄健康鸭10只,每只颈部皮下注射疫苗0.5mL;在第一次免疫后2周,进行二免,每只再次颈部皮下注射疫苗0.5mL;注射后继续观察饲养14天,观察免疫后动物的反应,每组对部分鸭进行解剖,观察注射部位疫苗的吸收情况。
4、疫苗对靶动物一次超剂量接种
每批疫苗分别免疫5~7日龄健康鸭10只,每只颈部皮下注射疫苗1mL;注射后继续观察饲养14天,观察免疫后动物的反应,每组对部分鸭进行解剖,观察注射部位疫苗的吸收情况。
5、试验结果
以上各组试验鸭均未出现局部和全身不良反应,接种疫苗后动物的精神状态和食欲良好,对部分鸭进行解剖观察表明;疫苗注射部位未见红肿、化脓等症状,疫苗完全吸收,结果见表1。因此,本发明实施例3制备的三批疫苗在单剂量、超剂量、多次接种的情况下均对鸭安全。
表1 安全性试验结果
实施例5 疫苗的效力检验
1、疫苗与实验动物
取实施例3制得的三批鸭BYD病毒(JXSP株)灭活疫苗,批号为2011001、2011002、2011003。健康鸭由广东大华农动物保健品股份有限公司提供。
2、疫苗免疫接种
每批疫苗分别免疫5~7日龄健康鸭10只,每只颈部皮下注射疫苗0.5mL;同时设非免疫对照组鸭10只。
3、血清抗体检测
免疫后21天采血分离血清采用间接ELISA方法检测抗体水平。具体操作方法如下:
①病毒抗原繁殖与纯化将BYD病毒(JXSP株)用DMEM基础液作100倍稀释后接种到已长成单层的鸭胚成纤维细胞上,37℃吸附1h后吸弃病毒液,加入维持液继续培养,每天观察,待75%~90%的细胞出现病变,收集病毒液,于4℃,10,000r/min高速离心45min后取上清,上清于4℃,40,000r/min超速离心2.5h,弃上清,按原体积的1/100用灭菌PBS悬浮沉淀,之后将悬浮液置于20%(W/V)和50%(W/V)的蔗糖层上于4℃,40,000r/min超速离心3h,取两个蔗糖层之间的浓缩病毒带于-80℃保存,作为ELISA检测的包被用抗原。
②将上述纯化抗原用碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释至6μg/mL,加入到96孔酶联反应板中(100μL/孔),4℃过夜包被酶联反应板;
③取包被好的酶联反应板,倾弃包被液,用含0.05%吐温-20的PBS(pH7.4)洗涤液(PBST)洗涤3次,每次3分钟;
④每孔加入150μL封闭液(5%的脱脂奶,PBST),37℃作用2小时,倾弃各孔液体,参照步骤③洗涤3次;
⑤每孔加入100μL待检鸭血清(1∶200)稀释,37℃作用1小时。同时每个反应板各设立2阳性和阴性血清对照孔。倾弃各孔液体,参照步骤③洗涤3次;
⑥每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗鸭IgG(H+L)(1∶500稀释,美国KPL公司生产),37℃作用1小时。倾弃各孔液体,参照步骤③洗涤3次;
⑦每孔加TMB底物液100μL,37℃避光感作15min,加入50μL 2M硫酸溶液终止反应,用酶标仪测定OD450nm值,记录结果。
4、血清抗体检测结果
抗体检测结果均达到0.85以上,对照组血清均为阴性(结果见表2)。血清抗体检测结果表明,鸭免疫接种该疫苗后可诱导产生良好的免疫反应。
采用固定病毒-稀释血清中和试验对血清进行平行检测,鸭血清ELISA抗体效价OD450nm≥0.85时,病毒中和效价≥1∶100。对强毒攻毒的保护率可达到90%以上。
表2 血清抗体检测结果
试验分组 |
疫苗批号 |
检测结果 |
免疫一组 |
2011001 |
OD450>1.05 |
免疫二组 |
2011002 |
OD450>0.89 |
免疫三组 |
2011003 |
OD450>0.95 |
非免疫对照组 |
/ |
OD450<0.2 |
5、攻毒试验
实验鸭免疫后3周脑内接种检验用强毒(实施例2制得的BYD-JXSP株BHK-21细胞培养第3代病毒液,其病毒滴度≥105.5TCID50/mL,0.1mL/只),继续观察14天,记录各组动物的反应,包括食欲、临床症状、剖检大体病理变化。对病死鸭和攻毒后第14天扑杀的试验鸭,用荧光RT-PCR方法检测脑和脾组织内的BYD-JXSP病毒。
6、攻毒试验结果
(1)攻毒对照鸭 攻毒后9/10只鸭发病,5/10只鸭死亡。
病鸭表现为:①临床观察见采食减少、缩脖、震颤、行走步态不正常、运动失调和瘫痪等;②大体剖检自然死亡鸭脾肿大、淤血,观察至14天扑杀鸭肉眼未见明显病变;③组织病理学观察可见脑小血管袖套样胶质细胞浸润、胶质细胞浸润灶等非化脓性脑炎变化。
对病死鸭和攻毒后14天扑杀的对照鸭,取脑和脾用荧光RT-PCR方法检测BYD病毒(JXSP株)均为阳性。详见表3。
表3 对照鸭攻毒试验结果表
(2)疫苗免疫鸭
三批灭活疫苗免疫组,大部分免疫鸭免疫后临床表现正常,每组有部分鸭在攻毒后4~8天可出现一过性减食、缩脖、摇晃等临床症状,免疫三组1只鸭于攻毒后第8天死亡,个别鸭可见共济失调。大体剖检未见异常,组织病理学观察偶见胶质细胞呈小灶性增生。脑和脾用荧光RT-PCR方法检测BYD病毒(JXSP株)三组仅4个样品为阳性。
结果见表4。
由实验结果可见,本发明实施例3制得的三批疫苗免疫鸭后,能够使鸭抵抗鸭BYD病毒的感染,没有引起不良反应,具有很好的保护效力。
表4 疫苗免疫组攻毒后结果汇总表
实施例6 疫苗免疫效果的综合检验
1、疫苗与实验动物
取实施例3制得的鸭BYD病毒灭活疫苗1批,批号为2011001。健康鸭由广东大华农动物保健品股份有限公司提供。
2、疫苗的安全性检验
5~7日龄健康鸭10只,每只颈部皮下注射疫苗1mL;注射后继续观察饲养14天,未见局部和全身不良反应,接种鸭采食正常。
3、效力检验
①疫苗免疫接种将疫苗接种5日龄健康鸭10只,每只颈部皮下注射疫苗0.5mL;同时设非免疫对照组鸭10只。
②攻毒保护试验 免疫后3周脑内接种检验用强毒(实施例2制得的BYD-JXSP株BHK-21细胞培养第3代病毒液,其病毒滴度≥105.5TCID50/mL,0.1mL/只),继续观察14天。4/10只鸭在免疫后3~8天出现一过性减食、缩脖、摇晃等临床症状,至攻毒后14天无死亡,全部存活。扑杀后大体剖检未见明显异常。脑和脾用荧光RT-PCR方法检测BYD病毒(JXSP株)0/10只和1/10只为阳性。
未免疫的对照鸭攻毒后9/10只鸭发病,5/10只鸭死亡。
病鸭表现为:①临床观察见采食减少、缩脖、震颤、行走步态不正常、运动失调和瘫痪等;②大体剖检自然死亡鸭脾肿大、淤血,观察至14天扑杀鸭肉眼未见明显病变;③组织病理学观察可见血管袖套样胶质细胞浸润、胶质细胞浸润灶等非化脓性脑炎变化。
对病死鸭和14天扑杀的对照鸭,脑和脾用荧光RT-PCR方法检测BYD病毒(JXSP株)8/10只和9/10只为阳性。详见表5。
表5 效力检验结果
4、确定鸭发病标准为
下列3项指标符合2项,可判定为发病鸭:
①死亡;
②临床观察见采食减少;出现缩脖、震颤、行走步态不正常、运动失调和瘫痪等神经症状;产蛋鸭产蛋数明显下降,甚至为0;
③8/10只以上脑和脾荧光RT-PCR检测BYD病毒阳性。
根据实验结果,可见本发明提供的BYD-JXSP病毒株具有良好的免疫原性,利用其制备的鸭BYD病毒灭活疫苗应用于鸭,能够有效帮助宿主鸭抵抗BYD病毒的感染,且安全性好,不会引起不良反应,可广泛应用于鸭BYD病毒的感染引起的鸭产蛋下降综合征的防控。