CN102517383A

CN102517383A - Il-6r基因snp位点的用途

Info

Publication number: CN102517383A
Application number: CN2011104121406A
Authority: CN
Inventors: 尤崇革; 谢小冬; 施星臣; 施鑫鹤
Original assignee: Individual
Current assignee: Suzhou Baiyuan Gene Technology Co Ltd
Priority date: 2011-12-12
Filing date: 2011-12-12
Publication date: 2012-06-27
Anticipated expiration: 2031-12-12
Also published as: CN102517383B

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及IL-6R基因SNP位点的用途及其试剂盒和检查方法。IL-6R基因SNP位点在制备诊断类风湿关节炎易感性的检测试剂盒中的用途。本发明首次发现位于IL-6R基因SNP位点rs4845617和rs2228145与类风湿性关节炎相关。因此在此基础上提出一种通过SNP来检测类风湿性关节炎易感风险性的方法和试剂盒，并且经临床实验研究验证，本检测方法具有可行性，本发明的检测试剂盒具有良好灵敏性、稳定性和特异性。本发明的检测试剂盒可对正常人群进行类风湿性关节炎易感性的筛查，能有效起到风险预警、早期诊断的作用。

Description

IL-6R基因SNP位点的用途

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及IL-6R基因SNP位点的用途及其试剂盒和检查方法。

背景技术

类风湿关节炎(RA)是以对称性、多关节、小关节病变为主的慢性全身性自身免疫性疾病，以关节滑膜炎为主要病理特征。作为一种常见的，慢性的，***炎症性自身免疫性疾病，其发病率约为0.4％～1％左右，80％患者发病年龄在20～45岁，男女之比为1∶2.4。类风湿关节炎发展至晚期可致关节强直和畸形，功能严重受损甚至残废，严重影响了患者的生活质量，因此该疾病每年给社会造成巨大的财力物力损失。类风湿性关节炎与环境、细菌、病毒、遗传、性激素及精神状态等因素密切相关。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指存在于某一(些)群体、正常个体的基因组DNA中单碱基的序列差异，并且在人群中的分布频率至少要在1％以上(Brookes AJ.Gene，1999，234(2)：177-186)，人类遗传基因的多态性在遗传信息上的本质表现，90％以上是由SNP所引起的。因为其多态信息量大，目前已成为继限制性片段长度多态性(RFLP)标志和微卫星即短串联重复(STR)标志后的第三代遗传标志。

从基础医学到临床医学的各个领域，SNP都存在巨大的应用价值。SNP的研究为基因诊断，尤其是疾病的早期诊断提供更多依据有重要意义。SNP由于其分布广、密度高而被期望在诸如癌症、糖尿病、高血压、忧郁症和哮喘等复杂疾病的研究中起重要作用，这些复杂疾病是多个遗传变异位点与环境因子共同作用的结果，由于发病原因复杂，涉及的基因数量多，已成为国际上疾病基因组学研究的重点。目前已有实验将SNP应用于肿瘤预后及易感性的判断，例如肺癌致癌物的易感性存在个体差异，即肺癌的基因易感性，研究较多的是代谢酶基因多态性，如人细胞色素P450-CYP450和髓过氧化酶MPO等。法国研究者证实，MPO基因启动子(463G/A)多态性导致该基因较低的表达，可以降低肺癌患病的危险性(Chewier I，Stucker l，Houllier AM，etal.pharmacogenetics，2003，13(2)：729-739)。日本学者发现了HER-2基因编码区的一个SNP与胃癌的发展及恶性程度有关(Kuraoka K，Matsumura S，Hamai Y，et al.Int J Cancer，2003，107(4)：593-596)。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为类风湿关节炎易感性的诊断或类风湿关节炎药物的个体化治疗提供一种解决方法。

为此，本发明公开了IL-6R基因SNP位点在制备诊断类风湿关节炎易感性的检测试剂盒中的用途。

在一些实施例中，所述IL-6R基因SNP位点为IL-6R基因-183A/G(rs4845617)和D358A/C(rs2228145)。

本领域技术人员将能通过能够检测SNP位点的任何方法或技术在个体的核酸中进行在本文所公开的一个或几个SNP标记上存在的核苷酸的分析。例如，一个人能用本发明所述的方法通过进行Taqman法、质谱法、DNA微阵列法、测序法、微测序、杂交、限制性片段分析、寡核苷酸连接检测、等位基因特异性PCR-HRM或联合应用上述方法检测SNP位点生物标记。当然，这一列表仅是示例性的，并且绝不用于限制本发明。本领域技术人员可使用任何合适的方法来实现这种检测。

本发明第二方面公开了IL-6R基因SNP位点单倍型或IL-6R和IL-6基因SNP位点单倍型在制备诊断类风湿关节炎易感性的检测试剂盒中的用途。

正如本领域所熟知，“单倍型”是指遗传标记的任何组合。单倍型能包含两个或更多的等位基因。发现本文所述的单倍型(或“风险单倍型”)在具有患类风湿关节炎风险的个体中比在健康个体中更频繁和更显著。因此，这些单倍型对于检测类风湿关节炎风险，或者个体对于类风湿关节炎的敏感性具有预测价值。“风险单倍型”因此旨在包括本文所述的与类风湿关节炎高度相关和显著相关的标记上的一种单倍型或单倍型组合。

本领域技术人员能通过本领域所熟知的检测SNP位点的序列的方法来进行单倍型的检测。

在一些实施例中，IL-6R基因SNP位点单倍型为IL-6R基因SNP位点rs4845617和rs2228145单倍型，为G-A、A-A或G-C单倍型。

其中G-A单倍型增加RA患病风险，A-A和G-C单倍型降低RA患病风险。

IL-6R和IL-6基因SNP位点单倍型为IL-6和IL-6R两个基因的五个SNP位点IL-6-rs1800796/rs1800797/rs1800795/IL-6R-rs4845617/IL-6R-rs2228145单倍组合，为C-G-G-G-A、G-G-G-A-C、G-G-G-G-A、C-G-G-A-C、G-G-G-A-A或G-G-G-G-C单倍组合；其中C-G-G-G-A、G-G-G-A-C和G-G-G-G-A单倍组合增加RA患病风险；C-G-G-A-C、G-G-G-A-A和G-G-G-G-C单倍组合降低RA患病风险。

在一些实施例中，所述检测试剂盒在人类受试者中进行类风湿关节炎的易感性评价和/或诊断和/或预测的体外方法中使用，其中所述试剂盒包含用于进行下列步骤的适当的工具：

a)评价至少一种与所述的人类受试者的基因组DNA样品中的IL-6R基因SNP位点的类型和/或水平；和

b)将所述的人类受试者的在a)中评价的生物标记数据与健康的和/或患病的人的生物标记数据进行比较，来做出所述的人类受试者的类风湿关节炎的风险评价和/或诊断和/或预测。

在一些实施例中，所述试剂盒在鉴定人类受试者中的与类风湿关节炎易感性相关的SNP单倍型的体外方法中使用，所述试剂盒包含用于进行下列步骤的适当的工具：

a)检测所述的人类受试者的核酸样品中的IL-6R基因或IL-6R和IL-6基因的至少一种SNP，其中所述至少一种SNP预示着类风湿关节炎的易感性；和

b)鉴定所述的人类受试者的SNP单倍型，其中所述SNP单倍型包含所述在a)中检测的所述至少一种SNP。

术语“检测试剂盒”和“试剂盒”是同义词并可互换使用。

在本发明的上下文中，当是指检测试剂盒时，术语“适当的工具”是指任何用于达到所指明的目的的任何技术手段。作为这种适当的工具的非限制性例子，能列举试剂和/或材料和/或流程和/或说明书和/或软件等。本发明所述的所有试剂盒可包含适当的包装和说明书用于在本文所公开的方法中使用。试剂盒可进一步包含适当的缓冲液和聚合酶，如耐热聚合酶，例如Taq聚合酶。这种试剂盒也包含对照引物和/或探针。

根据优选的具体实施方式，本发明所述的检测试剂盒，包括基因组DNA抽提试剂、PCR反应体系试剂和HRM荧光染料试剂，所述PCR反应体系包括dNTP、MgCl₂、Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液和引物，其特征在于所述引物为分别针对IL-6R基因SNP位点rs4845617和rs2228145的引物对，或分别针对IL-6基因SNP位点rs1800796、rs1800797和rs1800795的引物对。在可检测出SNP位点的前提下，HRM荧光染料试剂可被Taqman法、质谱法、DNA微阵列法、测序法、微测序等试剂替换。

在一些实施例中，针对IL-6R基因SNP位点rs4845617的引物对的核酸序列如SEQ ID No.1～2所示，针对IL-6R基因SNP位点rs2228145的引物对的核酸序列如SEQ ID No.3～4所示；针对IL-6基因SNP位点rs1800796的引物对的核酸序列如SEQ ID No.5～6所示，针对IL-6基因SNP位点rs1800797的引物对的核酸序列如SEQ ID No.7～8所示，针对IL-6基因SNP位点rs1800795的引物对的核酸序列如SEQ ID No.9～10所示。

在一些实施例中，所述Taq DNA聚合酶优选为热启动PCR聚合酶，其中最优选为realstart酶。

在一些实施例中，所述HRM荧光染料为Eva Green、Syto9、Resolight和SupperGreen中之一。

另一方面，本发明公开了一种类风湿性关节炎易感性的检测方法，包括下列步骤：

a)基因组DNA的抽提；

b)PCR检测：PCR反应体系包含10～30ng基因组DNA，1×PCR Buffer，0.25U Taq DNA聚合酶，0.2mM dNTP，0.3μM上下游引物，1×HRM荧光染料，Mg²⁺浓度根据HRM荧光染料的种类不同变化；PCR扩增条件为预变性95℃2min，变性94℃10sec，退火延伸60℃30sec，共30-40个循环；

c)HRM检测：条件为96℃30sec，50℃30sec，熔解曲线数据收集从83℃到90℃，温度上升率0.05℃/s；

d)基因分型：依据熔解曲线峰型的改变进行基因分型；

其中所述上下游引物为分别针对IL-6R基因SNP位点rs4845617和rs2228145的引物对，和/或分别针对IL-6基因SNP位点rs1800796、rs1800797和rs1800795的引物对。

在一些实施例中，所述HRM荧光染料为Eva Green，Syto9，Resolight和SupperGreen中之一，其中优选为Eva Green。

在一些实施例中，所述HRM荧光染料为Eva Green时，PCR反应体系中Mg²⁺浓度＞1.5mM，其中优选为2.5mM或3.0mM；

在一些实施例中，所述HRM荧光染料为Lc Green时，PCR反应体系中Mg²⁺浓度2.5～3.0mM，其中优选为2.5mM；

在一些实施例中，所述HRM荧光染料为SupperGreen时，PCR反应体系中Mg²⁺浓度1.5～3.0mM，其中优选为1.5mM；

此外，本文所公开的SNP和单倍型可对患者分层(Stratification)。鉴定为发生类风湿性关节炎的风险增加或降低的个体的亚群能被用于，尤其是，用于定向临床试验项目和遗传药理学治疗，其中对于多态性的了解用于帮助鉴定最适合用特定药物制剂进行治疗的患者。

本发明的优点为：本发明首次发现位于IL-6R基因SNP位点rs4845617和rs2228145与类风湿性关节炎相关。因此在此基础上提出一种通过SNP来检测类风湿性关节炎易感风险性的方法和试剂盒，并且经临床实验研究验证，本检测方法具有可行性，本发明的检测试剂盒具有良好灵敏性、稳定性和特异性。本发明的试剂盒对正常人群进行类风湿性关节炎易感性的筛查，能有效起到风险预警、早期诊断的作用。

附图说明

图1为退火温度的优化凝胶电泳图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

1材料与方法

1.1研究对象

收集兰州大学第二医院2008年10月以来住院后经临床确证类风湿关节炎患者全血标本405例(枸橼酸钠抗凝3ml)。所有全血标本均在收集后2小时内进行血浆分离，4000rmp离心5分钟，取1ml血浆于1.5mlEP管内，其余全血分装2管。分装标本均保存在-40℃。本研究经医院伦理委员会批准，所有受试者或家属均知情同意。

1.2主要试剂

全血基因组DNA提取试剂盒北京百泰克；QuickGene DNA whole blood kit SFujifilm；Realstart Taq DNA polymerase南京GenScript；Pfu DNAPolymerase南京GenScript；dNTP Mixture，10mM each南京GenScript；TaqDNA Polymerase大连TaKaRa；dNTP Mixture，2.5mM each大连TaKaRa；Hot TaqDNA Polymerase BBI；Taq DNA Polymerase BBI；Taq DNA Polymerase北京天根；HotStart Taq PCR MasterMix北京天根；TrueStart Hot Start Taq DNAPolymerase Fermentas；EvaGreen Dye(20×)Biotium；Fast EvaGreen MasterMix for qPCR and HRM Biotium；SupperGreen Dye(20×)厦门百维信；LCGreenplus Dye(10×)Idaho；Anti-CCP ELISA kit上海沪峰；Anti-MCV ELISA kit上海沪峰；Roche capillary Roche；DNA marker BBI；SDNAClear Nucleic AcidStain BBI；Agarose上海生工；Water-DEPC上海生工；RF检测试剂盒上海捷门；

1.3主要仪器

Rotor-Gene 6000荧光定量PCR仪Corbett(澳大利亚)；Lightcycler 1.5荧光定量PCR仪Roche(瑞士)；黑金刚梯度PCR仪北京东胜创新；QuickGene-Mini80核酸提取仪Fujifilm(日本)；Centrifuge 5424台式高速离心机Eppendorf(德国)；PE-2400PCR仪PE(美国)；2F-258全自动凝胶成像***上海嘉鹏；微量核酸电泳***Bio-Rad(美国)；Nanodrop 2000微量核酸蛋白检测仪；Thermal scientific(美国)

实施例1PCR-HRM检测体系

1.1基因组DNA的提取(参考试剂盒说明书)

1.2引物设计与合成

选择IL-6基因1086-597G＞A(rs1800797)进行PCR-HRM检测体系的建立。通过美国国家医学图书馆Pubmed引擎(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/snp)检索到其侧翼序列，在线软件Primer3(http://frodo.wi.mit.edu/primer3)进行引物设计。IL-6基因引物：TGGCAAAAAGGAGTCACACA/CTGTGAGCGGCTGTTGTAGA；通过UCSC-PCR(http://genome.ucsc.edu)验证其特异性后交南京金斯特公司合成，引物浓度调整到20μM-20℃保存。另合成IL-6基因-597G＞A位点突变基因(长度96bp)作为阳性对照。

1.3检测体系酶***的选择

酶***分别以不同生物技术公司出售的Taq酶和hot Start Taq酶进行常规PCR反应，以Biotium公司生产的HRM专用试剂盒Eva Green Master Mix作为对照进行比对，在扩增效率好，特异性高的基础上，选择成本较低酶***。

1.4检测体系荧光染料的选择

PCR荧光染料的选择是在PCR扩增体系酶***确定的基础上进行选择，判断依据是PCR扩增效率(观察荧光扩增曲线的陡度和S曲线)、PCR产物的特异性(观察熔解曲线和熔解峰并进行琼脂糖凝胶电泳验证)。

1.5检测体系PCR扩增条件的优化

A.Mg²⁺的优化

Mg²⁺浓度从1.5mmol/L(mM)开始到4.0mM，每个梯度增加0.5mM，共有六个梯度即1.5mM、2.0mM、2.5mM、3.0mM、3.5mM和4.0mM。最适Mg2+浓度依据PCR扩增效率和产物的特异性进行确定。

B.退火温度的优化

退火温度从54℃开始，每次增加1℃，依据PCR扩增效率和产物特异性进行确定。

C.引物浓度的优化

引物浓度从0.2-0.9μM选择三个点进行优化，一旦出现扩增效率低，就需要进行上下游引物比例的调整。

D.模板上样量的优化

按照模板不超过总体积1/10的原则，选择0.5-1.0μL进行优化，选择扩增效率最佳的模板浓度。必要时可稀释模板。

E.PCR扩增条件的优化

首先进行两步法和三步法的选择，再依据扩增效率、产物特异性、产物熔解温度和GC含量进行优化，必要时加入Enhancer。

1.6检测体系HRM熔解条件的优化

PCR后直接进入HRM。在第一次扩增后进行普通熔解曲线(Melting：70～95℃)，判断PCR产物Tm的范围，以±3℃确定HRM的高分辨熔解范围；第二次根据PCR产物高分辨熔解产生的杂合峰调HRM条件(first hold temperature：10～120second，second hold temperature：30～60second，HRM：Tm-3℃～Tm+3℃)，最后确定HRM条件。

1.7PCR-HRM检测体系的确定与验证

A.特异性

PCR扩增产物的特异性通过溶解曲线峰的单一性、琼脂糖电泳和测序进行判断。

B.批内重复性

同一标本在同一批检测中重复检测5-10次，依据标准化熔解曲线的重合度以及Tm值的变异来判断。(最终以能否正确进行基因分型为标准)

C.批间重复性(再现性)

同一标本在不同批次检测中重复检测3次以上，依据标准化熔解曲线和熔解分型的相似程度来判断。(最终以能否正确进行基因分型为标准)

D.测序验证

将PCR产物送上海生工生物技术公司测序，测序结果应用Chromas软件分析。

结果：

1、酶***

以biotium的Eva Green Master Mix作为参照，与天根生物技术公司的普通Taq酶进行比对，发现尽管天根Taq酶扩增效率高，但其PCR产物特异性不如EvaGreen Mix，而且存在引物二聚体。说明在进行PCR-HRM时，最好选择热启动酶，以保证PCR产物的均一性。

热启动酶realstart在扩增效率、PCR产物的特异性和产量方面都优于Truestart，而后者无论在哪一方面都是低效，不能很好的与EvaGreen染料匹配。

相对而言，Realstart热启动酶与EvaGreen荧光染料匹配扩增效率、PCR产物特异性如上图所示，基本一致，但价格方面要低于EvaGreen Mix，所以将Realstart酶***与EvaGreen匹配组合成PCR-HRM检测***是最佳选择。

2、荧光染料

三种荧光染料EvaGreen、Supper Green和Lc Green与realstart酶***结合进行PCR-HRM，就其检测效能而言，都能达到HRM技术的检测要求，但三种染料的检测分辨率依次增强，价格也是依次升高。所以同等条件下，Eva Green为最适选择。

3、检测体系PCR扩增条件

A.Mg²⁺的优化

从扩增曲线和熔解曲线可以看出，荧光染料EvaGreen除1.5mM的Mg²⁺不能扩增出产物外，其余浓度均能扩出PCR产物。其中2.5mM和3.0mM的扩增效率、产物特异性和产量接近，处于最佳状态。

从扩增曲线和熔解曲线可以看出，荧光染料Lc Green除2.0mM的Mg²⁺不能有效扩增出产物，2.5mM的Mg²⁺扩增效率、产物特异性和产量均优于3.0mM的Mg²⁺，处于最佳状态。

从扩增曲线和熔解曲线可以看出，荧光染料Supper Green除1.5mM-3.0mM的Mg²⁺均能有效扩增出产物，但就扩增效率、产物特异性和产量三个方面综合考虑，1.5mM的Mg²⁺处于最佳状态。

B.退火温度的优化

从图1梯度PCR结果可以看出60℃时目的条带很亮，非特异带没有，仅见引物二聚体。同加入荧光染料进行熔解曲线分析60℃时熔解峰最高，说明此温度为最适退火温度。

C.引物浓度的优化

退火温度优化时的引物浓度是0.5μM，出现引物二聚体，故上qPCR时调整到0.3μM，扩增效果极佳。

D.模板上样量的优化

从扩增曲线和PCR产物的特异性来看，10ng模板量是足够进行10μL体系的PCR反应。

E.PCR扩增条件的优化

PCR扩增条件为预变性96℃3min，变性95℃6sec，退火60℃6sec，延伸72℃15sec 35个循环。

4、检测体系HRM熔解条件

通过不同的变性时间(hold1)和杂合退火时间(hold2)的摸索，发现变性时间大于30sec足以使PCR产物完全变性，除非PCR产物Tm值和产量均很高，适当地延长时间。杂合退火时间30sec足够形成容易辨认的杂合，提高温度虽然能形成更多的杂合，但杂合峰不易辨认。故最终以变性时间和杂合退火时间均为30sec作为首选。HRH的温度范围，在预实验时进行70-90℃的Melting寻找到PCR产物的Tm之后。

5、PCR-HRM检测体系验证

A.批内重复性

以富士核酸提取试剂盒提取的129号标本为例对新建PCR-HRM检测体系进行批内重复性试验(重复五次)，熔解曲线进行标准化后完全重合，说明重复性极好，相对百泰克试剂盒而言，重合度更高，因此分辨率也就更高。Tm值的均值80.60±0.049.

B.批间重复性(再现性)

以富士核酸提取盒提取的四个标本为例对新建的PCR-HRM检测体系进行批间重复性试验(重复三天)，熔解曲线的熔解峰型和标准化溶解曲线图形基本没有变化，基因分型结果完全一致。

C.测序验证

随机抽取三种基因分型样本每种各两例进行测序验证，结果与PCR-HRM技术基因分型结果完全一致。

由此，我们可以获得一种检测试剂盒，包括基因组DNA抽提试剂、PCR反应体系试剂和Eva Green荧光染料试剂，所述PCR反应体系包括dNTP、MgCl₂、realstart酶、PCR反应缓冲液和针对SNP位点的特异性引物对。

实施例2

2.1基因组DNA的提取(参考试剂盒说明书)；

2.2引物设计与合成

针对IL-1β基因-511C＞T、-31T＞C和+3954C＞T三个SNP位点，TNF基因-863C＞A和-857C＞T两个SNP位点，TNFR1基因-383A＞C和TNFR2基因T676G两个SNP位点，IL-6基因-597G＞A、-572和-174G＞C三个SNP位点，IL-6R基因-183和D358A两个位点，IL-1RN C＞T基因共13个位点应用第一章建立的PCR-HRM检测体系进行类风湿关节炎患者的基因多态性检测。通过美国国家医学图书馆Pubmed引擎(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/snp)检索到每个位点的侧翼序列，输入在线软件Primer3(http://frodo.wi.mit.edu/primer3)进行引物设计。通过UCSC-PCR(http://genome.ucsc.edu)验证其特异性后交上海生工生物技术公司合成，引物浓度调整到20μM-20℃保存。各位点引物序列及PCR产物如下：

IL-1B-511

染色体及位置：2q14

位点多态性：C/T(rs16944)

引物：P1 CCCAGCCAAGAAAGGTCAAT Tm：56.7℃GC％：50

P2 TGAGGGTGTGGGTCTCTACC Tm：59.1℃GC％：60

PCR产物：100bp Tm：85.47℃ GC％：54

CCCAGCCAAGAAAGGTCAATtttctcctcagaggctcctgcaattgacagagagctcc

ga

ggcagagaacagcacccaaGGTAGAGACCCACACCCTCA

IL-1B-31

染色体及位置：2q14

位点多态性：T/C(rs1143627)

引物：P1 TTTCTCAGCCTCCTACTTCTGC Tm：60.1℃GC％：50

P2 CTTGTGCCTCGAAGAGGTTT Tm：57.7℃GC％：50

PCR产物：86bp Tm：81.57℃GC％：46.5

TTTCTCAGCCTCCTACTTCTGCttttgaaagc

ataaaaacagcgagggagaaactggcag

ataccAAACCTCTTCGAGGCACAAG

IL-1B+3954

染色体及位置：2q14

位点多态性：C/T(rs1143634)

引物：P1 GGCCTGCCCTTCTGATTTTA Tm：58.5℃GC％：50

P2 CGTGCACATAAGCCTCGTTA Tm：58.5℃GC％：50

PCR产物：95bp Tm：81.11℃GC％：45.3

GGCCTGCCCTTCTGATTTTAtacctaaacaacatgtgctccacatttcagaacctatcttctt

gacacatgggaTAACGAGGCTTATGTGCACG

TNF-863，-857

染色体及位置：6p21.3

位点多态性：C/A(rs1800630)，C/T(rs1799724)

引物：P1 AGACCTCTGGGGAGATGTGA Tm：53.1℃GC％：55

P2 CGTCCCCTGTATTCCATACC Tm：56.9℃GC％：55

PCR产物：159bp Tm：88.92℃GC％：57.9

AGACCTCTGGGGAGATGTGAccacagcaatgggtaggagaatgtccagggctatggaagtcgagt

atggggaccccc

cttaagaagacagggccatgtagagggccccagggagtgaaag

agcctccaggacctccaGGTATGGAATACAGGGGACG

TNFR1-383

染色体及位置：12p13.2

位点多态性：A/C(rs2234649)

引物：P1CTTGGTGTTTGGTTGGGAGT Tm：57.8℃GC％：50

P2AGGAAGAGCTGGAGGAGGAG Tm：58.0℃GC％：60

PCR产物：153bp Tm：89.62℃GC％：58.2

CTTGGTGTTTGGTTGGGAGTggtcggattggtgggttgggggcacaaggcagccag

tctg

ggactcctgtgcttgtgactggactacaaagagttaaagaacgttgggcctcctcctcccgcctc

ctgtggcCTCCTCCTCCAGCTCTTCCT

TNFR2 T676G

染色体及位置：1p36.3-p36.2

位点多态性：G/T(rs1061622)

引物：P1 CTCCTCCTCCAGCTGTAACG Tm：59.2℃GC％：60

P2 GTGTTGGGATCGTGTGGAC Tm：54.0℃GC％：57.9

PCR产物：139bp Tm：90.74℃GC％：61.9

CTCCTCCTCCAGCTGTAACGtggtggccatccctgggaatgcaagca

ggatgcagtctgc

acgtccacgtcccccacccggagtatggccccaggggcagtacacttaccccagccagtGTCCAC

ACGATCCCAACAC

IL-6-597

染色体及位置：7p21

位点多态性：G/A(rs1800797)，

引物：P1 TGGCAAAAAGGAGTCACACA Tm：54.3℃GC％：45(SEQ ID No.7)

P2 CTGTGAGCGGCTGTTGTAGA Tm：58.0℃GC％：55(SEQ ID No.8)

PCR产物：96bp Tm：84.98℃GC％：52.1

TGGCAAAAAGGAGTCACACActccacctggagacgccttgaagtaactgcacgaaatttgagg

tggcaggcagtTCTACAACAGCCGCTCACAG

IL-6-572

染色体及位置：7p21

位点多态性：G/C(rs1800796)

引物：P1 GAGACGCCTTGAAGTAAC Tm：56.68℃GC％：50(SEQ ID No.5)

P2 TGAGTTCTTCTGTGTTCTG Tm：55.88℃GC％：42.1(SEQ ID No.6)

PCR产物：93bp Tm：84.79℃GC％：52.7

GAGACGCCTTGAAGTAACtgcacgaaatttgagg

tggccaggcagttctacaacagccc

tcacagggagagcCAGAACACAGAAGAACTCA

IL-6-174

染色体及位置：7p21

位点多态性：G/C(rs1800795)

引物：P1 GCCTCAATGACGACCTAAGC Tm：58.4℃GC％：55(SEQ ID No.9)

P2 GGGGCTGATTGGAAACCTTA Tm：58.3℃GC％：50(SEQ ID No.10)

PCR产物：101bp Tm：82.88GC％：47.5

GCCTCAATGACGACCTAAGCtgcacttttcccctagttgtgtcttg

ccatgctaaaggac

gtcacattgcacaatcttaaTAAGGTTTCCAATCAGCCCC

IL-6R D358A

染色体及位置：1q21

位点多态性：A/C(rs2228145)

引物：P1 TCCTCCTATTCCTTTTTCTCCA Tm：55.5℃GC％：40.9(SEQ ID No.3)

P2 GGAATGTGGGCAGTGGTACT Tm：58.7℃GC％：55(SEQ ID No.4)

PCR产物：103bp Tm：78.51℃GC％：38.8

TCCTCCTATTCCTTTTTCTCCAtattctcctcttcctcctctatcttcaattttttttttaacct

agtgcaag

ttcttcttcAGTACCACTGCCCACATTCC

IL-6R-183

染色体及位置：1q21.3

位点多态性：A/G(rs4845617)

引物：P1 gcCGCTCTGAGTCATGTGCGAGTG Tm：60.61℃GC％：59.1(SEQ ID No.1)

P2 GGCTCTCTACACACACTGCGAG Tm：59.74℃GC％：59.1(SEQ ID No.2)

PCR产物：110bp Tm：84.8℃GC％：68.8

CGCTCTGAGTCATGTGCGAGTGggaagtcgcactgacactgagccgg

ccagagggagagg

agccgagcgcggcgcggggccgagggaCTCGCAGTGTGTGTAGAGAGCC

IL-1RN

染色体及位置：2q13

位点多态性：C/T(rs4251961)

引物：P1 CGTGTCATTCATGCTTCCGGTG Tm：59.24℃GC％：54.7

P2 cCAGGTCTGCAGCCAACCAGTTGTG Tm：62.79℃GC％：58.3

PCR产物：139bp Tm：79.38℃GC％：52.5

CGTGTCATTCATGCTTCCGGTGagccctaagtctaagatagggcagatagca

caggtcca

ttttgcagctgtcaaaatgaggtctgaagggcagaagtggtgtgcccacacacaCACAACTGGTT

GGCTGCAGACCTG

2.3PCR-HRM技术检测基因多态性

采用实施例1建立的PCR-HRM检测体系作为基础进行基因多态性检测，引物浓度为0.3μM，反应体系12μL，金斯特Taq酶***组成为：0.2U热启动酶，2.5mM的Mg+，0.2mM的dNTP，1×PCR Buffer，20×EvaGreen，模板0.5μL。扩增条件为预变性96℃3min，变性95℃6sec，退火60℃6sec，延伸72℃15sec 35个循环。EvaGreen Mix扩增条件为预变性96℃3min，变性96℃6sec，退火60℃6sec，延伸72℃15sec35个循环。高GC的IL-6R-183扩增条件为预变性96℃3min，变性95℃10sec，退火60℃10sec，延伸72℃15sec 35个循环。高分辨熔解选择HRM通道，按Rotor gene6000仪器默认条件进行。熔解温度范围按不同扩增子Tm±3℃确定。

2.4基因分型及测序验证

基因分型依靠仪器分析软件HRM标准化图形，参考熔解图和扩增图进行判断，对不同类型熔解曲线的标本随机抽样2-3份进行测序验证，必要时双相测序或复查。

2.5统计学处理与分析

将检测数据输入Spss13.0软件，并进行数据处理与统计分析。计算各SNP的基因型频率和基因频率以及单倍型和单倍组合，并应用在线分析软件SHEsis(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)与对照组进行病例-对照分析。此外，还进行性别分层分析。

结果：

选取76例正常对照与病例组进行病理-对照关联分析，结果如下：

表1.1 IL-1B和IL-1RN在病例组和对照组的基因分布比较

表1.2 IL-1B和IL-1RN在病例组和对照组的基因型分布比较

表1.3 IL-1B和IL-1RN在病例组和对照组的HWE检验

表1.4 IL-1B和IL-1RN基因的单倍型分析

IL-1B和IL-1RN在病例组和对照组的基因分布、基因型分布、Hardy-Weinberg遗传平衡(HWE)分析和单倍型分析分别见表1.1、表1.2、表1.3和表1.4。除IL-1B+3954位点基因型频率在病例组和对照组之间有统计学差异外(P＝0.039)，其余位点基因频率和基因型频率在两组之间均无统计学差异。HWE分析显示IL-1RN位点基因型频率在病例组未达到遗传平衡外，其余各位点均达到遗传平衡，对照组四个位点全部达到遗传平衡，说明对照组具备群体代表性。单倍型分析显示单倍型C-T-T-C频率在两组之间具有统计学差异降低RA患病风险(OR＝0.322，P＝0.017)。

表2.1 IL-6和IL-6R病例组和对照组的基因分布比较

表2.2 IL-6和IL-6R在病例组和对照组的基因型分布比较

表2.3 IL-6和IL-6R在病例组和对照组的HWE检验

表2.4 IL-6基因的单倍型分析

^*指单倍型频率＞0.03

表2.5 IL-6R基因的单倍型分析

^*指单倍型频率＞0.03

表2.6 IL-6和IL-6R基因的单倍组合分析

^*指单倍组合频率＞0.03

IL-6和IL-6R在病例组和对照组的基因分布、基因型分布、Hardy-Weinberg遗传平衡(HWE)分析、单倍型和单倍组合分析分别见表2.1、表2.2、表2.3表2.4、表2.5和表2.6。除IL-6R-183和IL-6R exon两个位点基因和基因型频率在病例组和对照组之间有统计学差异外(P＝0.002，P＝0.011；P＝0.0004，P＝0.001)，其余位点基因频率和基因型频率在两组之间均无统计学差异。IL-6R-183和IL-6R exon两个位点均增加RA患病风险(OR＝1.712，OR＝1.867)。HWE分析显示五个研究位点基因型频率在两组均无显著性差异，说明研究样本具备群体代表性。IL-6三个位点单倍型分析显示在病例组和对照组之间无统计学差异的单倍型；IL-6R两个位点单倍型分析显示G-A单倍型在两组之间具有统计学差异且增加RA患病风险(OR＝3.591，P＜0.001)，A-A和G-C单倍型在两组间有统计学差异且降低RA患病风险(OR＝0.541，P＝0.003；OR＝0.491，P＜0.001)。IL-6和IL-6R两个基因的五个位点L-6-572G＞C/-597G＞A/-174G＞C/IL-6R-183A＞G/IL-6RexonC＞A单倍组合分析显示C-G-G-G-A、G-G-G-A-C和G-G-G-G-A单倍组合在病例组和对照组之间存在统计学差异，增加RA患病风险(F＝26.9％，OR＝2.735，P＜0.001；F＝8.1％，OR＝2.378，P＝0.0496；F＝12.9％，OR＝6.822，P＜0.001)；C-G-G-A-C、G-G-G-A-A和G-G-G-G-C单倍组合在两组间存在统计学差异，降低RA患病风险(F＝16.4％，OR＝0.641，P＝0.037；F＝4％，OR＝0.279，P＜0.001；F＝2.6％，OR＝0.216，P＜0.001)。

表3.1 TNF和TNFR在病例组和对照组的基因分布比较

表3.2 TNF和TNFR在病例组和对照组的基因型分布比较

表3.3 TNF和TNFR在病例组和对照组的HWE检验

表3.4 TNF基因的单倍型分析

^*指单倍型频率＞0.03

表3.5 TNF和TNFR基因的单倍组合分析

^*指单倍组合频率＞0.03

表3.1和表3.2显示TNF、TNFR1和TNFR2三个基因四个位点的基因频率和基因型频率分布。四个位点的基因频率和基因型频率在病例组和对照组之间均无统计学差异。表3.3显示四个位点在对照组均达到遗传平衡，检测样本具备群体代表性；但在病例组TNF-857C＞T和TNFR1-383A＞C位点未达到遗传平衡(P＜0.001，P＜0.001)。表3.4显示的TNF-857C＞T/-863C＞A单倍型和表3.5显示的TNF-857C＞T/-863C＞A/TNFR1-383A＞C/TNFR2exonT＞G单倍组合在病例组和对照组之间均无统计学差异。

表4.1全部13个SNP位点的单倍组合分析

^*指单倍型频率＞0.03

表4显示全部13个位点IL-1B-511/IL-1B-31/IL-1B-3954/IL-1RN/TNF-857/TNF-863/TNFR1-383/TNFR2-exon/IL-6-572/IL-6-597/IL-6-174/IL-6R-183/IL-6R-exon的单倍组合情况。单倍组合C-T-C-T-C-C-A-T-C-G-G-G-A、T-C-C-T-C-C-A-T-C-G-G-G-A和C-T-C-T-C-C-A-T-G-G-G-G-A在病例组和对照组之间存在统计学差异，增加RA患病风险(F＝4.3％，OR＝6.209，P＝0.0146；F＝13.3％，OR＝6.682，P＜0.001；F＝5.6％，P＝0.00048)；单倍组合C-T-C-T-C-C-A-T-G-G-G-A-A和T-C-C-T-C-C-A-T-C-G-G-A-A在两组之间存在统计学差异，降低RA患病风险(F＝8.8％，P＜0.001；F＝6.4％，OR＝0.402，P＝0.027)。

二、性别分层

表5.1IL-1B和IL-1RN基因分布的性别分层

表5.2 IL-1B和IL-1RN的基因型分布的性别分层

表5.3 IL-1B和IL-1RN在不同性别中的HWE检验

表5.4 IL-1B和IL-1RN在不同性别中的单倍型分析

表5.1显示经过性别分层进行IL-1B和IL-1RN基因频率比较发现，+3954T等位基因在男性表现为增加RA患病风险(OR＝1.610，P＝0.465)而在女性则降低RA患病风险(OR＝0.362，P＝0.006)，但男性表现的疾病易感没有统计学意义。表5.2显示性别分层后对女性来说只有+3954位点的基因型频率在病例组和对照组之间存在有统计学意义的差异。其余各位点在性别分层后无论是在基因频率还是基因型频率均未发现有统计学意义的差异。表5.3显示各SNP位点在性别分层后病例组和对照组在不同性别中的哈-代遗传平衡状况。在对照组经过性别分层后各位点仍处于遗传平衡状态，说明对照组样本具有群体代表性。病例组除IL-1RNT＞C位点在女性未达到遗传平衡外(P＝0.011)其余均达到遗传平衡。表5.4显示各SNP位点组成的单倍型在性别分层后的情况(只列出频率＞0.03的单倍型)，只有单倍型C-T-T-C频率对女性而言，在病例组和对照组之间存在具有统计学意义的差异且降低RA患病风险(OR＝0.168，P＝＜0.001)，其余单倍型在两组之间无统计学差异。

表6.1 IL-6和IL-6R基因分布的性别分层

表6.2 IL-6和IL-6R基因型分布的性别分层

表6.3 IL-6和IL-6R在不同性别中的HWE检验

表6.4 IL-6-572G＞C/-597G＞A/-174G＞C单倍型分析

表6.5 IL-6R-183A＞G/exon C＞A的单倍型分析

表6.6 IL-6-572G＞C/-597G＞A/-174G＞C/IL-6R-183A＞G/exon C＞A的单倍组合分析

表6.1和6.2显示经性别分层后IL-6和IL-6R基因和基因型分布情况，在女性中IL-6R-183A和exon A两个等位基因的基因频率在病例组和对照组均有统计学差异且增加RA患病风险(OR＝1.840，P＝0.005；OR＝2.145，P＝0.001)，它们的基因型频率在两组间也存在统计学差异(P＝0.024，P＝0.002)。在男性中IL-6R-597位点的基因型频率在病例组和对照组之间存在统计学差异(P＝0.048)。其余位点的基因和基因型频率的差异均无统计学意义。表6.3显示经过性别分层后各位点的哈-代遗传平衡情况，均无统计学差异，说明基因频率具备群体代表性。表6.4和表6.5分别显示IL-6和IL-6R基因性别分层后的单倍型情况，单倍型G-A无论对男性还是女性而言，在病例组和对照组之间均存在具有统计学意义的差异且增加RA患病风险(OR＝2.449，P＝0.005；OR＝6.505，P＜0.001)，单倍型G-C在女性两组之间存在统计学差异且降低RA患病风险(OR＝0.408，P＜0.001)。表6.6显示两个基因的五个位点在性别分层后进行单倍组合后两组之间的频率比较，对男性而言，单倍组合C-G-G-G-A增加RA患病风险(OR＝2.627，P＝0.009)，C-G-G-G-C降低RA患病风险(OR＝0.379，P＝0.009)，单倍组合G-G-G-G-C只出现在病例组(P＝0.039)；而在女性，单倍组合C-G-G-G-A、G-G-G-A-C和G-G-G-G-A均增加RA患病风险(OR＝3.499，P＝0.001；OR＝4.917，P＝0.004；OR＝809.2，P＜0.001)，C-G-G-A-C、G-G-G-A-A和G-G-G-G-C均降低RA患病风险(OR＝0.559，P＝0.033；OR＝0.310，P＝0.002；OR＝0.096，P＜0.001)。

表7.1 TNF和TNFR基因分布的性别分层

表7.2 TNF和TNFR基因型分布的性别分层

表7.3 TNF和TNFR在不同性别中的HWE检验

表7.4 TNF-857C＞T/-863C＞A的单倍型分析

表7.5 TNF-857C＞T/-863C＞A/TNF-R1-383A＞C/TNF-R2exonT＞G的单倍组合分析

表7.1和表7.2显示性别分层后TNF和TNFR基因频率和基因型频率的分布情况，在男性中TNF-863C＞A位点基因型频率在病例组和对照组之间存在统计学差异(P＝0.048)，其余位点的基因频率和基因型频率均无统计学差异。表7.3显示性别分层后各位点的遗传平衡状况，对照组各位点均达到遗传平衡，具有群体代表性；病例组TNF-857C＞T位点未达到遗传平衡(P＝0.044，P＝0.001)，TNFR1-383A＞C位点仅在女性人群中未达到遗传平衡(P＜0.001)。表7.4显示性别分层后TNF两个位点TNF-857C＞T和-863C＞A组成的单倍型情况，在病例组和对照组之间无论男性还是女性均无统计学差异出项。表7.5显示性别分层后TNF和TNFR两个基因四个位点

TNF-857C＞T/-863C＞A/TNF-R1-383A＞C/TNF-R2exonT＞G的单倍组合状况，同样在病例组和对照组之间无论男性还是女性均无统计学差异出项。

表8.1全部SNP位点在男性中的单倍组合分析

表8.2全部SNP位点在女性中的单倍组合分析

表8.1和表8.2分别显示性别分层后全部13个SNP位点IL-1B-511/IL-1B-31/IL-1B+3954/IL-1RN/TNF-857/TNF-863/TNFR1-383/TNFR2exon/IL-6-572/IL-6-597/IL-6-174/IL-6R-183/IL-6R exon单倍组合在男性和女性人群的分布情况。单倍组合T-C-C-T-C-C-A-T-C-G-G-G-A频率在病例组最高(Fm＝15.2％，Ff＝13.8％)，与对照组相比较存在统计学差异显著增加RA患病风险(OR＝21.19，P＜0.001)，女性对照组未发现该单倍组合(P＜0.001)；其次为单倍组合C-T-C-T-C-C-A-T-C-G-G-G-A(F＝6.4％，OR＝6.904，P＝0.037)，女性对照组未发现该单倍组合(F＝5.2％，P＝0.010)，在女性人群中单倍组合C-T-C-T-C-C-A-T-G-G-G-G-A增加RA患病风险(F＝4.2％，P＝0.022)仅出现在病例组。单倍组合T-C-C-T-T-C-A-T-C-G-G-G-C频率在男性对照组最高(F＝13.0％)，病例组未发现，显著降低RA患病风险(P＜0.001)，在女性人群，单倍组合C-T-C-T-C-C-A-T-C-G-G-A-C和C-T-C-T-C-C-A-T-G-G-G-G-C频率较高显著降低RA患病风险(F＝10.8％，OR＝0.155，P＜0.001；F＝9.8％，OR＝0.158，P＜0.001)，单倍型T-C-C-T-T-C-A-G-C-G-G-G-A也降低RA患病风险(F＝4.3％，P＜0.001)，其在病例组未发现。

讨论

类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种病因不明的慢性、消耗性、反复发作、以关节症状为主的自身免疫性疾病。大量研究显示关键炎症细胞因子IL-1β、TNF-α和IL-6在RA患者关节滑液中异常表达。由于细胞因子的表达受基因调控，故本研究检测了这三个细胞因子及其受体共七个基因13个SNP位点在RA患者中分布，并与76健康对照进行病例-对照研究。

在IL-1B与IL-1RN的四个SNP位点中，IL-1B+3954位点的基因型频率在病例组和对照组之间存在统计学差异，单倍型分析显示单倍型IL-1B-511C/-31T/+3954T/IL-1RN C频率在两组之间具有统计学差异降低RA患病风险。性别分层后发现这种差异均存在于女性中。由于基因表达的调控存在顺式(如启动子)和反式(如转录因子)调控单元，IL-1B-511和-31位点作为启动子中的SNP，在本研究中与RA易感性无关联，提示RA患者IL-1β的异常表达可能这两个SNP无关，也许与反式调控单元起主要作用。+3954位点虽然有相关性，但与文献报道的T等位基因增加RA患者的关节损伤之间的关系需进一步研究。

在IL-6和IL-6R的五个SNP位点中，IL-6R-183和IL-6R exon两个位点基因和基因型频率在病例组和对照组之间有统计学差异外均增加RA患病风险，单倍型分析显示IL-6R-183G/exon A在两组之间具有统计学差异且增加RA患病风险，五个位点IL-6-572G＞C/-597G＞A/-174G＞C/IL-6R-183A＞G/IL-6RexonC＞A单倍组合分析显示C-G-G-G-A、G-G-G-A-C和G-G-G-G-A在病例组和对照组之间存在统计学差异均增加RA患病风险。性别分层后IL-6R-183和IL-6R exon两个位点等位基因和基因型差异均来源于女性人群；除单倍组合G-G-G-A-C和G-G-G-G-A在男性两组间无统计学差异外，其余上述增加RA患病风险的单倍型和单倍组合均未发生改变，这说明单倍型IL-6R-183G/exon A和单倍组合IL-6-572C/-597G/-174G/IL-6R-183G/exon A可能在RA发病中起一定作用且不受性别影响。本研究发现IL-6R-183和IL-6R exon两个位点的同时突变显著增加RA的患病风险，但单独存在则降低其风险；同时通过单倍组合分析发现IL-6三个和IL-6R两个SNP位点均为野生型时RA发病风险增大。

在TNF和TNFR的四个SNP位点中均未发现具有统计学意义的增加RA患病风险的等位基因、基因型、单倍型和单倍组合，性别分层后仅发现TNF-863位点在男性中存在基因型的统计学差异。这提示TNF的异常表达可能与其基因水平的突变关系不大。

由于细胞因子之间存在复杂的相互激活作用，本研究将13个SNP位点放在一起进行单倍组合分析发现增加RA患病风险的组合有三种即C-T-C-T-C-C-A-T-C-G-G-G-A、T-C-C-T-C-C-A-T-C-G-G-G-A和C-T-C-T-C-C-A-T-G-G-G-G-A，性别分层后发现T-C-C-T-C-C-A-T-C-G-G-G-A和C-T-C-T-C-C-A-T-C-G-G-G-A组合主要存在男性，C-T-C-T-C-C-A-T-G-G-G-G-A组合主要存在女性，说明RA发病在不同性别之间存在遗传背景差异，这种差异在很大程度上可能源于性激素，其调控机制需进一步研究。

总之，本研究建立PCR-HRM技术平台对RA患者的细胞因子及其受体七个基因13个SNP位点进行了多态性检测，依据扩增子的高分辨熔解曲线熔解峰的差异进行基因分型，并通过测序验证PCR-HRM技术基因分型的可靠性。总共481例临床标本13个SNP位点检测应用，再次证实自主建立的PCR-HRM技术平台能够用于临床常规化的SNP分型，而且该法具备操作简便、价格低廉、闭管无污染等优点使其成为临床科研推广潜力最大的技术之一。

本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。

Claims

1.IL-6R基因SNP位点在制备诊断类风湿关节炎易感性的检测试剂盒中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述IL-6R基因SNP位点为rs4845617和rs2228145。

3.IL-6R基因SNP位点单倍型或IL-6R和IL-6基因SNP位点单倍型在制备诊断类风湿关节炎易感性的检测试剂盒中的用途。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于所述IL-6R基因SNP位点单倍型为IL-6R基因SNP位点rs4845617和rs2228145单倍型，G-A、A-A或G-C单倍型。

5.如权利要求3所述的用途，其特征在于所述IL-6R和IL-6基因SNP位点单倍型为IL-6和IL-6R两个基因的五个SNP位点IL-6-rs1800796/rs1800797/rs1800795/IL-6R-rs4845617/IL-6R-rs2228145单倍组合，为C-G-G-G-A、G-G-G-A-C、G-G-G-G-A、C-G-G-A-C、G-G-G-A-A或G-G-G-G-C单倍组合。

6.如权利要求1或3中所述检测试剂盒，包括基因组DNA抽提试剂、PCR反应体系试剂和HRM荧光染料试剂，所述PCR反应体系包括dNTP、MgCl₂、Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液和引物，其特征在于所述引物为分别针对IL-6R基因SNP位点rs4845617和rs2228145的引物对，和/或分别针对IL-6基因SNP位点rs1800796、rs1800797和rs1800795的引物对。

7.如权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于所述针对IL-6R基因SNP位点rs4845617的引物对的核酸序列如SEQ ID No.1～2所示，针对IL-6R基因SNP位点rs2228145的引物对的核酸序列如SEQ ID No.3～4所示；针对IL-6基因SNP位点rs1800796的引物对的核酸序列如SEQ ID No.5～6所示；针对IL-6基因SNP位点rs1800797的引物对的核酸序列如SEQ ID No.7～8所示；针对IL-6基因SNP位点rs1800795的引物对的核酸序列如SEQ IDNo.9～10所示。

8.如权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于所述Taq DNA聚合酶为realstart酶。

9.如权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于所述HRM荧光染料为EvaGreen、Syto9、Resolight和SupperGreen中之一。

10.一种类风湿性关节炎易感性的检测方法，包括下列步骤：

a)基因组DNA的抽提；

b)PCR检测：PCR反应体系包含10-30ng基因组DNA，1×PCR Buffer，0.25UTaq DNA聚合酶，0.2mM dNTP，0.3μM上下游引物，1×HRM荧光染料，Mg²⁺浓度根据HRM荧光染料的种类不同变化；PCR扩增条件为预变性95℃2min，变性94℃10sec，退火延伸60℃30sec，共30-40个循环；

d)基因分型：依据熔解曲线峰型的改变进行基因分型；