CN102516344B - 一种具有抗肿瘤活性的化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有抗肿瘤活性的化合物，为式I结构的化合物，不但可应用于制备抗肿瘤药物，而且还可以用于制备预防肿瘤的药物。本发明还公开了一种具有抗肿瘤活性的化合物的制备方法，包括：将毛酸浆宿萼用提取溶剂回流提取，得到提取液；将提取液浓缩，用水稀释后用有机溶剂萃取，所述的有机溶剂至少包括二氯甲烷，得到二氯甲烷萃取液；将二氯甲烷萃取液经浓缩后过色谱柱，经过洗脱体系洗脱后重结晶得到具有抗肿瘤活性的化合物。该制备方法简单可靠，可操作性强，效率高，可进行工业化大生产，有利于推广应用，具有良好的应用前景。

Description

一种具有抗肿瘤活性的化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物化学医药领域，具体涉及一种从毛酸浆中提取的具有抗肿瘤活性的化合物及其制备方法和应用。

背景技术

WITHANOLIDE型化合物是一类具有28个碳原子的麦角甾烷型的甾体类化合物，其主体结构如式II结构所示，其中，式II结构中的T部分可能是a、b、c、d、e、f、g、h中的一种。WITHANOLIDE型化合物分为经典型和非经典型。经典WITHANOLIDE型化合物在自然界占有绝对多数，这些化合物主要分布在茄科(Solanaceae)的几个属中，几个属中就包括了酸浆属(Physalis)。WITHANOLIDE型化合物的生物活性主要集中体现在抗肿瘤、抗炎、抗菌以及作为植物的昆虫拒食剂等方面。由于此类化合物的结构复杂，而且手性中心很多，因此，此类化合物多借助于二维核磁共振谱(2DNMR)、圆二色谱(CD)、X-单晶衍射(X-ray)等先进技术进行结构的鉴定。

目前，对于癌症的治疗仍以化疗和放疗作为首选，两者虽对肿瘤的治疗取得了相当的疗效。但由于缺乏对肿瘤细胞的特异性，因而具有较大的毒副作用，同时某些肿瘤细胞对化疗和放疗处理的不敏感，这样在很大程度上限制了化疗和放疗在临床中的应用。因此，人们把目光转向中药，试图从天然成分中寻找毒副作用小、作用独特的抗肿瘤药物。

毛酸浆(P.pubescens L)为茄科酸浆属植物，黑龙江有产，尤以齐齐哈尔依安县最好。毛酸浆，性味苦寒，归肺经，具有清热解毒、利咽、化痰、利尿等功效，可应用于咽痛音哑、痰热咳嗽、小便不利、外治天泡疮、湿疹等疾病的治疗。现代药理学研究表明毛酸浆具有抗炎、抗菌、抗癌等活性，其抗炎机理是抑制正常人外周血多形核白细胞(PMN)氧自由基的产生和释放而发挥作用。迄今为止，国内外对毛酸浆的抗肿瘤活性的报道甚少。

文献“毛酸浆果提取物的抑菌活性研究”(郑敬彤；毛酸浆果提取物的抑菌活性研究；中国实验诊断学；2010年第14卷第6期)公开了毛酸浆化学成分抑菌方面的研究，包括乙醇提取，提取物抑菌活性测试，虽然对提取物化学成分进行了抑菌方面的研究，但并没有对其化学成分进行分离和抗肿瘤活性的测试的研究，对毛酸浆活性成分的研究范围局限于提取物的抑菌活性，存在着技术缺陷。

文献“毛酸浆宿萼的化学成分研究”(张辉；毛酸浆宿萼的化学成分研究；中草药；2010年第11期)公开了毛酸浆干燥宿萼的化学成分研究，包括化合物的提取分离，单体化合物的生物活性筛选，虽然对其化学成分进行了分离得到4个甾醇类化合物和11个黄酮类化合物，但并没有分离得到WITHANOLIDE型化合物，并且也没有发现高效的具有抗肿瘤活性化合物，存在技术缺陷。

为了探索这一药食两用的植物(即毛酸浆)是否具有抗肿瘤有效成分，发明人对毛酸浆宿萼提取物中具有抗肿瘤活性的化学成分进行了研究。

发明内容

本发明提供了一种具有抗肿瘤活性的化合物，属于经典WITHANOLIDE型化合物。

一种具有抗肿瘤活性的化合物，为式I结构的化合物：

式I

该化合物的核磁共振氢谱和核磁共振碳谱的结果如表1所示，通过核磁共振氢谱和核磁共振碳谱的表征，可以表明从毛酸浆中提取的具有抗肿瘤活性的化合物的结构如式I所示。

表1

(in CDCl₃，¹H NMR 500MHz，¹³C NMR 125MHz)

Position	Cδ	Hδ
			1	202.2
2	132	6.23(1H，d，J＝10.0Hz)
			3	142.3	6.97(1H，dd，J＝5，10Hz)
4	69.6	3.8(1H，d，J＝5Hz)
			5	63.5
6	62	3.27(1H，s)
			7	30.2	2.1(1H，m)，1.5(1H，m)
8	29	1.75(1H，m)
			9	43.7	1.13(1H，m)
10	47.5
			11	21.8	1.9(1H，m)，1.5(1H，m)
12	39.3	1.96(1H，m)，1.25(1H，m)
			13	42.9
14	50	1.34(1H，m)
			15	75.9	4.84(1H，m)
16	37	1.55(1H，m)，2.13(1H，m)
			17	58.7	1.29(1H，m)
18	12.6	0.77(3H，s)
			19	17.3	1.45(3H，s)
20	38.4	1.75(1H，m)
			21	12.5	0.92(3H，d，J＝5Hz)
22	64.7	3.65(1H，m)
			23	29.3	1.7(2H，m)
24	64.7

25	63.7
			26	91.6	5.03(1H，s)
27	16.5	1.45(3H，s)
			28	18.8	1.44(3H，s)
29	170.7
			30	21.3	2.07(3H，s)

本发明还提供了一种具有抗肿瘤活性的化合物的制备方法，其制备简单、易于控制、可操作性强。

所述的具有抗肿瘤活性的化合物的制备方法，包括以下步骤：

1)将毛酸浆宿萼用提取溶剂回流提取，得到提取液；

所述的提取溶剂为醇或者含醇体积百分数50％～99.99％的醇水溶液；

2)将步骤1)中得到的提取液浓缩，用水稀释后再用有机溶剂萃取，得到二氯甲烷萃取液；

所述的有机溶剂至少包括二氯甲烷；

3)将步骤2)中得到的二氯甲烷萃取液经浓缩后过色谱柱，经过洗脱体系洗脱后重结晶得到具有抗肿瘤活性的化合物；

所述的洗脱体系为由石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱溶剂、由石油醚和丙酮组成的洗脱溶剂、由二氯甲烷和甲醇组成的洗脱溶剂、由氯仿和甲醇组成的洗脱溶剂中的一种。

为了取得更好的发明效果，以下作为本发明的优选：

步骤1)中，所述的醇为甲醇或乙醇，选择这两种醇时，提取溶剂的提取效率较高。更优选地，所述的提取溶剂为甲醇或含乙醇体积百分数95％的乙醇水溶液，该提取溶剂的性质非常适合于提取毛酸浆宿萼，能够更加完全地获取毛酸浆中的具有抗肿瘤活性的化合物。

每次加入相对于毛酸浆宿萼重量的6～10倍重量的提取溶剂，在90℃～100℃回流提取，每次提取的时间为2h～3h，提取2～3次。在这样的提取条件下，不但节省了提取溶剂的使用量，而且能充分将毛酸浆宿萼中的具有抗肿瘤活性的化合物提取，提高了提取率。

步骤2)中，所述的有机溶剂包括石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯，萃取时按极性大小依次使用单一有机溶剂进行萃取，一般采用等体积萃取，即每次使用的有机溶剂的体积与提取物用水稀释后得到的溶液的体积相等。根据相似相容原理，分别通过上述有机溶剂萃取，以使提取物用水稀释后得到的溶液按照极性由小到大分离，通过薄层色谱(TLC)检识毛酸浆中具有抗肿瘤活性的化合物***斑点几乎全部集中于二氯甲烷萃取液中，其他有机溶剂主要是为了进一步提取毛酸浆中的具有抗肿瘤活性的化合物或者除去其他极性物质使得提取到更多和更高纯度的具有抗肿瘤活性的化合物。

步骤3)中，所述的色谱柱所用的填料为氧化铝或100～200目的柱层层析硅胶。所述的二氯甲烷萃取液经浓缩后得到的浸膏与填料的重量比为1∶1～10。

所述的由二氯甲烷和甲醇组成的洗脱溶剂包括由体积比为20～30∶1的二氯甲烷和甲醇组成的洗脱溶剂。所述的由二氯甲烷和甲醇组成的洗脱溶剂包括由体积比为100∶1的二氯甲烷和甲醇组成的洗脱溶剂、由体积比为50∶1的二氯甲烷和甲醇组成的洗脱溶剂、由体积比为25∶1的二氯甲烷和甲醇组成的洗脱溶剂和由体积比为10∶1的二氯甲烷和甲醇组成的洗脱溶剂，并按极性由小到大依次进行梯度洗脱。

所述的由氯仿和甲醇组成的洗脱溶剂包括由体积比为40～60∶1的氯仿和甲醇组成的洗脱溶剂。所述的由氯仿和甲醇组成的洗脱溶剂包括由体积比为100∶1的氯仿和甲醇组成的洗脱溶剂、由体积比为50∶1的氯仿和甲醇组成的洗脱溶剂和由体积比为25∶1的氯仿和甲醇组成的洗脱溶剂，并按极性由小到大依次进行梯度洗脱。

采用由二氯甲烷和甲醇组成的洗脱溶剂或者由氯仿和甲醇组成的洗脱溶剂，并进行梯度洗脱，该洗脱体系洗脱能力强，并且通过薄层色谱(TLC)检识毛酸浆中的具有抗肿瘤活性的化合物几乎全部位于由体积比为25∶1的二氯甲烷和甲醇组成的洗脱溶剂或者由体积比为50∶1的氯仿和甲醇组成的洗脱溶剂，使得毛酸浆中的具有抗肿瘤活性的化合物更加集中，并且提高了分离效率。

所述的具有抗肿瘤活性的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。所述的肿瘤包括脑瘤、肺癌、肝癌、乳腺癌、***癌、胰腺癌、***、胃癌、食道癌等。本发明制备的具有抗肿瘤活性的化合物也可以应用于制备癌症化学预防药物和抑制肿瘤血管生成药物中。

以MTT法进行抗肿瘤作用的筛选，结果显示，本发明具有抗肿瘤活性的化合物对肿瘤细胞如乳腺癌细胞(MCF-7)、人肝癌细胞(HepG2)、人胃癌细胞(SGC7901)、人***细胞(Hela)具有明显抑制其增殖的作用，而对正常人外周血多形核白细胞(PMN)抑制作用较小。上述细胞株可采用市售产品，如可采用美国模式培养物集存库ATCC(American type culturecollection)的各种细胞株。

二相代谢酶对于预防肿瘤的发生具有重要意义，作为二相代谢酶之一的醌还原酶(NAD(P)H：quinone reductase，QR)是一类具有解毒、清除自由基作用的细胞保护酶，对醌还原酶具有诱导活性的成分被认为在肿瘤起始阶段具有癌症预防作用，醌还原酶水平的上调被认为是预防癌症发生的重要机制(参考文献：Hayes JD，McMahon M.Molecular basis for the contribution ofthe antioxidant responsive element to cancer chemoprevention.Cancer Letters，2001，174(2)：103-113.Gerhauser C，Klimo K，Heiss E，et al.Mechanism-basedin vitro screening of potential cancer chemopreventive agents.Mutat Res，2003，523-524：163-172.)。以MTT法进行癌症化学预防的筛选，即醌还原酶诱导实验，结果显示，本发明具有抗肿瘤活性的化合物能够诱导醌还原酶的表达，对醌还原酶具有诱导活性，具有癌症预防作用。

本发明具有抗肿瘤活性的化合物可与市售的载体或者常用的载体结合，用于制备预防或者/和***的药物。所述的药物可以为片剂、粉针剂等形式。

所述的具有抗肿瘤活性的化合物制成片剂，由以下重量份的原料制成：

具有抗肿瘤活性的化合物    50份；

黏合剂                    2～10份；

羧甲淀粉钠                6～14份；

淀粉                      12～20份；

硬脂酸镁                  0.5～1.5份；

所述的黏合剂由含羟丙甲纤维素的质量百分数为1％～10％的羟丙甲纤维素水溶液和含淀粉的质量百分数为4％～10％的淀粉浆按照重量比3∶10混合而成。该药物片剂对乳腺癌细胞(MCF-7)、人肝癌细胞(HepG2)、人胃癌细胞(SGC7901)、人***细胞(Hela)具有很强的抑制作用，而对正常人外周血多形核白细胞(PMN)抑制作用较小。

本发明具有抗肿瘤活性的化合物，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将本发明具有抗肿瘤活性的化合物配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5～8，较佳的pH约为6～8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、皮下、皮内或局部给药。

以本发明具有抗肿瘤活性的化合物为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。药物制剂的形式应与给药方式相匹配。本发明可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂、胶囊之类的药物，可通过常规方法进行制备。药物如针剂溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制备。药物活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天1μg/kg体重～约2000mg/kg体重。此外，本发明具有抗肿瘤活性的化合物还可以与其他治疗剂一起使用。

当本发明具有抗肿瘤活性的化合物被用作药物时，可将治疗有效剂量的该化合物施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地，该有效剂量是约10微克/千克体重～约1毫克/千克体重。当然，具体有效剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明具有抗肿瘤活性的化合物为有效的抗肿瘤药物的活性成分，在毛酸浆植物中含量高，生产成本较低。本发明具有抗肿瘤活性的化合物除了对肿瘤细胞具有毒性作用外，还具有诱导醌还原酶表达的作用。因此，本发明具有抗肿瘤活性的化合物不但可应用于制备抗肿瘤药物，而且还可以用于制备预防肿瘤的药物。

本发明具有抗肿瘤活性的化合物的制备方法，用醇、二氯甲烷和硅胶等一些常见低廉的试剂从毛酸浆植物中分离得到具有抗肿瘤活性的化合物单体，降低了生产成本。该制备方法简单可靠，可操作性强，效率高，可进行工业化大生产，有利于推广应用，具有良好的应用前景。

附图说明

图1是本发明实施例1制备的具有抗肿瘤活性的化合物的核磁共振氢谱；

图2是本发明实施例1制备的具有抗肿瘤活性的化合物的核磁共振碳谱。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的内容作进一步详细的说明，但不应将实施例理解为对本发明的限制。在不脱离本发明上述思想情况下，根据本领域普通技术知识和常规手段作出的各种替换手段或变更，均包含在本发明之内。

实施例1

1)将1Kg毛酸浆宿萼装入提取罐，每次加入相对于药材重量8倍的含乙醇体积百分数95％的乙醇水溶液(即乙醇水溶液8Kg)，在90℃回流提取，每次提取的时间为2h，总共提取2次(乙醇水溶液总计16Kg)，合并提取液；

2)将步骤1)中得到的提取液浓缩(回收乙醇)至近干，得到稠浸膏12g，用1L水稀释后，每次用1L二氯甲烷萃取，共萃取3次，合并二氯甲烷萃取液；

3)将步骤2)中得到的二氯甲烷萃取液进行浓缩得到的浸膏5g经硅胶柱色谱(湿法装柱，干法上样)，其中，色谱柱所用的填料为100目的柱层层析硅胶，浸膏与柱层层析硅胶的重量比为1∶5，再经过由体积比为50∶1的氯仿和甲醇组成的洗脱溶剂洗脱，该洗脱溶剂每次使用6L，共洗脱3次，合并洗脱液，在丙酮中重结晶得具有抗肿瘤活性的化合物(C₃₀H₄₂O₈)20mg，命名PP-31J。

实施例1制备的具有抗肿瘤活性的化合物的核磁共振氢谱如图1所示，核磁共振碳谱如图2所示，通过图1和图2可以表征，实施例1制备的具有抗肿瘤活性的化合物结构如式I所示。

实施例2

1)将1Kg毛酸浆宿萼装入提取罐，每次加入相对于药材重量8倍的含乙醇体积百分数95％的乙醇水溶液(即乙醇水溶液8Kg)，在90℃回流提取，每次提取的时间为2h，总共提取2次(乙醇水溶液总计16Kg)，合并提取液；

2)将步骤1)中得到的提取液浓缩(回收乙醇)至近干，得到稠浸膏12g，用1L水稀释后，分别用石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯按极性大小依次使用单一有机溶剂进行萃取，每样有机溶剂每次使用1L，每样有机溶剂萃取3次，分别得到石油醚萃取液、二氯甲烷萃取液、乙酸乙酯萃取液，通过薄层色谱(TLC)检识毛酸浆中具有抗肿瘤活性的化合物***斑点几乎全部集中于二氯甲烷萃取液中，合并二氯甲烷萃取液；

3)将步骤2)中得到的二氯甲烷萃取液进行浓缩得到的浸膏6g经硅胶柱色谱(湿法装柱，干法上样)，其中，色谱柱所用的填料为100目的柱层层析硅胶，浸膏与柱层层析硅胶的重量比为1∶5，再分别由体积比为100∶1的氯仿和甲醇组成的洗脱溶剂、由体积比为50∶1的氯仿和甲醇组成的洗脱溶剂和由体积比为25∶1的氯仿和甲醇组成的洗脱溶剂按极性由小到大依次进行梯度洗脱，每样洗脱溶剂每次使用6L，每样洗脱溶剂洗脱3次；通过薄层色谱(TLC)检识毛酸浆具有抗肿瘤活性的化合物几乎全部位于由体积比为50∶1的氯仿和甲醇组成的洗脱溶剂的洗脱液中，合并该洗脱液，将该洗脱液在丙酮中重结晶得具有抗肿瘤活性的化合物(C₃₀H₄₂O₈)22mg，命名PP-31J。

实施例2制备的具有抗肿瘤活性的化合物的核磁共振氢谱和核磁共振碳谱与实施例1的一致。

实施例3

1)将1Kg毛酸浆宿萼装入提取罐，每次加入相对于药材重量10倍的含乙醇体积百分数95％的乙醇水溶液(即乙醇水溶液10Kg)，在100℃回流提取，每次提取的时间为3h，总共提取3次(乙醇水溶液总计30Kg)，合并提取液；

2)将步骤1)中得到的提取液浓缩(回收乙醇)至近干，得到稠浸膏16g，用800mL水稀释后，每次用800mL二氯甲烷萃取，共萃取3次，合并二氯甲烷萃取液；

3)将步骤2)中得到的二氯甲烷萃取液进行浓缩得到的浸膏8g经硅胶柱色谱(湿法装柱，干法上样)，其中，色谱柱所用的填料为200目的柱层层析硅胶，浸膏与柱层层析硅胶的重量比为1∶10，再经过由体积比为25∶1的二氯甲烷和甲醇组成的洗脱溶剂洗脱，该洗脱溶剂每次使用6L，共洗脱3次，合并洗脱液，在丙酮中重结晶得具有抗肿瘤活性的化合物(C₃₀H₄₂O₈)27mg，命名PP-31J。

实施例3制备的具有抗肿瘤活性的化合物的核磁共振氢谱和核磁共振碳谱与实施例1的一致。

实施例4

1)将1Kg毛酸浆宿萼装入提取罐，每次加入相对于药材重量10倍的含乙醇体积百分数95％的乙醇水溶液(即乙醇水溶液10Kg)，在100℃回流提取，每次提取的时间为3h，总共提取3次(乙醇水溶液总计30Kg)，合并提取液；

2)将步骤1)中得到的提取液浓缩(回收乙醇)至近干，得到稠浸膏16g，用800mL水稀释后，分别用石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯按极性大小依次使用单一有机溶剂进行萃取，每样有机溶剂每次使用800mL，每样有机溶剂萃取3次，分别得到石油醚萃取液、二氯甲烷萃取液、乙酸乙酯萃取液，通过薄层色谱(TLC)检识毛酸浆中具有抗肿瘤活性的化合物***斑点几乎全部集中于二氯甲烷萃取液中，合并二氯甲烷萃取液；

3)将步骤2)中得到的二氯甲烷萃取液进行浓缩得到的浸膏8g经硅胶柱色谱(湿法装柱，干法上样)，其中，色谱柱所用的填料为200目的柱层层析硅胶，浸膏与柱层层析硅胶的重量比为1∶10，再分别由体积比为100∶1的二氯甲烷和甲醇组成的洗脱溶剂、由体积比为50∶1的二氯甲烷和甲醇组成的洗脱溶剂、由体积比为25∶1的二氯甲烷和甲醇组成的洗脱溶剂和由体积比为10∶1的二氯甲烷和甲醇组成的洗脱溶剂按极性由小到大依次进行梯度洗脱，每样洗脱溶剂每次使用6L，每样洗脱溶剂洗脱3次；通过薄层色谱(TLC)检识毛酸浆具有抗肿瘤活性的化合物几乎全部位于由体积比为25∶1的二氯甲烷和甲醇组成的洗脱溶剂中，合并该洗脱液，将该洗脱液在丙酮中重结晶得具有抗肿瘤活性的化合物(C₃₀H₄₂O₈)28mg，命名PP-31J。

实施例4制备的具有抗肿瘤活性的化合物的核磁共振氢谱和核磁共振碳谱与实施例1的一致。

实施例5(具有抗肿瘤活性的化合物PP-31J体外抗肿瘤细胞实验)

取对数期的细胞每孔1×10⁴接种于96孔板上，每孔加入200μL的DMEM培养基，12h后，弃上清液，然后将不同量的实施例1制备的具有抗肿瘤活性的化合物分别溶于50μL的二甲基亚砜，加入到复孔中，分别按具有抗肿瘤活性的化合物0，10，20，40，80，100μmol/L浓度给药，即各个复孔中，具有抗肿瘤活性的化合物的浓度分别为0，10，20，40，80，100μmol/L，每个浓度设3个复孔，为化合物给药组，其中，给药浓度为0的复孔作为空白组；将不同量的阿霉素(碧云天试剂公司)分别溶于50μL的二甲基亚砜，加入到复孔中，分别按阿霉素0，10，20，40，80，100μmol/L浓度给药，即各个复孔中，阿霉素的浓度分别为0，10，20，40，80，100μmol/L，每个浓度设3个复孔，为阿霉素给药组，其中，给药浓度为0的复孔作为空白组；培养24h后，弃上清液。分别向化合物给药组、阿霉素给药组中加入带MTT的溶液50μL培养4h，MTT的溶液由MTT(噻唑蓝，碧云天试剂公司)溶解在磷酸缓冲液(PBS，pH＝7.3)中形成，MTT浓度为0.5mg/mL，再向各孔分别加入100μL二甲基亚砜(DMSO)，振荡1h，于酶标仪上570nm处测OD(光密度optical density)值。得到各浓度下的OD值，通过得到的OD值计算各浓度下的增殖抑制率，然后通过各浓度与其对应的增殖抑制率进行拟合计算，得到非线性回归方程，IC₅₀值指肿瘤细胞系增殖抑制率为50％时的给药浓度。其中，增殖抑制率＝(空白组OD值-加药组OD值)/空白组OD值。

本实验分别对乳腺癌细胞(MCF-7)、人肝癌细胞(HepG2)、人胃癌细胞(SGC7901)、人***细胞(Hela)、正常人外周血多形核白细胞(PMN)进行抗肿瘤活性的检测，上述细胞株均购置于ATCC，具体的结果如表2所示。结果显示，加入具有抗肿瘤活性的化合物后，肿瘤细胞活性明显下降，对肿瘤细胞的抑制增殖作用较强，而对正常细胞PMN的抑制作用较小。

表2

实施例6(具有抗肿瘤活性的化合物PP-31J的醌还原酶诱导实验)

取对数期的小鼠肝癌细胞(Hepa 1c1c7，购置于ATCC)，每孔1×10⁴接种于96孔板上，每孔加入200μL的DMEM培养基，12h后，弃上清，然后在3个复孔中加入实施例2制备的具有抗肿瘤活性的化合物0.106mg，为化合物加药组；在3个复孔中加入4′-溴黄酮0.106mg，为阳性对照加药组；在3个复孔中加入二甲基亚砜0.106mg，为阴性对照组；空白组为不加药的200μL的DMEM培养基。培养24h后，弃上清液。分别向化合物加药组、阳性对照加药组、阴性对照组和空白组中加入洋地黄皂苷10μg使细胞裂解，再加入带MTT的溶液200μL培养5min，MTT的溶液由MTT(噻唑蓝，碧云天试剂公司)溶解在磷酸缓冲液(PBS，pH＝7.3)中形成，MTT浓度为0.5mg/mL，于酶标仪上550nm处测OD(光密度optical density)值。通过测得的OD值计算IR(诱导倍数)值，IR值为相对于阴性对照组的醌还原酶诱导的倍数，其中，IR＝[(加药组OD值-空白组OD值)/(阴性对照组OD值-空白组OD值)]/(1-增殖抑制率)；其中，增殖抑制率＝(空白组OD值-加药组OD值)/空白组OD值。

结果显示，本发明具有抗肿瘤活性的化合物PP-31J在1mmol/L(0.106mg)给药浓度下IR值为2.54，阳性对照药4′-溴黄酮的IR值为2.1；结果表明本发明具有抗肿瘤活性的化合物PP-31J能够诱导醌还原酶的表达，在肿瘤起始阶段具有预防癌症作用。

实施例7(化合物药物片剂的制备)

1)称取0.05g的实施例3制备的具有抗肿瘤活性的化合物、0.006g的黏合剂、0.01g的羧甲淀粉钠、0.016g的淀粉和0.001g的硬脂酸镁；其中，黏合剂由含羟丙甲纤维素的质量百分数为8％的羟丙甲纤维素水溶液和含淀粉的质量百分数为8％的淀粉浆(淀粉和水组成)按照重量比3∶10混合而成。羧甲淀粉钠作为崩解剂使用。

2)将称取的具有抗肿瘤活性的化合物0.05g、淀粉0.016g、羧甲淀粉钠0.008g置于混合槽内混合20min，然后加入黏合剂0.006g混合制软材，再过14目筛制粒，干燥后过14目筛整粒，加入称取的硬脂酸镁0.001g和0.002g的羧甲淀粉钠，混合后压制成片，即完成化合物药物片剂的制备；制备的化合物药物片剂规格为0.083g。

将上述的具有抗肿瘤活性的化合物替换为阿霉素(碧云天试剂公司)，重复步骤1)和步骤2)，得到阿霉素药物片剂。

实施例8(化合物药物片剂的体外抗肿瘤实验)

取对数期的细胞每孔1×10⁴接种于96孔板上，每孔加入200μL的DMEM培养基，12h后，弃上清液，然后将不同量的实施例7制备的化合物药物片剂分别溶于50μL的二甲基亚砜，加入到复孔中，分别按具有抗肿瘤活性的化合物0，10，20，40，80，100μmol/L浓度给药，即各个复孔中，具有抗肿瘤活性的化合物的浓度分别为0，10，20，40，80，100μmol/L，每个浓度设3个复孔，为化合物药物片剂组，其中，给药浓度为0的复孔为空白组；将不同量的实施例7制备的阿霉素药物片剂分别溶于50μL的二甲基亚砜，加入到复孔中，分别按阿霉素0，10，20，40，80，100μmol/L浓度给药，即各个复孔中，阿霉素的浓度分别为0，10，20，40，80，100μmol/L，每个浓度设3个复孔，为阿霉素药物片剂组，其中，给药浓度为0的复孔为空白组；培养24h后，弃上清液。分别向化合物药物片剂组、阿霉素药物片剂组中加入带MTT的溶液50μL培养4h，MTT的溶液由MTT(噻唑蓝，碧云天试剂公司)溶解在磷酸缓冲液(PBS，pH＝7.3)中形成，MTT浓度为0.5mg/mL，再向各孔分别加入100μL二甲基亚砜(DMSO)，振荡1h，于酶标仪上570nm处测OD(光密度opticaldensity)值。分别测得各浓度下的OD值，然后通过得到OD值计算各浓度下的增殖抑制率，然后通过各浓度与其对应的增殖抑制率进行拟合计算，得到非线性回归方程，IC₅₀值指肿瘤细胞系增殖抑制率为50％时的给药浓度。其中，增殖抑制率％＝(空白组OD值-加药组OD值)/空白组OD值。

本实验分别对乳腺癌细胞(MCF-7)、人肝癌细胞(HepG2)、人胃癌细胞(SGC7901)、人***细胞(Hela)、正常人外周血多形核白细胞(PMN)进行抗肿瘤活性的检测，上述细胞株均购置于ATCC，具体的结果如表3所示。结果显示，加入化合物药物片剂后，肿瘤细胞活性明显下降，对肿瘤细胞的抑制增殖作用较强，而对正常细胞PMN的抑制作用较小。

表3

Claims (10)

1.一种具有抗肿瘤活性的化合物，为式I结构的化合物：

2.一种如权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的化合物的制备方法，包括以下步骤：

1）将毛酸浆宿萼用提取溶剂回流提取，得到提取液；

所述的提取溶剂为醇或者含醇体积百分数50%～99.99%的醇水溶液；

2）将步骤1）中得到的提取液浓缩，用水稀释后再用有机溶剂萃取，得到二氯甲烷萃取液；

所述的有机溶剂至少包括二氯甲烷；

3）将步骤2）中得到的二氯甲烷萃取液经浓缩后过色谱柱，经过洗脱体系洗脱后重结晶得到具有抗肿瘤活性的化合物；

所述的洗脱体系为由石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱溶剂、由石油醚和丙酮组成的洗脱溶剂、由二氯甲烷和甲醇组成的洗脱溶剂、由氯仿和甲醇组成的洗脱溶剂中的一种。

3.如权利要求2所述的具有抗肿瘤活性的化合物的制备方法，其特征在于，步骤1）中，所述的醇为甲醇或乙醇。

4.如权利要求2所述的具有抗肿瘤活性的化合物的制备方法，其特征在于，步骤1）中，所述的提取溶剂为甲醇或含乙醇体积百分数95%的乙醇水溶液。

5.如权利要求2所述的具有抗肿瘤活性的化合物的制备方法，其特征在于，步骤1）中，每次加入相对于毛酸浆宿萼重量的6～10倍重量的提取溶剂，在90℃～100℃回流提取，每次提取的时间为2h～3h，提取2～3次。

6.如权利要求2所述的具有抗肿瘤活性的化合物的制备方法，其特征在于，步骤2）中，所述的有机溶剂包括石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯，萃取时按极性大小依次使用单一有机溶剂进行萃取。

7.如权利要求2所述的具有抗肿瘤活性的化合物的制备方法，其特征在于，步骤3）中，所述的由二氯甲烷和甲醇组成的洗脱溶剂包括由体积比为20～30:1的二氯甲烷和甲醇组成的洗脱溶剂；

所述的由氯仿和甲醇组成的洗脱溶剂包括由体积比为40～60:1的氯仿和甲醇组成的洗脱溶剂。

8.如权利要求2所述的具有抗肿瘤活性的化合物的制备方法，其特征在于，步骤3）中，所述的由二氯甲烷和甲醇组成的洗脱溶剂包括由体积比为100：1的二氯甲烷和甲醇组成的洗脱溶剂、由体积比为50：1的二氯甲烷和甲醇组成的洗脱溶剂、由体积比为25:1的二氯甲烷和甲醇组成的洗脱溶剂和由体积比为10:1的二氯甲烷和甲醇组成的洗脱溶剂，并按极性由小到大依次进行梯度洗脱；

所述的由氯仿和甲醇组成的洗脱溶剂包括由体积比为100：1的氯仿和甲醇组成的洗脱溶剂、由体积比为50：1的氯仿和甲醇组成的洗脱溶剂和由体积比为25:1的氯仿和甲醇组成的洗脱溶剂，并按极性由小到大依次进行梯度洗脱。

9.如权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的肿瘤包括脑瘤、肺癌、肝癌、乳腺癌、***癌、胰腺癌、***、胃癌、食道癌。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的具有抗肿瘤活性的化合物制成片剂，由以下重量份的原料制成：

所述的黏合剂由含羟丙甲纤维素的质量百分数为1%～10%的羟丙甲纤维素水溶液和含淀粉的质量百分数为4%～10%的淀粉浆按照重量比3:10混合而成。

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