CN106310247B - 小鹅瘟灭活疫苗的制备方法及其制备的灭活疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种小鹅瘟灭活疫苗的生产方法，属于生物制品技术领域，所述方法包括：1)健康易感鹅胚的筛选，2)生产用毒液的制备，3)毒液效价的测定、灭活、配苗及分装。本发明制备的小鹅瘟灭活疫苗通过免疫种鹅，使种鹅在产蛋期内血清、种蛋卵黄小鹅瘟病毒特异性抗体处于较高水平，所孵化雏鹅出雏后既能通过吸收卵黄产生良好的被动免疫保护效果。本疫苗具有安全性高、可多次免疫、显著降低人力成本且不存在散毒的危害性等优点。

Description

小鹅瘟灭活疫苗的制备方法及其制备的灭活疫苗

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及小鹅瘟疫苗的制备方法及产品。

背景技术

小鹅瘟病毒(Gosling plague virus,GPV)，又称鹅细小病毒或Derzsy’s病原，它能够引起1月龄以内(以20日龄以内的为主)的雏鹅爆发急性、接触性、致死性的疾病。GPV属于细小病毒科，细小病毒属成员，其仅有一种血清型，但与番鸭细小病毒(Muscovy duckparvovirus,MDPV)具有部分相同的抗原。VP3基因编码GPV的主要结构性蛋白，可以刺激机体产生中和性抗体。我国学者方定一、王永坤等于1956年首次在江苏扬州发现该病毒，并将其命名为“小鹅瘟”。匈牙利学者德舍氏(Derzsy’s)于1966年首次使用鹅胚分离到该病毒，1974年，世界家禽协会将其正式命名为Derzsy’s病，随后GPV不断蔓延至中国台湾、匈牙利、英国、日本、泰国、德国、美国、瑞典和波兰等多个国家和地区。近些年，GPV仍在世界各国陆续的出现，该病毒的流行与感染给养鹅业、养番鸭业造成了很大的损失，严重威胁着水禽养殖业发展。

对于小鹅瘟的防制，目前各国均研制出相应的疫苗进行免疫预防，取得了一定的效果，但至今没能较好地控制小鹅瘟发生。国内商品化的小鹅瘟疫苗均为弱毒活疫苗(SYG61株或GD株)，小鹅瘟活疫苗免疫可能存在以下缺点：(1)由于GPV只能在鹅胚、番鸭胚、鹅成纤维细胞、番鸭成纤维细胞上繁殖，对鸡胚不易感，且用于小鹅瘟活疫苗生产的鹅胚等均不是SPF级，活疫苗中存在着有外源病毒污染的可能，免疫后，对鹅群有极大的外源毒感染风险。(2)小鹅瘟活疫苗免疫种鹅群后，由于机体排毒，给鹅场、孵化场带来二次污染，对鹅场的病毒净化不利。(3)雏鹅免疫活疫苗后，免疫期产生需约1周时间，而1周内雏鹅是感染GPV的高发日龄段，由于我国水禽饲养还处于开放式低水平阶段，如果此时免疫后隔离措施不到位，雏鹅极易在抗体产生前感染GPV，造成防疫失败。

1962年中国爆发鹅细小病毒，曾使用高免血清保护刚孵出的雏鹅，后来欧洲也广泛使用由高免鹅制备的血清进行抗血清治疗。目前，国内已有商品化小鹅瘟卵黄抗体出售，即雏鹅出雏后，3日龄内立即注射卵黄抗体，其原理是雏鹅在易感日龄段通过注射卵黄抗体获得被动免疫，起到预防GPV感染的作用。注射卵黄抗体的不足之处是：(1)雏鹅出雏后每只免疫，成本高且费时。(2)由于注射的卵黄抗体在雏鹅体内代谢较快，其被动免疫持续期保持较短，只能保护易感高发日龄段雏鹅，对雏鹅整个小鹅瘟感染日龄段不能达到全保护。

因此，如何提高该疫苗效力和安全性成为了当前首要的任务。灭活疫苗具有安全性高、可多次免疫、不存在散毒的危害性等特点，并可以通过免疫种鹅产生的母源抗体来保护其子代成为了本疫苗研发的主要依据。目前我国尚无商品化防控小鹅瘟病的灭活疫苗产品。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明是基于非免鹅胚扩繁种毒，经连续在线纯化、浓缩后低温乳化制备小鹅瘟灭活疫苗的方法，为小鹅瘟提供一种安全连续封闭式的制备方法，与传统生产工艺相比，灭活疫苗具有安全性高、疫苗中抗原含量高、可多次免疫、不存在散毒的危害性等特点。

本发明提供了一种小鹅瘟灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)筛选健康易感鹅胚；

2)生产用毒液的制备

毒种繁殖

将种毒稀释，接种于11日龄易感鹅胚的尿囊腔内，接种后每日照胚3～4次，选取48～120小时内死亡且病变明显的鹅胚，收获无菌且对1％鸡红细胞悬浮液凝集阴性的尿囊液样品。

接种

将上述尿囊液样品稀释，接种于11日龄易感鹅胚的尿囊腔，继续孵育，每日照蛋1次，将48小时内死亡的鹅胚弃去，然后每4～6小时照胚1次，随时取出48～144小时死亡的鹅胚，置于2～8℃冷藏库冷却4小时以上。

收获

将上述冷却的鹅胚取出，吸取尿囊液清亮的绒毛***及羊膜的胚液，经纯化、浓缩后病毒含量不低于10^8.0ELD₅₀/ml；最后经灭活、高速低温乳化及分装。

所述步骤1)均为11日龄易感鹅胚，通过对非免疫鹅胚卵黄中GPV琼扩抗体及接种前鹅胚内小鹅瘟病毒的检测来确保非免疫鹅胚的质量，并同时按照2010版的《中国兽药典》附录中关于外源毒检测的方法进行检测。

所述纯化步骤包括纯化浓缩中所使用的纯化设备为瑞典Alta Laval在线碟片式离心机，在线离心速度为5000～8000转/分钟。所使用的浓缩设备为美国PALL抗原浓缩机。

所述灭活方法为：将检验合格的病毒液缓慢加入经0.2M的NaOH环化后的BEI，使其终浓度达到0.1％，随即混匀并升温。当灭活罐中心温度达32℃后开始计时，以120转/分缓慢搅拌并持续灭活60小时。灭活完成后加入终浓度为2％的硫代硫酸钠终止灭活。

所述乳化的方法为：取3份油相放入乳化罐中，慢速搅拌的同时缓缓加入1份水相，加完后，搅拌混匀，然后使用德国IKA剪切机高速连续乳化，转速设定为2000～4000转/分钟，温度设定为10～20℃之间。

本发明的方法具有如下优点：相较于传统的活疫苗制备方法中增加了标准鹅胚的筛选环节、抗原连续在线纯化浓缩技术及高速低温乳化，有效地提高了病毒的繁殖效力及抗原损失，显著提升疫苗产品质量；疫苗经连续在线纯化和浓缩后杂蛋白含量显著减少，病毒含量明显提高；本疫苗为灭活疫苗，目前国内外均无该疫苗制备的标准方法及相关疫苗生产，具有安全性高且显著降低劳动力成本。

本发明的另一方面提供了根据上述方法制备的小鹅瘟灭活疫苗的产品，包括乳化后制得油包水剂型灭活疫苗。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

健康易感鹅胚的筛选

鉴于小鹅瘟病毒扩繁条件的局限性，仅能选择非免疫健康易感鹅胚作为制备种毒、生产种毒和生产毒液的繁殖载体。非免疫鹅胚的筛选及检测便成为了疫苗研发和生产的重要工作之一，本研究通过对非免疫鹅胚卵黄中GPV琼扩抗体及接种前鹅胚内小鹅瘟病毒的检测来确保非免疫鹅胚的质量，主要步骤包括小鹅瘟琼脂扩散试验抗原制造及质量标准、小鹅瘟琼脂扩散抗体的检测和小鹅瘟病毒抗原检测方法，并同时按照2010版的《中国兽药典》附录中关于外源毒检测的方法进行检测。

1小鹅瘟琼脂扩散试验抗原制造及质量标准

1.1抗原制造

1.1.1病毒繁殖取小鹅瘟病毒(TZ10株)生产用毒种，接种易感鹅胚，收获鹅胚液。

1.1.2病毒浓缩将收获的鹅胚液，经3000r/min离心30分钟，取上清液加入等量氯仿震荡30分钟，吸取上清液装入透析袋，置于盛有PEG6000的容器中，4℃浓缩至原体积的1/30～1/50倍，用适量灭菌生理盐水洗涤透析袋，制成20～30倍浓缩琼扩抗原，小量分装，-20℃以下冷冻保存。

1.2质量标准

本品系用小鹅瘟病毒(TZ10株)接种易感鹅胚培养，收获感染胚液，经浓缩后制成。

1.2.1性状淡黄色澄清液体。

1.2.2无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

1.2.3效价测定按现行《中国兽药典》附录测定ELD50，病毒含量应≥10^7.0ELD₅₀/0.2ml。

1.2.4特异性检验分别与小鹅瘟阳性血清、鸭肝炎病毒阳性血清、鸭瘟病毒阳性血清、H5亚型禽流感病毒阳性血清、H9禽流感病毒阳性血清、新城疫病毒阳性血清、减蛋综合征病毒阳性血清、及SPF鸡血清做琼扩试验，抗原对小鹅瘟阳性血清应为阳性，对鸭瘟等其它阳性血清及SPF鸡血清应为阴性。

1.2.5作用与用途用于检测小鹅瘟病毒抗体的琼脂扩散试验。

1.2.6规格1ml/瓶

1.2.7贮藏-20℃以下保存，有效期为12个月。

2小鹅瘟琼脂扩散试验操作

2.1待检样品处理

2.1.1待检卵黄用5％碘酒消毒待检鹅蛋(或鸡蛋)，用无菌方法吸取1ml卵黄至灭菌小青瓶中，加入等量灭菌生理盐水充分混匀，即为1:1稀释的卵黄液，再进行倍比稀释，取适当稀释度，用于琼扩检测。

2.1.2待检血清采集鹅血(或鸡血)，用3000r/min离心10min，分离血清，立即实验或冷冻保存。

2.2琼扩板制备取优质琼脂粉0.8g，加入pH7.8的8％NaCl溶液100ml，标记刻度，加热使琼脂完全溶解，补纯水至刻度线，待琼脂冷却至60℃左右，制成3～3.5mm厚的平板，完全冷却后，冷藏密封保存。

2.3琼脂扩散试验操作步骤

2.3.1打孔将制备好的琼脂板按模板用打孔器打孔，挑出孔中琼脂，用烧热的针沿孔壁转一圈熔化孔中琼脂补孔底。一组琼脂孔为，中心1孔、周围6孔、孔径3mm、孔距4mm。

2.3.2加样中央孔加入检验合格的琼扩抗原，周围6孔中的第1～5孔依次加入待检稀释度血清(或卵黄)，第6孔加标准阳性血清。各孔均以加满而不溢出为度。

2.3.3孵育将加样后的琼脂板放入湿盒内，置37℃温箱，24～96小时观察琼扩线。

2.4结果判定

2.4.1琼扩阳性或阴性判定当标准阳性血清孔与抗原孔之间出现清晰沉淀线时，被检血清(或卵黄)孔与抗原孔之间也出现沉淀线，且与标准阳性血清沉淀末端相吻合，即被检血清(或卵黄)，判为阳性；被检血清(或卵黄)孔与抗原孔之间未出现沉淀线，判为阴性。

2.4.2琼扩抗体效价判定当被检血清(或卵黄)最高稀释倍数孔与抗原孔之间形成清晰沉淀线时，该稀释度判即为被检血清(或卵黄)琼扩抗体效价。

3小鹅瘟病毒抗原检测方法

3.1材料与准备

3.1.1病料取适量病料组织与双抗磷酸盐缓冲液(PBS)按1:3质量比进行混合后研磨，将研磨后的病料经2次冻融后12000转/分钟离心5分钟，取上清进行检测。

3.1.2胚体挑取胚体于灭菌容器中(谨防卵黄破裂)，胚体用组织捣碎机以8000～10000转/分、研磨5～10分钟，制成组织匀浆。将胚体组织匀浆液于-20℃冻融2次，用灭菌的1层100目铜网与4层纱布进行过滤，弃胚渣，取胚体组织滤液进行检测。

3.1.3引物设计合成检测引物：P1，5′-CCAAGCTACAACAACCACAT-3′；P2：5′-TGAGCGAACATGCTATGGAAGG-3′，扩增目的片段大小为539bp。

3.1.4 10％SDS称取10g SDS溶于80ml的去离子水中，定容至100ml，室温保存。

3.1.5蛋白酶K(20mg/ml)的配制可溶性的蛋白酶K粉剂以20mg/ml的浓度溶解在50mol/L Tris-Cl(pH8.0)和1.5mol/L EDTA中，分装后-20℃保存。

3.1.6 RTE缓冲液按照以下浓度配制TE缓冲液，10mM Tris-HCl，pH 8.0；1mMEDTA，pH 8.0，然后按照20μg/ml的终浓度加入Rnase A。

3.2方法

3.2.1待检样品DNA提取取待检样品500μl，加入92μl 10％SDS，8μl蛋白酶K(20mg/ml)，混匀后55℃作用30分钟。再加入等体积的酚:氯仿(1:1)，剧烈震荡混匀，以12000转/分钟离心10分钟，取400μl上清液，加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，-20℃放置20分钟后，以12000转/分钟离心10分钟。弃上清，在加入800μl 70％的乙醇洗涤，弃掉乙醇，吹干，加入30μl RTE缓冲液，37℃水浴15min溶解DNA，立即使用或保存在-20℃保存备用。同时分别设阳性和阴性对照样品，以同样的方法提取DNA。

3.2.2 PCR扩增按照以下体积配制反应体系：

PCR反应程序：94℃预变性3min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃再延伸10min，12℃保存。

3.2.3电泳将PCR扩增产物以1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测，在凝胶成像***下观察结果。

3.3结果判定当阳性对照样品扩增出539bp的条带，阴性对照样品无特异性的条带出现时，结果成立。当被检样品扩增出539bp条带时即为小鹅瘟病毒阳性，无条带时为阴性。

实施例2

病毒接种及培养制备病毒液

毒种繁殖

将种毒用灭菌生理盐水进行1:100倍稀释，尿囊腔内接种11日龄易感鹅胚，每胚0.2ml，接种后每日照胚3～4次，选取48～120小时内死亡且病变明显的鹅胚，分别收获尿囊液，置于灭菌容器内。将经无菌检验合格，且对1％鸡红细胞悬浮液凝集阴性的样品定量分装，注明收获日期、种毒代次等信息，冷冻保存。

接种

将生产用毒种用灭菌生理盐水进行1:100倍稀释，尿囊腔内接种11日龄易感鹅胚，每胚0.2ml，石蜡封孔，置38℃继续孵育，不必翻蛋。

孵育和观察

接种后48小时内，每日照蛋1次，将48小时内死亡的鹅胚弃去。此后，每4～6小时照胚1次，随时取出48～144小时死亡的鹅胚，置2～8℃冷藏库，气室向上直立，冷却4小时以上。弃去144小时以后的活鹅胚。

收获

将冷却的鹅胚取出，消毒气室部位，无菌剥除气室部卵壳，揭去壳膜，挑破绒毛***及羊膜(谨防卵黄破裂)，吸取胚液，吸取胚液前均应注意检查每个鹅胚的尿囊液及胚体，观察尿囊液是否清亮，如果出现尿囊液浑浊、异味、散黄、胚胎腐败等现象则弃去。每若干鹅胚分为一组，吸取胚液放于同一灭菌容器中，分别取样，-20℃以下保存备用；同时挑取胚体于另一灭菌容器中(谨防卵黄破裂)，胚体用组织捣碎机8000～10000转/分、研磨10～20分钟，制成组织匀浆液，置-20℃冻融2次，用灭菌的4层纱布和1层80目铜网进行过滤，弃胚渣，将胚体组织滤液取样，-20℃以下保存备用。病毒液-20℃保存应不超过6个月。

实施例3

病毒液的纯化、浓缩及疫苗制备

1病毒液的纯化

经检验合格的病毒液通过无菌管道传送至Alta Laval在线碟片式离心机，经连续在线离心后，获得纯化后的病毒液。

2病毒液的浓缩

病毒经纯化后通过无菌管道传送至PALL浓缩机进行浓缩，根据浓缩前病毒含量确定的浓缩倍数进行浓缩，使浓缩后病毒液中每毫升中病毒含量不低于10^8.0ELD₅₀。

3病毒液灭活及制备成疫苗产品

3.1病毒液灭活：

将检验合格的抗原混合液用灭菌的4层纱布和1层80目铜网进行过滤，置灭活罐中，加入经0.2M NaOH环化的BEI，使其终浓度达到0.1％，边加边搅拌，充分混合，当灭活罐中心温度升至32℃后开始计时，以120转/分灭活60小时，灭活后以终浓度为2％的硫代硫酸钠进行终止，置2～8℃保存备用，应不超过3个月。

3.2油佐剂灭活疫苗的制备：

取注射用白油94份，加硬脂酸铝1份，边加入边搅匀，直到完全透明为止，再加入6份司本-80，混合后，高压灭菌备用。取灭活的制苗用病毒液96份，加入4份灭菌的吐温-80，充分摇匀，直至吐温-80完全溶解。取3份油相放入乳化罐中，慢速搅拌的同时缓缓加入1份水相，加完后，中速搅拌，然后经IKA连续的高速低温乳化，制成小鹅瘟灭活疫苗。

实验例4

本实验例说明得到的疫苗产品的安全试验及免疫效力。

一、疫苗安全性试验

小鹅瘟油乳剂灭活疫苗(TZ10株)，批号分别为TZ-001、TZ-002、TZ-003共3批，均由我公司研发中心实验室制备。小鹅瘟琼扩抗体阴性的1月龄鹅、7月龄开产种鹅、9月龄产蛋种鹅，均购自高邮市心连心鹅业合作社。

1试验方法

1.1单剂量一次接种的安全实验

每批疫苗分别选取3-5日龄雏鹅10只、1月龄鹅10只、7月开产种鹅10只、9月龄产蛋种鹅10只，雏鹅每只胸部肌肉注射0.2ml，其余鹅每只胸部肌肉注射疫苗1.0ml，每组均另取10只相同来源、相同日龄的鹅，作为非免疫对照组。注射后连续观察21日，每日观察各组鹅精神状况、饮水、进食量等情况；免疫后7日、14日、21日触摸检查各免疫组鹅注射部位，检查是否有红肿等局部注射反应；免疫前与免疫后21日称重，比较免疫组与非免疫对照组鹅平均增重是否有差异(用SPSS软件比较)；产蛋种鹅免疫组与非免疫组免疫后21日产蛋率是否有差异；分别任取每批次疫苗免疫后21日种鹅所产鹅胚20枚，做好标记，比较鹅胚孵化率是否有差异；剖杀所有鹅，检查注射部位疫苗吸收情况、是否有病理变化；每组随机筛选10只雏鹅称重后饲养至1月龄，统计成活率及相对日增重，比较免疫组与对照组雏鹅成活率及平均相对日增重的差异。

1.2单剂量重复接种安全实验

每批疫苗分别选取3-5日龄雏鹅10只、1月龄鹅10只、7月开产种鹅10只、9月龄产蛋种鹅10只，雏鹅每只胸部肌肉注射0.2ml，其余鹅每只胸部肌肉注射疫苗1.0ml，第一次接种后14日，每组以相同方法、相同剂量再接种一次，每组均另取10只相同来源、相同日龄的鹅，作为非免疫对照组。第二次注射后连续观察21日，每日观察各组鹅精神状况、饮水、进食量等情况；第二次免疫后7日、14日、21日触摸检查各免疫组鹅注射部位，检查是否有红肿等局部注射反应；免疫前与第二次免疫后21日称重，比较免疫组与非免疫对照组鹅平均增重是否有差异(用SPSS软件比较)；产蛋种鹅免疫组与非免疫组产蛋率是否有差异；分别任取每批次疫苗免疫后21日种鹅所产鹅胚20枚，做好标记，比较鹅胚孵化率是否有差异；剖杀所有鹅，检查注射部位疫苗吸收情况、是否有病理变化；每组随机筛选10只雏鹅称重后饲养至1月龄，统计成活率及相对日增重，比较免疫组与对照组雏鹅成活率及平均相对日增重的差异。

1.3双倍剂量一次接种的安全实验

每批疫苗分别选取3～5日龄雏鹅10只、1月龄鹅10只、7月开产种鹅10只、9月龄产蛋种鹅10只，3～5日龄雏鹅每只胸部肌肉注射0.4ml(按照相对体重进行免疫剂量调整)，其余鹅每只胸部肌肉注射疫苗2.0ml，每组均另取10只相同来源、相同日龄的鹅，作为非免疫对照组。注射后连续观察21日，每日观察各组鹅精神状况、饮水、进食量等情况；免疫后7日、14日、21日触摸检查各免疫组鹅注射部位，检查是否有红肿等局部注射反应；免疫前与免疫后21日称重，比较免疫组与非免疫对照组鹅平均增重是否有差异(用SPSS软件比较)；产蛋种鹅免疫组与非免疫组产蛋率是否有差异；分别任取每批次疫苗免疫后21日种鹅所产鹅胚20枚，做好标记，比较鹅胚孵化率是否有差异；剖杀所有鹅，检查注射部位疫苗吸收情况、是否有病理变化；每组随机筛选10只雏鹅称重后饲养至1月龄，统计成活率及相对日增重，比较免疫组与对照组雏鹅成活率及平均相对日增重的差异。

2实验结果

2.1单剂量一次性接种的安全实验

3批疫苗每批分别单剂量一次性接种不同年龄段鹅，连续饲养观察21日，所有免疫组鹅，精神状态正常，采食和饮水正常，未出现任何全身不良反应。在免疫后7日、14日和21日，用手触摸接种部位，均未发现肿胀。免疫后21日，剖检注射部位均无疫苗颗粒存在，所有免疫鹅注射部位局部均无水肿、渗出、出血。免疫组与非免疫组鹅平均日增重用SPSS软件比较，没有明显差异。9月龄产蛋种鹅接种后，各免疫组在疫苗免疫后1周内种鹅产蛋数较非免疫组少2～3枚，随后逐渐恢复正常，免疫后21日各免疫组种鹅产蛋数与非免疫组比较无显著差异(见表1)。种鹅所产鹅胚每组20枚，三批次疫苗免疫组分别孵出17、16、17只雏鹅，非免疫对照组孵出17只雏鹅，免疫组与非免疫组雏鹅孵化率均在80％～85％，无差异。

表1单剂量一次性接种主动免疫种鹅安全实验

2.2单剂量重复接种安全实验

3批疫苗每批分别单剂量重复接种3～5日龄、1月龄、7月龄、9月龄种鹅，所有免疫组鹅，精神状态正常，采食和饮水正常，未出现任何全身不良反应。在免疫后7日、14日和21日，用手触摸接种部位，均未发现肿胀。免疫后21日剖检注射部位，均无疫苗颗粒存在，所有免疫鹅注射部位局部均无水肿、渗出、出血。免疫组与非免疫组鹅平均日增重用SPSS软件比较，没有明显差异。9月龄产蛋种鹅接种后，各免疫组在疫苗免疫后1周内种鹅产蛋数较非免疫组少2～3枚，随后逐渐恢复正常，免疫后21日各免疫组种鹅产蛋数与非免疫组比较无显著差异(见表2)。种鹅所产鹅胚每组20枚，三批次疫苗免疫组分别孵出18、17、17只雏鹅，非免疫对照组孵出17只雏鹅，免疫组与非免疫组雏鹅孵化率均在85％～90％，无差异；雏鹅孵出均隔离观察5日，被动免疫组与对照组雏鹅精神、采食、饮水均正常，无差异。

表2单剂量重复接种安全实验

2.3双倍剂量接种安全实验

3批疫苗每批分别按照0.4ml/只接种3～5日龄雏鹅，按照双倍剂量接种1月龄、7月龄、9月龄种鹅，所有免疫组鹅，精神状态正常，采食和饮水正常，未出现任何全身不良反应。在免疫后7日、14日和21日，用手触摸接种部位，均未发现肿胀。免疫后21日剖检注射部位，3批次疫苗免疫1、7、9月龄种鹅均有1～3只接种部位延肌纤维走向有少量乳黄色疫苗颗粒未吸收，其他种鹅接种部位均无疫苗颗粒存在，所有免疫鹅注射部位局部均无水肿、渗出、出血。免疫组与非免疫组鹅平均日增重用SPSS软件比较，没有明显差异。9月龄产蛋种鹅接种后，各免疫组在疫苗免疫后1周内种鹅产蛋数较非免疫组少2～3枚，随后逐渐恢复正常，免疫后21日各免疫组种鹅产蛋数与非免疫组比较无显著差异(见表3)。种鹅所产鹅胚每组20枚，三批次疫苗免疫组分别孵出17、18、17只雏鹅，非免疫对照组孵出17只雏鹅，免疫组与非免疫组雏鹅孵化率均在85％～90％，无差异；雏鹅孵出均隔离观察5日，被动免疫组与对照组雏鹅精神、采食、饮水均正常，无差异。

表3双倍剂量重复接种安全实验

上述结果表明，用GPV3毒株最高允许的生产种毒代次F25代，生产的3批次小鹅瘟灭活疫苗(TZ10株)对种鹅是安全的，免疫后不引起种鹅任何全身和局部不良反应，均不影响种鹅的生产性能，表明采用该疫苗生产工艺在实验室制备的疫苗能够达到对鹅的安全性要求。根据上述实验结果暂定该疫苗的安全性实验规程为：用1月龄左右小鹅瘟琼扩抗体阴性的健康鹅10只，每只各胸部肌肉注射疫苗2ml，观察21日，应不出现因注射疫苗引起的局部和全身不良反应。

二、疫苗效力实验

小鹅瘟油乳剂灭活疫苗(TZ10株)，批号分别为TZ-001、TZ-002、TZ-003共3批，均由我公司研发中心实验室制备。小鹅瘟琼扩抗体阴性8月龄健康开产种鹅，均购自高邮市心连心鹅业合作社。小鹅瘟病毒TZ10株F3病毒液(病毒含量104.83ELD50/0.2ml)，由公司研发中心实验室制备。小鹅瘟琼扩抗原、阳性血清均由公司研发中心制备。

1实验方法

1.1分组与免疫选取8月龄健康开产种鹅80只(小鹅瘟琼扩抗体阴性)，随机分成4组，每组20只。任选三组分别免疫TZ-001、TZ-002、TZ-003批次疫苗，胸部肌肉注射1ml/只，剩余一组为非免疫对照组，各实验组鹅分别做好标记。

1.2 GPV琼扩抗体检测

1.2.1种鹅血清GPV琼扩抗体检测

各实验组鹅自疫苗免疫后每周逐只采血至免疫后28日，分离血清，用灭菌生理盐水进行倍比稀释，按照小鹅瘟灭活疫苗(TZ10株)质量标准中附注2的方法检测GPV琼扩抗体。

1.2.2鹅蛋卵黄GPV琼扩抗体检测

每组分别任取免疫后4～5周内种鹅所产鹅蛋10枚(连同对照组)，每枚蛋分别取卵黄1ml，加入等量灭菌生理盐水混匀，取50μl于96孔稀释板上进行倍比稀释，按照小鹅瘟灭活疫苗(TZ10株)质量标准中附注2的方法检测GPV琼扩抗体。

1.2.3 3日龄雏鹅被动免疫攻毒实验

每组分别任取免疫后4～5周内种鹅所产鹅蛋20枚(连同对照组)，做好标记，置38℃孵化箱孵化29～30日，将每组刚孵出的雏鹅任选10只戴上脚标，置于攻毒区隔离器中饲养3日，每组雏鹅逐只采血，分离血清，检测GPV琼扩抗体。同时进行攻毒实验，用GPV-TZ10F3攻毒株(每毫升尿囊液病毒含量104.83ELD50/0.2ml)，每只雏鹅口服0.5ml，颈部皮下注射0.5ml，免疫组与对照组分别隔离饲养14日，每日观察记录雏鹅临床症状。攻毒后14日，被动免疫攻毒组每组应至少8只雏鹅健活，非被动免疫攻毒组应至少8只雏鹅发病死亡，剖检可见典型小鹅瘟肠道病变。

2实验结果

2.1种鹅血清GPV琼扩抗体检测

每批次疫苗免疫后1周，每组20只种鹅分别有7～11只血清原液出现琼扩沉淀线；首免后2周每组20只种鹅分别有16～17只血清出现琼扩沉淀线，琼扩抗体效价在20～22，3批次疫苗免疫组GPV琼扩抗体几何平均值在0.7log2～1.0log2；免疫后3周每组20只种鹅血清均出现琼扩沉淀线，琼扩抗体效价在21～24,3批次疫苗免疫组GPV琼扩抗体几何平均值在2.2log2～2.6log2；免疫后4周每组20只种鹅血清琼扩抗体效价均在22～25,3批次疫苗免疫组GPV琼扩抗体几何平均值在3.3log2～3.6log2；非免疫对照组20只种鹅血清GPV琼扩抗体均为阴性，结果见表4。

表4种鹅血清GPV琼扩抗体效价

注：“+”表示血清原液出现琼扩沉淀线，“-”表示未出现琼扩沉淀线，“/”表示平均值太小，不计算。

2.2鹅蛋卵黄GPV琼扩抗体检测

每批次疫苗免疫组免疫后3～4周内任取10枚鹅蛋，其卵黄GPV琼扩抗体均为阳性，效价在22～24，非免疫对照组10枚鹅蛋卵黄GPV琼扩抗体均为阴性，结果见表5。

表5免疫后3～4周内鹅蛋卵黄GPA琼扩抗体效价

2.3 3日龄雏鹅被动免疫攻毒实验

2.3.1 3日龄雏鹅血清GPV琼扩抗体检测

3批疫苗被动免疫组每组10只雏鹅血清均GPV琼扩抗体阳性，效价在22～24，结果见表6。

表6日龄雏被动免疫血清GPV琼扩抗体效价

2.3.2 3日龄雏鹅被动免疫攻毒实验

3批疫苗被动免疫组每组10只雏鹅攻毒后采食、饮水、精神状态均正常，无小鹅瘟临床症状发生，攻毒后14日每组均10/10健活。非被动免疫对照组雏鹅攻毒后第3日精神开始出现精神萎靡、卧地聚堆、站立不稳、采食、饮水开始减少，排稀灰白色或黄绿色粪便，攻毒后第5日出现死亡，至攻毒后10日共死亡9只雏鹅。每只病死鹅剖检，心、肝、脾等实质性器官肉眼病变不明显，脑壳均充血、出血，尤其小脑部显著，肠道小肠段有部分肠管外观较正常肠道粗大，质地较硬，剖开可见小鹅瘟典型的淡灰或淡黄色纤维素性样栓塞，易于剥离，肠粘膜光滑，栓子切面层层纤维素性渗出物与坏死物凝固而成的假膜。被动免疫攻毒保护结果见表7。

表7雏鹅被动免疫攻毒实验结果

上述实验结果证明，3批次疫苗对种鹅均具有很好的免疫效果，使雏鹅出雏时血清中即含有较高水平的GPV抗体，可以有效的抵抗小鹅瘟病毒攻击。

Claims (2)

1.一种小鹅瘟灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)筛选健康易感鹅胚

筛选11日龄易感鹅胚，通过对非免疫鹅胚卵黄中GPV琼扩抗体和/或接种前鹅胚内小鹅瘟病毒的检测来确保非免疫鹅胚的质量，主要步骤包括小鹅瘟琼脂扩散试验抗原制造及质量标准、小鹅瘟琼脂扩散抗体的检测和小鹅瘟病毒抗原检测方法，并同时按照2010版的《中国兽药典》附录中关于外源毒检测的方法进行检测；

2)生产用毒液的制备

毒种繁殖

将种毒稀释，接种于11日龄易感鹅胚的尿囊腔内，接种后每日照胚3～4次，选取48～120小时内死亡且病变明显的鹅胚，收获无菌且对1％鸡红细胞悬浮液凝集阴性的尿囊液样品；

接种

将上述尿囊液样品稀释，接种于11日龄易感鹅胚的尿囊腔，继续孵育，每日照蛋1次，将48小时内死亡的鹅胚弃去，然后每4～6小时照胚1次，随时取出48～144小时死亡的鹅胚，置于2～8℃冷藏库冷却4小时以上，弃去144小时以后的活鹅胚；

收获

将上述冷却的鹅胚取出，吸取尿囊液清亮的绒毛***及羊膜的胚液，吸取胚液放于灭菌容器中，分别取样，-20℃以下保存备用；同时挑取胚体于另一灭菌容器中，胚体用组织捣碎机8000～10000转/分、研磨10～20分钟，制成组织匀浆液，置于-20℃冻融2次，用灭菌的4层纱布和1层80目铜网进行过滤，弃胚渣，将胚体组织滤液取样，-20℃以下保存备用；

纯化

经检验合格的病毒液通过无菌管道传送至Alta Laval在线碟片式离心机，经连续在线离心后，在线离心速度为5000～8000转/分钟，获得纯化后的病毒液；

浓缩

病毒经纯化后通过无菌管道传送至PALL浓缩机进行浓缩，根据浓缩前病毒含量确定的浓缩倍数进行浓缩，使浓缩后病毒液中每毫升中病毒含量不低于10^8.0ELD₅₀；

灭活

将检验合格的抗原混合液用灭菌的4层纱布和1层80目铜网进行过滤，置灭活罐中，加入经0.2M NaOH环化的BEI，使其终浓度达到0.1％，边加边搅拌，充分混合，当灭活罐中心温度升至32℃后开始计时，以120转/分灭活60小时，灭活后以终浓度为2％的硫代硫酸钠进行终止，置2～8℃保存备用，应不超过3个月；

成型

取注射用白油94份，加硬脂酸铝1份，边加入边搅匀，直到完全透明为止，再加入6份司本-80，混合后，高压灭菌备用；取灭活的制苗用病毒液96份，加入4份灭菌的吐温-80，充分摇匀，直至吐温-80完全溶解；取3份油相放入乳化罐中，慢速搅拌的同时缓缓加入1份水相，加完后，中速搅拌，然后经剪切机连续的高速低温乳化，温度设定为10～20℃之间，制成小鹅瘟灭活疫苗。

2.根据权利要求1所述的小鹅瘟灭活疫苗的制备方法所制得的疫苗产品。