CN102481389A

CN102481389A - 三维纳米结构化复合支架及其制备方法

Info

Publication number: CN102481389A
Application number: CN2010800393706A
Authority: CN
Inventors: 詹斯·文吉·尼高; 黎·比埃尔; 科迪·埃里克·邦杰; 弗莱明·贝森巴赫
Original assignee: Aarhus Universitet
Current assignee: Aarhus Universitet
Priority date: 2009-06-26
Filing date: 2010-06-25
Publication date: 2012-05-30
Anticipated expiration: 2030-06-25
Also published as: CN102481389B; WO2010149176A1; US20120128739A1; EP2266635A1; US8815276B2; CA2764871A1; US20140329323A1; EP2448608A1; CN105126177A

Abstract

一种能支撑例如生长和分化的细胞活动的三维生物相容性支架的制备方法，所述方法包括提供支撑网格，所述网格形成开放的网状结构并且为第二生物相容性材料提供机械支撑。所述第二生物相容性材料具有相互连接的腔室，所述腔室使得营养物、代谢物和可溶性因子扩散通过所述支架。支架的设计可以理解成分层排列的结构，在微米至亚微米的长度标尺上，上/下制备方法用于制备将组成框架的结构，下/上处理方法用于在所述框架中形成具有特殊纳米大小特征的开放多孔支架。该分层排列的涉及的优势在于：其可以同时具有微米和纳米大小结构的有点，促进特殊的细胞活动和提供充分的机械顺应性。

Description

三维纳米结构化复合支架及其制备方法

技术领域

本发明涉及用于组织工程的三维复合支架及其制备和使用方法。

背景技术

组织工程是用于修复组织或使组织再生的策略。组织工程中所涉及的细胞培养物还需要三维支架以支撑细胞。具有三维多孔结构的支架在许多组织培养应用中是必要的，这是由于细胞在二维单层细胞培养物中会失去其细胞形态和表型表达。

在组织再生和修复中，三维支架的装配是一个重要的问题，支架装配的方式是支架模拟细胞外基质，从而促使细胞生长成功能组织，以及使营养物、代谢物和可溶性因子扩散。

当组织再生时，三维基质的性质可以极大地影响细胞粘附和生长，以及决定终产物的质量。一种优化的支架材料应能促进细胞粘附、细胞增殖、细胞特异表型的表达以及提高细胞的活性。

在许多组织工程应用以及再生性药物领域中，已经有许多生物材料用作支架材料，其通过与移植细胞相互作用来控制工程化组织的功能和结构。这些材料包括天然物质，例如胶原和海藻酸盐。一些生物材料已经被证明可以支撑细胞长入(ingrowth)和受损组织的再生，并且没有免疫排斥现象，这些生物材料还被证明可以通过刺激细胞合成和分泌细胞外基质蛋白来促进重构过程而协助愈合过程。保留在这些生物材料中的细胞外基质也能通过与例如细胞表面受体的特异性相互作用影响干细胞的表型分化。但是，由于这些分离的生物材料在植入和细胞灌注接种期间机械性质不足，限制了这些材料的应用。

高孔隙率的支架通常是受到推荐的，其用于减少植入材料的量并产生较大的表面供细胞黏附。另外，互相连接性(interconnectivity)，即支架中孔隙之间的连接，是非常重要的，这是因为其对于细胞在支架中的移动性以及随后的营养物和细胞产生的废物的运输(扩散和对流)，起着决定性的作用。

Heijkants等人公开(2008)了通过组合使用盐浸和热诱导相分离技术，以聚氨酯制备多孔支架的方法。该方法可以获得具有非常高的孔隙率和交联性的泡沫材料。该方法一个主要的优点在于许多可变因素，例如孔隙率、孔径和交联性，在制备过程中可以单独地调节而不会出现毒性物质。但是，所得泡沫空隙率的增加却降低了支架的机械稳定性。

WO2006093778公开了至少部分基于支架层构建的三维制品的实体自由成型制备方法。该方法包括提供支架材料和支撑材料。支撑材料具有泡沫层状外形。泡沫用于在支架的制备期间支撑支架材料，随后通过洗涤出去。在该方法的某些实施例中，泡沫不被除去，而被保留在结构中。WO2006093778中说明了将泡沫保留在结构中会导致问题，即其会夹带空气并且可能限制细胞的迁移和运动。另外，为了使打印设备能直接在泡沫中打印，泡沫必须是柔韧的，以使打印装置的喷嘴能浸入泡沫。因此该泡沫不能是在Heijkants等人的论文中公开的聚合物类型。

Mo等人(2006)公开了一种用于血管组织再生的中空PCL-PLGA复合物管状支架。该支架包括中空的涂敷了PCL的PLGA编织管，这种PLGA编织管通过以PCL二氧六环/水溶液涂敷编织管，然后在相分离后冻干获得。编织管的这种中空结构使得其对于在制备、***和使用时的压缩力非常脆弱。

因此，本发明的目的在于提高三维支架的性质以用于组织工程。具体地，支架具有改善的机械稳定性的将是有利的。更具体地，支架在制备(例如剪切)、***和使用(例如植入)过程中具有改善的压缩机械应力将是有利的。而且，改善支架内细胞移动性以及营养物和细胞产生的废物的运输将是有利的。

发明概述

本发明的一个目的在于能支撑例如生长和分化的细胞活动的三维生物相容性支架的制备方法。

具体地，本发明的目的在于提供一种能解决现有技术中的上述问题的方法。

因此，本发明一方面涉及能支撑例如生长和细胞分化的细胞活动的三维生物相容性支架的制备方法，所述方法包括：

-提供包括第一生物相容性材料的支撑网格，所述网格为第二生物相容性材料提供机械支撑，所述第一材料包括一种或多种聚合物，所述网格形成开放网状结构；

-向所述开放网状结构的大部分中加入溶液，所述溶液包含一种或多种可生物降解的聚合物与两种或更多种溶剂的混合物；

-除去所述溶剂得到在所述开放网状结构中的第二生物相容性材料；所述第二生物相容性材料具有相互连接的腔室，在所述第二生物相容性材料中的所述相互连接的腔室使得细胞生长成功能组织，并且使得营养物、代谢物和可溶性因子扩散遍及所述支架；

本发明另一方面涉及能支撑例如生长和细胞分化的细胞活动的三维生物相容性支架的制备方法，所述方法包括：

-向所述开放网状结构的大部分中加入溶液，所述溶液包含一种或多种生物相容性聚合物与一种或多种溶剂的混合物；

-除去所述溶剂得到在所述开放网状结构中的第二生物相容性材料；所述第二生物相容性材料具有相互连接的腔室，在所述第二生物相容性材料中的所述相互连接的腔室使得细胞生长成功能组织，并且使得营养物、代谢物和可溶性因子扩散通过所述支架；所述网格在制备、***和使用期间还保护所述三维生物相容性支架不受压缩力的影响。

本发明又一方面涉及一种能支撑例如生长和分化的细胞活动的三维生物相容性支架，所述支架包含第一和第二生物相容性材料，所述第一材料的形状为微米级的线形成的一个或多个网格，所述线形成空隙的开放网状结构；所述第二材料填充所述开放网状结构的大部分空隙，所述第二材料是多孔的，其中孔隙相互连接，所述第二材料具有多个均匀分布在其中的开孔，所述开孔的平均尺寸小至使细胞不能渗入。

本发明优选的发明涉及一种能支撑例如生长和分化的细胞活动的三维生物相容性支架，所述支架包含第一和第二生物相容性材料，所述第一材料的形状为微米级的线形成的一种或多种网格，所述线形成空隙的开放网状结构；所述第二材料填充所述开放网状结构的大部分空隙，所述第二材料是多孔的，其中空隙相互连接，所述第二材料具有多个均匀分布在其中的开孔，所述开孔的平均尺寸小至使细胞不能渗入，所述网格为所述第二生物相容性材料提供保护性机械支撑，所述网格还保护所述三维生物相容性支架在制备、***和使用期间不受压缩力的影响，所述第二生物相容性材料包含一种或多种生物相容性聚合物。

附图说明

图1显示了所示为PCL在1，4-二氧六环中的浓度与水含量的函数关系的初始设置；

图2显示了在玻璃圆筒中的冻干的支架，用于切支架的“闸床(Guillotine)”和10mm直径×5mm高度的最终支架样品；

图3显示了经NaOH处理前(左图)后(右图)的角接触测量。处理后表面亲水性明显增强；

图4显示了含有1wt％的H₂O(A)、3wt％的H₂O(B)和7wt％的H₂O(C)的支架的SEM图像。水含量越高，观察到的表面图像越不均匀；

图5显示了含有7wt％的H2O的溶液制备的支架中的纳米结构的高分辨率SEM图像。最小的特征低至10nm。整个支架中形态是一致的；

图6显示了来自ESRF的纳米断层摄影图像。所示的支架是从含有1wt.％H2O的溶液制备的实壁支架(A)和从含有7wt.％H2O的溶液制备的多孔壁支架(B)。(A)中壁厚约5μm，并且两幅图像长度标尺相同；

图7显示了来自ESRF的纳米断层摄影图像。双级支架从含有7wt.％H2O的溶液制备。该图的标尺与图6的图像的标尺相等。大孔隙的直径(白线)为175μm，小孔隙直径约为10μm；

图8显示了支架上的1×10⁶hMSC-TERT活/死染色，所述支架从含有1wt％的H₂O(A)、3wt％的H₂O(B)和7wt％的H₂O(C)的溶液制备。与(C)相比，观察到(A)和(B)支架细胞位置更接近表面；

图9显示了培养1、8和15天时hMSC-TERT的DNA定量。DNA的量以平均值±SD(n＝4)表示。接种为2×10⁶hMSC-TERT/支架；

图10培养1、8和15天时碱性磷酸酶(ALP)的活性。活性以平均值±SD(n＝4)表示。活性以纳摩尔对硝基苯酚/毫克DNA每分钟(nmol/μgDNA×min)表示。接种量为2×10⁶hMSC-TERT/支架；

图11显示了在体外长达21天后，组织切片的H&E染色。接种量为3.5×10⁶hMSC-TERT/支架。在7wt％H₂O的支架中，从第1天观察到均匀的分布，但是3wt％H₂O和1wt％H₂O的支架中，分别直到15天和21天才观察到均匀的分布；

图12显示了细胞粘附到各支架的SEM图像。对于1wt％H₂O型支架啊(A)和3wt％H₂O型支架(B)，细胞紧密粘附在支架表面上，但是细胞更接近表面地粘附于7wt％H₂O型支架(C)。在左图中，条带表示20μm，在右图中为10μm；

图13显示了支架的Goldner三色染色图像(A)和SEM图像(B)。在所有类型的支架中，在培养21天后均观察到hMSC-TERT的矿物化，并且图像代表了1-7wt％H2O型的支架。观察到了矿物化的细胞和表面上的小结节(nodule)(条带在A图中为150μm，在B中为5μm)；

图14显示了植入小鼠皮下的2mm高的1wt％H₂O型支架。在左边的数字是指在小鼠中的周数(条带＝1mm)；

图15显示了抗压测试。低、中和高密度对应于20、30和40mg/g聚合物溶液；

图16显示了10mm(直径)×10mm(高度)的3D绘制(plotted)支架。SEM图像显示了支架的高孔隙率微结构，其实心纤维直径约为175μm；

图17显示了在初始吸附24小时后，打印支架上的细胞的Actin和Hoechst染色。一纤维的直径约为175μm；

图18显示了在初始吸附24小时后，绘制支架上的细胞的SEM图像。条带表示100μm(左)和200μm(右)；

图19显示了打印并冻干的(组合的)支架。纤维直径约为175μm，所用溶液的浓度(以mg(PCL)/g(二氧六环)表示)和水的wt.％显示在各图下方；

图20显示了组合的支架上的hMSC-TERT的活/死染色。

本发明现在将在下文中详细说明。

具体实施方式

定义

在进一步详细讨论本发明之前，首先定义下列术语和约定：

实体自由成型制备方法(Solid freeform fabrication，SFF)是一类用于制备固态物体的方法，其通过将能量和/或物质依次传送至空间中的特殊位置来制备固体。SFF有时也被称作快速成型法、快速制备法、层叠制备法和添加制备法。

溶剂浇铸-粒子沥滤法(Solvent Casting-Particulate Leaching(SCPL))使得可以制备具有常规孔隙率但支架尺寸有限的多孔结构。首先将聚合物溶于合适的有机溶剂中(例如可以将聚乳酸溶解在二氯甲烷中)，然后将溶液浇注入填充有致孔剂颗粒的磨具中。所述致孔剂可以是例如氯化钠的无机盐、糖晶体、明胶球或石蜡球。致孔剂颗粒的大小将影响支架空隙的大小，同时聚合物与致孔剂的比例与最终结构的孔隙率直接相关。在浇注聚合物溶液后，将溶剂完全蒸发，然后将模具中的复合结构浸入适合溶解致孔剂的液体浴中：在氯化钠、蔗糖和明胶用作致孔剂时，用水作为液体浴，在石蜡用作致孔剂时，用如己烷之类的脂肪族溶剂作为液体浴。一旦致孔剂完全溶解，便获得了多孔的结构。除了获得的支架大小较小外，SCPL另一缺陷在于所使用的有机溶剂必须完全除去以避免对接种在支架上的细胞的任何可能的损伤。最后，与SFF相反，模具决定了支架的整体形状。

气体发泡法可以用于克服必须使用有机溶剂和固体致孔剂的缺陷。该方法通过将气体用作致孔剂实现。首先，通过压塑法使用加热的模具制备由期望的聚合物制成的盘状结构。然后将该盘状结构至于腔室中，暴露于高压CO₂下数天。将腔室的内部压力逐渐恢复至常压水平。在此过程中，二氧化碳分子离开聚合物而形成空隙，从而得到海绵状结构。该技术的一个问题是在压塑过程中使用过量的热量。过量的热量阻止了任何对温度不稳定的物质掺入聚合物基质。其次，随着孔隙的形成会发生较大的体积变化，这使得如果不使用模具会难以控制支架的最终整体形状。再次，SFF方法中未引入对支架几何结构的限制。

乳化冻干技术与SCPL不同，不需要使用固体致孔剂。首先，将合成的聚合物溶于合适的溶剂中(例如将聚乳酸溶于二氯甲烷中)。然后，将水加入聚合物溶液中，混合两种液体以获得乳液。在两相分离之前，将乳液浇注入模具中，并通过浸入液氮中快速冷冻。随后，冻干冷冻的乳液以除去分散的水和溶剂，从而得到固化的多孔聚合物结构。与SCPL相比，由于其不需要使用耗时的沥滤步骤，因此冻干制备方法更加迅速。

热诱导的相分离方法(TIPS)与上述技术相似，该相分离方法需要使用可通过降低温度固化并且易于升华的溶剂。例如二氧六环可用于溶解聚乳酸。例如通过加入少量水，导致形成聚合物富集相和聚合物非富集相，从而有利于聚合物相分离。在相分离期间，冷却混合物至低于溶剂熔点，随后冻干以升华溶剂，从而得到多孔的结构。

术语“生物相容性”应理解成，但不限于，不引起给定的生物体的免疫反应或引起的免疫反应很小。事实上，由于机体内免疫反应和修复功能非常复杂，仅说明一种材料与一种细胞类型或组织之间的生物相容性是不够的。

生物“可生物降解的”应被理解成，但不限于，在生理环境下，例如人体内或动物体内，材料发生化学(例如生物化学)分解。

术语“开孔”应被理解成，但不限于，分割的中空空间，其中壁或表面是缺口的。其不应与所有有机体的基本组织单元混淆。因此，“开孔”并不涉及有机物质，例如从活组织中分离的细胞。

术语“腔室”将被理解成，但不限于，孔隙、相互连接的孔隙和“开孔”。不幸的是，在组织工程文献中，腔室和孔隙是指“孔”，并且不应与所有有机体的组织单元相混淆。

血液的pH值通常呈微碱性，为7.4。该值在生物学也医学中被称为生理pH值。

支架

聚合物支架意图用作暂时的细胞外基质(ECM)，直至骨和其它组织发生再生。因此，支架与体内微环境越接近，其可能会越成功。

已经考虑将现有的支架形成可克服具体缺陷的3D植入模型。这主要通过复制3D扫描图像的融合沉积方法获得。所用的材料为纯聚合物、混合的聚合物或聚合物与骨导颗粒(bone-conducting granule)的混合物。但是单纤维上可供细胞附着的表面积有限，限制了精确的沉积。

因此，在本发明中提出了新的且合理的解决方案，即将严格的3D结构与提供了供细胞长入的充裕表面积的内部相结合。通过提供具有亚微孔结构与相互连接的空隙的组合的材料，获得了大量的表面积。亚微孔结构定义为平均孔径低于约1微米的结构。

相互连接，即支架中孔隙和/或亚微孔结构之间的连接，是非常重要的，这是因为其在细胞扩散进入支架以及营养物和细胞产生的废物的运输中具有决定性作用。亚微孔结构太小以致不能使细胞渗透，这能使营养物和细胞废物在整个支架内恒定地和持续地运输。没有亚微孔结构，支架可能会具有渗入细胞的凝集风险，该风险会导致营养物和细胞废物运输的紊乱。这可能导致不利的支架中心部分的细胞的死亡。

本发明一方面涉及一种能支撑例如生长和分化的细胞活动的三维生物相容性支架，所述支架包含第一和第二生物相容性材料，所述第一材料的形状为微米级的线形成的一个或多个网格，所述线形成空隙的开放网络；所述第二材料填充所述开放网络的大部分空隙，所述第二材料是多孔的，其中孔隙相互连接，所述第二材料具有多个均匀分布在其中的开孔，所述开孔的平均尺寸低至使细胞不能渗入。

在本发明一个实施例中，所述开孔的平均尺寸为约1纳米至约6微米，例如为从约1纳米至约5微米，例如为从约1纳米至约4微米，例如为从约1纳米至约2微米，例如为从约1纳米至约1微米，例如为从约1纳米至约900纳米，例如为从约5纳米至约800纳米，例如为从约10纳米至约700纳米，例如为从约15纳米至约600纳米，例如为从约15纳米至约500纳米，例如为从约15纳米至约300纳米，例如为从约20纳米至约100纳米，优选地例如为从约25纳米至约50纳米。

为确保良好的相互连接性，在本发明优选的实施例中，所述第二材料中的所述开孔的孔密度在约10⁹(10的9次方)至约10²⁰开孔每立方厘米所述第二材料，例如从约11¹⁰至约10¹⁸，更优选地例如从约12¹⁰至约10¹⁵每立方厘米所述第二材料。

在另一实施例中，所述第二材料中的开孔的总体积包含一定比例的所述第二材料的总体积，该比例在约10％至约99％的范围内，例如从约15％至约98％的范围内，例如从约20％至约95％的范围内，更优选地例如从约50％至约90％的范围内。

在又一实施例中，所述第二材料中的孔隙的平均直径在低于1000微米的范围内，例如从约0.01至约800微米，例如从约0.1至约700微米，例如从约1至约700微米，例如从约1至约500微米，例如从约10至约400微米，优选地例如从约10至约50微米。

拉动单个细胞的力在nPa的范围内，并且是表型特异的。Engler等人(2006)研究了与平面基底刚度变化有关的各种细胞反应，并由此证明了细胞对机械相互作用的依赖。具体地，他通过微阵列分析说明了接近1、11和34kPa的基底刚度可特异化间质干细胞谱系，并分别形成神经元、肌肉或骨表型。因此，可能根据感兴趣的干细胞来调节本发明第二生物相容性材料的刚度。

本发明另一方面涉及工程化支架用于骨修复和再生的用途，例如工程化支架用于修复脑或脊髓组织修复和再生的用途。

本发明另一方面涉及工程化支架用于软骨组织修复和再生的用途。

本发明又一方面涉及整个器官或局部器官(例如肝、肾和肺)的组织工程化，例如工程化的支架用于治疗肝疾病、肾疾病、肺疾病、骨疾病软骨疾病或其它组织疾病的用途。

本发明另一方面涉及工程化的支架用于培养细胞和/或细菌的用途。

本发明又一方面涉及工程化支架用于软组织修复和再生的用途。

本发明还一方面涉及工程化支架用于脑或脊髓组织修复和再生的用途。

本发明另一方面涉及工程化的支架用于制备医药剂的用途，例如工程化支架用作医药剂的用途。

本发明另一方面涉及本发明支架的植入方法。

本发明又一方面涉及工程化支架用作医药剂的用途。

选定组织的压缩刚度

下表显示了选定组织的压缩刚度

因此，为模拟组织的机械性质，可以考虑支架必须具有与感兴趣组织相等的压缩刚度以避免在机体自身或外力提供的局部压力下塌陷。但是，支架的刚度必须同时足以引导间质干细胞谱系生长成正确的组织。从Engler等人的工作(2006)可知，用于生成骨组织的支架优化的刚度为34kPa。但是，骨的压缩刚度在4-17GPa的范围内。因此，具有此优化刚度的支架在机体自身的局部压力下会塌陷。

本发明的发明人通过制备打印和冻干相组合的支架解决了这个问题。

因此，本发明优选的方面涉及一种能支撑例如生长和分化的细胞活动的三维生物相容性支架，所述支架包含第一和第二生物相容性材料，所述第一材料的形状为微米级的线形成的一种或多种网格，所述线形成空隙的开放网状结构；所述第二材料填充所述开放网状结构的大部分空隙，所述第二材料是多孔的，其中孔隙相互连接，所述第二材料具有多个均匀分布在其中的开孔，所述开孔的平均大小小至使细胞不能渗入，所述网格为所述第二生物相容性材料提供保护性机械支撑，所述网格还保护所述三维生物相容性支架在制备、***和使用期间不受压缩力的影响，所述第二生物相容性材料包含一种或多种生物相容性聚合物。

本发明发明人已经制备的支架，其中三维生物相容性支架的第二生物相容性材料的压缩应力(初始压缩刚度)在0.31-6.32kPa的范围内。当与包含第一生物相容性材料的支撑网格组合时，压缩应力经测试在360-5100kPa的范围内。大试样的机械测试根据ISO3386-1进行。

在本发明优选的实施例中，支撑网格的压缩应力比第二生物相容性材料高5倍，如高5-100000倍(例如高10倍)，如高15-90000倍(例如高50倍)，如高55-90000倍(例如100倍，如高200-50000倍(例如高500倍)，如高700-30000倍(例如高900倍)，如高1.500-20.000倍。

在本发明一个实施例中，支架的压缩应力值与目标组织的压缩应力值相当。例如，发明人已经制备了测量值为5100kPa压缩应力的支架。所述支架可用于骨小梁的重构，其中骨小梁的压缩应力值为5000kPa。“相当的”值将被理解成与另一个值偏离不超过35％的值，如不超过25％，例如20％，优选不超过10％，例如5％。

在本发明另一实施例中，支架具有相容的抗压强度以承受周围目标组织的压缩力。“相容的”抗压强度将被理解成这样的方式：当支架植入时，在周围目标组织压在支架上时，支架仍然保持基本未被压缩。支架在使用期间必须不能塌陷。基本不被压缩将被理解成这样的方式：支架体积在使用期间减少不超过35％，如25％，例如20％，优选地不超过10％，例如5％。

在本发明的一方面，将具有分化形成期望组织谱系能力的细胞接种在支架上。为提高接种效率，随后可为支架涂覆生物相容性聚合物，从而将细胞包封在支架中。

在一个实施例中，第二生物相容性材料中的一种或多种生物相容性聚合物在生理pH值下带负电荷。

在本发明另一个实施例中，第二生物相容性材料中的一种或多种生物相容性聚合物在生理pH值下带负电荷。另外，所述支架包含体外接种的细胞，所述支架还包括第一生物相容性聚合物涂层，所述第一生物相容性聚合物涂层包含一种或多种在生理pH值下带正电荷的生物相容性聚合物，所述细胞位于所述第二生物相容性材料和所述第一生物相容性聚合物涂层之间。

在另一实施例中，如果第一生物相容性聚合物涂层带正电荷，所述支架还包括第二生物相容性聚合物涂层，所述第二生物相容性聚合物涂层包含一种或多种在生理pH值下带负电荷的生物相容性聚合物，所述第二生物相容性聚合物涂层位于所述第一生物相容性聚合物涂层的顶部。

在一个实施例中，第二生物相容性材料中的一种或多种生物相容性聚合物在生理pH值下带正电荷。

在本发明另一个实施例中，第二生物相容性材料中的一种或多种生物相容性聚合物在生理pH值下带正电荷。另外，所述支架包含体外接种的细胞，所述支架还包括第一生物相容性聚合物涂层，所述第一生物相容性聚合物涂层包含一种或多种在生理pH值下带负电荷的生物相容性聚合物，所述位于所述第二生物相容性材料和所述第一生物相容性聚合物涂层之间。

在另一实施例中，如果第一生物相容性聚合物涂层带负电荷，所述支架还包括第二生物相容性聚合物涂层，所述第二生物相容性聚合物涂层包含一种或多种在生理pH值下带正电荷的生物相容性聚合物，所述第二生物相容性聚合物涂层位于所述第一生物相容性聚合物涂层的顶部。

在又一另外的实施例中，其中所述第二生物相容性材料以第一生物相容性聚合物涂层和第二生物相容性聚合物涂层涂覆，所述第一生物相容性聚合物涂层包含一种或多种在生理pH值下带负电荷的生物相容性聚合物，第二生物相容性聚合物涂层包含一种或多种在生理pH值下带正电荷的生物相容性聚合物。另外，支架包含在体外接种的细胞，所述细胞位于第一和第二生物相容性聚合物涂层之间。

在还一另外的实施例中，其中所述第二生物相容性材料以第一生物相容性聚合物涂层和第二生物相容性聚合物涂层涂覆，所述第一生物相容性聚合物涂层包含一种或多种在生理pH值下带正电荷的生物相容性聚合物，第二生物相容性聚合物涂层包含一种或多种在生理pH值下带负电荷的生物相容性聚合物。另外，支架包含在体外接种的细胞，所述细胞位于第一和第二生物相容性聚合物涂层之间。

在另一实施例中，接种的细胞具有分化形成期望组织谱系的能力。在优选的实施例中，接种的细胞可以具有不同的类型。

另一实施例涉及通过上述的任何方法制备/获得的产品。

方法

近年来，已经提出了大量的制备高分子支架的方法，包括溶剂浇铸-粒子沥滤法、冻干法、快速成型法、电纺丝(electrospinning)等。尽管付出了许多努力，特殊的方法或性质的组合还未表现出明显的区别，只要制备的支架具有一些常见的性质，例如生物相容性、高孔隙率、生物降解性和临床可操作性。

许多支架的制备方法不能精确地控制孔隙大小、孔隙的几何形状或支架中通道的形成。当申请临床使用批件时，由于需要对产品进行清楚的说明，这可能是关键的。但是在本发明中，由于冻干的聚合物的微米和纳米结构具有高度的重现性和可操作性，并且由于打印的骨架决定了外部形状，因此开发的支架具有高度的均一性。最终植入物的大小和外形由计算机辅助设计，以打印期望的3D模板，并加入冻干内部。最终的支架可以被理解成开放的、相互连接的分级排列的结构。对于微米至亚微米长度标尺，快速成型的上/下制备方法用于制备将组成框架的结构，热诱导相分离的下/上处理方法在框架中形成多开孔的支架，该多开孔支架具有呈双峰分布的高度相互连接的孔隙。一组孔隙尺寸大于约20微米，其它组的孔隙或开孔的大小低于5微米。

因此，本发明的一方面涉及能支撑例如生长和分化的细胞活动的三维生物相容性支架的制备方法，该方法包括：

-除去所述溶剂得到在所述开放网状结构中的第二生物相容性材料，所述第二生物相容性材料具有相互连接的腔室，在所述第二生物相容性材料中的所述相互连接的腔室使得细胞生长成功能组织，并且使得营养物、代谢物和可溶性因子在整个支架中扩散。

-除去所述溶剂得到在所述开放网状结构中的第二生物相容性材料，所述第二生物相容性材料具有相互连接的腔室，在所述第二生物相容性材料中的所述相互连接的腔室使得细胞生长成功能组织，并且使得营养物、代谢物和可溶性因子遍及所述支架扩散；

所述网格还保护所述三维生物相容性支架在制备、***和使用期间不受压缩力的影响。

在一个实施例中，在所述第二生物相容性材料中的一种或多种生物相容性聚合物在生理pH值时带正电荷，所述方法还包括下列步骤：

a)以细胞接种从权利要求1获得的三维生物相容性支架；

b)以一种或多种在生理pH值时带负电荷的生物相容性聚合物涂覆所述接种了细胞的支架；

c)任选地，以一种或多种在生理pH值时带正电荷的生物相容性聚合物涂覆所述细胞接种的支架。

在另一实施例中，在所述第二生物相容性材料中的一种或多种生物相容性聚合物在生理pH值时带负电荷，所述方法还包括下列步骤：

a)以细胞接种从权利要求1获得的三维生物相容性支架；

b)以一种或多种在生理pH值时带正电荷的生物相容性聚合物涂覆所述细胞接种的支架；

c)任选的，以一种或多种在生理pH值时带正电荷的生物相容性聚合物涂覆所述细胞接种的支架。

在又一个实施例中，所述方法还包括：

a)以一种或多种在生理pH值下带负电荷的生物相容性聚合物涂覆支架表面；

b)任选地，以细胞接种支架；

c)任选地，以一种或多种在生理pH值下带正电荷的生物相容性聚合物涂覆支架表面。

在一个实施例中，所述方法还包括：

a)以一种或多种在生理pH值下带正电荷的生物相容性聚合物涂覆支架表面；

b)任选地，以细胞接种支架；

c)任选地，以一种或多种在生理pH值下带负电荷的生物相容性聚合物涂覆支架表面。

在还一个实施例中，所述混合物包含两种或更多种溶剂。

在另一实施例中，接种的细胞具有分化形成所需组织的谱系的能力。在优选的实施例中，接种的细胞可以是不同的类型。

在整个支架中的扩散将被理解成，但不限于，如下意义：基本上整个支架都有扩散，如约99％、如约90％、如约80％，如约70％的支架被扩散。在支架中，运输机理(扩散和对流)可被引导通过较大的通道。

术语“支架”将被理解成，但不限于，准备用于植入的构建物，例如适合用作植入物。在本发明的某些方面，支架在植入前先剪切以适合缺陷处。

支架的大小必须反映缺陷的大小，细胞的迁移率(例如支架中的迁移率)也需要考虑。当不存在打印的支架，并且使用了较高的细胞密度(3.5×10⁶/支架)，支架(0.07)的大部分呈开孔结构的内部在约5mm的整个高度上具有均匀的细胞分布，因此其间的细胞迁移必须仔细考虑。较低的PCL浓度可进一步增强细胞迁移，因此现在评价了20mg/g以用于组合的支架。支架的骨架/网格应该打印为充分开放的结构，以使冻干材料获得全面的孔隙率，从而保证了良好的迁移和物质转运。

高孔隙率通过双溶剂热诱导相分离方法获得，但是机械性质与孔隙率成反比。因此，在打印形式的支架中，稳定的骨架/网格被引入高孔隙率的支架中。通过该制备方法的组合，制备了最外层稳定的具有供细胞粘附和迁移的柔性内部的支架。当支架用于移植时是有利的，这是由于完全柔性的支架可以在使用期间可保持住组织以维持与特定缺陷的适配。

本发明另一方面涉及一种方法，其中所述相互连接的腔室通过热诱导的相分离和/或冻干溶剂形成。

本发明又一方面涉及一种方法，其中所述腔室通过气体发泡形成。

本发明另一方面涉及一种方法，其中所述腔室通过盐沥滤和热诱导的相分离方法形成。

本发明还一方面涉及一种方法，其中所述网格通过实体自由成型方法制备。

本发明还一方面涉及一种方法，其中所述第二材料中的平均孔隙直径在0.01至约800微米的范围内，例如从约0.1至约700微米，例如从约1至约700微米，例如从约1至约500微米，例如从约10至约400微米，优选地例如从约10至约50微米。

本发明另一方面涉及一种方法，其中所述混合物包含至少两种溶剂，例如约3种至约10种溶剂，例如约3种至约5种溶剂。

溶剂的非限制性的实例为己烷、庚烷、苯、四氯化碳、氯仿、乙酸、乙酸乙酯、THF、二氯甲烷、丙酮、乙醇、甲醇、丙醇、异丙醇、二氧六环、乙腈、二甲基亚砜、DMSO和水。

本发明还一方面涉及一种方法，其中所述溶剂的凝固点相互隔开至少5℃，例如从约5℃至约100℃，例如从约6℃至约95℃，例如从约8℃至约90℃，例如从约10℃至约70℃，优选例如从约5℃至约100℃。

本发明还一方面涉及一种方法，其中所述支架表面以天然或合成涂覆材料涂覆，所述天然或和成涂覆材料例如蛋白质、多肽、核苷酸和/或小干扰RNA。

在又一另外的方面，本发明涉及工程化的组织，该工程化的组织通过使生物相容性活性支架与细胞在生物相容性三维支架与细胞之间发生有效反应的条件下，在体内或体外接触而制备，所述生物相容性活性支架通过上述方法制备。在某些实施例中，细胞选自干细胞、祖细胞和/或分化细胞，例如部分或完全分化的细胞。在另一实施例中，细胞选自再生细胞。在某些实施例中，细胞是神经细胞、上皮细胞、心肌细胞、肺细胞、角质化细胞和内皮细胞中的至少一种。在某些实施例中，细胞是PC12或神经元限制前体(NRP)细胞，工程化的组织是神经元形成组织。

应该注意的是，在本发明其中一方面的文中所说明的实施方式和特征也适用于本发明的其它方面。

在本申请中所引用的所有专利和非专利文献均通过引用将其全部内容引入本文。

本发明将通过下列非限制性实例进一步详细说明。

在本发明的一方面，本发明的支架可通过双光子聚合复制，其原理公开于Andreas Ostendorf等人的论文

实施例

打印和冻干支架的制备

支架——冻干

支架通过聚己酸内酯(PCL，商品级6405，Solvay)的热诱导相分离(TIPS)及随后的冻干制备。简而言之，在室温下将PCL溶于1，4-二氧六环中。当获得均质混合物时，加入少量的水。支架的制备过程在层流工作台中进行，并且设置如图1所示。对三种类型的支架进行生物学测试，并且根据其水含量百分比进行标注，例如0.01、0.03和0.07。聚合物浓度为20、30或40mg PCL/g二氧六环。

将混合物浇注入玻璃量筒中(直径＝9.6mm，室温下)。将量筒至于冻干机中，降低温度至-25℃(2.5℃/分钟)，并保持20小时。由于1，4-二氧六环的凝固点为12℃，水的为0℃，它们会在不同的时间点上形成晶体。当混合物完全固化，PCL链包裹在晶界中时，该过程结束。将温度升高至-5℃，压力降低至约50毫托后，进行冻干，再进行升华(即直接由固相变成气相)。PCL量筒先在液氮中冷冻，然后由刀片剪切成最终支架大小。在用于体外时，剪切成5-10mm的高度，在用于体内时，剪切成2mm的高度。通过乙醇梯度(96％、70％，50％，间隔30分钟)对支架进行灭菌，之后再以无菌水洗涤。为增强支架的亲水性，支架表面以1.25M的NaOH腐蚀16小时(产生COO^-基团)，再以1M HCl中和1小时(使COO^-基团质子化形成COOH)，然后再以大量的无菌水洗涤。干燥支架或将其冷藏于生理盐水中直至使用。

支架——3D打印

快速成型设备Bioscaffolder(SysEng，Hünxe，Germany)用于打印PCL支架。PCL聚合物(T＝108℃)从直径为200μm的针管中挤出(最终纤维直径约为175μm)，并根据载入Bioplotter CAM软件中的模型逐层沉积。沉积速度为240mm/分钟，纤维之间的距离约为600μm(0/90度型)以获得高空隙率。支架为圆筒状(直径为10mm，高度为5mm)。

细胞和构建物的培养

用于测试PCL支架的细胞为hMSC-TERT，其在基础培养基或补充了100nM***、290nM抗坏血酸(Merck，Darmstadt，Germany)和5mM甘油磷酸脂的基础培养基中接种和培养，以用于矿化测试(成骨介质)。接种密度在1-3.5×10⁶每支架之间。

构建物的细胞性(cellularity)

将高度为5mm的冻干支架接种2×10⁶细胞，并按照前述在基础培养基中培养达21天。DNA量使用PicoGreen根据制造商的说明(n＝4)进行测定。

移植入小鼠

为测定体内细胞的长入以及退化行为，将未接种的0.01和0.07支架移植入雄性CDF1小鼠(18-20周，25-45g)。操作在麻醉下(25mg/kg氟阿尼酮，0.7875mg/kg枸橼酸芬太尼和12.5mg/kg安定，静脉注射)进行。在手术之前，以70％的乙醇对小鼠皮肤进行消毒。在每只小鼠背部的皮肤上剪一个1厘米长的切口，并且通过钝性分离形成两个皮下的小囊。在各个囊中放置一个支架，并针对侧面和小鼠，对支架顺序进行随机化。两种支架类型以4种形式出现。以线缝和切口，并在术后三天对小鼠进行止痛处理(5mg/kg卡洛芬，皮下注射)。在植入后1-6周，静脉注射戊巴比妥对小鼠实施安乐死，回收样品进行组织学分析。所有的动物实验均经过丹麦机构动物管理和使用委员会(Danish Institutional Animal Care and Use Committee)的批准。

活/死染色

按照活/死染色试剂盒的说明，使用该试剂盒进行可行性测试。

组织学

对于组织学分析，体外和体内样品均以4％的甲醛溶液(pH 7.0)固定，嵌入Technovit

7100(Ax-lab，Vedbaek，Denmark)，并使用Polycut E显微镜用薄片切片机(Reichert&Jung，Heidelberg，Germany)切成10μm切片。切片取自支架的中心部分，并以苏木精和曙红染色。使用CamediaC-5060数码相机(Olympus，Denmark)在BX50显微镜上获取图像。其它体外切片以Goldner三色法染色。该方法由以下步骤组成：以0.4％酸性品红(5分钟)，橙黄G(20分钟)和2％的淡绿(5分钟)染色，各染色步骤之间以乙酸冲洗。切片用蒸馏水中的苏木素进行复染。核染色质染成蓝色，矿物化骨染成绿色，胶原/类骨质染成亮红色。

肌动蛋白免疫染色

细胞骨架的排列根据肌动蛋白染色确定。将培养了24小时的构建物以4％的多聚甲醛PBS溶液固定，并且根据制造商的说明使用微丝骨架和粘着斑染色试剂盒(Chemicon International，Inc)染色。TRITC共轭的鬼笔环肽稀释度为1∶400(在室温下孵育60分钟，肌动蛋白染色)，DAPI稀释度为1∶1000(孵育5分钟，核对比染色)。在激光扫面显微镜510Meta上获取图像。激光激发为543nm，滤光片在520/554之间透光，在580nm下可见肌动蛋白。

SEM

对于SEM，支架在液氮中冷冻后以刀片在中部切片，而构建物以含有0.1M二甲胂酸钠缓冲液(pH 7.4)的2.5％的戊二醛固定，并在转移至干燥器空气干燥之前以梯度乙醇脱水(50％、70％、90％、99％，间隔30秒)。支架和构建物使用低真空二次电子检测仪(Nova NanoSEM 600，FEICompany)分析。

高分辨率X射线断层摄影

X射线断层显微镜(XTM)研究在欧洲同步辐射装置(EuropeanSynchrotron Radiation Facility)第19实验站(Grenoble，France)中进行，这利用了由同步加速器实现的高X射线强度获得高对比度。正弦式轨迹激励磁铁用于选择20keV的光子，通过所用的检测器，X射线敏感的转换器产生可见光，并且在FReLoN相机中，在冷却的电荷耦合装置上成像。

最终分辨率由光束的性质特性决定，检测器的有效像素大小选定为0.28μm，视场为0.6×0.6mm²。从单个样品确定的数据包括1500幅角扫描图像，所述图像在样品旋转期间获得，其中步长为0.12°，样品与检测器的距离为8mm。曝光时间为每幅图像0.15秒。在该图像获得方案后计算物质的空间分布，所述物质使用平行光过滤的逆投影算法从工程图像中重构，该过程由ESRF软件PyHST实时。这提供了包含具有0-255的灰度值的三维像素的3D图像。从该图像，材料的形态的渲染可通过在等值的像素之间***表面积而可视化为等值面。在此图像中的单个像素具有280×280×280nm的大小。因此通过该3D图像，切片可揭示分析的支架的形态。分析了约8mm³的样品(n＝2)。它们以氰基丙稀酸酯胶固定在铝制圆筒表面上，圆筒置于断层摄影操作台的回转台上。

聚己酸内酯支架

在玻璃管中冻干PCL会得到长筒状的支架(图2)。其在闸床(guillotine)中手动剪切，所以最终支架在高度上稍有不同。热解质谱分析法显示，无论支架中的水含量，其中不存在有机溶剂。

无论水含量，冻干会导致表面具有很高的疏水性。如接触角测试所显示的(图3)，该角度在NaOH处理后显著降低，显示该表面变得具有明显更高的亲水性。

SEM显示了一些结构上的差异，即0.01支架比0.07和0.03的表面更加均匀(图4)。0.07支架的表面形态非常粗糙，具有许多裂缝和鼓包，但是0.01支架外表较为光滑。在一些制备批次之间，这些外观是可以再现的。当仔细观察0.07支架时，可以观察到均匀精细的ECM装结构(图5)，这接近地模拟了天然组织的各种纤维尺寸。

高分辨率微断层摄影显示了取决于制备期间加入水量的双级支架结构(图6)，这是由于两种溶剂的结晶点不同。支架由规则的大约250μm的较大孔隙组成，孔隙壁上的孔隙率的量不相同(从0.01支架0至0.07支架的1-5μm)。水量的增加导致供细胞附着的表面积显著增加。该双级孔隙在二氧六环结晶(较大孔)后由残留在聚合物溶液中结晶水(小孔)形成，由于1-3％的水含量不会形成多孔的孔隙壁，因此需要一定量的大于5-6％的水。对于具有较低浓度聚合物(30mg/g)的0.01支架，所得的支架的壁较薄，但是孔隙大小相似，并且没有二次分级(数据未显示)。当对较大的0.07支架切片进行观察时，可以看到花状的结构(图7)。残留在孔隙壁中的水晶体在升华时可能引起了***式的转变，这是由于许多壁看起来是内-外指向的(例如，参见正好位于白线的上端的扇状区域)。

在活/死染色中(图8)，与更常规分散在0.07中的细胞相比，从0.01至0.07的强度梯度可以反映0.01中的细胞的高表面值。一般而言，细胞在表面上的接种形态反映了支架表面的波浪状的特征，这导致了细胞层的不均匀的外观。

PCL支架的细胞性从DNA定量估算。大量的0.07支架在灭菌期间溶解，因此没有获得可靠的DNA定量(n＝4/时间点)所需的数据。因此，仅显示了0.01和0.03的结果(图9)。在所有的时间点上，0.01支架中的细胞性略高，但是没有明显的差异。在培养期间细胞性有较小的增加，这显示增殖不是最佳的，经推测是因为细胞尽在支架表面生长(见图11的组织学图像)。对于ALP酶活性，两种支架类型均在8天后达到峰值水平(图10)。

在三种类型的支架中，细胞的长入有很大的不同(图11)。

0.01和0.03支架在第1天和第7天有较浅的一层细胞，然而0.07支架在第一天起整个横截面上就已经有均匀分布的细胞。在0.01支架中，直到第21天细胞才分布均匀，而0.03支架要到第14天。0.07支架是第一个在第1天便观察到完全均匀的细胞分布的支架。细胞粘附在所有的三种支架上(图12)。在0.01支架上，细胞是平滑的，并且紧邻支架结构，仅有数个较小的凹陷横跨在表面上。在0.03支架中，拉伸的外观比较明显，但是0.07支架最为显著，其中伸出的细胞固定了许多粘附点从而横跨了大量的凹陷。在0.07支架上，细胞倾向于具有浮动的外观，仅接触支架架构的端部，这未得到组织学切片的证实。

在成骨培养基中培养三周后，通过三色法染色的组织学切片，观察到形成了矿物化细胞的区域(图13)。在染色片中观察到了不同的分化水平；灰绿色的细胞是矿物化的成骨细胞，红色圆形的是未矿物化的成骨细胞前体细胞，细长的亮红色细胞是未分化的前体细胞。SEM显示在构建物的表面的簇中有较小的(0.5-1μm)结节状结构形成。图像代表了三种类型的支架。

将空支架皮下植入小树，在实验期间未观察到炎症迹象或不良组织反应。从第一周就观察到接受的细胞的长入，但是直到第四周才获得完全细胞化的支架(图14)。在观察阶段期间，发现形成了越来越多的基质以及支架的收缩。第六周后，支架中完全渗入了细胞，但是没有明显的降解。在第六周的切片中观察到了一些与炎性反应有关的多核细胞，这表明了宿主组织和PCL之间的生物相容性。

这些支架的机械性质普遍会存在问题。获得的支架的稳定性非常低，并且在“闸床”剪切和NaOH制备期间经常可以观察到崩溃现象。压力测试表明孔隙率和刚性成反比，0.01、0.03和0.07的估计刚性分别为0.31、5.76和6.32kPa。

为优化支架的机械性质，试验了另一制备方法，快速成型或3D打印方法。针对定义的结构和孔隙率，3D打印方法获得了非常均匀的支架(图16)。各层沉积在彼此的顶部，并且由于聚合物溶液在打印时会融合，因此单个纤维固定在临近的纤维上，从而得到具有良好稳定性的多层结构。由于各纤维为实体，因此该方法获得的支架的机械性质与冻干的支架相比明显增强。肌动蛋白丝与细胞的附着和迁移高度相关，其染色用于说明hMSC-TERT细胞和打印支架的生物相容性(图17)。拉长的肌动蛋白的表面上有大量的附着点，这些附着点会被认为是在融合沉积工艺后支架和细胞的相容性的表现。但是由于不存在冻干支架的高孔隙率的支架壁，因此聚集在支架上的细胞的密度会低很多。

根据肌动蛋白染色，SEM显示打印的支架具有良好的细胞粘附性，并且细胞在支架的各层之间伸展(图18)。

为结合两种类型支架的最佳的性质，制备了打印和冻干(组合)支架。打印的PCL芯材在冷冻和冻干之前，先浸入二氧六环-水-聚合物溶液。根据工艺窗(process window)(图1)测定全范围的聚合物浓度和H₂Owt.％，并且可以在绘制的支架内合成所有之前的结构(图19)。从而获得了具有良好的细胞粘附性和长入的机械稳定的支架。通过绘制的微米级结构提供了高刚度，并且该高刚度可通过网格布局调整。由热诱导的相分离期间形成的结构引入支架的纳米结构提供了极高的表面积和渗透性。纳米结构的特征可通过改变浓度水平调整。最重要的是用于调节宏观性质的机理与用于调节纳米级性质的机理并不关联，因此这些性质可单独地调节。由于打印结构决定了形式，过量的冻干物质可以通过钳子除去，所以支架几乎可以形成任何3D外形。这克服了模具的边缘效应，该效应可能闭合供营养物流动的支架周边。

活/死染色确认了组合支架也具有全细胞活性(图20)。

在PCL 0.07上观察到了高伸展的细胞，尽管在打印的PCL支架上，细胞在形态上看起来更圆——这可能是由于绘制的PCL的表面比其它支架表面更加平滑。

打印和冻干支架在兔软骨细胞上的体内测试

将兔软骨细胞接种在打印和冻干支架上，并与商业产品Chondro-Gide

(CG，从I型和III型胶原蛋白制备)的生长进行比较。

软骨相关的基因(SOX 9，AGC，Col II和Col X)和成骨相关的基因Col I的转录水平通过qRT-PCR测量。

实时定量聚合物酶链反应(qRT-PCR)使用TaqMan

基因表达测试仪(Applied Biosystems)在7500快速实时PCR***上，在标准的酶和循环条件下进行。

接种的支架的SOX 9的表达是CG的2倍。

接种的支架的Col II的表达是CG的4倍。

接种的支架的AGC的表达是CG的5倍。

接种的支架的Col X的表达与细胞刮的相同，表面了相同的活性。

接种的支架的Col I的表达比所有的细胞刮(cell scrape)低4被，表面当细胞在支架中生长时形成较少的瘢痕组织。

宏观封装的打印支架的制备

该研究评价了打印支架的涂层和接种***对细胞接种效率、增殖和分化的影响。这些参数对于组织工程的成功是最重要的。涂层***是天然的和合成的聚合物的混合物，使用三步方法与细胞一起施加到支架上。申请人使用了永生化hMSC群在两种不同的培养方法(反应瓶和静态培养)下来测试基于PCL的打印支架，该支架通过聚合电解质复合凝聚涂敷了透明质酸、甲基化的胶原和三元共聚物。为提高骨髓基质细胞(MSC)在3D支架中的接种效率和活力，实施了通过聚合电解质复合凝聚的宏观封装。用于复合凝聚的两种复合电解质为甲基化胶原以及甲基丙烯酸羟乙基酯、甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸的三元共聚物(HEMA-MMA-MAA)。通过调节接触时间，可以形成封装3D支架的不同厚度和密度的胶原-三元共聚复合物。该水性凝胶的密度可以通过控制许多参数进行调节，例如聚合电解质对的材料性质、聚合电解质在复合凝聚期间的接触时间，这可以确保有效的细胞捕获同时不会损及基质内的传质。

支架的制备和表面处理

聚己酸内酯(PCL)支架以BioScaffolder(SYS+ENG GmbH，德国)通过融合沉积成型方法制备。以活检咬取钳(biopsy punch)(Acuderm，Florida)从5mm厚的多孔PCL垫中冲出直径为10mm的圆筒状支架。整体纤维宽度和高度分别为170和120μm。在各沉积层中，中心-中心纤维距离为1.0mm，各连续层的纤维取向呈105°角，偏移0.17mm。为提高表面的亲水性从而促进细胞的附着，以乙醇和氢氧化钠处理支架，以切断表面的聚合物链，以及使端基羟基化。支架以无菌水润洗多次，干燥并置于无菌干燥器中保存。

甲基化胶原和三元共聚物的制备

阳离子型胶原通过使用甲醇酯化羧基制备(Chia，Leong等人，2000)。甲基化胶原的浓度为3mg/ml。阴离子型HEMA-MMA-MAA三元共聚物按照其它部分的描述合成和纯化(Chia，Leong等人，2000)。用3％的三元共聚物宏观封装3D支架。

支架上的共聚合膜的装配和特征

在室温下在抽空的干燥器中，将支架浸入在4.0mg/ml的透明质酸溶液中(780kDa，Lifecore Biomedical Inc.，批号：P9805-9A)24小时，然后冻干(Lyphoware，NJ，US)。移取100μl(微升)3mg/ml的甲基化的胶原溶液进入干燥的透明质酸预涂敷的支架，然后以最后一层3％的三元共聚物溶液覆盖，从而完成宏观封装。在接触10分钟后，复合凝聚反应亦磷酸盐缓冲盐水(PBS)淬灭。

扫描电子显微镜(SEM)用于检查支架上共聚合物膜的形态和分布。

hMSC-TERT的扩培

端粒酶逆转录酶基因转导细胞群hMSC-TERT细胞群用于本研究。这些细胞保持了其初始MSC的功能特征，并且在特殊刺激下能分化形成某些中胚层细胞类型(成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞)。在含有10％的胎牛血清(FBS)的Dulbecco′s改性的必需培养基(DMEM)中，将来自PD水平262(通道45)的细胞接种在培养烧瓶中，并在37℃和5％CO₂的潮湿氛围中培养。一周后，以PBS洗涤细胞，以在PBS中的1.25％的胰蛋白酶和5mM的EDTA分离，补种，再培养一周。胰蛋白酶处理细胞(PD水平271，通道47)，再分散于DMEM/10％FBS(青霉素(100U/ml)和链霉素(100mg/l))中备用(4×10⁷细胞/ml)。

hMSC-TERT在PCL支架中的宏观封装

将涂敷了透明质酸的支架置于琼脂糖涂敷的6孔培养板(4个支架/孔)中。将在3mg/ml的甲基化胶原溶液中的2×10⁷细胞/ml的细胞悬浮液100μl分散在支架上，从而得到了1×10⁶细胞/支架的接种量。将接种的支架孵育2小时，然后通过100μl的3％的三元共聚物溶液以滴加的方式包封。接触10分钟后，向各孔中加入7.5ml DMEM/10％FBS、100U/ml青霉素、100mg/l链霉素，并将该支架孵育过夜以使细胞附着。在对照组中，未涂敷的PCL支架接种了1×10⁶细胞/支架。

未涂敷的和涂敷的PCL支架的旋动反应瓶培养和静态培养

24小时后，将支架转移至新的琼脂糖涂敷的6孔板(1支架/孔)或置于直径为58mm的单侧壁反应瓶(Bellco glass，Vineland NJ，USA)。装配具有4个枕头的可加热刚结构，并将其置于反应瓶中。各枕头上放置两个接种了细胞的支架，每个反应瓶上共装有8个支架。于侧臂帽松散地连接的CO₂孵育器中，将具有120ml介质的反应瓶置于具有4mm的搅拌棒的Bell-enniumTM五位磁力搅拌器(Bellco Biotechnology，NJ，USA)中，搅拌速度为30转每分钟。从第一天开始，介质是用于DNA、ALP和基因表达分析的DMEM/10％FBS，其含有10-8M 1，25-(OH)₂-维生素D3(Vit D，LEO Pharma，Denmark)。在第1、7、14和21天，各组的四个支架(涂敷的和未涂敷的、静态的和反应的)以PBS润洗，并冷冻以用于DNA定量，收集三个支架用于活/死染色、组织学和SEM，另外的四个支架在冷的PBS中润洗并冷冻在1ml Trizol(Invitrogen，Taastrup，Denmark)中用于基因表达分析。此外，在第7天和14天，四个支架用于ALP活性测试。细胞接种效率根据下式确定：％接种效率＝第一天的每个支架的DNA量/每100万个细胞的DNA量。

对于钙沉积测量，将接种了细胞的支架在DMEM/10％FBS中培养1周，然后以成骨刺激介质(含有100nM***、290μM抗坏血酸和5mM β-甘油磷酸盐的DMEM/10％FBS，Sigma)替换培养基。在第14天、21天和28天，收集各组的四个支架用于钙测试，另外的支架进行von Kossa染色。所有培养基中的介质每3-4天进行更换。

DNA定量

3D多孔支架中的总细胞数量通过使用Quant-iT^aPicoGreen

dsDNA测试(Invitrogen)测量每个支架中的dsDNA量进行测量。支架在1ml MEM中冷冻，融化，再以1秒开/5秒关闭的间隔进行超声波降解，总共进行1分钟。向各DNA样品中加入3mg胶原酶，然后在45℃的水浴下孵育过夜。以Tris-EDTA缓冲液将样品体积稀释10倍，涡旋以从支架碎片中释放DNA。从各样品中取出2×50μl，与PicoGreen

制备，避光孵育5分钟，使用酶标仪Victor3 1420Multilabel Counter(PerkinElmer Life Sciences，Denmark)在96孔板中进行测量。在480nm下激发样品，在520nm下测量荧光发射强度。根据制造商的说明制备标准物(lambda DNA，浓度范围：0-1μg/ml)。技术复制用于各生物样品。

活/死染色

支架以PBS润洗，并以在PBS中的2μM钙黄绿素AM和4μM乙锭同源二聚体(EthD-1)(LIVE/DEAD

Viability Kit，Molecular Probes)避光染色30分钟。非荧光钙黄绿素AM通过细胞内酯酶的活性转变成荧光的钙黄绿素，其将活力细胞染成绿色，但是EthD-1进入膜受损的细胞并通过与DNA结合将死细胞染成红色。图像使用激光扫描共聚焦显微镜510Meta(Zeiss Microimaging GmbH，Germany)立即获得。所有细胞图像的共聚焦设置(激发、激光功率、检波器增益和针孔大小)均相同。使用单独的通道和过滤器，钙黄绿素的激发/发射波长为494/517nm，EthD-1的为528/617nm。

碱性磷酸酶(ALP)活性测试

ALP活性使用色度终点测试法测定，该测试法测量在ALP的存在下对硝基苯基磷酸酯(Sigma)转变成黄色产物对硝基苯酚的酶转化率。对硝基苯酚的吸光度通过显微分光光度计在激发/发射波长为405/600nm下测量。标准物从对硝基苯酚(浓度范围0-0.2mM)制备。技术复制用于各生物样品。

钙含量测试

接种了细胞的支架的钙含量通过色度终点测试法定量，该测试法基于一种钙离子与两种偶氮胂III分子络合形成蓝紫色产物这种络合反应(Diagnostic Chemicals Limited，Charlottetown，PE，Canada)。简而言之，将钙沉积物溶于1M的乙酸中，并置于摇床中过夜。样品以ddH₂O稀释50倍，再将等分的20μl稀释液转移至96孔板中。加入偶氮胂III溶液(280ml)，在室温下孵育10分钟。制备从0至50μg/ml的钙标准物的系列标准稀释液，并以显微分光光度计在650nm下定量Ca²⁺浓度。钙含量以Ca²⁺的毫克数表示。

Von Kossa染色

支架以PBS轻轻地润洗，并在甲醛中固定5分钟，然后以ddH₂O洗涤，与2.5％的硝酸银溶液避光孵育20分钟，随后加入对苯二酚显色两分钟。最后，使用硫代硫酸盐除去剩余的银，时间为5分钟。在真空中干燥支架，然后拍照。将支架嵌入在Technovit

7100(Ax-lab，Vedb3/4k，Denmark)中，并使用Sawing Microtome KDG 95(Meprotech，Heerhugowaard，theNetherlands)切成25μm的切片。以0.1％的甲苯胺蓝染色切片。观察图像，并使用数码相机(Camedia C-5060)在BX50显微镜上拍照(所有的照片均使用Olympus拍摄，Denmark)。

组织学

支架以70％的乙醇固定，嵌入Technovit

7100(Ax-lab，Vedb3/4k，Denmark)，使用Sawing Microtome KDG 95(Meprotech，the Netherlands)切成25μm的切片。切片取自支架的周围部分和中心部分，支架以在PBS中的1mg/l Hoechst 33258(Sigma-Aldrich，Brondby，Denmark)在37℃下染色10分钟，再装配。观察图像，并使用数码相机(Camedia C-5060)在BX50显微镜上拍照(所有的照片均使用Olympus拍摄，Denmark)。

RNA提取和实时RT-PCR

以1ml Trizol收集的支架剧烈漩涡处理，加入氯仿，再次漩涡样品。以异丙醇沉淀RNA，以75％的乙醇洗涤，并溶于无核糖核酸酶、DEPC处理的水(Ambion，Cambridgeshire，UK)中。RNA的量、纯度和完整性使用UV/vis分光光度计(在260和280nm下的吸光度)和琼脂糖凝胶电泳测量。然后以脱氧核糖核酸酶I(Invitrogen)处理RNA样品。使用High Capacity cDNAArchive Kit(Applied Biosystems，Naerum，Denmark)从2μg总RNA制备cDNA。

实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)在7500快速实时PCR***上在标准酶和循环条件下进行，Hs00427621ml(TATA盒结合蛋白，TBP)、Hs99999907_ml(β-2-微球蛋白，B2M)、Hs99999908_ml(葡萄糖醛酸酶β，GUSB)，Hs00165814_ml(SOX9)、Hs00153936_ml(Aggrecan，AGC)、Hs00166657_ml(Col X)、Hs00231692_ml(Runx2)，Hs00758162_ml(ALP)、Hs00164004_ml(I型和α-I型胶原，Col I)、HsO1587813_gl(骨钙蛋白，OC)、Hs00277762_ml(骨粘连蛋白，ON)、Hs00167093_ml(骨涎蛋白I，BSP I/骨桥蛋白，OP)、Hs00173720_ml(骨涎蛋白II，BSPII)使用TaqMan

基因表达测试，人RNA聚合物II(RPII)使用定制的TaqMan

测试。所有的这些测试均包括两种未标记的引物和一种跨越外显子边界的FAMTM染料标记的TaqMan

MGB核酸外切酶探针。扩增子大小均小于170bp。使用了用于7500快速***的标准酶和循环条件。将对应于40ng RNA的模板cDNA加入各PCR反应中，并且对各种基因，各生物样品进行技术复制。使用7500快速***序列检测软件(1.3版，Fast System SequenceDetection Software)进行数据分析。感兴趣的基因的表达水平标准化为BestKeeper指数(Pfaffl等人，2004)，基于来自GAPDH、UBC和RPII的阈值循环(Ct)的几何平均值对各样品进行计算。下列等式用于各样品：

感兴趣的基因的相对表达＝2Ct(BestKeeper)-Ct(感兴趣的基因)。

统计分析

对于n＝4的生物复制物，结果以平均值±标准偏差(SD)表示。

统计使用Stata 10.0(College station，TX)进行测量。ALP活性、钙含量和基因表达使用方差分析(时间×处理)进行测定。当发现有明显的主效应或主效应间有相互作用时，使用t检验(方差齐性)或威尔科克森秩和检验(方差非齐性)做具体的比较。当p＜0.05时，平均值之间的差异被认为有统计学显著性。

支架上的共聚膜的特征

PCL支架的SEM显微(未显示)显示了约180μm宽的PCL显微如何形成支架。其中心-中心纤维距离为1mm，各层纤维之间边缘-边缘的距离为640μm。未涂敷的纤维的表面显示了20-50μm宽的凹陷和浅层裂缝，这些凹陷和裂缝在球粒形成期间产生。当支架以聚电解质复合凝聚宏观封装后，透明质酸-甲基化的胶原-三元共聚物复合物形成在支撑网格(PCL支架)中和周围。包含纳米纤维网格的共聚物复合物均匀地分布在PCL支架中，并且由PCL支架支撑。

细胞接种效率

假定在接种后的首个24小时期间，没有出现细胞***，未涂敷的PCL支架的接种效率经计算为49.6％，涂敷的PCL支架为70.7％(t-检验，p＝0.0001，n＝4)。

DNA定量

由于DNA的量与细胞的量成比例，所以从支架中提取DNA。从而可以追踪细胞随着时间的增殖。在培养期间，在所有的培养物中，均能观察到DNA的量增多。对于静态培养物，在第7天(p＝0.001)和14天(p＝0.003)，涂敷的支架的DNA水平明显较未涂敷的高。对于动态的培养物，在第7天(p＝0.006)和14天(p＝0.013)，未涂敷的支架的DNA水平高于涂敷的支架。在第14天和21天，对未涂敷的和涂敷的支架，与静态的培养相比，动态培养的DNA水平较高。

活/死染色和共聚焦显微法

在活/死荧光标记方法染色后，通过共聚焦显微镜对支架表面上的活细胞的分布进行可视化。在第一天，接种导致了涂敷的支架和未涂敷的支架上的细胞有轻微不规则的分散。但是在第7天，在静态培养物中，涂敷的支架和未涂敷的支架上，细胞增殖和迁移覆盖了整个支架表面，从而克服了上述现象。但是对于静态培养物，在所有的时间点上，涂敷的支架显示了在支架表面上分布得更加均匀的细胞群，相比于未涂敷的支架。对于动态培养物，在第14天和21天，涂敷的和未涂敷的支架的表面均获得了均匀分散的细胞曾。在第14天，未涂敷的支架比涂敷的支架显示了更加融合的细胞层，但是在第21天，两者没有差别。静态培养物与动态培养物相比，静态培养物中获得了更加融合的细胞层，这可能是由于与静态培养物相比，细胞的总体数量并没有减少，从而在动态培养物中细胞迁移至支架的中心。

ALP活性

在第7天和14天，静态的和动态的培养物中涂敷的支架的ALP活性显著高于未涂敷的支架。动态的培养物达到峰值的时间早于静态的培养物。

矿物化

为评价hMSC-TERT细胞的矿物化，测定了细胞/支架构建物的钙含量。在第21和28天，动态培养物中，涂敷的支架的钙沉积明显高于未涂敷的支架。静态培养物中，涂敷的支架和未涂敷的支架在所有的时间点上没有明显的区别。对于未涂敷的和涂敷的支架，在第21天和28天，动态反应瓶培养物与静态培养物相比，钙沉积明显增加。对于未涂敷的支架，在第21天和28天，反应瓶培养物比静态培养物的分别高2.2倍和3.5倍，对于涂敷的支架，分别高4.6倍和5.3倍。

在第21天和28天，申请人观察到反应瓶培养物的von Kossa染色比静态培养物的更加黑。与为涂敷的支架相比，涂敷的支架整个支架上的黑色更加均匀。无论采用哪种培养方法，活细胞存在于涂敷的支架的内部。对于静态和动态的培养物，涂敷的支架中细胞渗入深度比未涂敷的更深。在反应瓶培养下，涂敷的支架中强的von Kossa染色表明了更高的基质矿物化。

组织学

支架中的细胞分布通过对样品的横截面进行荧光显微来评价。从支架的顶部到底部，穿过整个支架的切片的中心部分进行拍照，并使用PhotoshopCS3进行合并。在培养7天后，细胞渗透进入支架的内部，并迁移至底部的纤维。在静态和反应瓶构建物中，在第7天观察到形成了新的ECM，在涂敷的动态培养下的支架中最为明显。培养14天后，显著量的细胞增殖并在整个支架中迁移，该现象在细胞培养3周后更加明显。在第21天，反应瓶培养物中涂敷的和未涂敷的支架之间有明显的差异。与未涂敷的构建物相比，在涂敷的构建物中，细胞在纤维内空袭中分散范围更广。

实时定量RT-PCR

软骨形成相关的基因(SOX 9、AGC和Col X)和成骨形成相关的基因Runx2的转录水平、ALP、Col I、OC、ON、骨涎蛋白I(BSP I/OP)和骨涎蛋白II(BSP II))通过qRT-PCR测量。

与反应瓶培养的构建物相比，静态培养的构建物的SOX 9表达水平在所有时间点上均较高。对于静态培养物，未涂敷的支架和涂敷的支架之间没有明显的区别，并且表达在第14天达到峰值。对于反应瓶培养物，直到第7天涂敷的支架中的表达水平一直增加，然后保持稳定。

静态培养物中AGC的表达高于反应瓶培养物，并且在动态和静态培养的支架中涂敷均降低了AGC的表达。

在反应瓶培养的支架中，Col X从第7天开始高度表达，并在第21天达到峰值，但是在静态培养的支架中，Col X的表达在所有时间点上均较低。无论培养方法，未涂敷的比涂敷的表达高。

静态培养的Runx 2的表达在所有的时间点上比反应瓶培养的高。对于静态培养物，表达从第14天达到峰值。对于反应瓶培养物，涂敷增加了表达并且在第21天达到峰值。

静态培养的ALP的表达在所有的时间点上比反应瓶培养的高。无论培养方法，涂敷的比未涂敷的表达高。在静态培养的支架中，培养期间表达升高，但是在动态培养的支架中，观察到稳定的表达。

在第21天，反应瓶培养的支架的Col I表达显著增加，但是在第2天两培养物表达均稳定。

从第7天，静态培养OC表达比反应瓶培养的高，并且在第7天达到峰值随后下降。对于静态的培养物，在第7天前的大多数时间点，无论培养方法，涂层都会使OC表达上调。

反应瓶培养物的ON表达比静态培养物的高。在第7天和14天，两培养物中涂层使表达上调，但是在第21天并未上调。

在静态和反应瓶培养物中，BSP I(OP)的表达从第2天下降。对于静态培养物，涂层通常导致表达上调。对于反应瓶培养物，涂层仅在第2天使表达上调。

在静态和反应瓶培养物中，BSP II表达在第2天最高，随后大幅下降。

从RT-PCR结果可知，对于Col X、Runx 2和ALP，未涂敷的反应瓶培养的支架的基因转录类型更显著。X类型胶原是肥大软骨细胞的标志物，肥大软骨细胞是最终软骨细胞分化前的最终阶段。虽然所有的培养都使用了成骨介质，ALP/DNA测量清楚地表明在该组中成骨表型最弱。这些发现表明该组中的细胞启动了软骨细胞的骨化，其中媒介软骨模板下沉然后钙化。

结论

涂敷的PCL支架

申请人的研究显示使用透明质酸-胶原-三元共聚物涂层显著提高了所有的结果变量，另外似乎对多孔支架中的细胞分布具有分散作用。涂层的作用主要来自于在细胞紧邻区域中其对天然ECM的模拟。由于透明质酸和I型胶原衍生物是ECM的主要成分，因此其被用于此目的。透明质酸是存在于大多数组织中的非常大的粘多糖。分子的大小和亲水性对于孵育组织膨胀和机械回弹性的功能是重要的，特别是肌肉骨骼***。在分子水平上，透明质酸是CD44的主要配体，CD44是普遍存在的调节细胞-细胞和细胞-基质粘附的跨膜受体，其中CD44能结合其它ECM分子，例如纤连蛋白和胶原蛋白。CD44受体-配体相互作用可触发决定细胞形态和生存的通路。这与粘合素受体的作用相似，两种受体家族都聚焦于Ras和Rac的活化。

悬浮液中的单细胞保持了富含透明质酸的细胞外层。该外层介导了对基底的快速的与粘合素无关的粘附。如果使用透明质酸酶酶性除去了外层，细胞将从基底弹开，即使存在粘合素配体。另一方面，如果基底和细胞均覆盖了大量的透明质酸，则不会出现粘合素依赖的附着，细胞也将弹开。在细胞迁移和细胞***期间，附着力的调节是重要的，当恶性细胞过度表达透明质酸或CD44时肿瘤侵袭性提高就表明了这一点。涂敷过程的原理在于：发明人希望通过在涂敷在支架表面的带正电荷的甲基化胶原和带负电荷的透明质酸之间形成凝聚复合物。将胶原溶液结合至支架可能有利于该反应。细胞混合入胶原溶液而不是透明质酸，这是因为透明质酸粘度太高以致于不能得到均匀的细胞悬浮液。最终步骤为使用带负电荷的三元共聚物进行包封。

一般而言，结果显示涂敷的支架具有较高的细胞接种效率，较多的分化细胞数量，并且分布均匀。定性地，涂敷降低了在支架表面上形成的细胞片的范围，该细胞片会限制营养物的运输。在涂敷的支架中，ALP活性、钙含量和一些成骨细胞标志物的表达(例如ALP、OC和BSP I)明显较高。反应瓶培养在细胞的增殖和存活方面优于静态培养，这对于基质矿物化尤其重要。本次体外研究提供的证据表明，共聚物膜提高细胞接种效率、增加细胞渗透深度和促进细胞在3D支架中的分布。

能控制干细胞多谱系分化的支架的制备

复杂组织和器官的制备是组织工程学的终极目标。工程化的形态学需要在空间上控制了多种细胞在植入物(支架)中的发展。本发明发明人针对该要求提出了新的解决方案，其通过将含有不同小干扰RNA(siRNA)的纳米颗粒吸附至纳米结构的支架上。这使得siRNA空间保留在纳米孔隙中直至其细胞释放。释放的siRNA能使间质干细胞中的BCL2L2和TRIB2基因沉默，从而分别增强成骨细胞和脂肪细胞的分化。位于单个植入物中的空间上不同位置的不同纳米颗粒使得两种不同的组织类型在植入物的可控的区域中形成。该简单且有效的用于增加分化的方法立即被用于所有的组织工程领域。而且，该技术使得复杂组织和器官通过多细胞类型在空间限制的纳米颗粒的引导下的原位形成而被工程化。

发明人提出了新的技术，siRES(siRNA增强的支架)，该技术由可生物降解的纳米结构的聚-ε-己内酯(PCL)支架构成，该支架以冻干的聚合物/基于脂质的纳米颗粒siRNA运输***功能化。使用用作祖细胞的hMSC和靶向增强的绿色荧光蛋白(EGFP)、tribble同系物2(TRIB2，也称为TRB2)和BCL样2(BCL2L2，也称为BCL-w)的siRNA，研究了颗粒的位置和保留性质，以及***分化的沉默和体内体外的增强。该研究成功地证明了分化的增强，并且在复合支架中的离散的位置中，通过控制含有纳米颗粒BCL2L2siRNA和TRIB2siRNA的沉积，细胞特化受到的影响不同。

结果

单层培养物

在单层培养物中初步研究了以siRNA逆转染hMSC的可能性。组织培养板接种端粒酶永生化的hMSC23，组织培养物通过冻干方法以具有水力直径(259±14nm)和界面电位(12.6±0.5mV)的TransIT-TKO/siRNA进行涂敷。使用了靶向EGFP(EGFP表达hMSC，用于这种情况24)、BCL2L2和TRIB2。流式细胞仪和定量PCR(qPCR)显示运输***在2天后能将所有siRNA靶向基因的表达降低至少50％。EGFP蛋白的水平在转染后第7天减少了超过95％。通过将hMSC在siRNA涂敷的板上在维持培养及中生长2天，再在不同的分化介质中生长12天，研究siRNA转染对细胞活力的影响。转染的细胞活力在维持培养基中稍有降低(EGFP、TRIB2和BCL2L2siRNA活力降低约30％、约40％和约45％)。该降低与通过分化培养基诱导的相当。当经受siRNA转染和分化培养基时，使用碱性磷酸酶和油红O染色，hMSC显示出分别分化成成骨细胞谱系和脂肪细胞谱系。总之，冻干的TransIT-TKO/siRNA颗粒是hMSC单层培养物的有效的转染剂。

siRNA涂敷的支架

分层排列的支架通过在双溶剂中PCL的热诱导的相分离，随后通过部分化学讲解引入纳米-粗糙度和亲水性表面来制备。当以扫描电子显微镜(SEM)可视化时(未显示)，支架的孔隙大小呈现出双峰分布。大孔隙(直径＞50μm)由壁(厚度为10-40μm)隔开，壁含有大小较小的腔室(最小的结构特征在于其延伸小于15nm)。这些纳米结构特征大幅提高了表面及。当以纳米颗粒涂敷时，较小的腔室填满了具有维持约20nm大小范围的siRNA。相反，突出的结构不含有可见的纳米颗粒。荧光siRNA颗粒被吸附到支架上以研究颗粒的吸附。当涂敷的支架加入介质和血清时，siRNA在24小时后继续位于壁上(未显示)。含有细胞的支架显示了siRNA的摄入，在一些细胞中限制了高达24小时，但是在大多数群中是在72小时后(未显示)。涂敷方法导致完整粘附的颗粒沉积在支架壁上，并使得siRNA内化入接种的细胞。

siRNA在支架上诱导的沉默

为进行定量敲除，将支架涂敷以含有EGFP siRNA的颗粒，并接种表达hMSC的EGFP。48小时后，通过qPCR测量mRNA的表达。在EGFP siRNA涂敷的支架上EGFP表达降低(与未涂敷的支架相比降低了60％，p＝0.02，与涂敷了错配的siRNA的支架相比降低了35％，p＝0.05)。随后，在含有靶向BCL2L2或TRIB2的siRNA颗粒的支架上接种hMSC。72小时后，通过qPCR测量mRNA的表达。BCL2L2siRNA和TRIB2siRNA分别的BCL2L和TRIB2分别降低了40％(p＝0.004)和47％(p＝0.002)。总之，siRNA为细胞接纳并且诱导了基因沉默。

siRNA在支架上增强分化

为研究siRES是否影响分化，将hMSC加入预涂敷了针对TRIB2或BCL2L的siRNA的支架中。在维持培养基中转染48小时后，使用分化介质诱导脂肪细胞或成骨细胞分化。在不同的时间点，收集样品进行qPCR、微型计算机断层扫描和组织学分析。

在脂肪细胞分化实验中，在未涂敷的支架和eGFP或TRIB2siRES中，早期脂肪细胞标志物(载脂蛋白(aP2))、脂肪细胞转录因子(PPARγ2)以及晚期脂肪细胞标志物(脂肪连接蛋白(ADN)和脂蛋白脂肪酶)的表达随着时间增加。在第7天，与未涂敷的支架相比，在TRIB2siRES中，除LPL外所有的标志物的表达特异地增加(PPARγ2，高2.9倍，p＝0.03。aP2，高2.8倍，p＝0.04。AND，高4.7倍，p＝0.01)。

在成骨细胞分化实验中，早期成骨细胞标志物，碱性磷酸酶(ALP)的表达在第7天达到峰值，增加了高达140倍。在第7天，在BCL2L2siRNA涂敷的支架中ALP的表达比在EGFP siRNA涂敷的支架中高(高3.4倍，p＝0.004)。可选的早期成骨细胞标志物，I型胶原(COLI)的表达在实验期间降低高达80％。但是在BCL2L2siRNA涂敷的支架中减少得最慢，并且在第7天和第12天，该组中COL1水平最高(第7天，比EGFP siRNA涂敷的支架稿2.1倍，p＝0.01。第12天，比未涂敷的支架高1.4倍，p＝0.004，比EGFP siRNA涂敷的支架高1.3倍，p＝0.002)。在第7天和第14天，晚期成骨细胞标志物，骨钙蛋白(OC)和成骨细胞转录因子RUNX2的表达在实验期间增加，并且样品之间的差异不明显。在第21天，在两对照中，两种金银的表达均降低，但是在BCL2L2siRNA涂敷的支架中保持较高(RUNX2，比未涂敷的高1.2倍，比EGFP siRNA高1.7倍，p值分别为0.03和0.02。OC，比未涂敷的高2.1倍，比EGFP siRNA涂敷的高2.2倍，p值分别为0.02和0.03)。

对在成骨细胞培养基中培养了21天的siRES进行微型计算机断层扫描、染色和免疫组织化学测试以确认qPCR的发现。微型计算机断层扫描和vonKossa染色显示在整个支架中成功地矿物化，但是骨钙蛋白免疫组织化学证明骨钙蛋白在细胞外基质中的沉积。在所有的三个测试中，成骨基质在以BCL2L siRNA涂敷的支架中生长的最为明显。在维持培养基中培养的阴性对照未显示von Kossa或骨钙蛋白染色。综上，这些体外测试结果表明，以BCL2LsiRNA涂敷支架植入物促进了成骨细胞的生长，TRIB2siRNA涂敷促进了其脂肪细胞的生长。

为研究siRNA涂层对体内组织生长的作用，发明人将未涂敷的支架以及TRIB2或BCL2L2siRNA皮下植入非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠。植入前，将支架接种hMSC 16小时。8周后，取出支架，使用免疫组织化学和染色(未显示)进行研究。所有的支架显示了新血管形成，并且在整个支架中有阳性人特异性CD99染色，这确认了大部分细胞是人类细胞。具有早期脂肪细胞标志物S 100的阳性染色仅在TRIB2siRNA涂敷的支架中观察到，这表明使该基因沉默使得一个分支的细胞开始脂肪细胞分化。在BCL2L2siRNA涂敷的支架中，胶原被染色成浓密的天狼星红色，并且在偏振光下显示双折射，这表明其具有成熟的结构。

相反，未涂敷的对照中，双折射和天狼星红染色强度较低，在TRIB2siRNA涂敷的支架中，几乎没有染色和双折射。另外，I型教员特异的染色支持了天狼星红的发现，这确认了沉积的胶原为成骨型胶原。BCL2L2siRNA涂敷的支架中比未涂敷的支架的骨粘连蛋白和RUNX2染色更加明显，其比TRIB2siRNA涂敷的支架染色更强。但是，没有观察到矿物化的迹象。这些体内测试结果确认了体外测试的发现，但是细胞在植入位置最终没有分化成成骨细胞，siRNA是仅有的分化线索。

支架中的双重分化

为构建具有两种类型细胞的组织，将支架圆筒对半切开，各部分涂敷TRIB2或BCL2L2siRNA。然后连接两侧，加入hMSC。

对于体外测试，支架在维持培养基中培养2天，在复合分化培养基中培养8天。然后将两侧分开，测量各部分的分化标志物的mRNA水平。两侧PPARγ2、RUNX2、AND和OC的表达在统计学波动上相同。但是，TRIB2siRNA涂敷的部分，ap2上调了几乎4倍，BCL2L2siRNA涂敷的部分ALP上调了45％。

对于体内测试，将组合的支架接种hMSC，在维持培养基中培养16小时，在皮下植入2周大的小鼠。然后手术取出支架，切片，使用H&E、天狼星红和von Kossa染色进行染色。H&E的显色显示两部分支架均含有细胞，但是生长成非常不同的形态。BCL2L2siRNA涂敷的部分表现的致密，而TRIB2siRNA涂敷的部分为具有较大孔隙的海绵结构。天狼星红染色显示在BCL2L2siRNA涂敷的部分中，在偏振光下有序的双折射胶原大量沉积，但是TRIB2siRNA涂敷的部分没有观察到双折射。von Kossa染色显示两部分中均没有矿物化。这些结果表明在相同的体内和体外植入物内的特异的位置，通过在不同的位置放置不同的siRNA，可诱导细胞进入不同的通路。

讨论

该工作说明了涂敷了纳米颗粒的纳米结构的支架，该支架能保留和运输siRNA，对于干细胞在体内和体外的分化具有广阔的用途。当以两种不同的siRNA功能化时，这种支架显示出在体内和体外促进了在具***置的两种不同的分化途径。

siRNA之前已经通过将其嵌入柔性凝胶或将其加入培养基中，运输至在三维基质中生长的细胞，或者细胞在接种到植入物上之前，先以siRNA转染细胞。但是，所有的这些方法均不能用于将siRNA运输至具体的位置以在基质中生成多种类型的细胞。这使siRNA稳定地结合支架成为必需，直至随手直接运输至附着的细胞。

从支架的DNA运输比siRNA探索得更为广泛。这些研究通过将DNA含有纳米颗粒和病毒载体的裸露的质粒DNA吸附到支架上进行。裸露的核酸的转染效率通常非常低，并且由于裸露的siRNA对核糖核酸酶不稳定使得其运输更加复杂。由于病毒载体具有致肿瘤性和免疫原性的缺陷，非病毒载体提供了具有吸引力的运输解决方案。蛋白保护的干燥的siRNA纳米颗粒通常可达到较高的沉默，但是常见的蛋白保护剂，例如葡萄糖，可诱导脂肪细胞分化。重要的是，TransIT-TKO/siRNA没有蛋白保护剂时也可以冻干，可以干燥保存较长的时间，并且仍然保留在血清中高的敲除效率，促进了其用于支架的运输。

当冻干到支架上时，纳米颗粒保留了其在预冻干的形态，并且位于支架壁钟较小的腔室内。NaOH处理的PCL由于暴露了羧酸带负电荷，并且发明人发现TransIT-TKO/siRNA带正电荷。因此观察到的相互反应本质上最可能为静电反应。经推测，纳米结构的孔隙大幅增加了表面积，阳离子的TransIT-TKO组分可通过多离子相互反应相互作用。另外，预期这些纳米孔隙可保护流体流顶替(fluid flow displacement)。相互作用的稳定性通过在含有血清的培养基中24小时后纳米颗粒的继续保留率来指示。该稳定的粘附可使siRNA纳米颗粒定位以及其诱导的区域敲除。

在体外，发明人观察到当与成骨细胞培养基组合时，BCL2L2沉默增强了成骨细胞的分化。在体内，发明人没有发现矿物化的迹象，这证明了之前在体内试验的发现，即仅BCL2L2敲除不会诱导矿物化。但是，对于I型胶原在体内的沉积和组织，发明人的确发现仅BCL2L2敲除增强了早期成骨细胞分化。当与脂肪细胞培养基组合时，TRIB2沉默增加了脂肪细胞的在体内的分化。这确认了一些体内单层研究，这些研究证明了TRIB家族成员抑制脂肪细胞分化。TRIB2通过抑制Aktl活化同时增加C/EBP的讲解来抑制脂肪形成。EGFP特异的siRNA似乎增加了脂肪细胞的分化，虽然不如TRIB2siRNA的多。体内研究显示仅TRIB2敲除足以消除胶原双折射，同时使一部分在8周后分化形成s100阳性脂肪细胞。

发明人推测一种siRNA在增强分化时，没有继续刺激是不足以驱使晚期成骨细胞和脂肪细胞特化的。在体内观察到少量的S100阳性脂肪细胞，这可能是来自支架或植入微点的较弱的脂肪细胞刺激的结果。不使用分化介质，会需要多种siRNA以完成分化14。或者使用microRNA(miRNA)或miRNA抑制剂(antimirs)。miRNA是与siRNA相关的内源性RNA，其同时也调节了多种基因。已经发现miRNA增加了成骨细胞和脂肪细胞的表达。鉴于TransIT-TKO运输***可运输miRNA和antimirs，此处说明的***应该也可以直接用于miRNA调控子的支架运输。

发明人能开发纳米结构的支架，该支架使用含有针对TRIB2和BCL2L2的siRNA的定位图层，优先地刺激在不同区域的脂肪细胞和成骨细胞的分化。这在体外得到了标志物aP2和ALP的分化表达的确认。另外，体内孵育的支架中，两相邻的部分的形态明显不同；在BCL2L2涂敷的部分中，胶原沉积和排列高度增加。同时由于siRNA纳米颗粒已知的多功能性，发明人以专注于siRNA，其它分化方法的空间定位可能用于达到相同的结果。此外，可以相信其它组装技术，例如用于区分位置的不同药物的快速成型技术，可用于代替手动装配的模块。

发明人开发了能运输siRNA至接种的细胞的纳米颗粒功能化的支架的实例。而且，发明人证明了siRNA在这些细胞中诱导序列特异的基因沉默。作为临床相关的实例，发明人显示了特异地靶向TRIB2和BCL2L2分别导致脂肪细胞和成骨细胞分化增强。因此，具有单种类型的siRNA的支架涂层是多用途的，并且是用于增加单细胞类型组织的有效方法，代表了进行3D基因敲除的方法。重要的是，支架的纳米结构的性质使不同的siRNA的纳米颗粒保留和定位于植入物的不同部位。这使得引导干细胞在具***置进行交替分化成为可能。

参考文献

R.G.J.C.Heijkant等人，Polyurethane scaffold formation via acombination of salt leaching and thermally induced phase separation，J.Biomedicinal Materials Research Part A(2008).

Chia，S.M.，K.W.Leong等人，Hepatocyte encapsulation for enhancedcellular functions，Tissue Eng 6(5)：481-95(2000).

E.B.Antonio Ascenzi，The compressive properties of single osteons，TheAnatomical Record，vol.161，pp.377-391，(1968).

Engler等人，Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.Cell(2006)vol.126(4)pp.677-689。

Claims

1.一种能支撑诸如生长和分化的细胞活动的三维生物相容性支架的制备方法，所述方法包括：

-除去所述溶剂得到在所述开放网状结构中的第二生物相容性材料，所述第二生物相容性材料具有相互连接的腔室，在所述第二生物相容性材料中的所述相互连接的腔室允许细胞生长成为功能组织，并且允许营养物、代谢物和可溶性因子遍及所述支架扩散；

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种生物相容性聚合物在生理pH值时带正电荷，所述方法还包括下列步骤：

a)以细胞接种从权利要求1获得的三维生物相容性支架；

b)以一种或多种在生理pH值时带负电荷的生物相容性聚合物涂覆所述细胞接种的支架；以及

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种生物相容性聚合物在生理pH值时带负电荷，所述方法还包括下列步骤：

a)以细胞接种从权利要求1获得的三维生物相容性支架；

b)以一种或多种在生理pH值时带正电荷的生物相容性聚合物涂覆所述细胞接种的支架；以及

c)任选地，以一种或多种在生理pH值时带负电荷的生物相容性聚合物涂覆所述细胞接种的支架。

4.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括：

b)任选地，以细胞接种支架；以及

5.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括：

b)任选地，以细胞接种支架；

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述混合物包含两种或更多种溶剂。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述相互连接的腔室通过热诱导的相分离和/或所述溶剂的冻干来形成。

8.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述腔室通过气体发泡形成。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述网格由实体自由成型制造方法制得。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述第二生物相容性材料的平均孔径在25nm至800μm的范围内。

11.根据权利要求6-10中任一项所述的方法，其中所述溶剂的凝固点至少相差5℃。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述支架表面以天然或合成涂覆材料涂覆，所述天然或合成涂覆材料为例如蛋白质、多肽、核苷酸、和/或小的干扰RNA。

13.一种可支撑诸如生长和分化的细胞活动的三维生物相容性支架，所述支架包含第一和第二生物相容性材料，所述第一材料的形状为微米级的线形成的一个或多个网格，所述线形成具有空隙的开放网状结构；所述第二材料填充所述开放网状结构的大部分空隙，所述第二材料是多孔的，其中孔隙相互连接，所述第二材料具有多个大致均匀地分布于其中的开孔，所述开孔的平均尺寸小至使细胞不能渗入，所述网格为所述第二生物相容性材料提供保护性机械支撑，所述网格还保护所述三维生物相容性支架在制备、***和使用期间不受压缩力的影响，所述第二生物相容性材料包含一种或多种生物相容性聚合物。

14.根据权利要求13所述的支架，所述支架的压缩应力值与目标组织的压缩应力值相当。

15.根据权利要求13所述的支架，所述支架具有相容的抗压强度以承受来自目标组织周围的压缩应力。

16.根据权利要求13-15所述的支架，其中所述一种或多种生物相容性聚合物在生理pH值时带负电荷。

17.根据权利要求16所述的支架，所述支架还包含细胞，所述细胞在体外接种，所述支架还包括第一生物相容性聚合物涂层，所述第一生物相容性聚合物涂层包含一种或多种在生理pH值下带正电荷的生物相容性聚合物，所述细胞位于所述第二生物相容性材料和所述第一生物相容性聚合物涂层之间。

18.根据权利要求17所述的支架，所述支架还包括第二生物相容性聚合物涂层，所述第二生物相容性聚合物涂层包含一种或多种在生理pH值下带负电荷的生物相容性聚合物，所述第二生物相容性聚合物涂层位于所述第一生物相容性聚合物涂层的上面。

19.根据权利要求13-15所述的支架，其中所述一种或多种生物相容性聚合物在生理pH值时带正电荷。

20.根据权利要求19所述的支架，所述支架还包含细胞，所述细胞在体外接种，所述支架还包括第一生物相容性聚合物涂层，所述第一生物相容性聚合物涂层包含一种或多种在生理pH值下带负电荷的生物相容性聚合物，所述细胞位于所述第二生物相容性材料和所述第一生物相容性聚合物涂层之间。

21.根据权利要求20所述的支架，所述支架还包括第二生物相容性聚合物涂层，所述第二生物相容性聚合物涂层包含一种或多种在生理pH值下带正电荷的生物相容性聚合物，所述第二生物相容性聚合物涂层位于所述第一生物相容性聚合物涂层的上面。

22.根据权利要求13-15所述的支架，其中所述第二生物相容性材料以第一生物相容性聚合物涂层涂覆，所述第一生物相容性聚合物涂层包含一种或多种在生理pH值下带正电荷的生物相容性聚合物，其中在所述第一生物相容性聚合物涂层上面有第二生物相容性聚合物涂层，所述第二生物相容性聚合物涂层包含一种或多种在生理pH值下带负电荷的生物相容性聚合物，其中细胞位于所述第一和第二生物相容性聚合物涂层之间。

23.根据权利要求13-15所述的支架，其中所述第二生物相容性材料以第一生物相容性聚合物涂层涂覆，所述第一生物相容性聚合物涂层包含一种或多种在生理pH值下带负电荷的生物相容性聚合物，其中在所述第一生物相容性聚合物涂层的上面有第二生物相容性聚合物涂层，所述第二生物相容性聚合物涂层包含一种或多种在生理pH值下带正电荷的生物相容性聚合物，其中细胞位于所述第一和第二生物相容性聚合物涂层之间。

24.根据权利要求13-23所述的支架，其中所述开孔的平均尺寸小于1微米。

25.根据权利要求13-24中任一项所述的支架，其中所述第二材料中的所述开孔的孔密度的范围为约10⁹至约10¹⁵开孔每立方厘米所述第二材料。

26.根据权利要求13-25中任一项所述的支架，其中在所述第二材料中形成的开孔的总体积占所述第二材料的总体积的比例在约20％-90％的范围内。

27.根据权利要求13-26中任一项所述的支架，其中在所述第二材料中形成的孔隙的平均直径小于1000微米。

28.根据权利要求13-27中任一项所述的支架，其中所述支架表面以天然或合成涂覆材料涂覆，所述天然或合成涂覆材料为例如蛋白质、多肽、核苷酸和/或小的干扰RNA。

29.根据权利要求13-28任一项所述的工程化的支架用于修复或再生组织，所述组织选自骨、软组织、软骨、以及脑或脊髓组织。

30.根据权利要求13-28中任一项所述的工程化的支架用作药剂。