CN102469808B - 天然物质作为用于水生动物的饲料添加剂的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及天然活性物质在制造用于水生动物，尤其用于冷水性鱼(例如鲑鱼、鳊鱼、鲈鱼)和温水性鱼(例如鲤鱼、罗非鱼、鲶鱼)的饲料组合物中的用途，所述天然活性物质选自由α-蒎烯、α-萜品醇、肉桂醛、二氢丁香酚、丁香酚、间甲酚和萜品油烯组成的组。更具体地，本发明涉及如上述定义的物质用于改善鱼的饲料转化率和/或日增重、用于调节肠的微生物菌群和用于保护动物免遭由致病微生物引起的感染的用途。

Description

天然物质作为用于水生动物的饲料添加剂的用途

技术领域

本发明涉及天然活性物质在制造用于包括鱼和虾的水生动物，尤其用于冷水性鱼(例如鲑鱼、鳊鱼、鲈鱼)和温水性鱼(例如鲤鱼、罗非鱼、鲶鱼)的饲料中的用途，所述天然活性物质选自由α-蒎烯、α-萜品醇、肉桂醛、二氢丁香酚(dihydroeugenol)、丁香酚(eugenol)、间甲酚和萜品油烯(terpinolene)组成的组。

更具体地，本发明涉及如上述定义的至少两种物质通过调节肠的微生物菌群和/或通过保护动物免遭由致病微生物引起的感染而用于改善鱼的饲料转化率和/或日增重、用于降低死亡率的用途。

此外，本发明涉及新颖的鱼饲料组合物，其包含作为活性成分的至少两种、优选地至少三种或四种活性化合物，所述活性化合物选自由α-蒎烯、α-萜品醇、肉桂醛、二氢丁香酚、丁香酚、间甲酚和萜品油烯组成的组。

背景技术

术语“饲料”或“饲料组合物”表示适用于或打算用于被动物摄入的任何化合物、制备物、混合物或组合物。

水产养殖业中的一个重要的考虑因素是周转率。周转率由鱼多快能生长到可捕获大小决定。作为例子，大西洋鲑鱼(Atlantic salmon)从幼鲑(当大西洋鲑鱼第一次可被从淡水转移到海水时的生理阶段)饲养到可捕获大小需要12至18个月。快的周转具有若干积极效果。首先，它有助于现金流动。第二，它改善了风险管理。特别地，高死亡率对渔民而言是重大风险。

众所周知，失衡的微生物菌群和/或由致病微生物引起的感染会导致死亡率增加。鱼生病是常见的，并且疾病爆发的可能性在长的生长期间内是较高的。由于渔网移动时的意外，或由于坏天气引起渔网残破，还有鱼会逃跑的风险。

对于其他家畜而言，使用抗生素和疫苗来预防疾病发展是公知的。在水产养殖业中，抗生素的使用不那么广泛——至少在冷水性水产养殖业中，这是由于疾病蔓延非常快，生病的鱼不会吃很多，并且还由于废弃的含药饲料对环境的负面影响。当疫苗可获得时其被广泛使用，但是它们不是针对所有疾病开发的。

作为合成药物的替换，在文献中描述了在动物饲料中使用植物提取物和精油。例如，专利文献WO2004/091307描述了在饲料中使用多酚和其他天然活性物质，以增加孵化后的卤虫(Artemia)的存活率。但是WO2004/091307关于可使用的化合物的选择没有记载。而且，在上述公开的例子中，应用多酚来降低死亡率仅在孵化时是有用的。

因此在水产养殖业中有下述需求：通过在肠道水平上的任何预防性手段(包括抗微生物活性)，来预防疾病发展因而降低死亡率。

发明内容

本申请的发明人出人意料地发现，如上文定义的物质具有在鱼饲料中使用的巨大潜能，例如用于改进饲料转化率(FCR)和/或增重和/或用于调控肠菌群。而且，本发明人出人意料地发现，这些物质(下文中也称为化合物)还具有导致死亡率降低的抗微生物活性。本发明的活性化合物的独特选择首次允许控制由许多不同的病原体引起的许多鱼疾病。

因而，在第一个具体实施方式中，本发明涉及在鱼饲料中使用选自由α-蒎烯、α-萜品醇、肉桂醛、二氢丁香酚、丁香酚、间甲酚和萜品油烯组成的组的至少两种活性化合物来用于改善饲料转化率(FCR)和/或增重和/或用于降低死亡率的方法，其通过调控肠微生物菌群和/或通过预防由致病微生物引起的疾病来实现。例如，已经表明，本发明选择的化合物(例如：肉桂醛、二氢丁香酚、丁香酚和间甲酚)展示了抑制Yersinia ruckeri生长的优良作用，所述Yersinia ruckeri是引起红嘴病(Enteric Redmouth，ERM)的致病微生物，红嘴病特别在鲑科鱼中发现并引起高死亡率。

在替换的实施方式中，α-蒎烯和/或α-萜品醇和/或肉桂醛和/或二氢丁香酚和/或丁香酚和/或间甲酚和/或萜品油烯被用来改善动物饲料消化性和/或通过支持免疫***功能保持动物健康。

在另一实施方式中，本发明涉及在鱼饲料中使用选自由α-蒎烯、α-萜品醇、肉桂醛、二氢丁香酚、丁香酚、间甲酚和萜品油烯组成的组的至少三种活性化合物来用于改善饲料转化率(FCR)和/或增重和/或用于降低死亡率的方法，其通过调控肠微生物菌群和/或通过预防由致病微生物引起的疾病来实现。

在优选的实施方式中，α-蒎烯和肉桂醛被用来改善动物饲料消化性和/或通过支持免疫***功能保持动物健康。

FCR可基于下述鱼生长试验测定，所述鱼生长试验包括：第一处理组，其中将根据本发明的至少两种化合物以每kg饲料的合适的浓度添加到动物饲料中；和第二处理组(对照)，没有添加化合物到动物饲料中。

如众所周知的，改善的FCR低于对照FCR。在特别的实施方式中，较之对照，FCR被改善了至少1.0％，优选至少1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％或至少2.5％。

如本文中使用的术语“肠”是指胃肠或消化道(也称为消化管)并且其是指多细胞动物内摄入食物、消化食物来提取能量和养分并排出剩余废物的器官***。

如本文中使用的术语肠“微生物菌群”是指居住于肠中并通过帮助适当消化来保持健康的天然微生物培养物。

如本文中使用的与肠微生物菌群有关的术语“调控”通常表示在健康和正常功能动物中改变、操作、变更、或调整其功能或状态，即非治疗性用途。

如本文中使用的术语“支持免疫***功能”是指通过化合物获得免疫刺激作用。

如本文中使用的术语“死亡率”是指与包括在池塘中的初始动物数量相比的在生长阶段术期的生存动物的比率。其可基于鱼挑战(challenge)试验测定，所述鱼挑战试验包括被特定鱼病原体挑战的两组鱼，其具有在未被处理的组中引起动物40到80％的死亡率的目标。但是，在喂有每Kg饲料合适浓度的根据本发明的至少两种化合物的混合物的挑战组中，较之未被处理的组，死亡率减低至少5％，优选地至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或至少50％。

具体地，本申请的发明人出人意料地发现根据本发明的化合物及其混合物对冷水性和温水性鱼的许多致病微生物是有效的。已经表明α-蒎烯、α-萜品醇、肉桂醛、二氢丁香酚、间甲酚和萜品油烯具有对Vibrioanguillarum——引起弧菌病的虾病原体的抑制作用。

已经表明α-蒎烯、肉桂醛、二氢丁香酚、丁香酚、柠檬烯和间甲酚和萜品油烯具有对Aeromonas salmonicida的抑制作用，Aeromonassalmonicida是引起称为疖病的疾病的病原体。

已经表明α-蒎烯、α-萜品醇、肉桂醛、二氢丁香酚、丁香酚、间甲酚和萜品油烯具有对鱼中的引起全身性感染的Edwardsellia tarda的抑制作用。

已经表明α-蒎烯、α-萜品醇、肉桂醛、二氢丁香酚、丁香酚和萜品油烯具有对格氏乳球菌(Latococcus garvieae)的抑制作用，格氏乳球菌是乳酸球菌病(Latococcosis)的病原，在夏季数月中当水温升高到超过16℃时，乳酸球菌病是影响许多鱼物种并且在海水和淡水水产养殖业二者中都引起重要经济损失的一种急性病。

肉桂醛、二氢丁香酚、丁香酚和间甲酚展示对Yersinia ruckeri的生长的优良抑制作用，Yersinia ruckeri是引起红嘴病(ERM)的致病微生物，红嘴病特别在鲑科鱼中发现并引起高死亡率。已经表明肉桂醛和间甲酚对下述的抑制作用：

(i)Vibrio salmonicida，其是嗜冷菌，是大西洋鲑鱼中的冷水性弧菌病的致病因素。

(ii)eromonas hydrophila，其引起疡和出血性败血病。该病原体对常规简单的抗微生物剂例如氯是非常有抗性的。

(iii)Photobacterium damselae，以前称为Pasteurella piscicida，其是在经济上重要的海水鱼，例如日本的鰤、赤点石斑鱼和美国的条纹鲈鱼和石首鱼的养殖工业中引起高损失的病原体。

(iv)Streptococcus iniae，其在海水鱼中是高致病的并且是高致命的：疾病爆发可与30-50％死亡率关联。

其他水生病原体例如：

(i)Piscirickettsia salmonis是鱼类立克次氏体病或鲑鱼立克次氏体败血病(SRS)的致病因素，

(ii)Vibrio viscosus最近被重新命名为Moritella viscosa，在病因学上是被称为“冬季溃疡”的疾病的原因，

(iii)Ich(parasite)，鱼的最流行的原生动物寄生虫之一，

(iv)Vibrio harveyi，造成发光性弧菌病的原因，发光性弧菌病是影响商业养殖对虾的疾病，

也会被本发明中描述的化合物混合物所抑制。

在第二个方面中，本发明提供了鱼饲料组合物，其包含选自由α-蒎烯(CAS99-86-5)、α-萜品醇(CAS98-55-5)、肉桂醛(CAS14371-10-9/104-55-2)、二氢丁香酚(CAS2785-87-7)、丁香酚(CAS97-53-0)、间甲酚(CAS108-39-4)和萜品油烯(CAS554-61-0)组成的组的至少两种活性化合物。根据本发明的化合物是商业上可获得的或可容易地被技术人员使用现有技术中的公知的工艺和方法制备。

作为鱼饲料组合物，本发明的化合物可以天然可获得的提取物或提取物混合物的形式或以天然物质的形式单独使用或以其混合物使用。

如本文中使用的术语“提取物”包括通过溶剂提取(提取物也被称为“提取油”)、蒸汽蒸馏(提取物也被称为“精油”)或其他为技术人员已知的方法获得的组合物。合适的提取溶剂包括醇类，例如乙醇。

在本文中术语“天然”被理解为这样的物质，其由天然存在的且从天然产物中获得或通过合成获得的化合物组成。

活性化合物或天然物质或进一步提取成分可以痕量添加。此类成分的例子有：辣椒辣素、丹宁、胡椒碱、三甲胺、3，4-二甲酚、糠醇及其混合物。

如果如上述指定的至少两种化合物的混合物是优选的，肉桂醛和/或间甲酚被用作为混合物的主要组分。适当地，混合物含有以重量计10-90％的间甲酚和/或肉桂醛、以重量计1-50％的α-蒎烯、以重量计1-50％的二氢丁香酚，其中所述量基于所述组分的总量计算。这些活性成分的总量可在宽的界限内改变但是最终以从10到5000ppm，优选地在100和1000ppm之间的量被使用在鱼饲料中，所述量是基于鱼饲料的干重计算的。

如上述指定的至少两种化合物的最优选的混合物包含作为混合物的主要组分的肉桂醛和α-蒎烯。适当地，混合物含有以重量计30-70％的α-蒎烯、以重量计30-70％的肉桂醛、以重量计1-20％的间甲酚、以重量计1-20％的二氢丁香酚，其中所述量相对于所述组分的总量计算。这些活性成分的总量可在宽的界限内改变但是最终以从10到5000ppm，优选地在100和1000ppm之间的量被使用在鱼饲料中，量是基于鱼饲料的干重计算的。

本文上述定义的所有化合物(活性化合物和额外成分)可与乳化表面活性剂组合使用。乳化剂可有利地从相当亲水性的那些乳化剂中选择，例如脂肪酸的聚甘油酯，例如酯化的蓖麻油酸或脂肪酸的丙二醇酯、糖酯类或糖甘油酯类、聚乙二醇、卵磷脂等等。

在本发明的优选的实施方式中，活性化合物的混合物可含有以重量计20％的肉桂醛，以重量计20％的间甲酚，以重量计20％的二氢丁香酚，以重量计20％的α-蒎烯，以重量计3％的三甲胺，以重量计1.8％的胡椒碱和以重量计4％的糠醇。在本发明的另一优选的实施方式中，活性化合物的混合物含有40到60重量％的α-蒎烯、40到60重量％的肉桂醛，并且还可含有1到5重量％的三甲胺，1到5％的胡椒碱和3到8重量％的糠醇。

将含有活性化合物的鱼饲料组合物掺进鱼饲料中可如实施例1描述的进行。然后活性化合物的混合物被直接制备为油，所述油接着与被喷雾到如在实施例1中描述的饲料颗粒上的油混合。

将含有活性化合物的鱼饲料组合物掺进鱼饲料中或者也可以通过制备活性成分和其他合适的添加剂的预混合物来实现。此类预混合物可包含以重量计2-10％的活性混合物或天然物质或提取物、以重量计0-40％的其他常规添加剂(例如调味料)和以重量计50-98％的任何常规吸收性载体。

载体可含有，例如以重量计40-50％的木纤维、以重量计8-10％的硬脂、以重量计4-5％的姜黄粉、以重量计4-5％的迷迭香粉末、以重量计22-28％的石灰石、以重量计1-3％的树胶例如***树胶、以重量计5-50％的糖和/或淀粉和以重量计5-15％的水。

接着将该预混合物与维生素例如维生素C、矿物盐和其他饲料添加剂成分(例如含有核苷酸、葡聚糖和其他肠微生物菌群调控剂的酵母提取物)混合，然后最终被以饲料会含有10-5000ppm，优选地100-1000ppm或100-500ppm的根据本发明的活性成分的这样的量添加到饲料中。而且，本发明的组合物将优选地与含有核苷酸和葡聚糖的酵母提取物一起使用。

而且，任选的，饲料添加剂成分是着色剂，例如类胡萝卜素(例如β-胡萝卜素)、虾青素和叶黄素；芳香化合物；稳定剂；抗微生物肽；多不饱和脂肪酸；和/或选自：植酸酶(EC3.1.3.8或3.1.3.26)；木聚糖酶(EC3.2.1.8)；半乳聚糖酶(EC3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)；蛋白酶(EC3.4.)；磷脂酶A1(EC3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC3.1.1.5)；磷脂酶C(EC3.1.4.3)；磷脂酶D(EC3.1.4.4)淀粉酶，例如α-淀粉酶(EC3.2.1.1)；和/或β-葡聚糖酶(EC3.2.1.4或EC3.2.1.6)中的至少一种酶。

多不饱和脂肪酸的例子是C18、C20和C22多不饱和脂肪酸，例如花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十五碳五烯酸和γ-亚油酸。

如本文中描述的鱼饲料具有20-60重量％的蛋白和1-45重量％的水分和脂质的近似组成。

在一些具体的例子中，鱼饲料含有：

——蛋白、碳水化合物和脂质(例如鱼粉、鱼油、血粉、羽毛粉、家禽粉、鸡粉和或从其他屠宰场废弃物中产生的其他类型的粉)，

——动物脂肪(例如家禽油)，

——植物粉(例如大豆粉、羽扇豆粉、豌豆粉、豆粉、油菜粉和/或向日葵粉)，

——植物油(例如菜籽油、大豆油)，

——麸质(例如小麦麸质或玉米麸质)和

——添加的氨基酸(赖氨酸)

中的一种或多种。

如本文中使用的术语“鱼饲料”包括根据本发明的鱼饲料组合物和如上述所述的组分。典型地，鱼饲料包括作为组分的鱼粉。适当地，鱼饲料是片状或颗粒(例如挤出颗粒)形式。

在第三方面中，本发明涉及用于水生动物的饲料组合物和涉及该组合物用于饲养鱼的用途。这种饲料特别适于饲养鲑鱼，其包括大西洋鲑鱼(盐湖鲑鱼)、其他鲑鱼物种和鳟鱼，以及非鲑鱼例如鳕鱼、海鲈、鲷(sea bream)和鳗鱼。但是，这种饲料可饲养所有类型的鱼，例如大菱鲆、大比目鱼、鲱(yellow tail)和酭鱼。

本文中描述和要求保护的发明不被限制在本文公开的具体实施方式的范围内，因为这些实施方式旨在作为本发明的若干方面的阐释。任何等效的实施方式在本发明的范围内。的确，除了本文中显示和描述的那些外，本发明的多种改进对本领域技术人员而言会从上述说明书中显而易见。此类改进还落在所附的权利要求的范围内。

实施例

实施例1：压制鱼饲料的制备

将主要原材料研磨并混合。然后将微量成分添加到混合器中，并且在预调节器中通过添加水和蒸汽对均匀混合物进行调节。这在淀粉部分(结合的组分)中开始了烧煮过程。将物料进料到制粒机中。物料被强迫通过磨机模口并且在模口的外部破碎为颗粒。含水量是低的并且饲料干燥不是必须的。包括根据本发明的鱼饲料组合物的额外的油接着被喷雾在颗粒的表面上，但是作为颗粒是相当致密的，总脂质含量很少超过24％。添加的油可以是鱼油或植物油，例如菜籽油或豆油或植物油的混合物或鱼油和植物油的混合物。油包覆后，颗粒在冷却器中冷却并包装。最后压制的鱼饲料含有10到5000ppm的如在本发明中描述的组合物。

实施例2：用于制备挤出鱼饲料的方法

将主要的原材料研磨并混合。将包括根据本发明的鱼饲料组合物的微量成分添加到混合器中。在预调节器中通过添加水和蒸汽对均匀混合物进行调节。还可在此阶段添加额外的油。这在淀粉部分(结合的组分)中开始了烧煮过程。将物料进料到挤出机中。挤出机可以是单螺杆或双螺杆型。由于在挤出机中物料的旋转运动，物料被进一步混合。额外的油、水和蒸气可被添加到在挤出机中的物料中。在挤压机的末端，物料具有高于100℃的温度和高于环境压力的压力。物料被强迫通过挤压机模口板的开口。由于温度和压力减轻，一些水分会迅速蒸发(闪蒸)并且挤出的物料成为多孔的。通过转刀将线切割为颗粒。水含量是相当高的(18-28％)并且颗粒因而在干燥器中被迅速干燥至大约10％水含量。

在干燥器之后，通过将油喷雾到饲料的表面上，或通过在油中浸饲料，更多的油可被添加至饲料。在其中气压低于环境气压(真空镀覆)的封闭的容器中将油添加至饲料是有优势的，这使得多孔饲料颗粒吸收更多的油。含有超过40％脂质的饲料可以该方式生产。在涂布机之后，饲料被冷却并包装。在如在上文中解释的方法中，油可在若干位置上添加，并且油可以是鱼油或植物油，例如菜籽油或豆油或植物油的混合物或鱼油和植物油的混合物。

为了生长并且保持良好健康状态，鱼需要蛋白质、脂肪、矿物质和维生素。肉食鱼的饮食是特别重要的。最初，在肉食鱼的养殖中，全鱼(whole fish)或粉碎鱼(ground fish)用来满足养殖鱼的营养需求。混有多种种类的干原材料(例如鱼粉和淀粉)的粉碎鱼，被称为软饲料或半潮湿饲料。随着养殖业成为工业化的，软饲料或半潮湿饲料被压制干饲料替代。它自身逐渐被挤出干饲料替代。

如今，挤出饲料在许多鱼物种(例如多种类型的鲑鱼、鳕鱼、海鲈和鲷)的养殖中几乎是通用的。

在鱼的干饲料中的重要蛋白来源是不同质量的鱼粉。其他动物蛋白来源也用于干的鱼饲料。因而，使用血粉、骨粉、羽毛粉和从其他屠宰场废弃物中产生的其他类型的粉例如鸡粉是已知的。这些通常比鱼粉和鱼油更便宜。然而，在一些地理区域中，有对在饲料生产中使用此类原材料用于生产食物的动物和鱼的禁令。

使用植物蛋白例如小麦麸质、玉蜀黍(玉米)麸质、大豆蛋白、羽扇豆粉、豌豆粉、豆粉、油菜粉、向日葵粉和米粉也是已知的。

实施例3：根据本发明的活性化合物对Yersinia ruckeri、Vibrioanguillarum、Vibrio salmonicida、Aeromonas salmonicida、Aeromonashydrophila、Edwardsellia tarda、Photobacterium damselae、Lactococcusgarvieae、Streptococcus iniae的存活的作用的评估

体外测定本发明的组合物对Yersinia ruckeri、Vibrio anguillarum、Vibrio salmonicida、Aeromonas salmonicida、Aeromonas hydrophila、Edwardsellia tarda、Photobacterium damselae、Lactococcus garvieae和Streptococcus iniae的抗微生物活性。

在测试中，使用了下述有机体、生长培养基、培养条件和评估方法：

细菌：所有测试的致病性菌株属于Centre for fish and wildlife health，Institute of Animal Pathology，University of Bern(Switzerland)的菌株收集处。

合适的细菌稀释度的确定：从在绵羊血琼脂(Biomeheux，Geneva)上的细菌的24小时旧继代培养中，将少量转移到无菌NaCl中，直到获得0.5的McFarland值。从该溶液中，在具有圆底的96孔平板上在TSB中制成3、1.5和0.75％的稀释度。每个孔接受100μl总体积。在22℃下，24小时之后，评定细菌生长。导致覆盖圆底孔一半的界线良好的斑点的稀释度被选择用于实验。

溶剂效应的测定：使用乙醇(ETOH)来溶解在TSB琼脂中的测试物质。为测定乙醇的可能的作用，用不同浓度的细菌在测试孔中测试计算的乙醇终浓度(0.1、0.05和0.025％)，没有显示对细菌生长的任何作用。

测试物质的浓度：考虑到至少1000ppm的很可能的膳食浓度和2％的日饲养比率，评估了体外剂量范围。在肠中的潜在浓度以最大值0.1μl/100μl建立。测试了连续2次稀释，这导致了0.85μg/ml、0.42μg/ml和0.21μg/ml的物质终浓度(当调至平均精油密度时)。

从每种物质中，制备由2μl物质、18μl ETOH和180μl PBS组成的原液。

平板制备：测试每种物质的三个浓度(0.21、0.42和0.85μg/ml)各三份。在每个平板上包括空白对照(PBS)和由在TSB中的细菌组成的阳性对照。而且，在每个平板上还包括ETOH的另外三个稀释各三份。

平板读数：在22℃下24小时孵育后，使用0(没有细菌生长＝在平板的底部上没有圆点)到3(正常生长＝与阳性对照的圆点比较的圆点大小)的记分阅读平板。

获得下述结果并总结在表1中：

用于测试的合适的细菌浓度：0.5McFarland值的1.5％的浓度导致覆盖2/3圆底孔的清晰可视斑点。该浓度因而被认为适于测试。

ETOH对细菌生长的作用：没有发现任何应用的乙醇浓度(1％、0.5％和0.05％)的作用。

测试物质的作用：结果总结在表1中。没有在三份内看出大的差异也没有在不同平板上的三份之间看出大的差异。所有阳性对照在48小时内显示了清晰可视的细菌生长。如从预备试验中期望的，没有测出乙醇的负面作用。使用肉桂醛和α-蒎烯随后使用间甲酚和二氢丁香酚，发现了对细菌的最广谱的作用。

表1：在22℃下24小时孵育后，不同的物质对Yersinia ruckeri、Vibrio anguillarum、Vibrio salmonicida、Aeromonas salmonicida、Aeromonas hydrophila、Edwardsellia tarda、Photobacterium damselae、Lactococcus garvieae和Streptococcus iniae的生长的作用。值代表5次单独各三份的平均值。nd：没有测出，3：没有作用，0：最大生长抑制。

表1：

nd＝未测

实施例4：根据本发明的活性化合物对Vibrio anguillarum和Aeromonassalmonicida的存活的作用的评估。

在22℃下24小时孵育后，测试不同物质的组合对Aeromonassalmonicida和Vibrio anguillarum的生长抑制的作用。测试条件如实施例3中所述并且测试的浓度是0.21μg/ml、0.42μg/ml和0.85μg/ml。表2和3的值分别代表在Aeromonas salmonicida和Vibrio anguillarum的三个不同的平板上的3个单独三份的平均值。3：表示没有作用，0：表示最大生长抑制。

单独或以组合测试的物质是间甲酚、肉桂醛、α-蒎烯，二氢丁香酚。对于两种物质以1∶1比例，对于三种物质以1∶1∶1比例和对于四种物质以1∶1∶1∶1比例制备物质的混合物。

结果：所有化合物和化合物的组合已显示在最高浓度下对两种病原体的一些抑制作用，并且观察到对两种细菌物种的作用的明显剂量依赖性并在表2和表3中示出。

表2：Aeromonas salmonicida的抑制测验结果

表3：Vibrio anguillarum的抑制

实施例5：包含α-蒎烯、肉桂醛、二氢丁香酚和间甲酚的精油的组合物对用Aeromonas salmonicida挑战的虹鳟鱼的死亡率的作用

由Aeromonas salmonicida的挑战实验已用幼年虹鳟鱼建立，以测试补充到饲料的四种精油的组合物的三个剂量的作用。

鱼：从Switzerland的商业鱼养殖场中获得600条年幼虹鳟鱼。

鱼饲养条件：对于在感染之前的驯化期和实验性饲养期，来自相同膳食处理的鱼被养在装备有自来水流动体系和持续换气的130L的玻璃养鱼池中，水温被保持在17±1.0℃。

在感染时间，来自每个处理组的鱼被转移到四个装备有自来水流动体系和持续换气的38L的玻璃养鱼池中。水温被保持在17.5±1.0℃。

饮食和饲养：用于幼年虹鳟鱼的基础饮食以4mm直径生产。从这些颗粒中，生产了适合鱼的大小的碎屑(crumbles)，并通过将混有油的精油组合物以不同剂量包覆到碎屑上，生产约5-kg一批的饲料。使用蠕动泵和混和搅拌机进行包覆，以确保产品的均匀分布。

以体重的3.3％的比率每日饲养鱼。针对鱼的增重有规律地调整饮食比率。

生产了四种实验用饮食：

——饮食A：没有补充有精油组合物的对照饮食

——饮食B：补充有500ppm的精油组合物的基础饮食

——饮食C：补充有2000ppm的精油组合物的基础饮食

——饮食D：补充有4000ppm的精油组合物的基础饮食

精油组合物是下述这种：等量剂量的α-蒎烯、肉桂醛、二氢丁香酚和间甲酚。在挑战前和挑战后用实验用饮食饲喂四周直到实验结束。在实验性饲养开始时、在挑战前和实验结束时对剩下的鱼记录鱼体重。

挑战实验：在预备实验中对相同的鱼种群并在相同的条件下，测定挑战剂量。在实验性饲养的4周时间后，25条鱼被随机分到4个38L的玻璃养鱼池中。接着以由分光光度法测定的1.2*10²cfu/鱼的剂量通过腹腔注射Aeromonas salmonicida，将来自每个实验槽的鱼麻醉并挑战。然后记录三周时间的日死亡率。来自第一个玻璃养鱼池的第一条死鱼经受细菌检验以确定引起死亡的细菌病因。在实验最后，针对感染的外在体征评定所有存活的鱼并且另外从每个饮食组的6条鱼中，进行尸检和细菌学检验。

累积死亡率的结果在表4中列出：

表4：相对于精油组合物剂量的累积死亡率的平均值±SD

结果：饲料摄入是正常的并且在实验期间鱼从4g长到约14g。

结果揭示了在用A.salmonicida.挑战的虹鳟鱼中的精油的剂量依赖效应。在接受较高剂量的两个组中发现了最低平均值，而在接受最低剂量的组中，发现比对照略微更高的累积死亡率。这些结果暗示饮食中4种精油的混合物对用A.salmonicida.感染的虹鳟鱼具有有益作用。在实验结束时发现了累积死亡率和存活的鱼中的细菌存在性方面的差异。

实施例6：包含α-蒎烯和肉桂醛的精油组合物对用Aeromonas salmonicida挑战的虹鳟鱼的死亡率的作用

目标：用Aeromonas salmonicida的挑战实验已用幼年虹鳟鱼建立，以测试补充到饲料的α-蒎烯和肉桂醛的作用。

鱼：从DSM Nutritional Products获得600条年幼虹鳟鱼。

鱼饲养条件：对于在感染之前的驯化期和实验性饲养期，来自相同膳食处理的鱼被养在装备有自来水流动体系和持续换气的130L的玻璃养鱼池中，水温被保持在14.5±1.0℃。

在感染的时间下，来自每次处理的鱼被转移到四个装备有自来水流动体系和持续换气的38L的玻璃养鱼池中。水温被保持在13.5±1.0℃。

饮食和饲养：用于幼年虹鳟鱼的基础饮食以4mm直径生产。从这些颗粒中，生产了适合鱼的大小的碎屑，并通过将混有油的精油组合物以不同剂量包覆到碎屑上，生产约5-kg一批的饲料。使用蠕动泵和混和搅拌机进行包覆，以确保产品的均匀分布。

以体重的3.3％的比率每日饲养鱼。针对鱼的增重有规律地调整饮食比率。

生产了四种实验用饮食：

——饮食A：没有补充有精油组合物的对照饮食

——饮食B：补充有4000ppm的α-蒎烯的基础饮食

——饮食C：补充有4000ppm的相等剂量α-蒎烯+肉桂醛的基础饮食

在挑战前和挑战后用实验用饮食饲喂四周直到实验结束。

在实验性饲养开始时、在挑战前和实验结束时对剩下的鱼记录鱼体重。

挑战实验：在预备实验中对相同的鱼种群并在相同的条件下，测定挑战剂量。在实验性饲养的4周时间后，25条鱼被随机分布到4个38L的玻璃养鱼池中。接着以由分光光度法测定的5*10³cfu/鱼的剂量通过腹腔注射Aeromonas salmonicida，将来自每个实验槽的鱼麻醉并挑战。然后记录三周时间的每日死亡率。来自第一个玻璃养鱼池的第一条死鱼经受细菌检验以确定引起死亡的细菌病因。在实验最后，针对感染的外在体征评定所有存活的鱼并且另外从每个饮食组的6条鱼中，进行尸检和细菌学检验。

结果：饲料摄入是正常的并且在实验期间鱼从1长到约8g。

结果揭示了单独的α-蒎烯没有作用但是α-蒎烯+肉桂醛的组合物有正面作用：较之对照处理降低15％的死亡率。累积死亡率的结果在表5中列出：

表5：相对于精油组合的累积死亡率的平均值±SD

Claims (11)

1.α-蒎烯和肉桂醛在制造用于改善水生动物的饲料转化率和/或日增重的饲料组合物中的用途。 

2.α-蒎烯和肉桂醛在制造用于调节水生动物的肠的微生物菌群的饲料组合物中的用途。 

3.α-蒎烯和肉桂醛在制造用于降低水生动物死亡率的饲料组合物中的用途。 

4.根据权利要求1到3的任一项的用途，其中所述水生动物是冷水性鱼，所述冷水性鱼选自鲑鱼、鳟鱼、鳊鱼或鲈鱼。 

5.根据权利要求1或3的任一项的用途，其中所述水生动物是温水性鱼，温水性鱼选自鲤鱼、罗非鱼或鲶鱼。 

6.根据权利要求1到3的任一项的用途，其中所述饲料组合物还含有二氢丁香酚和间甲酚。 

7.根据权利要求6的用途，其中所述饲料组合物含有浓度都在每Kg饲料10mg和5g之间的α-蒎烯、肉桂醛、二氢丁香酚和间甲酚。 

8.根据权利要求6的用途，其中所述饲料组合物含有浓度都在每Kg饲料0.1g和1g之间的α-蒎烯、肉桂醛、二氢丁香酚和间甲酚。 

9.α-蒎烯和肉桂醛在制造用于治疗和预防在水生动物中由Aeromonas salmonicida引起的疾病的饲料组合物中的用途。 

10.用于水生动物的饲料组合物或预混合组合物或饲料添加剂，其包含作为主要成分的α-蒎烯和肉桂醛。 

11.根据权利要求10的饲料添加剂，其中所述饲料添加剂组合物是含有α-蒎烯和肉桂醛作为主要成分的天然提取物。