CN102477074A

CN102477074A - 寡肽化合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102477074A
Application number: CN2010105737919A
Authority: CN
Inventors: 彭师奇; 赵明; 崔莹
Original assignee: Capital Medical University
Current assignee: Capital Medical University
Priority date: 2010-11-30
Filing date: 2010-11-30
Publication date: 2012-05-30
Anticipated expiration: 2030-11-30
Also published as: CN102477074B

Abstract

本发明涉及具有溶血栓活性的寡肽及其制备方法和用途。本发明的寡肽如以下通式6a-f所示，式中n＝6、8、10、12、14或16。本发明通过动物实验评价了本发明寡肽的体外和体内溶血栓活性，证明了本发明的寡肽具有优秀的溶血栓活性，可用于制备溶血栓药物。

Description

寡肽化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及了具有溶血栓活性的寡肽化合物，属于生物医药领域。

背景技术

P6A(ARPAK)为纤维蛋白β链降解产物之一，具有溶血栓活性。在P6A的代谢研究中发现了代谢产物PAK。在大鼠动静脉旁路插管溶血栓模型上，PAK的溶血栓活性比母体P6A强。按照一般的认识，多肽在体内都会迅速降解。通过PAK的结构修饰延缓体内降解速率和提高溶血栓活性，是寡肽溶血栓药物研究的重要途径。

按照一般的认识，含多肽的两亲性分子，例如脂肪胺链修饰的多肽，在适当的条件下通过分子间非共价键相互作用可发生自组装，形成纳米结构。借助纳米结构可改善多肽在体内的输送、延缓多肽在体内的降解速率和提高多肽的体内活性。根据这些认识，发明人提出了本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供具有溶血栓活性的寡肽化合物，并通过动物实验评价了这些化合物的溶血栓活性，证明了本发明的寡肽化合物具有优秀的溶血栓活性。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

本发明的目的之一是提供以下结构的化合物，

通式6a-f

其中，n为6、8、10、12、14或16。

本发明目的之二是提供制备以上化合物的方法，具体包括如下步骤：

1)在二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)存在下，Boc-Pro在无水THF中与Ala缩合为Boc-Pro-Ala；

2)在DCC和HOBt存在下Boc-Pro-Ala在无水THF中与Lys(Z)-OBzl或Lys-(Boc)-OBzl缩合为Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl或Boc-Pro-Ala-Lys-(Boc)-OBzl；

3)在甲醇中，将步骤2)得到的产物皂化为Boc-Pro-Ala-Lys(Z)或Boc-Pro-Ala-Lys-(Boc)；

4)在DCC存在下Boc-Asp在无水THF中与饱和脂肪胺缩合为Boc-Asp[NHCH₂(CH₂)nCH₃]-NHCH₂(CH₂)nCH₃，其中，n为6、8、10、12、14或16；

5)在氯化氢-乙酸乙酯溶液Boc-Asp[NHCH₂(CH₂)nCH₃]-NHCH₂(CH₂)nCH₃脱去Boc生成Asp[NHCH₂(CH₂)nCH₃]-NHCH₂(CH₂)nCH₃；

6)在DCC和HOBt存在下Boc-Lys(Boc)在无水THF中与

Asp[NHCH₂(CH₂)nCH₃]-NHCH₂(CH₂)nCH₃缩合为Boc-Lys(Boc)-Asp[NHCH₂(CH₂)nCH₃]-NHCH₂(CH₂)nCH₃；

7)Boc-Lys(Boc)-Asp[NHCH₂(CH₂)nCH₃]-NHCH₂(CH₂)nCH₃在氯化氢-乙酸乙酯溶液中脱除Boc生成Lys-Asp[NHCH₂(CH₂)nCH₃]-NHCH₂(CH₂)nCH₃；

8)在DCC和HOBt存在下，步骤3)所得产物在无水THF中与Lys-Asp[NHCH₂(CH₂)nCH₃]-NHCH₂(CH₂)nCH₃缩合为

Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Lys[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-Asp[NHCH₂(CH₂)nCH₃]-NHCH₂(CH₂)nCH₃或

Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)-Lys[Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)]-Asp[NHCH₂(CH₂)nCH₃]-NHCH₂(CH₂)nCH₃；

9)当步骤8)的缩合产物为Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Lys[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-Asp[NHCH₂(CH₂)nCH₃]-NHCH₂(CH₂)nCH₃时，先将步骤8)的产物在甲醇、Pd/C和H₂下氢解为

Boc-Pro-Ala-Lys-Lys[Boc-Pro-Ala-Lys]-Asp[NHCH₂(CH₂)nCH₃]-NHCH₂(CH₂)nCH₃，再将

Boc-Pro-Ala-Lys-Lys[Boc-Pro-Ala-Lys]-Asp[NHCH₂(CH₂)nCH₃]-NHCH₂(CH₂)nCH₃在氯化氢-乙酸乙酯溶液中脱除Boc生成权利要求1所述化合物；

当步骤8)的缩合产物为

Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)-Lys[Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)]-Asp[NHCH₂(CH₂)nCH₃]-NHCH₂(CH₂)nCH₃时，将

Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)-Lys[Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)]-Asp[NHCH₂(CH₂)nCH₃]-NHCH₂(CH₂)nCH₃在氯化氢-乙酸乙酯溶液中脱除Boc生成本发明化合物。

本发明的目的之三是提供一种药物组合物，该药物组合物含有治疗上有效剂量的本发明化合物，并含有一种或多种药学上可接受的赋型剂或者辅加剂。

本发明的目的之四是提供一种药物制剂，该药物制剂是将本发明化合物与药学上可接受的赋型剂或者辅加剂的混合物制成片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、锭剂或口服液。

本发明的化合物和本发明的药物组合物均可用于制备溶血栓药物。

本发明通过动物实验评价了本发明化合物的体外和体内溶血栓活性，实验结果证明本发明的化合物具有优秀的溶血栓活性，可用于制备溶血栓药物。

附图说明

图1为本发明化合物的结构式；

图2为本发明化合物的合成路线图；

图3为本发明化合物6c的透射电子显微镜照片。

在图2中，i)DCC、HOBt和NMM；ii)NaOH；iii)HCl/EA；iv)Pd/C；H₂。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

在本发明的实施例中，所用的缩略术语表示以下含义：

THF 四氢呋喃

HOBt N-羟基苯并三氮唑

DCC 二环己基碳二亚胺

DCU 二环己基脲

TLC 薄层色谱

Boc 叔丁氧羰基

实施例1制备Boc-Asp[NHCH₂(CH₂)₆CH₃]-NHCH₂(CH₂)₆CH₃(1a)

将1.17g(5mmol)Boc-Asp用20ml无水THF溶解。向得到的溶液中加入0.68g(5.0mmol)N-羟基苯并三氮唑(HOBt)。10分钟后，在冰浴下加入2.06g(10mmol)二环己基碳二亚胺(DCC)与25ml无水THF的溶液，得到反应液(I)。把1.42g(11mmol)NH₂CH₂(CH₂)₆CH₃溶于10ml无水THF并搅拌30分钟，得到反应液(II)。冰浴下将反应液(II)加入反应液(I)中，然后室温搅拌12h，TLC(二氯甲烷/甲醇，20∶1)显示Boc-Asp消失。反应混合物过滤，滤除二环己基脲(DCU)。滤液减压浓缩，除去THF。残留物用250ml乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用饱和NaHCO₃水溶液洗、饱和NaCl水溶液洗、5％KHSO₄水溶液洗和饱和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯溶液用无水Na₂SO₄干燥、过滤、滤液减压浓缩至干，残留物经柱层析纯化，得到1.640g(72％)目标化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：456[M+H]⁺.

实施例2制备Boc-Asp[NHCH₂(CH₂)₈CH₃]-NHCH₂(CH₂)₈CH₃(1b)

按照实施例1的方法由2.8g(12mmol)Boc-Asp和4.15g(26.4mmol)CH₃(CH₂)₈CH₂NH₂制得4.353g(71％)目标化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：512[M+H]⁺.

实施例3制备Boc-Asp[NHCH₂(CH₂)₁₀CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₀CH₃(1c)

按照实施例1的方法由5.0g(21.5mmol)Boc-Asp和9.58g(51.50mmol)CH₃(CH₂)₁₀CH₂NH₂制得7.94g(65％)目标化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：568[M+H]⁺.

实施例4制备Boc-Asp[NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃(1d)

按照实施例1的方法由5.0g(21.5mmol)Boc-Asp和11.02g(51.5mmol)CH₃(CH₂)₁₂CH₂NH₂制得8.32g(62％)目标化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：624[M+H]⁺.

实施例5制备Boc-Asp[NHCH₂(CH₂)₁₄CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₄CH₃(1e)

按照实施例1的方法由2.78g(12mmol)Boc-Asp和6.36g(26.4mmol)CH₃(CH₂)₁₄CH₂NH₂制得3.74g(46％)目标化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：680[M+H]⁺.

实施例6制备Boc-Asp[NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃(1f)

按照实施例1的方法由2.33g(10mmol)Boc-Asp和6.73g(25mmol)CH₃(CH₂)₁₆CH₂NH₂制得3.61g(49％)目标化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：736[M+H]⁺.

实施例7制备Asp[NHCH₂(CH₂)₆CH₃]-NHCH₂(CH₂)₆CH₃(2a)

将2.28g(5.0mmol)Boc-Asp[NHCH₂(CH₂)₆CH₃]-NHCH₂(CH₂)₆CH₃溶解在20ml 4N氯化氢-乙酸乙酯溶液中，室温搅拌1小时，TLC(二氯甲烷/甲醇，20∶1)显示Boc-AspAsp[NHCH₂(CH₂)₆CH₃]-NHCH₂(CH₂)₆CH₃消失，减压浓缩除去乙酸乙酯，残留物反复加少量***进行减压浓缩以除去氯化氢。最后加少量***将残留物研磨成1.62g(93％)目标化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：356[M+H]⁺.

实施例8制备Asp[NHCH₂(CH₂)₈CH₃]-NHCH₂(CH₂)₈CH₃(2b)

按照实施例7的方法2.044g(4.00mmol)Boc-Asp[NHCH₂(CH₂)₈CH₃]-NHCH₂(CH₂)₈CH₃制得1.72g(84％)目标化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：412[M+H]⁺.

实施例9制备Asp[NHCH₂(CH₂)₁₀CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₀CH₃(2c)

按照实施例7的方法6.28g(11.0mmol)Boc-Asp[NHCH₂(CH₂)₁₀CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₀CH₃制得5.24g(94％)目标化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：468[M+H]⁺.

实施例10制备Asp[NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃(2d)

按照实施例7的方法6.32g(10.1mmol)Boc-Asp[NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃制得5.39g(95％)目标化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：524[M+H]⁺.

实施例11制备Asp[NHCH₂(CH₂)₁₄CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₄CH₃(2e)

按照实施例7的方法2.72g(4.0mmol)Boc-Asp[NHCH₂(CH₂)₁₄CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₄CH₃制得2.24g(82％)目标化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：580[M+H]⁺.

实施例12制备Asp[NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃(2f)

按照实施例7的方法3.68g(5.0mmol)Boc-Asp[NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃制得2.86g(90％)目标化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：636[M+H]⁺.

实施例13制备Boc-Lys(Boc)-Asp[NHCH₂(CH₂)₆CH₃]-NHCH₂(CH₂)₆CH₃(3a)

按照实施例1的方法由1.26g(3.6mmol)Boc-Lys(Boc)和1.18g(3.0mmol)Asp[NHCH₂(CH₂)₆CH₃]-NHCH₂(CH₂)₆CH₃制得1.63g(80％)目标化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：685[M+H]⁺.

实施例14制备Boc-Lys(Boc)-Asp[NHCH₂(CH₂)₈CH₃]-NHCH₂(CH₂)₈CH₃(3b)

按照实施例1的方法由1.246g(3.60mmol)Boc-Lys(Boc)和1.34g(3.0mmol)Asp[NHCH₂(CH₂)₈CH₃]-NHCH₂(CH₂)₈CH₃制得1.65g(74％)目标化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：741[M+H]⁺.

实施例15制备Boc-Lys(Boc)-Asp[NHCH₂(CH₂)₁₀CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₀CH₃(3c)

按照实施例1的方法由1.25g(3.6mmol)Boc-Lys(Boc)和1.51g(3.0mmol)Asp[NHCH₂(CH₂)₁₀CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₀CH₃制得1.72g(72％)目标化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：797[M+H]⁺.

实施例16制备Boc-Lys(Boc)-Asp[NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃(3d)

按照实施例1的方法由1.25g(3.6mmol)Boc-Lys(Boc)和1.68g(3.0mmol)Asp[NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃制得1.72g(67％)目标化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：853[M+H]⁺.

实施例17制备Boc-Lys(Boc)-Asp[NHCH₂(CH₂)₁₄CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₄CH₃(3e)

按照实施例1的方法由1.25g(3.6mmol)Boc-Lys(Boc)和1.85g(3.0mmol)Asp[NHCH₂(CH₂)₁₄CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₄CH₃制得1.85g(68％)目标化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：909[M+H]⁺.

实施例18制备Boc-Lys(Boc)-Asp[NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃(3f)

按照实施例1的方法由0.42g(1.2mmol)Boc-Lys(Boc)和0.67g(1.0mmol)Asp[NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃制得0.81g(85％)目标化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：965[M+H]⁺.

实施例19制备Lys-Asp[NHCH₂(CH₂)₆CH₃]-NHCH₂(CH₂)₆CH₃(4a)

按照实施例7的方法1.37g(2.0mmol)Boc-Lys(Boc)-Asp[NHCH₂(CH₂)₆CH₃]-NHCH₂(CH₂)₆CH₃制得0.87g(90％)目标化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：485[M+H]⁺.

实施例20制备Lys-Asp[NHCH₂(CH₂)₈CH₃]-NHCH₂(CH₂)₈CH₃(4b)

按照实施例7的方法1.48g(2.0mmol)Boc-Lys(Boc)-Asp[NHCH₂(CH₂)₈CH₃]-NHCH₂(CH₂)₈CH₃制得0.99g(99％)目标化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：541[M+H]⁺.

实施例21制备Lys-Asp[NHCH₂(CH₂)₁₀CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₀CH₃(4c)

按照实施例7的方法1.72g(2.2mmol)Boc-Lys((Boc)-Asp[NHCH₂(CH₂)₁₀CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₀CH₃制得1.34g(93％)目标化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：597[M+H]⁺.

实施例22制备Lys-Asp[NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃(4d)

按照实施例7的方法1.72g(2.0mmol)Boc-Lys(Boc)-Asp[NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃制得1.30g(89％)目标化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：653[M+H]⁺.

实施例23制备Lys-Asp[NHCH₂(CH₂)₁₄CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₄CH₃(4e)

按照实施例7的方法1.83g(2.0mmol)Boc-Lys(Boc)-Asp[NHCH₂(CH₂)₁₄CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₄CH₃制得1.29g(90％)目标化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：709[M+H]⁺.

实施例24制备Lys-Asp[NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃(4f)

按照实施例7的方法1.93g(2.0mmol)Boc-Lys(Boc)-Asp[NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃制得1.39g(91％)目标化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：765[M+H]⁺.

实施例25制备Boc-Pro-Ala

将2.7g(12.6mmol)Boc-Pro用30ml无水THF溶解，向得到的溶液中加入1.59g(13.86mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)。10分钟后，在冰浴下加入2.86g(13.9mmol)DCC与20ml无水THF。在室温下搅拌10h，TLC(二氯甲烷/甲醇，30∶1)显示Boc-Pro消失，得到的反应液滤除DCU，减压除去THF。残留物用250ml乙酸乙酯溶解之后用5％NaHCO₃洗三次，收集有机相，减压除去乙酸乙酯，得到的无色固体用THF溶解，得反应液(I)。将1.23g(13.9mmol)Ala溶于30ml水得到反应液(II)。冰浴下将反应液(II)加入反应液(I)中并用饱和NaHCO₃调pH至8，然后室温搅拌16h，TLC(二氯甲烷/甲醇，30∶1)显示反应液(I)中的Boc-Pro-OSu消失。反应液用饱和KHSO₄调pH至7，减压除THF，残留物用饱和KHSO₄调pH至2。得到的溶液用乙酸乙酯萃取5次，收集的有机相用饱和NaCl水溶液洗三次后用无水Na₂SO₄干燥、过滤、滤液减压浓缩至干得到3.44g(95％)目标化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：287[M+H]⁺.

实施例26制备Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl

按照实施例1的方法由1.37g(4.8mmol)Boc-Pro-Ala和2.17g(4.0mmol)Lys(Z)-OBzl制得1.56g(61％)目标化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：639[M+H]⁺.

实施例27制备Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)-OBzl

按照实施例1的方法由3.15g(11.0mmol)Boc-Pro-Ala和2.97g(10.0mmol)Lys(Boc)-OBzl制得4.47g(85％)目标化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：529[M+H]⁺.

实施例28制备Boc-Pro-Ala-Lys(Z)

将1.92g(3.0mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl溶于甲醇中，冰浴搅拌下用2N NaOH调pH至12并搅拌4h，TLC(二氯甲烷∶甲醇＝30∶1)显示Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。反应混合物用饱和KHSO₄调pH至6，减压除甲醇之后再用饱和KHSO₄调pH至2，得到的混合物用乙酸乙酯萃取5次，收集的有机相用饱和NaCl水溶液洗3次之后用无水Na₂SO₄干燥、过滤、滤液减压浓缩至干得1.48g(90％)目标化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：547[M-H]^-.

实施例29制备Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)

按照实施例28的方法由2.64g(5.0mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)-OBzl制得2.34g(93％)目标化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：515[M-H]^-.

实施例30制备Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Lys[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-Asp[NHCH₂(CH₂)₆CH₃]-NHCH₂(CH₂)₆CH₃(5a)

按照实施例1的方法由1.32g(2.6mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)和650mg(1.16mmol)Lys-Asp[NHCH₂(CH₂)₆CH₃]-NHCH₂(CH₂)₆CH₃制得180mg(11％)目标化合物，为无色粉末。Mp 116℃；[α]_D ²⁵＝-48.8(c＝0.65，甲醇)；ESI-MS(m/e)：1545[M+H]⁺；IR(KBr)：3296.72，3080.40，2930.87，2863.14，1694.10，1642.96，1543.49，1452.23，1401.17，1254.75，1164.15，1119.18，1029.28，976.16，698.29.¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)：8.19-7.96(m，3H)，7.87-7.70(m，2H)，7.43-7.28(m，9H)，7.22-7.12(m，1H)，5.0(s，4H)，4.13-4.02(m，3H)，3.41-3.38(m，2H)，3.16(s，1H)，3.06-2.87(m，9H)，2.14-2.02(m，2H)，1.87-1.68(m，6H)，1.45-1.28(m，26H)，1.28-1.12(m，29H)，0.85(d，J＝6.3Hz，6H).

实施例29制备Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)-Lys[Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)]-Asp[NHCH₂(CH₂)₈CH₃]-NHCH₂(CH₂)₈CH₃(5b)

按照实施例1的方法由1.138g(1.0mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)和0.494g(1mmol)Lys-Asp[NHCH₂(CH₂)₈CH₃]-NHCH₂(CH₂)₈CH₃制得0.139g(9％)目标化合物，为无色粉末。Mp 103℃；[α]_D ²⁵＝-38.9(c＝0.55，甲醇)；ESI-MS(m/e)：1533[M+H]⁺；IR(KBr)：3417，3357，3067，2926，2857，2741，1650，1549，1458，1380，1297，1237，1107，1056，989，937，897，849，735，550.¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)：8.19-7.94(m，4H)，7.94-7.59(m，4H)，7.57-7.36(m，2H)，6.70(s，2H)，4.51-4.02(m，8H)，3.71-3.58(m，2H)，3.12-2.92(m，7H)，2.92-2.78(m，5H)，2.35(s，1H)，2.16-1.97(m，2H)，1.94-1.55(m，10H)，1.55-1.28(m，49H)，1.28-1.09(m，39H)，0.85(t，J＝5.4Hz，J＝6.6Hz，6H).

实施例30制备Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Lys[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-Asp[NHCH₂(CH₂)₁₀CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₀CH₃(5c)

按照实施例1的方法由1.182g(2.3mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)和0.70g(1.04mmol)Lys-Asp[NHCH₂(CH₂)₁₀CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₀CH₃制得0.21g(13％)目标化合物，为无色粉末。Mp 197℃；ESI-MS(m/e)：1658[M+H]⁺.¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝8.02-7.83(m，5H)，7.33(s，9H)，7.19(s，2H)，4.99(s，4H)，4.41-4.30(m，4H)，4.19-4.01(m，4H)，2.97(s，10H)，2.08(s，2H)，1.98(s，3H)，1.78(s，8H)，1.51-1.49(m，3H)，1.38(s，11H)，1.31(s，16H)，1.225(s，48H)，0.85-0.83(t，J＝6.0Hz J＝6.6Hz 6H).

实施例31制备Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Lys[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-Asp[NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃(5d)

按照实施例1的方法由1.167g(2.27mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)和750mg(1.03mmol)Lys-Asp[NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃制得0.313g(18％)目标化合物，为无色粉末。Mp 106℃；IR(KBr)：3323.64，2927.85，2853.85，2687.75，2614.76，2475.82，1691.03，1635.55，1538.16，1454.79，1398.84，1311.14，1245.16，119.11，1113.40，1045.63，989.39，890.35，767.76，648.93，538.93，466.01，415.94.ESI-MS(m/e)：1713[M+H]⁺.¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝8.1-8.0(m，2H)，7,88-7.62(m，7H)，7.34(s，13H)，7.19(s，2H)，4.99(s，4H)，4.11-4.04(m，8H)，2.95-2.94(m，14H)，2.07-1.99(m，4H)，1.78-1.76(m，10H)，1.61(s，4H)，1.39(s，17H)，1.35(s，3H)，1.31(s，19H)，1.23(s，56H)，0.87-0.83(t，J＝4.8Hz J＝6.9Hz 6H).

实施例32制备Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)-Lys[Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)]-Asp[NHCH₂(CH₂)₁₄CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₄CH₃(5e)

按照实施例1的方法由1.138g(1.0mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)和0.678g(1.1mmol)Lys-Asp[NHCH₂(CH₂)₁₄CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₄CH₃制得0.31g(18％)目标化合物，为无色粉末。Mp 108℃；[α]_D ²⁵＝-25.3(c＝0.75，甲醇)；ESI-MS(m/e)：1701[M+H]⁺；IR(KBr)：3292，3087，2927，2857，1691，1641，1452，1390，1249，1169，1119，992，857，745，702.¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝8.22-7.60(m，8H)，7.60-7.33(m，2H)，6.78-6.62(s，2H)，4.52-4.05(m，7H)，3.15-2.80(m，10H)，2.21-1.94(m，3H)，1.94-1.62(m，8H)，1.62-1.05(m，92H)，0.92-0.78(t，J＝5.4Hz，J＝6.6Hz，6H).

实施例33制备Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Lys[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-Asp[NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃(5f)

按照实施例1的方法由0.603g(1.1mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)和0.418g(0.5mmol)Lys-Asp[NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃制得0.23g(25％)目标化合物，为无色粉末。Mp 107℃；[α]_D ²⁵＝-3.5(c＝0.6，甲醇)；ESI-MS(m/e)：1825[M+H]⁺ IR(KBr)：3297.55，3080.33，2922.96，2853.41，1695.84，1641.14，1545.33，1456.85，1400.91，1256.66，1164.52，705.96.¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝8.17-7.92(m，5H)，7.90-7.63(m，5H)，7.40-7.38(m，14H)，7.23-7.12(m，3H)，5.0(s，4H)，4.52-4.05(m，11H)，3.09-2.82(m，13H)，2.19-1.96(m，4H)，1.96-1.71(m，10H)，1.71-1.28(m，51H)，1.28-1.0(m，71H)，0.94-0.78(d，J＝6.6Hz，6H).

实施例34制备Boc-Pro-Ala-Lys-Lys(Boc-Pro-Ala-Lys)-Asp[NHCH₂(CH₂)₆CH₃]-NHCH₂(CH₂)₆CH₃

将0.771g(0.5mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Lys[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-Asp[NHCH₂(CH₂)₆CH₃]-NHCH₂(CH₂)₆CH₃用25ml甲醇溶解，加入0.15g Pd/C，通H₂(0.02Mba)并室温搅拌至Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Lys[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-Asp[NHCH₂(CH₂)₆CH₃]-NHCH₂(CH₂)₆CH₃消失。滤除Pd/C、滤液减压浓缩至干得0.60g(94％)目标化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：1277[M+H]⁺.

实施例35制备Boc-Pro-Ala-Lys-Lys(Boc-Pro-Ala-Lys)-Asp[NHCH₂(CH₂)₁₀CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₀CH₃

按照实施例34的方法由0.828g(0.50mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Lys[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-Asp[NHCH₂(CH₂)₁₀CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₀CH₃制得0.638g(92％)目标化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：1389[M+H]⁺.

实施例36制备Boc-Pro-Ala-Lys-Lys(Boc-Pro-Ala-Lys)-Asp[NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃

按照实施例34的方法由0.856g(0.50mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Lys[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-Asp[NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃制得0.665g(92％)目标化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：1445[M+H]⁺.

实施例37制备Boc-Pro-Ala-Lys-Lys(Boc-Pro-Ala-Lys)-Asp[NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃

按照实施例34的方法由0.912g(0.50mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Lys[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]Asp[NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃制得0.725g(92％)目标化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：1577[M+H]⁺.

实施例38制备Pro-Ala-Lys-Lys(Pro-Ala-Lys)Asp[NHCH₂(CH₂)₆CH₃]-NHCH₂(CH₂)₆CH₃(6a)

按照实施例7的方法由0.789g(0.5mmol)Boc-Pro-Ala-Lys-Lys(Boc-Pro-Ala-Lys)Asp[NHCH₂(CH₂)₆CH₃]-NHCH₂(CH₂)₆CH₃制得0.516g(96％)目标化合物，为无色粉末。Mp 103℃；[α]_D ²⁵＝-38.9(c＝0.55，甲醇)；ESI-MS(m/e)：1077[M+H]⁺；IR(KBr)：3412，3278，3063，2931，2856，1655，1546，1546，1456，1381，1247，1165，1041，655.¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)：8.41-7.98(m，2H)，4.49-4.22(m，8H)，3.70-3.41(m，5H)，3.26-3.04(m，7H)，3.04-2.91(m，5H)，2.78-2.67(m，2H)，2.47(s，2H)，2.18-2.00(m，7H)，1.79-1.64(m，9H)，1.60-1.37(m，22H)，1.32(s，20H)，1.23-1.15(m，3H)，0.85(t，J＝5.1Hz，J＝6.6Hz，6H).

实施例39制备Pro-Ala-Lys-Lys(Pro-Ala-Lys)-Asp[NHCH₂(CH₂)₈CH₃]-NHCH₂(CH₂)₈CH₃(6b)

按照实施例7的方法由0.120g(0.07mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)-Lys[Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)]-Asp[NHCH₂(CH₂)₈CH₃]-NHCH₂(CH₂)₈CH₃制得0.083g(93％)目标化合物，为无色粉末。Mp 91℃；[α]_D ²⁵＝-26.5(c＝0.55，甲醇)；ESI-MS(m/e)：1133[M+H]⁺.IR(KBr)：3417，3392，3067，3377，2926，2857，2741，1650，1549，1459，1380，1335，1238，1108，1075，987，943，881，735，551.¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝10.05(s，2H)，8.92-8.78(d，J＝6.6Hz，2H)，8.58-8.42(s，2H)，8.37-8.13(m，2H)，8.13-7.88(m，10H)，7.75-7.68(d，J＝8.4Hz，2H)，7.50-7.58(t，J＝7.2Hz，J＝7.5Hz，2H)，7.47-7.38(t，J＝7.8Hz，J＝7.5Hz，2H)，4.53-4.32(m，3H)，4.29-4.08(m，5H)，3.98-3.89(m，2H)，3.83-2.68(m，5H)，3.13-2.88(m，9H)，2.82-2.67(m，7H)，2.38-2.22(m，2H)，1.95-1.82(m，6H)，1.44-1.15(m，43H)，0.85(t，J＝5.4Hz，J＝6.9Hz，6H).

实施例40制备Pro-Ala-Lys-Lys(Pro-Ala-Lys)-Asp[NHCH₂(CH₂)₁₀CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₀CH₃(6c)

按照实施例7的方法由0.694g(0.50mmol)Boc-Pro-Ala-Lys-Lys(Boc-Pro-Ala-Lys)-Asp[NHCH₂(CH₂)₁₀CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₀CH₃制得0.535g(90％)目标化合物，为无色粉末。Mp 109℃；[α]_D ²⁵＝-41.56(c＝0.60，甲醇)；ESI-MS(m/e)：1189[M+H]⁺.IR(KBr)：3287.90，3070.41，2924.07，2854.39，1644.63，1548.28，1460.31，1378.54，1294.89，1249.94，1164.13，1041.54，714.64.¹HNMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝9.98(s，1H)，8.83(s，1H)，8.68(s，1H)，8.35-7.90(m，5H)，7.69(s，1H)，7.38(s，1H)，4.48-4.34(m，2H)，4.32-4.05(m，4H)，3.20(s，6H)，2.97(s，8H)，2.73(s，4H)，2.46-2.30(m，5H)，1.89(s，6H)，1.78(s，1H)，1.75-1.55(m，9H)，1.34(s，9H)，1.23(s，42H)，0.86-0.82(t J＝6.0Hz J＝6.9Hz 6H).

实施例41制备Pro-Ala-Lys-Lys(Pro-Ala-Lys)-Asp[NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃(6d)

按照实施例7的方法由0.723g(0.50mmol)Boc-Pro-Ala-Lys-Lys(Boc-Pro-Ala-Lys)-Asp[NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃制得0.566g(91％)目标化合物，为无色粉末。Mp 108℃；[α]_D ²⁵＝-43.69(c＝0.50，甲醇)；IR(KBr)：3326.16，3039.73，2925.81，2850.71，2360.91，1626.48，1574.44，1438.57，1311.61，1242.74，1087.61，1045.63，894.44，649.16，452.09.ESI-MS(m/e)：1245[M+H]⁺.¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝9.98(s，1H)，8.85-8.83(d，J＝6.0Hz 1H)，8,58(s，1H)，8.05(s，5H)，7.58-7.33(m，2H)，4.81-4.36(m，2H)，4.21-4.11(m，4H)，3.20(s，6H)，2.97(s，8H)，2.73(s，4H)，2.45-2.41(m，2H)，2.31-2.29(m，3H)，1.98-1.86(m，6H)，1.78(s，1H)，1.57-1.55(m，9H)，1.23(s，56H)，0.86-0.82(t，J＝6.0Hz，J＝6.9Hz，6H).

实施例42制备Pro-Ala-Lys-Lys(Pro-Ala-Lys)-Asp[NHCH₂(CH₂)₁₄CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₄CH₃(6e)

按照实施例7的方法由0.120g(0.07mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)-Lys[Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)]-Asp[NHCH₂(CH₂)₁₄CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₄CH₃制得0.089g(97％)目标化合物，为无色粉末。Mp 96℃；[α]_D ²⁵＝-23.5(c＝0.60，水)；ESI-MS(m/e)：1301[M+H]⁺；IR(KBr)：3411，3272，3068，2923，2854，1650，1549，1462，1736，1376，1267，1249，1149，1097，1062，549.¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝8.92-8.80(m，2H)，8.55-7.83(m，10H)，7.67-7.58(m，2H)，4.53-4.06(m，6H)，3.28-3.12(m，5H)，3.12-2.86(m，6H)，2.86-2.67(m，4H)，2.40-2.21(m，2H)，1.99-1.76(m，6H)，1.76-1.49(m，9H)，1.49-1.05(m，64H)，0.86-0.84(t，J＝3.9Hz，J＝6.0Hz，6H).

实施例43制备Pro-Ala-Lys-Lys(Pro-Ala-Lys)-Asp[NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃(6f)

按照实施例7的方法由0.639g(0.5mmol)Boc-Pro-Ala-Lys-Lys(Boc-Pro-Ala-Lys)-Asp[NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃]-NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃制得0.603g(89％)目标化合物，为无色粉末。Mp 105℃；[α]_D ²⁵＝-18.5(c＝0.60，甲醇)；ESI-MS(m/e)：1357[M+H]⁺；IR(KBr)：3286.91，3064.09，2921.86，2852.60，1648.64，1546.83，1461.29，1376.50，1249.16，1162.49，1045.63，570.15.¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝8.37-7.78(m，7H)，4.45-4.29(m，3H)，4.29-4.09(m，6H)3.30-3.13(d，J＝2.5Hz，7H)，3.02(s，7H)，2.81-2.67(m，5H)，2.39-2.18(m，3H)，1.99-1.78(m，8H)，1.72-1.48(m，13H)，1.48-1.12(m，74H)，0.95-0.79(d，J＝6.3Hz，6H).

实验例16a-f的溶血栓活性

将200-220g雄性SD大鼠用20％乌拉坦溶液(6ml/kg，i.p.)进行麻醉。麻醉大鼠仰卧位固定，分离右颈总动脉，于近心端夹动脉夹，近心端和远心端分别穿入手术线，将远心端的手术线于皮毛用止血钳夹紧，在远心端插管，松开动脉夹，放出约1ml动脉血并装在1ml的EP管中。往垂直固定的玻璃管(长15mm，内径2.5mm，外径5.0mm，管底用胶塞密封)中注入0.1ml大鼠动脉血液，往管内迅速***一支不锈钢质料的血栓固定螺栓。该血栓固定螺旋用直径为0.2mm的不锈钢丝绕成，螺旋部分长12mm，含15个螺圈，螺圈的直径为1.0mm，托柄与螺旋相连，长7.0mm，呈问号型。血液凝固15min后，打开玻璃管底部的胶塞，用镊子固定血栓固定螺旋的托柄，从玻璃管中取出被血栓包裹的血栓固定螺旋，精确称重。

旁路插管由3段构成，中段为聚乙烯胶管，长60mm，内径3.5mm，两端为相同的聚乙烯管，长100mm，内径1mm，外径2mm，该管的一端拉成尖管(用于***大鼠颈动脉或静脉)，外径1mm，另一端的外部套一段长7mm，外径3.5mm的聚乙烯管(加粗，用于***中段的聚乙烯胶管内)。3段管的内壁均硅烷化。将血栓包裹的血栓固定螺旋放入中段聚乙烯胶管内，胶管的两端分别与两根聚乙烯的加粗端相套。用注射器通过尖管端将管中注满肝素生理盐水溶液(50IU/kg)备用。

分离大鼠的左颈外静脉，近心端和远心端分别穿入手术线，在暴露的左颈外静脉上小心地剪一斜口，将上面制备好的旁路管道的尖管由斜口***左颈外静脉开口的近心端，同时远离旁路管中段(含精确称重的血栓固定螺旋)内血栓固定螺旋的托柄。用注射器通过另一端的尖管推入准确量的肝素生理盐水(50IU/kg)，此时注射器不撤离聚乙烯管，用止血钳夹住注射器与聚乙烯管之间的软管。在右颈总动脉的近心端用动脉夹止血，在离动脉夹不远处将右颈总动脉小心地剪一斜口。从聚乙烯管的尖部拔出注射器，将聚乙烯管的尖部***动脉斜口的近心端。旁路管道的两端都用4号手术缝线与动静脉固定。

用头皮针将生理盐水(3ml/kg)，尿激酶的生理盐水溶液(20000IU/kg)或1nmol/kg 6a-f的生理盐水溶液通过旁路管的中段(含精确称重的血栓固定螺旋)，刺入远离血栓固定螺旋的近静脉处，打开动脉夹，使血流通过旁路管道从动脉流向静脉，此即大鼠动静脉旁路溶栓模型，缓慢将注射器中的液体注入到血液中(约6min)，使生理盐水(空白对照)，尿激酶(阳性对照)或本发明的6a-f通过血液循环，按静脉-心脏-动脉的顺序作用到血栓上。从开始注射时计时，1h后从旁路管道中取出血栓固定螺旋，精确称重。计算每只大鼠旁路管道中血栓固定螺旋给药前后的质量差，统计并评价化合物的体内溶栓活性。结果见表1。

表11nmol/kg 6a-f对大鼠血栓减重的影响^a

a)n＝10，血栓湿重用均值±SD mg表示；b)与生理盐水组相比，p＜0.01。

实验例2剂量对6c体内溶血栓活性的影响

按照实验例1的实验方法，选取溶栓效果最好的6c考察1nmol/kg、0.01nmol/kg和0.001nmol/kg三个剂量下的溶栓活性。结果如表2所示。结果表明，6c的溶栓作用显示剂量依赖性。

表2

表2为6c的剂量对大鼠血栓减重的影响^a，其中a表示样本数，即所用大鼠的个数，a)n＝10；血栓减重用均值±SD mg表示；b)与生理盐水及0.01nmol/kg 6c组比，p＜0.01；c)与生理盐水及0.001nmol/kg 6c相比，p＜0.01；d)与生理盐水相比，p＜0.05。

实验例2水溶液中6a-f的纳米球的粒径

1)水溶液中6a-f纳米球的粒径

在激光散射粒度仪上观察了25℃和37℃时6a-f在10^-4M、10^-5M和10^-6M水溶液中形成的纳米球的粒径。结果如表3所示，结果表明，6a-f在水溶液中可组装为纳米球，25℃时粒径为120至416nm，37℃时粒径为85至306nm。

表3

2)6a-f的纳米球的形态

将6a-f配成浓度为1×10^-12mg/ml的水溶液，然后将此溶液滴在铜网上，挥发干溶剂后在JEM-1230透射电子显微镜下观察纳米球的形态。以6c为例，6c的透射电子显微镜照片如图3所示。从图3可知，6a-f形成规则的纳米球。

Claims

1.以下结构的化合物，

通式6a-f

其中，n为6、8、10、12、14或16。

2.一种制备权利要求1所述化合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

5)Boc-Asp[NHCH₂(CH₂)nCH₃]-NHCH₂(CH₂)nCH₃在氯化氢-乙酸乙酯溶液中脱去Boc生成Asp[NHCH₂(CH₂)nCH₃]-NHCH₂(CH₂)nCH₃；

6)在DCC和HOBt存在下，Boc-Lys(Boc)在无水THF中与Asp[NHCH₂(CH₂)nCH₃]-NHCH₂(CH₂)nCH₃缩合为Boc-Lys(Boc)-Asp[NHCH₂(CH₂)nCH₃]-NHCH₂(CH₂)nCH₃；

7)在氯化氢-乙酸乙酯溶液中，Boc-Lys(Boc)-Asp[NHCH₂(CH₂)nCH₃]-NHCH₂(CH₂)nCH₃脱除Boc生成Lys-Asp[NHCH₂(CH₂)nCH₃]-NHCH₂(CH₂)nCH₃；

9)当步骤8)的缩合产物为

Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Lys[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-Asp[NHCH₂(CH₂)nCH₃]-NHCH₂(CH₂)nCH₃时，先将步骤8)的产物在甲醇、Pd/C和H₂下氢解为

当步骤8)的缩合产物为

Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)-Lys[Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)]-Asp[NHCH₂(CH₂)nCH₃]-NHCH₂(CH₂)nCH₃在氯化氢-乙酸乙酯溶液中脱除Boc生成权利要求1所述化合物。

3.一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物含有治疗上有效剂量的权利要求1所述化合物，并含有一种或多种药学上可接受的赋型剂或者辅加剂。

4.一种药物制剂，其特征在于，是将权利要求1所述化合物与药学上可接受的赋型剂或者辅加剂的混合物制成片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、锭剂或口服液。

5.权利要求1所述化合物在制备溶血栓药物中的应用。

6.权利要求3所述药物组合物在制备溶血栓药物中的应用。