CN102477403A

CN102477403A - 一株邻苯二甲酸酯类化合物降解菌及其菌剂的生产方法

Info

Publication number: CN102477403A
Application number: CN2010105543025A
Authority: CN
Inventors: 庄国强; 金德才; 王萍; 吕作鹏; 白志辉
Original assignee: Research Center for Eco Environmental Sciences of CAS
Current assignee: Research Center for Eco Environmental Sciences of CAS
Priority date: 2010-11-23
Filing date: 2010-11-23
Publication date: 2012-05-30

Abstract

本发明提供一株分离自活性污泥的能够高效降解邻苯二甲酸酯类化合物的细菌菌株，并提供其菌剂的生产方法，属于生物技术领域。经鉴定这株菌为Diaphorobacter sp.，并将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.4345，该菌株的16S rDNA基因序列已经递交到了GenBank数据库，登录号为HQ588349。其菌剂的生产方法包括5个步骤：培养基配制、菌种活化、液体种子制备、液态发酵、菌剂制备。由本发明技术方案生产的邻苯二甲酸酯降解菌剂能高效降解环境中的常见环境激素——邻苯二甲酸酯类化合物。

Description

一株邻苯二甲酸酯类化合物降解菌及其菌剂的生产方法

技术领域：

本发明属于生物技术领域，涉及一株分离自活性污泥的能高效降解环境激素邻苯二甲酸酯类化合物的菌株(Diaphorobacter sp.QH-6)，及其菌剂的生产方法。

技术背景：

邻苯二甲酸酯类又称酞酸酯类，是大约30种化合物的总称，由邻苯二甲酸和相应的醇化合而成，一般为无色油状粘稠液体，难溶于水，易溶于有机溶剂，常温下不易挥发，成本较低，品种多，产量大，常用来做增塑剂提高塑料的可塑性能。目前使用的增塑剂主要是酞酸酯类化合物。酞酸酯类增塑剂应用最多的是酞酸二异辛酯(DEHP)，其次是酞酸二酯。我国常用的品种有：邻苯二甲酸二辛酯(DOP)、邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)、邻苯二甲酸二壬酯(DNP)等。近年来，随着工业生产和塑料制品的使用，塑料垃圾的大量增加，邻苯二甲酸酯不断进入环境，已成为全球性最普遍的污染物之一，广泛存在于空气及大气降尘物、水体、土壤、底泥、生物体等自然环境中，成为环境中无所不在的污染物。

由于邻苯二甲酸酯类化合物在自然界中光解和水解速率很慢，微生物降解是其矿化的主要途径。筛选高效降解菌具有重要的实践意义。邻苯二甲酸酯降解微生物筛选常用的方法是从邻苯二甲酸酯污染地区采集样品，经富集培养、平板划线等操作，分离得到单菌落，然后经驯化培养，或紫外化学诱变等方法获取高效降解菌株，或通过细胞工程、基因工程等技术手段构建工程菌株。例如：中国发明专利(申请号：200710026366)公开了一株降解邻苯二甲酸酯的乙酸钙不动杆菌。

城市污水处理厂的处理水来源复杂，有机污染物程度较高。其中，邻苯二甲酸酯是生活污水中的主要污染物之一。污水处理中，有机污染物的去除主要是通过活性污泥中的微生物降解而得以完成，从而达到污水净化的目的。然而，随着塑料工业的发展，邻苯二甲酸酯的污染也不断加剧，在污水处理厂的出水口也可以检测到邻苯二甲酸酯类化合物的存在，因此，从污水处理厂采集污泥，通过富集培养，梯度压力法驯化，获得高效降解菌并应用于实践，对于降低邻苯二甲酸酯在环境中的危害具有现实意义。

本专利是从活性污泥分离出的一株高效降解邻苯二甲酸二丁酯的菌株，命名为Diaphorobacter sp. QH-6，实验表明该菌能利用邻苯二甲酸二丁酯作为唯一碳源和能源生长繁殖，在纯培养条件下，该菌12h能将无机盐培养基中500mg/L邻苯二甲酸二丁酯降解完全，且在较宽pH范围内均能较好的降解DBP；该菌同时对邻苯二甲酸二甲酯，邻苯二甲酸二己酯，邻苯二甲酸正辛酯和邻苯二甲酸异辛酯等均具有良好的利用能力。表明该菌可用于治理邻苯二甲酸酯污染。目前尚未发现从活性污泥分离出降解邻苯二甲酸酯的Diaphorobacter属菌株及其菌剂生产方法的文献报道。

发明内容：

本发明的目的是提供一株分离自活性污泥的能够高效降解邻苯二甲酸酯类化合物的菌株，并提供该菌剂的生产方法。

本发明所提供的降解邻苯二甲酸酯类化合物的菌株是由我们实验室从活性污泥中分离筛选出来的。该菌株的分类命名为Diaphorobacter sp.，菌株编号：QH-6；于2010年11月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.4345，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。该菌株的16S rDNA基因序列已经递交到了GenBank数据库，登录号为HQ588349。在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站上用blast程序与已登录细菌菌株的16S rDNA基因序列进行比较，结果表明与Diaphorobacter sp.相似性最高，可以达到99％以上。

本发明所述的菌剂的生产方法如下：

1、培养基配制：

1)菌种保藏培养基(固体，1L)：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠5g，琼脂20g，加水至1L，pH 7.0-75；

2)菌种活化培养基(液体，1L)：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠5g，加水至1L，pH 7.0-75；

3)种子培养基(液体，10L)：酵母膏2g，DBP 1g，K₂HPO₄ 58g，KH₂PO₄ 30g，(NH₄)₂SO₄20g，MgCl₂ 1.6g，CaCl₂ 0.2g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.024g，FeCl₃ 0.018g，MnCl₂·2H₂O0.015g，pH＝6.8-7.5；

4)发酵培养基(液体，200L)：K₂HPO₄ 600g，KH₂PO₄ 300g，(NH₄)₂SO₄ 200g，MgCl₂16g，CaCl₂ 2g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.24g，FeCl₃ 0.18g，MnCl₂·2H₂O 0.15g，酵母膏200g，糖蜜300g，加水至200L，pH 6.8-7.5；

以上培养基均在121℃灭菌15-30min。

2、菌种活化：挑取邻苯二甲酸酯降解菌的菌种，在保藏培养基平板划线，于30℃培养，待长出明显的单菌落后，挑取单菌落在菌种活化培养基中，于30℃，150-200r/min摇床振荡培养12-24h；

3、液体种子制备：向装有高温灭菌的种子培养基的发酵罐中，按照5％-10％的接种量接种邻苯二甲酸酯降解菌，于25-37℃，通空气培养12-24h，得到液体种子。

4、液态发酵：向装有高温灭菌的发酵培养基的发酵罐中，按照5％-10％的接种量接种邻苯二甲酸酯降解菌，于25-37℃，通空气培养18-60h，得到活菌体培养物。

5、菌剂制备：培养好的发酵液经细菌计数后，超滤浓缩，调节至10¹⁰CFU/mL，灌装，于4℃保藏。使用时用水稀释50-1000倍。

具体实施方式：

由本发明技术方案生产的邻苯二甲酸酯降解菌剂能够有效降解环境中的邻苯二甲酸酯类化合物。以下通过具体实施例详细说明本发明的实施，目的在于帮助读者更好地理解本发明的精神实质，但不作为对本发明实施范围的限定。

实施例1：邻苯二甲酸酯降解菌剂的生产

1、培养基配制：

2)菌种保藏培养基(固体，1L)：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠5g，琼脂20g，加水至1L，pH 7.0-7.5；

5)菌种活化培养基(液体，1L)：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠5g，加水至1L，pH 7.0-75；

6)种子培养基(液体，10L)：酵母膏2g，DBP 1g，K₂HPO₄ 58g，KH₂PO₄ 30g，(NH₄)₂SO₄20g，MgCl₂ 1.6g，CaCl₂ 0.2g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.024g，FeCl₃ 0.018g，MnCl₂·2H₂O0.015g，pH＝6.8-75；

7)发酵培养基(液体，200L)：K₂HPO₄ 600g，KH₂PO₄ 300g，(NH₄)₂SO₄ 200g，MgCl₂16g，CaCl₂ 2g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.24g，FeCl₃ 0.18g，MnCl₂·2H₂O 0.15g，酵母膏200g，糖蜜300g，加水至200L，pH 6.8-75；

以上培养基均在121℃灭菌20min。

2、菌种活化：挑取邻苯二甲酸酯降解菌的菌种，在保藏培养基平板划线，于30℃培养，待长出明显的单菌落后，挑取单菌落在菌种活化培养基中，于30℃，150r/min摇床振荡培养24h；

3、液体种子制备：向装有高温灭菌的种子培养基的发酵罐中，按照7％的接种量接种邻

苯二甲酸酯降解菌，于30℃，通空气培养16h，得到液体种子。

4、液态发酵：向装有高温灭菌的发酵培养基的发酵罐中，按照5％的接种量接种邻苯二甲酸酯降解菌，于30℃，通空气培养14h，得到活菌体培养物。

5、菌剂制备：培养好的发酵液经细菌计数后，超滤浓缩，调节至1010CFU/mL，灌装，于4℃保藏。

实施例2：邻苯二甲酸酯降解菌剂对邻苯二甲酸二丁酯的降解效果

1)在100mL含有500mg/L邻苯二甲酸二丁酯的无机盐培养基中接种1mL菌剂；不接种的作为对照

2)12h后，取样萃取，利用高效液相色谱测定邻苯二甲酸二丁酯的含量，结果发现接种组检测不到邻苯二甲酸二丁酯的存在，降解率约为100％，而对照组邻苯二甲酸二丁酯的含量几乎没有变化。

本发明所提供的邻苯二甲酸酯降解菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2010年11月16日，分类命名：Diaphorobacter sp.，保藏编号：CGMCCNo.4345，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。

Claims

1.一株能够高效降解邻苯二甲酸酯类化合物的细菌菌株，其特征在于：该菌株分类命名为Diaphorobacter sp.，菌株编号：QH-6，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No 4345。

2.权利要求1所述的Diaphorobacter sp. QH-6菌株，其特征在于：该菌株的16S rDNA基因序列已经递交到了GenBank数据库，登录号为HQ588349。

3.用权利要求1所述芽孢杆菌的菌剂生产方法，其特征在于，生产步骤包括：

(1)培养基配制：

菌种保藏培养基(固体，1L)：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠5g，琼脂20g，加水至1L，pH 7.0-7.5；

菌种活化培养基(液体，1L)：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠5g，加水至1L，pH 7.0-7.5；种子培养基(液体，10L)：酵母膏2g，DBP 1g，K₂HPO₄ 58g，KH₂PO₄ 30g，(NH₄)₂SO₄20g，MgCl₂ 1.6g，CaCl₂ 0.2g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.024g，FeCl₃ 0.018g，MnCl₂·2H₂O 0.015g，pH＝6.8-75；

发酵培养基(液体，200L)：K₂HPO₄ 600g，KH₂PO₄ 300g，(NH₄)₂SO₄ 200g，MgCl₂ 16g，CaCl₂ 2g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.24g，FeCl₃ 0.18g，MnCl₂·2H₂O 0.15g，酵母膏200g，糖蜜300g，加水至200L，pH 6.8-7.5；

以上培养基均在121℃灭菌15-30min；

(2)菌种活化：挑取邻苯二甲酸酯降解菌的菌种，在保藏培养基平板划线，于30℃培养，待长出明显的单菌落后，挑取单菌落在菌种活化培养基中，于30℃，150-200r/min摇床振荡培养12-24h；

(3)液体种子制备：向装有高温灭菌的种子培养基的发酵罐中，按照5％-10％的接种量接种邻苯二甲酸酯降解菌，于25-37℃，通空气培养12-24h，得到液体种子；

(4)液态发酵：向装有高温灭菌的发酵培养基的发酵罐中，按照5％-10％的接种量接种邻苯二甲酸酯降解菌，于25-37℃，通空气培养18-60h，得到活菌体培养物；

(5)菌剂制备：培养好的发酵液经细菌计数后，超滤浓缩至10¹⁰CFU/mL，灌装，于4℃保藏；使用时用水稀释50-1000倍。