CN108026583A

CN108026583A - Hla-b*15:02的单核苷酸多态性及其应用

Info

Publication number: CN108026583A
Application number: CN201680047174.0A
Authority: CN
Inventors: T·莫里诺; H·方; X·徐; M·德戴克; K·考尔
Original assignee: Millennium Health LLC
Current assignee: Millennium Health LLC
Priority date: 2015-06-29
Filing date: 2016-06-29
Publication date: 2018-05-11
Also published as: US10683548B2; EP3314026A4; US9932638B2; US20160376656A1; US11542556B2; CA2993517A1; AU2016286088A1; US20180216190A1; US20210123102A1; EP3314026A1; WO2017004189A1; TW201713776A

Abstract

本文公开了HLA‑B*15：02中的新型单核苷酸多态性(SNP)，其可以用作卡马西平诱导的亚洲人严重不良皮肤反应的生物标记物。本文还提供了用于评估特定SNP、以及将SNP应用于预测卡马西平诱导的严重不良皮肤反应的风险增加的方法和试剂。

Description

HLA-B*15:02的单核苷酸多态性及其应用

相关申请的交叉参考

本申请主张2015年6月29日提交的美国临时申请第62/186,219和2016 年6月28日提交的美国申请第15/195,114的优先权和权益，二者全文通过引用纳入本文。

技术领域

本公开涉及HLA-B*15:02基因分型的方法和组合物，具体而言，涉及其中的单核苷酸多态性(SNP)及其应用。所述SNP可作为卡马西平(及其相关药物)诱导的严重不良皮肤反应的生物标记物起作用。

背景技术

卡马西平(CBZ)是在癫痫和双相障碍的治疗中经常作为处方的药物。 HLA-B*15:02与皮肤和粘膜中的卡马西平诱导的危及生命的炎症性不良反应强相关(Chung等，“医学遗传学：史蒂文斯-约翰逊综合征的标记物” (Medical genetics:a marker for Stevens-Johnson syndrome)，《自然(Nature)》，2004，428(6982)：486页；Chen等，“台湾的卡马西平诱导的毒性作用和HLA-B*15:02筛选”(Carbamazepine-induced toxic effects and HLA-B*15:02 screening in Taiwan)，《新英格兰医学杂志(N Engl J Med)》，2011，364(12)：1126-33页)。还参见 www.fda.gov/Drugs/DrugSafety/PostmarketDrugSafetyInformationforP atientsandProviders/ucm124718.htm。因此，要保证在需要卡马西平治疗的患者中进行HLA-B*15:02筛选(和处方信息：FDA批准的标签.2014)。目前，通过HLA分型来检测HLA-B*15:02是可行的，但由于所有HLA-B单倍型的高多态性和同源性质，在技术上存在挑战。目前的HLA分型方法在分辨率、精度、价格和/或便利性上存在限制，使其不能广泛用于HLA-B*15:02筛选。

简而言之，目前有四种主要方案可用于HLA-B*15:02检测：

(1)直接测序方法–例如，Sanger测序或下一代测序(NGS)-是最精确的方案，但耗时、昂贵、且需要特殊的专门知识来分析数据；

(2)序列特异性寡核苷酸探针杂交(SSOP)具备高灵敏度和特异性，但还有许多缺点，包括处理复杂和分辨率低；

(3)序列特异性PCR(SSP-PCR)，例如，可商业获得的世基生物医学股份有限公司(Pharmigene)PG15:02检测试剂盒(美国专利第7470513号)廉价且更易于处理，但其为低通量，且由于交叉反应而特异性低；以及

(4)标签SNP方法，特别是由次要等位基因rs2844682和rs3909184 组成的两个SNP单倍型，已被报道用于标记来自中国北京汉族群体(CHB) (de Bakker等，“在扩展的人类MHC中的用于疾病关联研究的高分辨率 HLA和SNP单体型图”(A high-resolution HLA andSNP haplotype map for disease association studies in the extended human MHC)《自然遗传学(Nat Genet)》，2006，38(10)：1166-72页)的HapMap(国际HapMap， C.，“国际HapMap项目”(The International HapMap Project)《自然 (Nature)》，2003，426(6968)：789-96页)的45个无关联个体中的 HLA-B*15:02等位基因。然而，进一步的试验显示这两个SNP对检测 HLA-B*15:02而言精度非常低(～6％灵敏度)(Zhu，G.D.等，“rs2844682 和rs3909184基因型在鉴定HLA-B*15：02携带者方面没有临床价值” (Genotypes atrs2844682 and rs3909184 have no clinical value in identifying HLA-B*15:02carriers)《欧洲临床药理学(Eur J Clin Pharmacol)》，2015)。

因此，鉴于卡马西平和相关药物所导致的潜在的危及生命的不良反应，迫切需要一种准确、高通量、且经济的用于筛选HLA-B*15:02的试验。具体地，理想的试验不应该产生假阴性。这样的试验将具备高价值，并在临床实践中被立刻需要。

发明概述

本公开基于惊讶地发现HLA-B*15:02基因中的特定SNP，rs144012689，其表示HLA-B*15:02的强生物标记物。于是，提供一种检测HLA-B*15:02 并由此预测、降低和/或防止卡马西平(和其相关药物)诱导的严重不良皮肤反应的新方案。

在一个方面，本文提供一种HLA-B*15:02等位基因的分离的生物标记物，其包括rs144012689。在一些实施方式中，负链中次要等位基因T的存在表明HLA-B*15:02等位基因的存在。

还提供生物标记物在预测、减少和/或防止卡马西平和其相关药物诱导的不良药物反应中的应用。在一些实施方式中，不良药物反应包括卡马西平(和其相关药物)诱导的严重不良皮肤反应。

另一个方面涉及一种用于检测样品中的HLA-B*15:02等位基因的方法，包括确定样品中rs144012689次要等位基因T的存在。所述方法可任选地包括获得样品的步骤。在一些实施方式中，所述方法还包括对样品进行选自基因分型、SNP阵列和下一代测序的试验。

在某些实施方式中，基因分型包括在Taq DNA聚合酶，使得由其产生的扩增子包含rs144012689的HLA-B基因中指定的一对引物，和与扩增子的位于或邻近rs144012689的部分杂交的非天然修饰的探针的存在下对样品进行聚合酶链式反应。所述探针可包括一个或多个选自SEQ ID NO： 5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQID NO：9和/或SEQ ID NO：10的序列。在一个实施方式中，所述方法包括用具备SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7序列的三种探针对样品进行基因分型。在另一个实施方式中，所述方法包括用具备SEQ ID NO：8、SEQ ID NO： 9和SEQ ID NO：10序列的三种探针对样品进行基因分型。在一些实施方式中，探针还包括报告染料和与其附连的淬灭剂染料，使得当两者附连时所述淬灭剂染料淬灭来自报告染料的信号，且当报告染料和淬灭剂染料中的一个或两者从探针中被释放，报告染料发出信号。所述信号可以是荧光。当探针与扩增子在rs144012689或附近杂交时，报告染料和淬灭剂染料中的一个或两者可通过Taq DNA聚合酶从探针中被释放。

在某些实施方式中，可使用包括多个与其结合的核酸的SNP阵列，其中多个核酸包括一个或多个选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO： 7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：10的序列。来自样品的DNA可与SNP阵列上的多个核酸杂交，以检测存在或不存在SNP。在一些实施方式中，来自样品的DNA被片段化和例如用报告染料标记。

在各种实施方式中，所述样品可来自有需要且给予卡马西平之前的患者。所述样品应包括基因组DNA。

另一个方面涉及包括选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、 SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：10的序列的非天然修饰的探针，其中所述探针附有可检测的标签。

又一个方面涉及包括非天然修饰的探针和与探针互补且退火的靶序列的双链核酸分子，其中所述探针包括选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：10的序列，其中所述探针附有可检测的标签。

再一方面涉及具有多个与其结合的核酸的固相，其中多个核酸包括一个或多个选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：10的序列。

又一方面涉及具有多个与其结合的核酸和退火至核酸的靶序列的固相，其中多个核酸包括一个或多个选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、 SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：9和/或SEQ ID NO：10的序列。

另一方面涉及治疗需要卡马西平的患者的方法，包括：获得来自患者的样品；确定样品中存在或不存在rs144012689次要等位基因T；以及在不存在rs 144012689次要等位基因T的情况下，向患者给予卡马西平。

本文还提供试用于检测样品中HLA-B*15:02等位基因的试剂盒，其包括选自SEQID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：10的探针。在一些实施方式中，所述试剂盒可包括具有SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、和SEQ ID NO：7序列的三种探针。在某些实施方式中，所述试剂盒可包括具有SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、和 SEQ ID NO：10序列的三种探针。在各种实施方式中，所述探针可用位于5’末端的荧光染料和位于3’末端的淬灭剂标记。所述探针可适用于基因分型试验。所述试剂盒可进一步包括HLA-B基因中指定的一对引物，使得由其产生的扩增子包括rs144012689；dNTP；以及Taq DNA聚合酶。本公开的每个实施方式和方面可单独或组合实践。而且，本文所用的词语和术语是为了描述目的，而不是限制性的。本文使用“包含”、“包括”、或“具有”、“含有”、“涉及”及其变化意味着涵盖其后列出的项目及其等价物，以及额外的项目。

参考具体实施方式，本公开的这些和其它方面以及各种优点和用途将变得显而易见。本公开的每个方面可以涵盖将理解的各种实施方式。

本申请中确定的所有文件通过引用整体并入本文。

附图说明

图1示出了一个示例性的HLA-B*15:02基因分型试验的结果。NTC＝无模板对照

具体实施方式

本发明公开的方法和组合物解决了现有技术缺陷，并提供一种新的生物标记物rs144012689以及HLA-B*15:02筛选的方案。该方案类似但优于通常的标签SNP方法。标签SNP在某个单倍型(但非其本身的基因单倍型的一部分)的连锁不平衡中被发现。标签SNP的限制是它们依赖连锁的统计理论，且不一定是经验上定义的连锁。此外，最近发现目前可接受的标签SNP 不能检测HLA-B*15:02(Zhu，G.D.等，“rs2844682和rs3909184基因型在鉴定HLA-B*15：02携带者方面没有临床价值”(Genotypes at rs2844682 and rs3909184 haveno clinical value in identifying HLA-B*15:02 carriers) 《欧洲临床药理学(Eur JClin Pharmacol)》，2015)。不幸的是，由于缺乏快速和有效的HLA-B*15:02筛选试验，以及对rs2844682和rs3909184 实际上不标记HLA-B*15:02这一事实的无知，许多实验室仍然使用这些SNP 来确定患者HLA-B*15:02状态，这已经被显示是高度易错的(Zhu，G.D.等，“rs2844682和rs3909184基因型在鉴定HLA-B*15：02携带者方面没有临床价值”(Genotypesat rs2844682 and rs3909184 have no clinical value in identifying HLA-B*15:02carriers)《欧洲临床药理学(Eur J Clin Pharmacol)》，2015)，或将Pharmigene试剂盒或单纯的SSP-PCR用于低分辨率的HLA-B*15:02测试。

与现有的标签SNP相反，基于公共数据库，本文公开的新SNP， rs144012689存在于HLA-B基因的内含子5中，且与HLA-B*15:02密切相关。而且，来自使用不同的检测试验的＞25,000个患者样品的结果显示，具有 100％灵敏度和99.96％特异性的rs144012689是一种可靠的HLA-B*15:02 的生物标记物。另外，在测试＞1000个患者样品后，设于rs144012689次要等位基因的新的基因分型试验也显示了对于检测HLA-B*15:02 的令人惊讶的100％灵敏度和100％特异性。明显地，rs144012689完全排除假阴性，使其成为高价值和临床上理想的生物标记物。基于rs144012689 的检测与另一种现有的被商用的方法相比，与HLA-B*15:02的特异性高得多，所述另一种现有的被商用的方法例如Pharmigene PG15:02检测试剂盒，其产品插页示出了假阳性列表(HLA-B*15:13、B*15:31、B*15:55、B*15:88、B*15:89、B*18:20、B*95:12、B*95:21、B*95:44和B*95:70)。因此，本文提供易于处理、高通量(例如，平行进行至少10、至少20、至少50、至少100、或更多样品)、且经济的基于rs144012689的HLA-B*15:02试验。这些试验可用于需要卡马西平(或相关药物、例如苯妥英、拉莫三嗪、艾司利卡西平、磷苯妥英和奥卡西平)治疗的患者的HLA-B*15:02高灵敏度筛选，以避免潜在的危及生命的皮肤和粘膜的炎症性不良反应。

定义

贯穿本说明书使用的各种术语应具有在此阐述的定义。

“HLA”是指人白细胞抗原***(HLA)复合物，其跨越约350万位于人染色体 6的短臂上的6p21.3区域的碱基对，并包括多于220个多种功能的基因。许多基因编码免疫***蛋白质。主要的区域是I类和II类区域。主要的I类抗原是HLA-A、HLA-B、和HLA-C，并且主要的II类抗原是HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR。 HLA基因是基因组中最多态性的基因之一。HLA抗原中表现出的多态性(并因此对移植的分型非常重要)主要位于II类基因的外显子2和I类基因的外显子2和3。

每个HLA等位基因名称有一个唯一编号，对应于最多四组用冒号分隔的数字。第一个冒号之前的数字描述类型，其通常对应于由同种异型携带的血清抗原。下一组数字用于列出亚型，数字按照被确定的DNA序列的顺序进行分配。在两组数字中编号不同的等位基因必须在改变被编码的蛋白质的氨基酸序列的一个或多个核苷酸取代中不同。在编码序列中仅在同义的核苷酸取代(也称为沉默或非编码取代)上不同的等位基因通过使用第三组数字来区分。仅在内含子中的、或在外显子和内含子侧翼的5’或3’非翻译区域中的序列多态性上不同的等位基因用通过使用第四组数字来区分。

HLA-B*15:02是指等位基因组15中的HLA-B基因的特定的等位基因，并具有亚型02。IMGT/HLA数据库中记载了编码区域(B*15:02:01–B*15:02:09)中的至少9个同义的取代，即编码相同蛋白质(参见 www.ebi.ac.uk/cgi-bin/ipd/imgt/hla/allele.cgi)。如在本文中所使用的，“生物标记物”是指可测量或可检测的特征，其提供以下信息：患者中疾病或侵入状态的存在和/或严重程度；与生物途径的关系；药效学或药物遗传学关系或输出；伴侣诊断；一个特定的物种；或生物样品的质量。生物标记物的例子包括基因、多态性、蛋白质、肽、抗体、细胞、基因产物、酶、激素等。

术语“基因”是指包含产生RNA或多肽或其前体所必需的编码序列的核酸(例如，DNA或RNA)序列。术语“部分”当被用于基因时是指该基因的片段。片段的大小可以在几个核苷酸到整个基因序列减去一个核苷酸的范围内。术语“基因”包括结构基因的编码区域，并包括位于5’和/或3’末端编码区附近的序列，使得该基因对应于全长mRNA的长度。术语“基因”包括基因的cDNA和基因组形式。基因的基因组形式或克隆包括被称为“内含子”或“间插区域”或“间插序列”的非编码序列隔开的编码区域。内含子是基因的区段，其被转录为核RNA(hnRNA)；内含子可包括调控元件，如增强子。内含子被从核或初级转录物中去除或“剪切”；因而内含子不存在于信使RNA(mRNA)转录物中。翻译期间mRNA功能是确定初生多肽中的氨基酸顺序或序列。

本文中所使用的术语“等位基因”通常是指各自编码类似的序列组合物的多种物质之一，但彼此有一定程度的区别。区别可以包括相关领域中的普通技术人员已知的任何类型的遗传变异，包括但不限于多态性，如单核苷酸多态性 (SNP)、***或缺失(***/缺失事件的组合也被称为“***/缺失”)、重复序列的数量差异(也被称为串联重复)、和结构变异。对于HLA等位基因，典型地，多个遗传的差异构成等位基因(即，大多数等位基因之间的区别超过一个碱基)。参考HLA基因，通过使用当前等位基因名称中的所有数字来定义等位基因。

本文中所使用的术语“等位基因频率”或“等位基因的频率”通常是指由特定变体组成的群体中所有变体的比例。

本文中所使用的“单倍型”是指一组存在于一个染色体上的倾向于一起遗传的紧密连接的HLA等位基因。

“连锁不平衡”是指在不同基因组位置上的特定等位基因一起出现的频率比偶然出现所预期的频率更高。如果任何特定组的等位基因(或单倍型) 的频率是其个体群体频率的乘积，那么给定的基因座上的等位基因是完全均衡的。

术语“多态性”是指在不同的基因组或个体之间出现两个或更多可选的基因组序列或等位基因。变异可包括含不限于一个或多个碱基改变，一个或多个核苷酸的***或一个或多个核苷酸的缺失。多态性包括单核苷酸多态性(SNP)、简单序列重复(SSR)和***/缺失，其为***和缺失。

如在本文中所使用的，术语“单核苷酸多态性”也被缩写为“SNP”，指单一位点上的多态性，其中多态性构成单个碱基对的变化。SNP是遗传多态性的常见形式。SNP可影响基因功能并改变个体对疾病的易感性。几乎所有的疾病在其病因学中都有其遗传因素，且大多数疾病在遗传学关联研究中都被揭示。在一些情况下，单一SNP可足以赋予易感性，而在其他情况下，多个SNP可共同影响疾病易感性。估计有2000万SNP存在于人类基因组中。

本领域技术人员之一理解，SNP通常具有两个并且至多四个替代的等位基因，并且每个对应于可能存在于染色体中的核苷酸。因此，SNP通过四个(A、 C、G、T)中的两个或更多核苷酸来表征。一个例子是SNP在每个染色体的给定位置具有等位基因C或等位基因T。这表示为C＞T或C/T。更常出现的等位基因第一个表示(在此处是C)并且称为主要的、常见的或野生型等位基因。替代常见的等位基因的出现得更少的替代的等位基因(在此处是T) 被称为次要、稀有或变异等位基因。由于人类是二倍体生物，也就是说每个染色体出现两个拷贝，每个个体在一个SNP上有两个等位基因。这些等位基因可以是相同等位基因的两个拷贝(CC或TT)，或它们可以是不同的 (CT)。CC、CT和TT称为基因型。其中CC和TT的特征在于具有两个相同的等位基因的拷贝，并被称为纯合基因型。基因型CT在每个染色体上具有不同的等位基因，并被称为杂合基因型。携带纯合或杂合基因型的个体分别被称为纯合子和杂合子。

“rs144012689”是位于人染色体6的31355003，HLA-B基因的内含子5 上的SNP。在负链上，主要等位基因是A，且次要等位基因是T。

术语“基因型”是对包含在个体或样品中的基因的等位基因的描述。如在本文中所使用的，对对象的基因的多态性等位基因(或DNA或其它生物样品)进行“基因分型”是指检测对象(或样品)存在或不存在基因或基因表达产物(例如，异质核(hn)RNA、信使RNA或蛋白质)的等位基因或多态性形式。从这样的基因表达的相关的RNA或蛋白质也可用于检测多态性变异。本领域已知个体对于特定的等位基因而言可以是杂合或纯合的。可能存在超过两种等位基因形式，因此可能有三种以上可能的基因型。出于本公开的目的，“基因分型”包括使用合适的血清学、组织学或分子技术等来进行HLA、特别是HLA-B等位基因的确定，如本领域已知的或如本文所公开的。如在本文中所使用的，当等位基因的相同性(例如，序列)已知时，可以“检测”或“确定”等位基因。序列变异可直接(通过例如测序)或间接(例如通过限制性片段长度多态性分析，或检测已知序列的探针的杂交，或参考链构象多态性)、或通过使用其它已知方法来检测。

术语“样品”是指含有或假定含有来自个体的核酸(例如DNA)的任何组合物。在本公开的上下文中，可使用任何类型的身体样品，包括但不限于皮肤、口腔拭子、组织活检、血浆、血清、全血和血液组分、唾液、尿液、泪液、***、***液和其他液体和组织，包括石蜡包埋的组织或在法医学调查过程中收集和保存的组织。样品还可以包括从个体获得的细胞的体外培养物的成分和组分。可以从各种样品中提取DNA进行基因分型等。

术语“引物”是指在PCR反应中起到DNA合成起点作用的寡核苷酸。引物长度通常为约15至约40个核苷酸(或更短或更长)，并且典型地包括至少一个靶杂交区域，其至少基本上与靶序列互补。

术语“探针”是指与靶核酸上的靶序列杂交的寡核苷酸。靶序列是指待分析的核酸区域，并包含感兴趣的多态性位点。对于试验，探针可另外包括淬灭剂和染料(例如，荧光)。当探针完整时，由于淬灭剂染料在报告染料附近，荧光被抑制。一个试验中可包括至少两个探针；在双等位基因***中，一个用于主要等位基因，且另一个用于次要等位基因。如果在靶区域中有超过两个等位基因，则可包括更多的探针。

术语“基因分型”或“试验”是一种利用Taq DNA聚合酶的5’-3’核酸酶活性，以允许通过由于PCR从探针释放的荧光报告物直接检测PCR的结果的技术。试验允许识别双等位基因(或更多) ***的等位基因。它代表了SNP基因分型的灵敏和快速手段。典型的TaqMan 试验包括Taq DNA聚合酶、dNTP、被设计用于扩增靶区域的一对引物、和至少两个探针(每个与靶区域中的不同的等位基因杂交)，混合DNA样品并进行PCR(例如，可检测并测量荧光的实时PCR)。在PCR退火步骤中，探针与靶位点杂交。在PCR延伸期间，由于Taq聚合酶的5'核酸酶活性，报告和淬灭剂染料被释放，导致报告染料的特征荧光增加。核酸外切酶活性仅在完美地杂交的探针上发生，因此包含错配碱基的探针不会被Taq聚合酶识别。

“Taq DNA聚合酶”是指在聚合酶链式反应(PCR)中用于扩增靶DNA 的热稳定酶。它在水生栖热菌(Thermus aquaticus)中被发现，因此得名。应当注意到，在TaqMan试验中，其它具有5’-3’核酸酶活性的聚合酶也可被用于替代Taq DNA聚合酶。

“下一代测序”或“NGS”包括一个或多个基于454的测序(罗氏公司 (Roche))、基于基因组分析仪的测序(Illumina/Solexa)、Ion torrent： Proton/PGM测序和基于ABI-SOLiD的测序(应用生物***公司(Applied Biosystems))。基础化学依赖于DNA聚合酶在DNA合成的连续循环期间催化将dNTP掺入DNA聚合物中的事实。在每个循环期间，掺入的核苷酸通过光学信号(例如荧光激发)或pH的变化(每个碱基的引入释放质子)来鉴定。与传统测序如Sanger测序相比，关键的区别在于，NGS不是一次对单个 DNA片段进行测序，而是以平行方式跨越多个片段进行扩展该过程，大大提高了测序速度和精度。

术语“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”是指天然和非天然的核苷酸(例如，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合物。该术语不受聚合物长度(例如，单体的数量)所限。核酸可以是单链或双链，并且通常包括5’ -3’磷酸二酯键，尽管在一些情况下，核苷酸类似物可能有其它的连接。核酸可包括天然存在的碱基(腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，尿嘧啶和胸腺嘧啶)以及非天然碱基。术语“非天然核苷酸”或“修饰核苷酸”是指包括修饰的含氮碱基、糖或磷酸基团或在其结构中并入非天然部分的核苷酸。非天然核苷酸的实例包括双脱氧核苷酸、生物素化、胺化、脱氨基、烷基化、苄化和荧光团标记的核苷酸。

术语“互补”和“互补性”是指由碱基配对规则关联的多核苷酸(例如核苷酸序列)。例如，序列5'-A-G-T-3'与序列3'-T-C-A-5'互补。互补性可能是“部分的”，其中只有一些核酸的碱基根据碱基配对规则进行配对。或者，核酸之间可能存在“完全”或“全部”互补性。核酸链间的互补程度对于核酸链间杂交的效率和强度有显著影响。这在扩增反应以及取决于核酸之间结合的检测方法中是特别重要的。

卡马西平或CBZ也被称为得理多(Tegretol)、癫妥(Tegol)、G-32883、 Biston、Calepsin、Carbatrol、Epitol、Finlepsin、Sirtal、Stazepine、 Telesmin、或Timonil，是一种芳族抗惊厥药。卡马西平被广泛用于治疗癫痫发作和三叉神经痛(引起面神经痛)。虽然在FDA标签中没有注明用于治疗，但这种药物也可用于治疗双相精神障碍。

“药物不良反应”(ADR)是药物不期望的和非预期的作用。特别是，在用于预防、诊断或治疗的剂量下出现不良的药物反应。根据被广泛引用的元分析，ADR排在最常见的死亡原因中的第四和第六之间(Lazarou等，JAMA,279(15):1200-1205,1998)。皮肤ADR占所有住院患者的约2-3％ (Bigby等，JAMA，256(24)：3358-3363,1986)。它们的范围随着严重程度的增加，从轻度斑丘疹(MPE)，到威胁生命的ADR，如超敏反应综合征(HSS)、史蒂文斯-约翰逊综合征(SJS)和毒性表皮坏死溶离(TEN；莱尔综合征)。后者的死亡率可高达40％。

“卡马西平诱导的严重不良皮肤反应”是指由卡马西平诱导的不良药物反应，特别是皮肤不良反应。一般而言，这些过敏反应包括发烧、皮疹、免疫细胞(白血球)异常、以及在某些情况下的肝炎。最严重的不良反应包括称为史蒂文斯-约翰逊综合征(SJS)的皮肤起泡损伤和毒性表皮坏死溶离(TEN)。卡马西平诱导的SJS/TEN在欧洲人中是罕见的，据报道每10000 个接触该药的个体中1-6个有风险。在HLA-B*15：02等位基因普遍存在的亚洲国家，风险几乎高出10-100倍(Lonjou等，2006；和处方信息：FDA批准的标签，2014)。HLA-B*15：02等位基因在亚洲人中发现卡马西平治疗后发生SJS/TEN的风险与一个人的遗传组成之间的最强关联(参见Chung等，“医学遗传学：史蒂文斯-约翰逊综合征的标记物”(Medical genetics:a marker for Stevens-Johnson syndrome)，《自然(Nature)》，2004，428(6982)：486页；Chen等，“台湾的卡马西平诱导的毒性作用和HLA-B*15:02筛选” (Carbamazepine-induced toxic effects and HLA-B*15:02 screening inTaiwan)，《新英格兰医学杂志(N Engl J Med)》，2011，364(12)： 1126-33页；以及Mushiroda和Nakamura，《基因组医学(Genome Medicine)》 2011,3:28)。

SJS和TEN是免疫复合物介导的超敏性失调，其特征在于伴随着牙龈干燥和皮肤脱落的紫癜性斑疹起病急剧发展和靶样病变的快速发展(Roujeau 等人，《皮肤病学研究杂志(J Invest Dermatol)》，1994,102：28S-30S)。它们主要由药物如磺胺类、抗惊厥药、别嘌呤醇、非甾体抗炎药和抗疟药引起(Roujeau等，《新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)》，333(24)： 1600-1607,1995)。

HLA-B*15:02和CBZ

基于公开可得的数据库(表1)，HLA-B*15：02等位基因在全球人群中以大约0.9％的等位基因频率存在。然而，HLA基因座的等位基因频率因种族而异。在HLA-B*15：02的情况下，汉族人的等位基因以8.6％的频率存在，而日本人和韩国人的等位基因频率只有0.1％；高加索人和非洲人的频率也很低(www.allelefrequencies.net)。在整个亚洲人群中，HLA-B*15： 02等位基因频率约为3.9％(表1)。

就CBZ而言，使用台湾人的研究证明HLA-B*15：02等位基因与CBZ诱导的SJS和TEN非常强相关(Chung W H.等，《自然(Nature)》2004年三月,428(6982)：486)。因此，在需要卡马西平治疗的患者(和处方信息：FDA批准的标签，2014)中需要HLA-B*15：02 筛查。目前，通过HLA分型的HLA-B*15：02检测是可行的，但技术上的挑战主要是由于缺乏可靠的生物标记物或在分辨率、精度、价格和便利性方面的限制。一个理想的生物标记物应该能够区分HLA-B*15：02与其他高度同源的HLA-B等位基因；应尽可能灵敏以避免假阴性；并可用于各种检测试验。

应该注意的是，其他芳族抗惊厥药，包括苯妥英、拉莫三嗪、艾司利卡西平、磷苯妥英和奥卡西平引起与CBZ类似的ADR。因此，可以使用HLA-B*15： 02来评估针对这些其他芳族抗惊厥药的ADR的风险。可使用HLA-B*15：02作为风险因子的芳族抗惊厥药还包括CBZ苯妥英、拉莫三嗪、艾司利卡西平、磷苯妥英和奥卡西平的化合物或代谢产物。这些药物的代谢物是本领域已知的 (参见例如Gennis等，1991；Leeder,《癫痫(Epilepsia)》,39增刊7:S8-16, 1998；Naisbitt等,《分子药理学(Mol.Pharmacol.)》,63(3):732-741,2003))，例如CBZ-10,11环氧化物、CBZ-10,11-二醇、CBZ-2,3-二醇、二氢CBZ、CBZ 儿茶酚和CBZ邻醌、对羟基苯妥英、苯妥英二氢二醇、苯妥英儿茶酚、苯妥英甲基儿茶酚和苯妥英邻醌。

作为HLA-B*15:02的生物标记物的rs144012689

通过挖掘公共数据库和患者样本的序列数据，对HLA-B基因座进行深入的生物信息学分析，我们确定了一系列区域，使我们能够专门研究B*15：02等位基因。具体而言，使用内部挖掘算法比较344种已知的HLA-B单倍型 (www.hla.alleles.org/data/txt/b_gen.txt)和另外的9种HLA-B*15：02 沉默突变(B*15:02:01-B*15:02:09)，发现位于HLA-B内含子5的SNP rs144012689存在于HLA-B*15：02中，而非绝大多数其他等位基因中。在负链上，rs144012689的主要等位基因是A，次要等位基因是T。只有HLA-B*15： 02和HLA-B*15：13在rs144012689处含有“T”的变体SNP，所有其他HLA-B 单倍型在该位置含有“A”的野生型SNP。因此，如果rs144012689是检测 HLA-B*15：02的准确标记，并且由于存在该等位基因而暗示CBZ使用的风险，唯一已知的检测的假阳性是HLA-B*15：13，其等位基因频率比HLA-B*15： 02低约9倍(www.allelefrequencies.net；表1)。因此，我们假设 rs144012689可以作为HLA-B*15：02的可靠标记物，如下所示。

表1：HLA-B*15:02和HLA-B*15:13等位基因频率

首先，在全球人群以及亚洲人，高加索人和非洲人中发现rs144012689次要等位基因(A＞T)与HLA-B*15：02的等位基因频率相似(表2)。

表2：rs144012689次要等位基因和HLA-B*15:02的等位基因频率相似。

接下来，我们通过比较来自公众可获得的数据库的基因分型结果来测试rs144012689次要等位基因和HLA-B*15：02等位基因之间的相关性。从千人基因组浏览器和NCBI dbMHC门户(其中HLA分型通过标准Sanger测序完成)分别检索了千人基因组计划样品的rs144012689基因型结果和HLA-B分型结果。具体而言，如果存在HLA-B*15：02的一个或两个拷贝，则HLA-B*15：02基因分型结果被称为“阳性”，如果不存在HLA-B*15：02的拷贝则被认定为“阴性”，没有中间基因型。总体而言，在所有955个样品中rs144012689次要等位基因阳性(在负链上含有‘T’(次要)等位基因的样品)和HLA-B*15：02 阳性之间观察到100％一致性。如表3所示，在这995个样本中，有12个真阳性(TP)样本是rs144012689等位基因的杂合子，同时也是HLA-B*15：02等位基因阳性。有943例真阴性(TN)样本是rs144012689次要等位基因阴性(这些样本在负链上包含A/A；A为主要等位基因)，同时也是HLA-B*15：02等位基因阴性。在这955个样品中没有假阳性(FP；对于rs144012689次要等位基因呈阳性但对于HLA-B*15：02呈阴性的样品)或假阴性(FN；对于rs144012689 次要等位基因呈阴性但对于HLA-B*15：02呈阳性的样品)。该结果显示 HLA-B*15：02与rs144012689次要等位基因的相关性为100％精度(100％灵敏度和100％特异性)。这种相关性具有统计学意义(双尾菲希尔精确校验 P＝0.0001)。

表3：rs144012689次要等位基因阳性也是HLA-B*15:02阳性

TP(真阳性)＝rs144012689次要等位基因和HLA-B*15:02均呈阳性的样品

FP(假阳性)＝rs144012689次要等位基因呈阳性且HLA-B*15:02呈阴性的样品

FN(假阴性)＝rs144012689次要等位基因呈阴性且HLA-B*15:02呈阳性的样品

TN(真阴性)＝rs144012689次要等位基因呈阴性且HLA-B*15:02呈阴性的样品

PPV＝阳性预测值；NPV＝阴性预测值；

*P值通过双尾菲希尔精确校验计算。

为了进一步验证rs144012689次要等位基因与HLA-B*15：02之间的相关性，我们接着使用NGS对数千个患者样品进行HLA-B外显子2/3和内含子5测序，分别产生常规HLA-B基因分型和rs144012689基因分型(由纽约州欧斯宁 HistoGenetics LLC进行的NGS服务)。在≥25,000个患者样品的队列中，对检测HLA-B*15：02，rs144012689次要等位基因显示了100％灵敏度和99.96 ％特异性，未检测到假阴性。根据我们以前的资料(表4)，预计有9例假阳性，均为HLA-B*15：13。

表4：在MH患者样品中，rs144012689次要等位基因与HLA-B*15:02等位基因相关

PPV＝阳性预测值；NPV＝阴性预测值；

*P值通过双尾菲希尔精确校验计算。

令人满意且值得注意的是，没有来自＞25,000个测试患者样本的假阴性结果，证明rs144012689是HLA-B*15：02的有力且准确的生物标记物。这是因为如果患者被错误地鉴定为HLA-B*15：02阴性且给予药物(CBZ和相关药物)，则他们处于潜在致命的不良药物反应(SJS/TEN)的风险中。因此，在理想的 HLA-B*15：02筛选试验中必须避免假阴性。然而，目前可用的标记物如 rs2844682和rs3909184已被发现精度非常差且不能避免假阴性(Zhu，G.D. 等，“rs2844682和rs3909184基因型在鉴定HLA-B*15：02携带者方面没有临床价值”(Genotypes at rs2844682 and rs3909184 have no clinical value in identifyingHLA-B*15:02 carriers)《欧洲临床药理学(Eur J Clin Pharmacol)》，2015)。相反，rs144012689是HLA-B*15：02的强生物标记物，并且可以使用各种基因分型方法检测。

HLA-B基因分型

一方面，HLA-B的基因型可以通过使用本领域已知的任何合适技术确定DNA 多核苷酸序列(例如HLA-B的内含子5)来测量。用于分型的多核苷酸通常是基因组DNA或衍生自基因组多核苷酸序列的多核苷酸片段，例如在使用来自个体的基因组材料制备的文库中。可以通过分析从个体获得的生物样品中存在的核酸样品来确定rs144012689的存在。核酸可以从血液样品、细胞或组织中分离。用于分离核酸的方案是已知的。

如本领域技术人员所理解的，可以在本公开中使用各种合适的基因分型试验。这包括使用等位基因特异性寡核苷酸的杂交、引物延伸、等位基因特异性连接、测序(例如焦磷酸测序)、电泳分离技术、单碱基延伸试验、DNA微阵列、高分辨率熔解法、变性高效液相层析、质谱法、以基于微球的悬浮阵列平台(Luminex)为基础的试验等。示例性的试验包括5'核酸酶试验、分子信标等位基因特异性寡核苷酸试验和通过实时焦磷酸酯序列的SNP打分。本领域已知的其他合适的方法也可用于本公开内容以检测SNP的存在。

在一些实施方式中，可以在包括使来自个体的多核苷酸样品与多态性的特异性结合剂接触并确定试剂是否结合多核苷酸的方法中检测多态性，其中结合指示多态性存在。所述结合剂还可以在多态性的一侧或两侧上结合侧翼核苷酸，例如总共或在每侧上至少2、5、10、15或更多侧翼核苷酸。在确定多核苷酸中存在多态性的情况下，可以以双链形式检测，但通常以单链形式检测。

所述结合剂通常可以是具有至少10个核苷酸的长度、例如至少15、20、30 或更多个核苷酸的多核苷酸(单链或双链)。用于该方法中的多核苷酸试剂通常以序列特异性的方式与目的多态性和侧翼序列结合(例如按照Watson-Crick 碱基配对杂交)，因此通常具有与多态性和侧翼区序列完全或部分互补的序列。所述结合剂可以是在结构上与包含能够参与Watson-Crick碱基配对的单元(例如嘌呤或嘧啶类似物、肽核酸或RNA衍生物如锁核酸(LIMA))的多核苷酸类似的分子。结合剂可以是蛋白质，通常具有至少10个氨基酸的长度、例如至少20、30、50或100或更多氨基酸。结合剂可以是抗体(包括这种能够结合多态性的抗体的片段)。

在本发明方法的一个实施方式中，使用结合剂作为探针。探针可以被标记或能够被间接标记。标签的检测可用于检测个体的核酸上(结合的)探针的存在。探针与多核苷酸的结合可用于固定探针或多核苷酸(从而将其从一种组合物或溶液中分离出来)。在另一个实施方式中，个体的多核苷酸被固定在固体支持物上，然后与探针接触。然后直接通过检测探针上的标记或通过使探针与结合探针的部分接触来检测(通过其与多态性的结合)固定在固体支持物上的探针的存在。在检测多核苷酸多态性的情况下，固体支持物通常由硝酸纤维素或尼龙制成。

在一些实施方式中，可以使用非天然修饰的探针。探针可以被人工修饰以具有附着于其上的可检测标记或染料，因此是非天然存在的。探针可以含有选自SEQ ID NO：5、SEQID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO： 9和/或SEQ ID NO：10的序列。可检测标记或染料可以共价、非共价、直接或间接连接到探针上。标签可以是荧光的或非荧光的(例如，半抗原如生物素和地高辛)。本领域已知的常用荧光标记包括罗丹明、荧光素和花青及其衍生物、 ATTO、Eterneon^TM、AlexaDy、Cy3^TM、Cy3.5^TM、Cy5^TM、Cy5.5^TM、HEX、 TET、FAM、VIC和Dabcyl。这些荧光标记可以通过例如荧光光谱直接检测。生物素和地高辛是间接标记，因为它们的可视化分别需要第二报告分子、链霉亲和素以及地高辛抗体。标记可以合成后通过具有6-碳间隔臂的氨基或巯基接头连接到寡核苷酸的5'-末端。染料也可以在合成过程中通过其亚磷酰胺直接偶联。通过用5-C6-氨基-2'-脱氧胸腺嘧啶核苷取代任何胸苷，可能在序列内部位点上合成后标记寡核苷酸。另外，如果需要，所有其他碱基可以被替代。还可以在合成后通过氨基连接来标记寡核苷酸的3'-末端。标记的或未标记的探针可以用于以下一种或多种：直接结合试验，SNP阵列和基因分型。

本发明的方法可以基于使用两种寡核苷酸探针的寡核苷酸连接试验。这些探针与含有多态性的多核苷酸上的相邻区域结合，(在结合后)允许两种探针通过适当的连接酶连接在一起。然而，两种探针只能(以允许连接的方式)结合到含有多态性的多核苷酸上，因此可以使用连接产物的检测来确定多态性的存在。

在一个实施方式中，探针被用于基于异源双链体分析的***以检测多态性。在这样的***中，当探针与含有多态性的多核苷酸序列结合时，它在多态性出现的位点形成异源双链体(即不形成双链结构)。这种异源双链体结构可以通过使用单链或双链特异性的酶来检测。通常，探针是RNA探针，且所使用的酶是裂解异源双链体区域的RNA酶H，因此可以通过检测裂解产物来检测多态性。

该方法可以基于荧光化学切割错配分析，例如在《PCR方法和应用(PCR Methodsand Applications)》3：268-71(1994)和《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》85：4397-4401(1998)中所描述的。在一个实施方式中，多核苷酸试剂只有在其结合含有多态性的多核苷酸(即序列或等位基因特异性PCR***)时才能够充当PCR反应的引物。因此，如果多态性存在于个体的多核苷酸中，则仅产生PCR产物，并且通过检测PCR产物来确定多态性的存在。与多态性互补的引物的区域优选位于引物3'端或其附近。在该***的一个实施方式中，多核苷酸试剂将与野生型序列结合，但不会作为PCR反应的引物起作用。

该方法可以是基于限制性片段长度多态性(RFLP)的***。如果多核苷酸中多态性的存在产生或破坏了由限制酶识别的限制性位点，则可以使用这种方法。因此，与相应的野生型序列相比，具有这种多态性的多核苷酸的处理将导致产生不同的产物。因此，特定限制性消化产物的存在的检测可以用于确定多态性的存在。例如，PCR-RFLP是通过PCR产物的限制性内切酶消化、并通过凝胶电泳分析所得片段的大小来检测基因组DNA序列的变异的技术。

多态性的存在可以基于凝胶电泳期间多态性的存在造成的多核苷酸或蛋白质的移动性的变化来确定。在多核苷酸的情况下，可以使用单链构象多态性 (SSCP)分析。与相应的野生型多核苷酸相比，这测量了单链多核苷酸在变性凝胶上的移动性，移动性差异的检测表明多态性的存在。变性梯度凝胶电泳 (DGGE)是一种类似的***，其中多核苷酸通过具有变性梯度的凝胶进行电泳，与相应的野生型多核苷酸相比，移动性差异表明多态性的存在。

多态性的存在可以使用基于荧光染料和淬灭剂的PCR测定法如检测***来测定。在检测多态性的另一种方法中，包含多态性区域的多核苷酸在含有多态性的区域上进行测序以确定多态性的存在。

肽核酸(PNA)亲和力试验是传统杂交试验的衍生(Nielsen等，《科学 (Science)》254:1497-1500(1991)；Egholm等，《美国化学学会杂志(J. Am.Chem.Soc.)》1 14:1895-1897(1992)；James等，《蛋白质科学(Protein Science)》3:1347-1350(1994))。PNA是遵循Watson-Crick碱基配对规则的结构DNA模拟物，并用于标准DNA杂交试验。PNA在杂交试验中显示出更高的特异性，因为PNA/DNA错配比DNA/DNA错配更不稳定，并且互补的PNA/DNA 链形成比互补DNA/DNA链更强的键。

已经开发了DNA微阵列以检测遗传变异和多态性(Taton等，《科学 (Science)》289：1757-60,2000；Lockhart等，《自然(Nature)》405： 827-836(2000)；Gerhold等，《生化科学趋势(Trends in Biochemical Sciences)》24：168-73(1999)；Wallace，R.W.，《今日分子医学(Molecular Medicine Today)》3：384-89(1997)；Blanchard和Hood，《自然生物技术(Nature Biotechnology)》149：1649(1996))。DNA微阵列是由高速机器人在玻璃或尼龙基材上制造的，含有已知相同性的DNA片段(“探针”)。微阵列用于根据传统碱基配对规则匹配已知和未知的DNA片段(“靶”)。蛋白质截断试验(PTT)也常用于检测遗传多态性(Roest等，《分子遗传学 (Molecular Genetics)》2：1719-1721(1993)；Van Der Luit等，《遗传学(Genomics)》20：1-4(1994)；Hogervorst等，《自然遗传学(Nature Genetics)》10：208-212(1995))。通常，在PTT中，感兴趣的基因被PCR 扩增，进行体外转录/翻译、纯化，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。

在一个实施方式中，可以使用SNP阵列来检测rs144012689。可以设计含有固定的等位基因特异性寡核苷酸探针的阵列。在某些实施方案中，探针可以包括选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：10的一个或多个序列。靶核酸序列可以从样品获得，片段化并用例如荧光染料标记。然后可以使靶核酸序列与阵列上的探针杂交。在一个实施方式中，杂交条件被控制为严格以便仅允许以100％互补性结合。记录和解释杂交信号的检测***被用于检测杂交，从而确定样品中存在的等位基因。

适用于本发明方法的各种其他检测技术对于那些熟悉检测、鉴定和/或区分多态性的方法的技术人员而言将是显而易见的。这样的检测技术包括但不限于直接测序、使用“分子信标”(在杂交时发荧光的寡核苷酸探针，可用于实时荧光PCR；参见例如Marras等，《遗传分析(Genet Anal)》14：151(1999)) 的使用；电化学检测(还原或氧化DNA碱基或糖；参见Thorp等人的美国专利第5,871,918号)；滚圈扩增(参见例如Gusev等，《美国病理学杂志(Am J Pathol)》159：63(2001))；第三浪潮科技公司(Third Wave Technologies) (威斯康星州麦迪逊)的基于非PCR的检测方法(参见例如Lieder，《实验室管理者进展(Advancefor Laboratory Managers)》，70(2000))。因此，在本方法中可以使用本领域已知的任何合适的检测技术。

常规的分子生物学、微生物学和重组DNA技术，包括测序技术在本领域技术人员中是众所周知的。这些技术在文献中有充分的解释。参见例如 Sambrook，Fritsch&Maniatis，《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning： A Laboratory Manual)》，第二版(1989)冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港(在此为“Sambrook等，1989”)；《DNA克隆：实践方法(DNACloning： A Practical Approach)》，第I和II卷(D.N.Glover编，1985)；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《核酸杂交(Nucleic AcidHybridization)》(B.D.Hames与S.J.Higgins编 (1985))；《转录和翻译(TranscriptionAnd Translation)》(B.D.Hames 与S.J.Higgins编(1984))；《动物细胞培养(Animal CellCulture)》 (R.I.Freshney编(1986))；《固化细胞和酶(Immobilized Cells AndEnzymes)》(IRL出版社，(1986))；B.Perbal，《分子克隆实践指南(A Practical Guide ToMolecular Cloning)》(1984)；F.M.Ausubel等(编)，《新编分子生物学实验指南(CurrentProtocols in Molecular Biology)》，约翰·威利父子公司(1994)。

包括基因或PCR产物或其片段或部分的任何核酸的序列可通过本领域已知的任何方法(例如化学测序或酶测序)进行测序。DNA的“化学测序”可以表示诸如Maxam和Gilbert(1977)(《美国国家科学院院刊 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》74：560)的方法，其中使用各个碱基特异性反应随机切割DNA。DNA的“酶测序”可以表示诸如Sanger等的方法(Sanger等，(1977)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》74：5463)。

特别是，下一代测序技术使得研究人员能够以较低的成本获得大量的数据，从而为任何物种的个体进行深度基因分型提供了巨大的机会(Lai等，“精英玉米自交系中遗传变异的全基因组模式”(Genome-wide patterns of genetic variation among elitemaize inbred lines)，2010，《自然遗传(Nat Genet)》42：1027-1030)。最近，开发了几种基因分型测序(GBS)方法来同时对数百个个体进行基因分型(Andolfatto等，“多重***枪基因分型用于快速高效的遗传作图”(Multiplexed shotgun genotyping for rapid andefficient genetic mapping)2011，《基因组研究(Genome Res)》21：610-17；Baird等，“使用测序的RAD标记的快速SNP发现和遗传作图”(Rapid SNP discovery and geneticmapping using sequenced RAD markers)，2008，PLoS One 3：e3376；Elshire 等，“一种高多样性物种的稳健、简单的基因分型测序(GBS)方法”(A Robust，Simple Genotyping-by-Sequencing(GBS)Approach for High Diversity Species)2011 PLoS One 6(5)：e19379)。

一旦核酸被获得、扩增和/或片段化，就可以使用任何合适的测序技术对其进行测序。例如，可以将衔接子添加到核酸中，然后进行例如基于的测序技术。这样的衔接子可以向添加它们的每个片段提供已知序列，该已知序列被设计成在测序过程期间提供使用的引物的结合位点。可以使用的测序技术的其它例子包括但不限于Sanger测序、下一代测序 (NGS或第二代测序)、高通量测序、超高通量测序、超深度测序、大规模平行测序、基于454的测序(罗氏公司(Roche))、基于基因组分析仪的测序(Illumina/Solexa)、Iontorrent：Proton/PGM测序和基于ABI-SOLiD 的测序(应用生物***公司(AppliedBiosystems))。

简言之，在基于基因组分析仪的测序(或Illumina测序)中，输入样品被切割成100-150bp的读段。将片段连接到通用衔接子并连接到载玻片上。进行PCR以使用衔接子特异性引物扩增每个读段，产生具有相同读段的许多拷贝的点，然后将其分成单链进行测序。载玻片铺满核苷酸和DNA 聚合酶。这些核苷酸被荧光标记，具有对应于不同碱基的不同颜色。核苷酸还具有终止子，因此一次只能添加一个碱基。每个循环对载玻片拍摄一个图像。在每个读取位置，将会有一个荧光信号指示已添加的碱基。然后将载玻片准备用于下一个循环。去除终止子以使其可以添加下一个碱基，并且去除荧光信号以防止信号污染下一个图像。重复该过程，一次添加一个核苷酸并在之间成像。然后使用计算机检测每个图像中每个位点的碱基，并用这些碱基构建序列。

在罗氏的基于454的测序中，核酸被片段化为高达1kb的读段。通用衔接子被添加到末端并连接到珠子，每个珠子一个DNA片段。然后使用衔接子特异性引物通过PCR扩增片段。然后将每个珠子放置在载玻片的一个单孔中。这些孔还含有DNA聚合酶和测序缓冲液。载玻片充满了四种dNTP种类之一。如果这个核苷酸是序列中的下一个，则将其添加到序列读段中。如果单个碱基重复，则添加更多。每个核苷酸的添加释放一个光信号。信号的这些位置被检测并用于确定核苷酸被添加到哪个珠子。然后洗掉dNTP 混合物。现在添加下一个dNTP混合物并重复该过程，循环通过四个dNTP。生成每个序列读数的图表，显示每个核苷酸洗涤的信号密度。然后可从每次洗涤中的信号密度计算确定序列。

Ion Torrent和Ion质子测序利用了向DNA聚合物添加dNTP会释放H+ 离子的事实。首先，将输入的DNA或RNA片段化至～200bp读段。添加衔接子并且一个分子被放置在一个珠子上。通过乳液PCR在珠子上扩增分子。将每个珠子放置在载玻片的一个单孔中。载玻片上充满了单一种类的dNTP，连同缓冲液和聚合酶，一次一个dNTP。检测每个孔中的pH，因为释放的每个H+离子都会降低pH。pH的变化允许确定该碱基是否以及其中多少被添加到所读序列中。dNTP被洗掉，并且通过不同的dNTP种类循环该过程。使用 pH变化(如果有的话)来确定在每个循环中加入了多少碱基(如果有的话)。

在基于ABI-SOLiD的测序中，从待测序的样品制备DNA片段文库，并且用于制备在每个珠子的表面上仅存在一种片段的克隆珠子群体。连接到珠子上的片段将具有连接的通用P1衔接子序列，从而每个片段的起始序列都是已知的并且是相同的。在微反应器中进行乳液PCR。然后将所得到的连接到珠上的PCR产物共价结合到载玻片上。引物与文库模板内的P1衔接子序列杂交。一组四个荧光标记的二碱基探针竞争连接测序引物。二碱基探针的特异性是通过调查每个连接反应中的每个第一和第二碱基来实现的。执行可确定最终读段长度的循环次数的循环，该循环包括连接、检测和切割。在一系列连接循环之后，去除延伸产物，并且用第二轮连接循环的与n-1 位置互补的引物重新设置模板。对各序列标签完成五轮引物的重新设定。通过所述引物重新设定过程，每个引物在两个独立的连接反应中被两个不同的引物所调查。例如，读取位置5处的碱基由连接循环2中的引物编号2 和连接循环1中的引物编号3来测定。

在一些情况下，使用各种下一代测序技术来测序由长范围PCR产生的大量核酸片段。在一些情况下，来自不同个体(例如；2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12或20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500或更多个，或之间任何数量的不同的人)的核酸可以同时测序。在这样的情况下，可以为每个个体使用独特的衔接子，使得每个测序片段可以被分配给片段所源自的特定个体。

试验

在一个实施方式中，可以使用试验来检测rs144012689的存在。在该试验中，可以使用在探针的5'末端使用报告染料(例如荧光如FAM或VIC) 标记并在探针的3'末端用淬灭剂染料(例如，非荧光淬灭剂)标记的寡核苷酸探针。淬灭剂与完整探针的接近维持了报告物的低荧光。在PCR反应过程中， DNA聚合酶的5'核酸酶活性对探针进行切割，并分离染料和淬灭剂。从而导致报告物的荧光增加。PCR产物的积累通过监测报告染料荧光的增加被直接检测。 DNA聚合酶的5'核酸酶活性仅在探针与靶标杂交且在PCR期间扩增的情况下在报高物与淬灭剂之间对探针进行切割。只有当存在特定的SNP等位基因时，才将探针设计为跨过靶SNP位置并与核酸分子杂交。

使用寡核苷酸引物和探针进行基因分型。寡核苷酸可以通过本领域已知的任何合适的方法(例如化学合成)合成和制备。寡核苷酸也可以方便地通过商业来源获得。本领域技术人员之一将容易地在PCR反应中优化和鉴定感兴趣的基因侧翼的引物。可以使用商业可获得的引物来扩增特定SNP的感兴趣的特定基因。许多计算机程序(例如Primer-Express)可用于设计最佳引物/探针组。对于本领域技术人员显而易见的是，可以相应地制备基于提供的核酸信息 (或公开可获得的登录号)的引物和探针。

用于标记探针的方法是本领域已知的。标记的探针用于在扩增区域内的扩增区域内进行杂交。探针被修饰以避免它们作为扩增的引物。检测探针用两种染料标记，一种能够在接近时淬灭另一种染料的荧光。一种染料连接到探针的 5'末端，另一种连接到内部位点或3'末端，以便当探针处于杂交状态时发生淬灭。

示例性的引物和探针示于下表8。设计两组引物用于巢式PCR，第一是外部组引物(“前置扩增正向引物”和“前置扩增反向引物”)，产生约120bp的扩增子，第二是内部组引物(“正向引物”和“反向引物”)，产生大约70bp 的扩增子。应该指出的是，对于常规的Taqman试验，一个引物组(例如外部组)是足够的。当例如在高通量筛选中使用小反应体积和/或样品DNA含量低时，巢式PCR方法对于增加TaqMan试验信号强度可能是理想的。

还设计了两组三种探针。探针序列中第二个粗体和加下划线的字母代表rs144012689(A/T)的位置；而第一个粗体和加下划线的字母表示在所有被靶向的单倍型中出现的另一个SNP(C/G)。因此，本文描述的试验中包括三种探针，但是通常两种探针在靶向1种SNP的常规试验中是足够的。

表8：试验引物和探针的示例性序列

上述示例性引物和探针在迄今为止进行的试验中实际上很好地发挥作用。然而，本领域的普通技术人员将会理解，可以基于HLA-B基因序列设计备选的引物和探针。用于设计引物和探针的算法被广泛使用并且在本领域中易于获得(例如，可以在www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/获得的Primer-BLAST)。实质上，可以使用适合于在聚合酶链式反应中扩增HLA-B基因的任何引物。在一些实施方式中，可能希望将最大扩增子大小保持为小于400bp(例如 50-150bp)。探针应被设计为靶向rs144012689区域，具有合适的长度(例如，18-22个碱基但可以更长或更短)以及如本文所讨论的适当的染料标记。

另外，引物设计领域的普通技术人员将认识到给定的引物不需要以100 ％互补性杂交以引发互补核酸链的合成。引物对序列可以是几个比对序列中的“最佳拟合”，因此它们不需要在比对中与任何一个序列的杂交区域完全互补。而且，引物可以在一个或多个区段上杂交，使得间插或相邻区段不参与杂交事件(例如，环状结构或发夹结构)。所述引物可以包含与感兴趣的靶核酸有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90 ％、至少95％或至少99％的序列相同性。因此，在一些实施方式中，相对于本文公开的特定引物序列，70％至100％或落入其中的任何范围内的序列相同性的变异程度是可能的。

为了说明，在下面的例子中描述了序列相同性的确定。长度为20个核碱基的引物与另一个长度为20个核碱基的引物有两个不同的残基，具有 18/20个相同残基(18/20＝0.9或90％序列相同性)。在另一个例子中，长度为15个核碱基的引物的全部残基与长度为20个核碱基的引物的15个核碱基段相同，与20个核碱基的引物具有15/20＝0.75或75％的序列相同性。百分比相同性不需要是整数，例如，28个连续的核碱基引物与31个连续的核碱基引物(28/31＝0.9032或90.3％相同)完全相同。百分比同源性、序列相同性或互补性可以通过例如Gap程序(Wisconsin序列分析软件包，

Unix版本8，遗传学计算机组，大学研究园区，威斯康星州麦迪逊)使用默认设置来确定，该默认设置使用Smith和Waterman的算法(《应用数学进展(Adv.Appl.Math.)》1981,2,482-489)。在一些实施方式中，引物相对于靶核酸的保守引发区的互补性在约70％与约80％之间。在其它实施方式中，同源性、序列相同性或互补性在约80％至约90％之间。在其他实施方式中，同源性、序列相同性或互补性为至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或为100 ％。在一些实施方式中，本文使用的引物包含与本文中具体公开的引物序列有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少98％或至少99％、或100％(或落入其中的任何范围)的序列相同性。

试验可使用设计和合成的引物和探针如下进行。首先，每个样品用125ng基因组DNA进行14个循环的预扩增(前置扩增)PCR。示例性的PCR程序包括在95℃初始变性10分钟，随后将在95℃变性15秒并在60 ℃退火和延伸4分钟进行14个循环，并保持在4℃1小时，然后无限期地 10℃。然后，将PCR产物稀释为1:5(通过向每个10μl样品中加入40μl1xTE)，并且仅使用4.2μl稀释的PCR产物用于总计96个反应。样品主混合物通过混合基因分型主混合物、DNA聚合酶、上样试剂和水来制备。对于每个样品，混合5.8μl样品主混合物和4.2μl稀释的前置扩增PCR产物。然后将约6μl的混合物加载到指定的样品孔中。通过混合引物和探针制备20x试验混合物。对于每个测定，将100μl 20x试验混合物与100μl 2x试验上样试剂混合，并将约6μl 10x试验混合物加载到指定的测定孔中。加载样品和试验混合物后进行实时PCR步骤。示例性的前置扩增PCR制备、样品主混合物和20x试验混合物制备示于下表9中。

表9：示例性的试验混合物

然后可以在任何合适的实时PCR仪上进行实时PCR，例如由Fluidigm或AppliedBiosystems制造的可以实时记录荧光水平的实时PCR仪。

使用在rs144012689的次要等位基因上设计的基因分型试验来检测HLA-B*15：02，以高通量、低成本的HLA-B*15：02筛选测试＞1000 个患者样品。结果显示在表10和图1中，具有惊人的100％灵敏度和100 ％特异性。

表10：由定制实时PCR基因分型试验检测的rs144012689次要等位基因与HLA-B*15：02状态相关

PPV＝阳性预测值；NPV＝阴性预测值；

*P值通过双尾菲希尔精确校验计算。

本公开的各个方面可以单独使用、组合使用、或者以前面描述的实施例中未具体讨论的各种配置使用，因此在其应用上不限于在前面的描述中阐述的或者在附图中示出的部件的细节和布置。例如，一个实施方式中描述的方面可以以任何方式与其他实施方式中描述的方面组合。而且，本文所用的词语和术语是为了描述目的，而不是限制性的。

在权利要求中使用诸如“第一”，“第二”，“第三”等来修饰权利要求的顺序术语本身并不意味着一个权利要求要素相对于另一要素的任何优先级、优先顺序或顺序、或者执行方法的行为的时间顺序，而是仅被用作标记，以区分具有某一名称的一个权利要求要素与具有相同名称的另一要素(但使用了序数词则)来区分权利要求要素。

而且，本文所用的词语和术语是为了描述目的，而不是限制性的。本文使用“包含”、“包括”、或“具有”、“含有”、“涉及”及其变化意味着涵盖其后列出的项目及其等价物，以及额外的项目。“基本上由...组成”是指包括其后列出的项目，并且对未列举的项目开放，这些项目不实质上影响本发明的基本和新颖性。

通过引用纳入

通过EFS-Web在2016年6月28日创建的名为“010102PCTseq.txt”的具有1732字节大小的ASCII文本文件通过引用全部并入本文。

本文提到的所有发表物、专利和序列数据库条目在此通过引用全文纳入，就好像各个单独发表物或专利特定和单独地表明通过引用纳入。

序列表

<110> 千年健康有限公司

<120> HLA-B*15:02的单核苷酸多态性及其应用

<130> 159372-010102/PCT

<150> US 62/186,219

<151> 2015-06-29

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

tcaagcccca ggtagaagtg tt 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 2

cattgtcaca tgtgctgcac aa 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 3

agtgttccct gcctcattac 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 4

agagtaagtg ctggcacaca 20

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 5

aagcagcatc ctcacag 17

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 6

aagcagcatc cacacag 17

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 7

aagcagcatg cacacag 17

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 8

cagcatcctc acaggggcta a 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 9

cagcatccac acaggggcta a 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 10

cagcatgcac acaggggcta a 21

Claims

1.一种HLA-B*15:02等位基因的分离的生物标记物，其包括rs144012689。

2.如权利要求1所述的生物标记物，其中rs144012689次要等位基因T的存在表示HLA-B*15:02等位基因的存在。

3.如权利要求1或2所述的生物标记物在预测、减少和/或防止卡马西平和其相关药物诱导的不良药物反应中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其中所述不良药物反应包括卡马西平诱导的严重不良皮肤反应。

5.一种检测HLA-B*15:02等位基因的方法，包括：获得样品；以及确定样品中rs144012689次要等位基因T的存在。

6.如权利要求5所述的方法，所述方法还包括对样品进行选自基因分型、SNP阵列和下一代测序的试验。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述基因分型包括在Taq DNA聚合酶、使得由其产生的扩增子包含rs144012689的HLA-B基因中指定的一对引物、和与扩增子的位于或邻近rs144012689的部分杂交的非天然修饰的探针的存在下对样品进行聚合酶链式反应。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述探针包括一个或多个选自SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：10的序列。

9.如权利要求7所述的方法，所述方法还包括用具备SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQID NO：7序列的三种探针对样品进行基因分型。

10.如权利要求7所述的方法，所述方法还包括用具备SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQID NO：10序列的三种探针对样品进行基因分型。

11.如权利要求7所述的方法，其中所述探针具有报告染料和与其附连的淬灭剂染料，当两者附连时，淬灭剂染料淬灭来自报告染料的信号，且当报告染料和淬灭剂染料中的一个或两者从探针中释放时，报告染料放出信号。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述信号是荧光。

13.如权利要求11所述的方法，其中当探针与扩增子在rs144012689或其附近杂交时，报告染料和淬灭剂染料中的一个或两者可通过Taq DNA聚合酶从探针中释放。

14.如权利要求6所述的方法，其中所述SNP阵列包括多个与其结合的核酸，其中多个核酸包括一个或多个选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：9和/或SEQ ID NO：10的序列。

15.如权利要求14所述的方法，所述方法还包括使来自样品的DNA与多个核酸杂交。

16.如权利要求15所述的方法，所述方法还包括标记来自样品的DNA。

17.如权利要求5-16中任一项所述的方法，其中样品来自有需要且给予卡马西平之前的患者。

18.如权利要求5-17中任一项所述的方法，其中样品包含基因组DNA。

19.一种非天然修饰的探针，其包括选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQID NO：8、SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：10的序列，其中所述探针附有可检测的标签。

20.一种双链核酸分子，其包括非天然修饰的探针和与探针互补且退火的靶序列，其中所述探针包括选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：10的序列，其中所述探针附有可检测的标签。

21.一种固相，其具有多个与其结合的核酸，其中多个核酸包括一个或多个选自SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：10的序列。

22.一种固相，其具有多个与其结合的核酸和退火至核酸的靶序列，其中多个核酸包括一个或多个选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：10的序列。

23.一种处理需要卡马西平的患者的方法，包括：

从患者获得样品，

确定样品中存在或不存在rs144012689次要等位基因T，以及

在不存在rs144012689次要等位基因T的情况下，向患者给予卡马西平。

24.一种用于检测样品中HLA-B*15:02等位基因的试剂盒，其包括选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：10的探针。

25.如权利要求24所述的试剂盒，其包括三种具有SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、和SEQID NO：7序列的探针。

26.如权利要求24所述的试剂盒，其包括三种具有SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、和SEQID NO：10序列的探针。

27.如权利要求24-26中任一项所述的试剂盒，其中探针在5’末端用荧光染料标记且在3’末端用淬灭剂标记。

28.如权利要求24-26中任一项所述的试剂盒，还包括：

HLA-B基因中指定的一对引物，使得由其产生的扩增子包括rs144012689；

dNTP；以及

Taq DNA聚合酶。