CN102523782A - 一种双重荧光防伪丸化种子的制备方法及防伪种子和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种双重荧光防伪丸化种子的制备方法，该方法是在裸种上先喷施第一荧光色剂的溶液并包被第一种衣剂，再喷施粘合剂并包被一层第一种衣剂，然后将第二种衣剂与一定量第二荧光色剂的粉剂相混合后包被丸状种子。该方法获得的防伪种子具有三层结构。本发明还提出了利用两种波长的激发光照射裂解后的丸化种子和早期幼苗的检测方法。本发明的优点在于在不改变种子原有丸化工艺流程的基础上进行简单调整，无需设备的更新，防伪成本低廉。这种具有双重荧光防伪功能的丸化种子与普通丸化种子在外观上无差异，只有在特定的检测步骤和检测光下才会显示出荧光特性。本方法为种子产业提供了更为完善的防伪技术。

Description

一种双重荧光防伪丸化种子的制备方法及防伪种子和检测方法

背景技术

本发明涉及防伪技术，具体的说涉及一种双重荧光防伪丸化种子的制备方法，还涉及该方法获得的防伪种子以及鉴别防伪种子的方法。

技术领域

种子在国民经济中占有重要地位，但种子经常面临被不法分子假冒的状况，这给农业生产和农民带来极大危害。关于种子防伪，目前业界普遍使用的都是防伪包装技术。种子包装是种子销售的直接载体，所以种子包装防伪也自然成为种子企业打击假冒伪劣、维护种子市场正常秩序、保护自身利益及合法权益的较为直接、有效的解决办法。但包装行业的鱼目混珠以及防伪产品本身的混乱，使得种子企业防不胜防，也让普通百姓真假难辨。而针对种子本身的防伪技术还较少见报道。

目前种子丸粒化已经是种业界普遍应用的技术，尤其是小粒和极小粒种子，其丸粒化加工工艺已日趋成熟，生产上也大都采用其丸粒化种子进行播种。

关于种子的防伪技术，中国专利CN101403694A公开了一种用于包衣种子的荧光防伪和检测方法。包括如下步骤：1)将一种紫外发亮黄荧光的色剂加入到溶剂中，浓度为0.5～3mg/ml，将搅拌器转速调至400～600转/分，搅拌直至成均一溶液，溶剂为PH值在7.2～8.0的磷酸缓冲液；2)将步骤1)所得溶液替代种子内层包衣时所用的清水，在内层包衣时多次喷施；3)种子包衣的其他工艺流程不变。

中国专利CN101971727A公开了一种具有防伪功能的包衣种子的制备和辨别方法。该方法是将荧光色剂与溶剂按照所述的工艺制成一定浓度的均一荧光溶液，然后在内层粉剂包衣时用荧光溶液进行喷施，按常规方法进行种子包衣处理，得到具有防伪功能的包衣种子。该专利申请进一步公开了采用的荧光色剂是荧光素。

荧光素是无毒安全的荧光色剂。在医学以及动物的健康检测方面荧光素已被广泛利用，在植物上也有报道证明荧光素可提高植株根的生长性能，促进植物的生长发育。而植物的生长起源于种子，对植物生长有促进作用本身就已说明荧光素对种子是无毒害的。同时，种子活力是种子品质的重要指标，某种化合物对种子活力影响效果的评价，通常根据种子发芽和幼苗生长情况来判断，通过测定播种后种子的发芽率、发芽势、发芽指数以及幼苗根长、苗高等指标来说明种子活力的高低。荧光素可提高植株根的生长性能，促进植物的生长发育，由此说明其对种子的发芽和幼苗根的生长、以及植株整个幼苗期的生长也是有促进作用的。

但是，现有的荧光防伪方法属于单一防伪，它的缺点在于在进行种子丸粒化时只添加了一种荧光物质，检测方法单一，防伪的安全性较低，且只能在种子裂解时进行防伪检测，对幼苗无法进行防伪。

而本发明则是针对丸化种子单一荧光防伪方法存在的问题，将荧光双重防伪和丸粒化相结合，并且将两种不同的荧光材料应用于种子丸粒化过程中，在确保荧光材料以及处理方式对种子发芽及幼苗生长无毒害作用的同时，又可最大限度的避免包装材料防伪的高成本以及单一防伪安全性较低的缺陷，同时，在幼苗阶段也具防伪的作用。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种双重荧光防伪丸化种子的制备方法，在保证种子活性的情况下，解决了市场上种子的假冒伪劣问题。该防伪方法简便易于操作，防伪成本低，使丸化种子的防伪功能增强，从而更大程度的保护了广大农户与种子公司的利益。

一种双重荧光防伪丸化种子的制备方法，包括如下步骤：

1、造粒：将一定质量的裸种倒入包衣机，喷雾第一荧光色剂制备的溶液湿润裸种表面，加入质量为3.5％-5.0％裸种质量的第一种衣剂，不断搅拌，使之包裹于裸种表面，重复以上步骤3-5次，形成微小丸状；然后每次加入20％-50％裸种质量的第一种衣剂并重复数次，期间不断喷雾粘合剂并搅拌；

2、丸化：将7-43倍裸种质量的第二种衣剂与5％-15％裸种质量的第二荧光色剂的粉剂混合均匀后得到混合物；然后多次加入裸种质量20％-50％的混合物到上个步骤形成的丸状种子，期间不断喷雾粘合剂并搅拌，然后筛选、抛光、上色、干燥，得到包衣完毕的种子。

其中，所述的第一荧光色剂是罗丹明B，所述的第二荧光色剂是荧光素。

其中，种衣剂可选自粘土、硅藻土，泥炭、云母、蛭石，珍珠岩、活性炭、磷矿粉、膨润土及滑石粉中的一种或几种的混合。所述的第一种衣剂选自膨润土。所述的第二种衣剂选自滑石粉。所述的粘合剂是选自高分子聚合物形成的溶液，高分子聚合物包括***树胶，淀粉、羧甲基纤维素、甲基纤维素，乙基纤维素，聚乙烯醋酸纤维(盐)、藻朊酸钠、聚偏二氯乙烯、聚乙烯氧化物、聚乙烯醇等，优选羧甲基纤维素。所述的粘合剂优选羧甲基纤维素的水溶液，其浓度为0.5％-3％(重量百分比)。

其中，所述的种子为适合丸化的蔬菜、花卉、牧草、经济作物等植物种子，蔬菜种子譬如花椰菜、甘蓝、油菜等，花卉种子譬如海棠、矮牵牛等，牧草种子譬如紫花苜蓿、披碱草等，经济作物如烟草、芝麻等。

其中，所述种子优选为在实际生产中需要经过丸粒化处理小粒和极小粒的种子，进一步优选千粒重小于5g的种子，特别优选千粒重在0.05-0.5g的极小粒种子。

其中，在造粒步骤中，加入第一荧光色剂的总质量优选为裸种质量的0.45％-0.75％。

其中，在丸化步骤中，加入第二荧光色剂的总质量优选为裸种质量的5％或10％或15％，最优选10％。

其中，当种子为千粒重在0.05-0.5g的极小粒种子时，在造粒步骤中加入的第一种衣剂质量总计为裸种质量的6-9倍，优选7.5倍。

其中，当种子为千粒重在0.05-0.5g的极小粒种子时，在丸化步骤中加入的第二种衣剂质量总计为裸种质量的35-43倍，优选42倍。

其中，在造粒步骤结束时，极小粒丸化种子的粒径为1.00mm-1.25mm，在丸化步骤结束时，极小粒丸化种子的粒径为1.60mm-1.80mm。

本发明的另一目的是提供一种双重荧光防伪种子，其中，以裸种为核心覆盖有三层结构，包裹裸种的第一层结构包括第一种衣剂和第一荧光色剂，包裹第一层结构的第二层结构包括第一种衣剂，包裹第二层结构的第三层结构包括第二种衣剂与第二荧光色剂。

其中，所述的第一荧光色剂是罗丹明B，所述的第二荧光色剂是荧光素。

其中，种衣剂可选自粘土、硅藻土，泥炭、云母、蛭石，珍珠岩、活性炭、磷矿粉、膨润土及滑石粉中的一种或几种的混合。所述的第一种衣剂选自膨润土。所述的第二种衣剂选自滑石粉。所述的粘合剂是选自高分子聚合物形成的溶液，高分子聚合物包括***树胶，淀粉、羧甲基纤维素、甲基纤维素，乙基纤维素，聚乙烯醋酸纤维(盐)、藻朊酸钠、聚偏二氯乙烯、聚乙烯氧化物、聚乙烯醇等，优选羧甲基纤维素溶液。所述的粘合剂优选羧甲基纤维素的水溶液，其浓度为0.5％-3％(重量百分比)。

其中，所述第一层结构中，第一荧光色剂的含量为裸种质量的0.45％-0.75％。

其中，所述第三层结构中，第二荧光色剂的含量为裸种质量的5％-15％，优选5％或10％或15％，最优选10％。

其中，当种子为千粒重在0.05-0.5g的极小粒种子时，所述第一种衣剂质量总计为裸种质量的6-9倍，优选7.5倍。

其中，当种子为千粒重在0.05-0.5g的极小粒种子时，所述第二种衣剂质量总计为裸种质量的35-43倍，优选42倍。

其中，当种子为千粒重在0.05-0.5g的极小粒种子时，在造粒步骤结束时，丸化种子的粒径为1.00mm-1.25mm，在丸化步骤结束时，丸化种子的粒径为1.60mm-1.80mm。

本发明的又一目的是提供一种快速检测双重荧光防伪种子的方法，该方法包括如下步骤：

首先将丸化种子放置在载玻片上，加水使其裂解，用波长范围480nm～500nm的蓝光照射加水裂解的丸化种子，若在照射下丸化种子内部显示明亮的绿色荧光则继而用波长范围520nm～540nm的绿光照射裂解的丸化种子，若在照射下丸化种子内部显示明亮的红色荧光，则所述的丸化种子是双重荧光防伪种子。

本发明还提供一种快速检测双重荧光防伪种子的方法，该方法包括如下步骤：

将丸化种子萌发，用波长范围480nm～500nm的蓝光照射早期幼苗，若在照射下幼苗能够显示明亮的黄绿色荧光，则继而用波长范围520nm～540nm的绿光照射，若幼苗在照射下显示明亮的红色荧光，则所述的丸化种子是双重荧光防伪种子。

其中，将烟草丸化种子萌发，用波长范围480nm～500nm的蓝光照射早期幼苗两片子叶，若在子叶尖端和茎生长点显示明亮的黄绿色荧光，则继而用波长范围520nm～540nm的绿光照射，若子叶叶脉在照射下显示明亮的红色荧光，则所述的丸化种子是双重荧光防伪种子。

其中，用蓝光照射和用绿光照射的步骤并无严格的先后之分。

本发明的优点在于：操作简单方便，在不改变种子原有丸化工艺流程的基础上进行简单调整，无需设备等的更新，成本低廉。这种具有双重荧光防伪功能的丸化种子与普通丸化种子在外观上无差异，只有在特定的检测步骤和检测光的照射下才会显示出双重荧光特性。且因为可在早期幼苗中检测到防伪标记，因此若农户实施播种后出现问题，可以取田间幼苗进行检测，辨别真假，较大程度的提高了防伪的时效性。本方法为种子产业提供了更为完善的防伪技术，保证了种子的质量，保护了种子企业和种子用户的利益。

附图说明

图1是实施例2中双重荧光防伪丸化种子吸水裂解时的荧光表现；

图2是实施例2中双重荧光防伪丸化种子发芽第7天和第16天幼苗的荧光表现；

图3是实施例3中荧光素处理后的丸化种子裂解时的荧光表现；

图4是实施例3中荧光素处理后的丸化种子发芽第7天幼苗的荧光表现。

具体实施方式

下面给出本发明的较佳的实施例，这些实施例并非限制本发明的内容。

下述实施例中，烟草品种“MS云烟85”和“红花大金元”的种子来自玉溪中烟种子有限责任公司。“MS云烟85”种子千粒重为0.085g，“红花大金元”种子千粒重为0.081g。油菜种子购自浙江省杭州市种子公司，紫花苜蓿种子购自浙江杭州牧草种子公司。膨润土和滑石粉来自玉溪中烟种子有限责任公司，羧甲基纤维素购自杭州华东医药集团有限公司。包衣机的型号为BY300A，购自上海新诺仪器设备有限公司。罗丹明B和荧光素来自Advtechind Corporation。

实施例1双重荧光防伪烟草丸化种子的制备方法

将10g“MS云烟85”烟草种子倒入包衣机。

造粒：取200mg罗丹明B加入蒸馏水中制备浓度为2.0mg/ml的罗丹明B水溶液，先喷雾7.5ml的罗丹明B水溶液湿润种子表面，加入质量为0.5g的膨润土后不断搅拌，使其包裹于种子表面，重复上述步骤3-5次，使种子形成微小丸状；然后每次将2-5g膨润土加入到丸状种子中，喷雾浓度为1.0％的羧甲基纤维素溶液，不断搅拌，重复多次，使丸状种子的粒径增加到1.00mm-1.25mm；

丸化：将1g荧光素粉剂与420g滑石粉混合均匀，将2-5g混合物加入到造粒形成的丸状种子中，喷雾2.0％的羧甲基纤维素溶液，不断搅拌，重复多次，使造粒形成的丸状种子的粒径增加到1.60mm-1.80mm，然后筛选、抛光、上色、干燥得到包衣完毕的种子。

在造粒步骤开始时，首先添加少量种衣剂，可使得种子充分分散，有利于后期造粒，造粒的目的是将种子进一步分散且增加其体积，丸化则使造粒后的种子体积继续增加至理想范围。丸化种子粒径的控制主要通过不同形状和大小的筛选机进行筛选，达到理想粒径的种子筛出，未达到的则继续丸化。

由于罗丹明B水溶性很好，而荧光素水溶性较差，在尽可能降低成本，简化制备步骤，又可达到有效荧光防伪的前提下，筛选出罗丹明B和荧光素的适宜处理方法和处理计量。同时将罗丹明B荧光溶液代替清水添加到第一层结构，第二层结构未添加任何荧光物质，第三层结构再添加荧光素，一是为了避免两种荧光色剂的混合串色，二是为了增加防伪的可鉴别性。

种衣剂可选自粘土、硅藻土，泥炭、云母、蛭石，珍珠岩、活性炭、磷矿粉、膨润土及滑石粉中的一种或几种的混合。本实施例中的第一种衣剂优选自膨润土。第二种衣剂优选自滑石粉。其主要原因在于该两种原料化学性质稳定、成分单一、廉价易得、易于工业化生产。

所述的粘合剂是选自高分子聚合物形成的溶液，高分子聚合物包括***树胶，淀粉、羧甲基纤维素、甲基纤维素，乙基纤维素，聚乙烯醋酸纤维(盐)、藻朊酸钠、聚偏二氯乙烯、聚乙烯氧化物、聚乙烯醇等，本实施例优选羧甲基纤维素溶液。所述的粘合剂优选羧甲基纤维素的水溶液，其浓度为0.5％-3％(重量百分比)。

同时，取“红花大金元”种子10g，经过前述的丸粒化操作，得到红花大金元丸化种子成品。

另外，制备一定量的MS云烟85和红花大金元的对照丸化种子，具体的制备方法与前述方法相似，其区别在于，在造粒步骤中用蒸馏水代替罗丹明B溶液进行喷施，在丸化步骤中不添加荧光素粉剂来制备丸化种子。对照均用CK来表示。

以下述方法对处理和对照丸化种子发芽和幼苗生理指标进行测定。

(1)种子发芽和幼苗指标

将丸化种子置于有三层吸湿滤纸的直径9cm培养皿中。每处理3次重复，每重复100粒丸化种子。发芽实验在20～30℃变温条件下进行，高温(30℃)8h，低温(20℃)16h，高温时段具有光照。

置床后第2天起每天对萌发种子计数，于第7天计算发芽势，第16天统计发芽率。发芽第17天，每个处理的3个重复均随机选择10株幼苗，测定其根长和苗高。将幼苗在80℃烘箱中烘干24h，测定其干重。发芽指数(GI＝∑(G_t/T_t))(式中：G_t为不同时间的发芽数，T_t为发芽天数，∑为总和)，活力指数(VI＝GI×苗干重)。

(2)幼苗叶绿素含量

取不同处理的幼苗鲜样0.2g，置于研钵中，加入1ml 95％乙醇研磨，充分磨碎后，倒入5ml离心管中，再加2ml 95％乙醇冲洗，倒入离心管中，于5000r/min离心10min。取上清液1ml于10ml离心管中，加入9ml 95％乙醇，混匀后测定665，649，470nm下吸光度值，以95％乙醇为空白对照，叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素以及叶绿素总含量的计算方法参照李合生，孙群，赵世杰等编写的《植物生理生化实验原理和技术》(北京：高等教育出版社，2001)中定义的方法。

(3)幼苗保护酶活性测定方法：

取不同处理后的幼苗鲜样0.5g，于10ml的0.05M磷酸缓冲液(pH7.8)中研磨至匀浆，然后以10000r/min离心15min，取上清液作为酶粗提液进行保护酶活性测定，所有步骤均在低温4℃下进行。过氧化氢酶(CAT)活性测定，按Cao等(2010)的方法，以每分钟A240变化0.01为1个酶活性单位；过氧化物酶(POD)活性测定，采用愈创木酚法(Qiu等，2005)，以每分钟A470变化0.01为1个酶活性单位；超氧化物歧化酶(SOD)活性测定参照Zhang等(2007)。

(4)统计分析方法

采用SAS(V8)软件进行方差分析，多重比较采用P＜0.05，LSD法，统计前试验结果的百分数数据先经过反正弦转化(y＝arcsin[sqr(x/l00)])。

测定结果如下述表格所示：

表1双重荧光防伪丸化处理对种子发芽和幼苗素质的影响

*不同字母表示同一品种不同处理间差异显著(P＜005，LSD)，下同

表2双重荧光防伪丸化处理对幼苗保护酶活性的影响

表3双重荧光防伪丸化处理对幼苗中叶绿素含量的影响

由测定结果可看出，用一定浓度的罗丹明B溶液代替水在种子内层丸化时喷施，其后又包被添加了荧光素的种衣剂，这种双重荧光防伪处理对种子发芽、幼苗生长、幼苗保护酶活性均无不良影响，且在一定程度上提高了烟草幼苗叶绿素的含量

实施例2双重荧光防伪烟草丸化种子的检测方法

将实施例1制备得到的MS云烟85双重荧光丸化种子放置在载玻片上，加水使其裂解，用波长范围480nm～500nm的蓝光照射，发现丸化种子内部显示明亮的绿色荧光，继而用波长范围520nm～540nm的绿光照射裂解的丸化种子，发现在照射下丸化种子内部显示明亮的红色荧光，说明此丸化种子为双重荧光防伪丸化种子。

将MS云烟85双重荧光丸化种子萌发，用波长范围480nm～500nm的蓝光照射早期幼苗两片子叶，在子叶尖端和茎生长点显示明亮的黄绿色荧光，继而用波长范围520nm～540nm的绿光照射，子叶叶脉显示明亮的红色荧光，说明此丸化种子为双重荧光防伪丸化种子。

以本实施例的方法对种子进行真伪检测，发现丸化种子在吸水裂解时，于自然光下无荧光表现，但是经蓝光激发在开裂部位可观察到明显的绿色荧光，经绿光激发可观察到红色荧光，而未添加荧光物质的对照丸化种子则无荧光表现(图1)。双重荧光防伪处理的幼苗生长第7天时，于自然光下无荧光表现，但在蓝光激发下幼苗子叶尖端及茎生长点可观察到明亮的绿色荧光(图2，A-a)，且在绿光激发下幼苗子叶叶脉可观察到明显的红色荧光(图2，A-b)。幼苗生长第16天时，两种荧光仍然可见，只是亮度减弱(图2，B-a和B-b)。而未添加荧光物质的对照幼苗在两种激发光下均无荧光表现(图2，CK-a和CK-b)。

图1是实施例1制备得到的MS云烟85双重荧光丸化种子吸水裂解后在不同激发光下的荧光表现，空白光指自然光。上层为未添加荧光物质的对照组丸化种子(CK)，在蓝光(波长范围480nm～500nm)和绿光(波长范围520nm～540nm)照射下无荧光表现。下层的双重荧光丸化种子在蓝光激发下显示明亮的绿色荧光，在绿光激发下显示明亮的红色荧光。

图2是MS云烟85双重荧光防伪丸化种子萌发后幼苗的荧光表现，其中CK表示未添加荧光物质的对照组，A代表双重荧光防伪处理幼苗生长第7天时的荧光表现，B代表双重荧光防伪处理幼苗生长第16天时的荧光表现，CK-a和CK-b分别表示未添加荧光物质的对照幼苗在蓝光和绿光下的荧光表现，A-a和A-b分别表示双重荧光防伪处理幼苗生长第7天时在蓝光和绿光下的荧光表现，B-a和B-b分别表示双重荧光防伪处理幼苗生长第16天时在蓝光和绿光下的荧光表现，本图放大20倍，空白光即指自然光。

实施例3具备单一荧光的烟草丸化种子的制备方法

为了便于体现本发明相对于现有技术的优点，现制备一定量的单一荧光的烟草丸化种子进行对比。

首先将Na₂HPO₄·2H₂O 35.61g或Na₂HPO₄·7H₂O 53.65g或Na₂HPO₄·12H₂O 71.7g用800ml蒸馏水溶解，然后再用蒸馏水定容至1000ml，配制成0.2mol/L Na₂HPO₄溶液，即母液A；将NaH₂PO₄·H₂O 27.6g或NaH₂PO₄·2H₂O 31.2g用800ml蒸馏水溶解，然后再用蒸馏水定容至1000ml，配制成0.2mol/L NaH₂PO₄溶液，即母液B；将母液A(xml)与母液B(yml)混合后再用蒸馏水稀释至200ml，得到如下表所示，浓度为0.1mol/L，pH值不同的磷酸缓冲液：

x(ml)	y(ml)	pH
			72.0	28.0	7.2
77.0	23.0	7.3
			81.0	19.0	7.4
84.0	16.0	7.5
			87.0	13.0	7.6
89.5	10.5	7.7
			91.5	8.5	7.8
93.0	7.0	7.9

94.7

5.3

8.0

其次把荧光素粉剂加入到上述步骤制备的磷酸缓冲液中，用搅拌器搅拌，得到浓度为0.5～3mg/ml的荧光溶液，搅拌器转速为400～600转/分。

具备单一荧光的丸化种子的制备方法与实施例1中提供的制备方法相似，其区别在于，在造粒步骤中用上述步骤制备的荧光溶液代替罗丹明B溶液进行喷施，在丸化步骤中不添加荧光素粉剂。

图3是实施例3制备得到的单一荧光丸化种子吸水裂解时在不同波长激发光下的荧光表现，空白光即指自然光。右侧一列的单一荧光丸化种子仅仅在蓝光激发下显示明亮的绿色荧光，在绿光激发下无荧光表现；左侧一列未添加荧光物质的对照组丸化种子吸水裂解时在两种激发光照射下均无荧光表现。

图4是荧光素单一荧光处理后的丸化种子发芽第7天的幼苗中的荧光表现。可以看到，单一荧光处理的幼苗生长第7天时，经蓝光激发，幼苗荧光与未添加荧光物质的对照幼苗已无任何差异。

这种单一防伪处理相对于双重荧光防伪处理来说有以下缺点：一是荧光素不易溶于水，溶液制备操作繁琐；二是幼苗生长早期已无荧光表现，荧光标记持续性差；三是只有一种防伪标记，易被仿造。

实施例4双重荧光防伪油菜丸化种子的制备方法

将10g的油菜种子倒入包衣机，其千粒重为4.5g。

造粒：取200mg罗丹明B加入蒸馏水中制备浓度为2.0mg/ml的罗丹明B水溶液，先喷雾7.5ml的罗丹明B水溶液湿润种子表面，加入质量为0.5g的膨润土后不断搅拌，使其包裹于种子表面，重复上述步骤3-5次，使种子形成微小丸状；然后每次将2-5g膨润土加入到丸状种子中，喷雾浓度为0.5％的羧甲基纤维素溶液，不断搅拌，重复多次，使丸状种子的粒径增加到2.80mm-2.90mm；

丸化：将1.5g荧光素粉剂与70g滑石粉混合均匀，每次将2-5g混合物加入到造粒形成的丸状种子中，喷雾1.0％的羧甲基纤维素溶液，不断搅拌，重复多次，使造粒形成的丸状种子的粒径增加到3.00mm-3.20mm，然后筛选、抛光、上色、干燥得到包衣完毕的种子。

本实施例提供的方法对油菜种子进行双重荧光防伪丸化处理后，种子在吸水裂解时，经蓝光激发在开裂部位可观察到明显的绿色荧光，且经绿光激发可观察到红色荧光。

双重荧光防伪处理的幼苗生长第5天时，在蓝光激发下幼苗可观察到明亮的绿色荧光，而在绿光激发下幼苗可观察到明显的红色荧光。

实施例5双重荧光防伪紫花苜蓿丸化种子的制备方法

将10g的紫花苜蓿种子倒入包衣机，其千粒重约为1.1g。

造粒：取200mg罗丹明B加入蒸馏水中制备浓度为2.0mg/ml的罗丹明B水溶液，先喷雾7.5ml的罗丹明B水溶液湿润种子表面，加入质量为0.35g的膨润土后不断搅拌，使其包裹于种子表面，重复上述步骤3-5次，使种子形成微小丸状；然后每次将2-5g膨润土加入到丸状种子中，喷雾浓度为1.0％的羧甲基纤维素溶液，不断搅拌，重复多次，使丸状种子的粒径增加到1.40mm-1.60mm；

丸化：将0.5g荧光素粉剂与250g滑石粉混合均匀，每次将2-5g混合物加入到造粒形成的丸状种子中，喷雾3.0％的羧甲基纤维素溶液，不断搅拌，重复多次，使造粒形成的丸状种子的粒径增加到1.80mm-2.00mm，然后筛选、抛光、上色、干燥得到包衣完毕的种子。

本实施例提供的方法对紫花苜蓿种子采用双重荧光防伪丸化处理后，在种子吸水裂解时，经蓝光激发在开裂部位可观察到明显的绿色荧光，且经绿光激发可观察到红色荧光。

双重荧光防伪处理的幼苗生长第5天时，在蓝光激发下幼苗可观察到明亮的绿色荧光，而在绿光激发下幼苗可观察到明显的红色荧光。

本发明认为较佳的双重防伪处理必须具备两个条件，一是对种子萌发和幼苗生长无不良影响，二是在丸化种子吸水裂解甚至早期幼苗的特殊部位可同时检测到两种防伪标记。与单一荧光防伪方法相比，双重防伪处理提高了防伪的安全性和可靠性，难以被模仿。且双重荧光防伪效果可延长至种子萌发若干天后长成幼苗之时(不同种子其萌发至形成幼苗天数不同)，增大了防伪的时效性，使得不仅可以在种子上防伪也可以在早期幼苗阶段辨别种子的真假。

Claims (10)

1.一种双重荧光防伪丸化种子的制备方法，包括如下步骤：

造粒：将一定质量的裸种倒入包衣机，喷雾第一荧光色剂制备的溶液湿润裸种表面，加入质量为3.5％-5.0％裸种质量的第一种衣剂，不断搅拌，使之包裹于裸种表面，重复以上步骤3-5次，形成微小丸状；然后每次加入20％-50％裸种质量的第一种衣剂并重复数次，期间不断喷雾粘合剂并搅拌；

丸化：将7-43倍裸种质量的第二种衣剂与5％-15％裸种质量的第二荧光色剂的粉剂混合均匀后得到混合物；然后多次加入裸种质量20％-50％的混合物到上个步骤形成的丸状种子，期间不断喷雾粘合剂并搅拌，然后筛选、抛光、上色、干燥，得到包衣完毕的种子。

2.如权利要求1所述的防伪种子的制备方法，其特征在于，所述的第一荧光色剂是罗丹明B，所述的第二荧光色剂是荧光素；所述的种衣剂可选自粘土、硅藻土，泥炭、云母、蛭石，珍珠岩、活性炭、磷矿粉、膨润土及滑石粉中的一种或几种的混合；所述的第一种衣剂选自膨润土；所述的第二种衣剂选自滑石粉；所述的粘合剂是选自高分子聚合物形成的溶液，高分子聚合物包括***树胶，淀粉、羧甲基纤维素、甲基纤维素，乙基纤维素，聚乙烯醋酸纤维及聚乙烯醋酸纤维盐、藻朊酸钠、聚偏二氯乙烯、聚乙烯氧化物、聚乙烯醇等，优选羧甲基纤维素溶液，其浓度为0.5％-3％。

3.如权利要求2所述的防伪种子的制备方法，其特征在于，所述的种子为适合丸化的蔬菜、花卉、牧草、经济作物等植物种子，蔬菜种子譬如花椰菜、甘蓝、油菜等，花卉种子譬如海棠、矮牵牛等，牧草种子譬如紫花苜蓿、披碱草等，经济作物如烟草、芝麻等。

4.如权利要求3所述的防伪种子的制备方法，其特征在于，所述种子优选为在实际生产中需要经过丸粒化处理小粒和极小粒的种子，进一步优选千粒重小于5g的种子，特别优选千粒重在0.05-0.5g的极小粒种子。

5.如权利要求1-4任意一项所述的防伪种子的制备方法，其特征在于，在造粒步骤中，加入第一荧光色剂的总质量优选为裸种质量的0.45％-0.75％；在丸化步骤中，加入第二荧光色剂的总质量优选为裸种质量的5％或10％或15％，最优选10％。

6.如权利要求5所述的防伪种子的制备方法，其特征在于，当种子为千粒重在0.05-0.5g的极小粒种子时，在造粒步骤中加入的第一种衣剂质量总计为裸种质量的6-9倍，优选7.5倍；在丸化步骤中加入的第二种衣剂质量总计为裸种质量的35-43倍，优选42倍；在造粒步骤结束时，极小粒丸化种子的粒径为1.00mm-1.25mm，在丸化步骤结束时，极小粒丸化种子的粒径为1.60mm-1.80mm。

7.一种如权利要求1中的制备方法制备的双重荧光防伪种子，其特征在于，以裸种为核心覆盖有三层结构，包裹裸种的第一层结构包括第一种衣剂和第一荧光色剂，包裹第一层结构的第二层结构包括第一种衣剂，包裹第二层结构的第三层结构包括第二种衣剂与第二荧光色剂。

8.如权利要求7所述的双重荧光防伪种子，其特征在于，所述的第一荧光色剂是罗丹明B，所述的第二荧光色剂是荧光素；所述的种衣剂可选自粘土、硅藻土，泥炭、云母、蛭石，珍珠岩、活性炭、磷矿粉、膨润土及滑石粉中的一种或几种的混合；所述的第一种衣剂选自膨润土；所述的第二种衣剂选自滑石粉。

9.一种如权利要求7所述的双重荧光防伪种子的检测方法，该方法包括如下步骤：

将丸化种子放置在载玻片上，加水使其裂解，用波长范围480nm～500nm的蓝光照射，若在照射下丸化种子内部显示明亮的绿色荧光则继而用波长范围520nm～540nm的绿光照射裂解的丸化种子，若在照射下丸化种子内部显示明亮的红色荧光，则所述的丸化种子是双重荧光防伪种子，用蓝光照射和用绿光照射的步骤并无严格的先后之分。

10.一种如权利要求7所述的双重荧光防伪种子的检测方法，该方法包括如下步骤：

将丸化种子萌发，用波长范围480nm～500nm的蓝光照射早期幼苗，若在照射下幼苗能够显示明亮的黄绿色荧光，则继而用波长范围520nm～540nm的绿光照射，若幼苗在照射下显示明亮的红色荧光，则所述的丸化种子是双重荧光防伪种子，用蓝光照射和用绿光照射的步骤并无严格的先后之分。

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