CN102465102B - 亚硝酸型生物脱氮菌剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种短程硝化-反硝化微生物菌剂，微生物菌剂含有节杆菌(Arthrobacter creatinolyticus)FDN-1、水氏黄杆菌(Flavobacterium mizutaii)FDN-2、脱氮副球菌(Paracoccus denitrificars)DN-3和甲基杆菌(Methylobacterium phyllosphaerae)SDN-3，四种菌株的保藏登记号分别为CGMCC No.3657、CGMCC No.3659、CGMCC No.3658和CGMCC No.3660。该微生物菌剂能实现同一反应器内氨氮、总氮和CODcr的脱除，废水处理效果好，特别适用于含氨氮废水的净化处理，真正实现短程硝化反硝化或同时硝化反硝化脱氮。

Description

亚硝酸型生物脱氮菌剂及其应用

技术领域

本发明属于环境微生物领域，具体地说涉及一种亚硝酸型生物脱氮菌剂及其应用，该菌剂可以实现用于含氨废水脱氮微生物菌剂的产业化、商品化。

背景技术

生物脱氮是解决氮素污染较为经济有效的方法之一。不管是传统的微生物附着型污水处理构筑物还是新开发的一些高效生物膜处理***，负责脱氮的微生物主要是自养硝化菌。自养细菌自身的增殖速度慢、在混合培养的活性污泥***中无法与异养细菌竞争、难以获得较高的生物量、硝化效率低，导致自养微生物脱氮***抗冲击能力弱、硝化作用不完全、总氮去除率低。所以一些新型的、效果更好的脱氮微生物，如异养硝化细菌、好氧反硝化细菌、厌氧氨氧化细菌等相继被发现。

厌氧氨氧化细菌属于专性厌氧菌，应用于短程硝化和厌氧氨氧化组合工艺中虽然具有低能耗、低污泥产量、低投资成本和运行费用等特点，但是采用两级工艺易出现短程硝化阶段积累的亚硝酸盐浓度过高，进而对微生物产生抑制的问题，同时由于短程硝化和厌氧氨氧化分别在不同的反应器中进行，使得整个工艺的基建费用投资和占地面积增加。如果采用一级工艺则由于使用专性厌氧的厌氧氨氧化细菌长期处于一定浓度的有氧环境中，从而在一定程度上降低了厌氧氨氧化细菌的活性。所以到目前为止，短程硝化-厌氧氨氧化工艺在国际上的工程应用主要有四处：荷兰鹿特丹Dokhaven市政污水处理厂的污泥消化液处理工程、荷兰Lichtenvoorde制革废水处理项目、日本三重县半导体加工废水处理项目和荷兰Olburgen土豆加工废水处理项目，还没有大规模推广应用。

异养硝化细菌生长速度快、细胞产率高、要求溶解氧浓度低、对环境的适应能力也强，与自养型硝化菌相比，虽然单位生物量的异养菌氧化铵盐的速率比自养菌慢，但其总体的氧化铵盐的速率并不比自养菌慢。有些异养微生物可在缺少有机碳源的条件下，进行氨的氧化获得生长所需的能量，也可以在有机物存在的条件下进行氨氧化，不获得能量，是一种次代谢过程，氨的氧化不受有机物的限制。因此异养硝化细菌作为一种新型的脱氮微生物备受关注。国内外研究者在异养硝化微生物筛选、功能代谢途径、酶和基因等方面进行了广泛的研究，但是目前仍仅停留在实验室研究阶段，真正将异养硝化菌应用于实际工程中处理污水的实例并不多见。好氧反硝化细菌特别是亚硝酸型好氧反硝化细菌的研究弥补了短程硝化-厌氧氨氧化工艺的不足，可以直接应用异养硝化与好氧反硝化菌组合实现一级工艺的短程硝化反硝化脱氮。因此将生长条件相近的优势菌株进行组合制备成菌剂，投加到常规废水处理***中或者用于特定污染水体的生物修复都可以提高脱氮效率、改善水质，推动脱氮微生物菌剂的产品化、商业化的进程，也将有利于短程硝化反硝化、同步硝化反硝化等新型脱氮工艺的进一步工业应用。

CN101302485A公开了一种异养硝化微生物菌剂、其培养方法和用途，该菌剂含有嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophiliastrain DN 1.1)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida strain DN 1.2)，该菌剂能够有效脱除水体中的氨氮和总氮，还可以同时去除有机废水中的COD，适用于高浓度养殖废水处理。该菌剂在处理氨氮浓度为455～600mg/L的猪场废水时，实验运行至94～95h，对废水中氨氮的去除率达87％～88％，处理出水氨氮含量为59～72mg/L；处理95h后能够将进水790mg/L的总氮处理至164mg/L，总氮去除率为79.2％。CN200910021020.7公开了一种降氨氮和亚硝酸氮的水质改良微生态制剂的制备方法，该菌剂中涉及一株节杆菌CGMCC No.1282，但该发明的微生态制剂属于水产养殖技术及生态环境保护技术领域。

现有短程硝化反硝化工艺中存在下列两个问题：(1)采用两级工艺在短程硝化阶段积累的亚硝酸盐浓度过高而对微生物产生抑制作用；(2)采用一级工艺由于长期的有氧环境在一定程度上会降低厌氧氨氧化细菌活性。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种可以采用一级工艺进行脱氮的微生物菌剂。该微生物菌剂除了解决现有短程硝化反硝化存在的问题外，可以投加到各类生化反应构筑物中改善微生物组成、提高脱氮效率，同时能够有效控制硝化反应进程，还可以有效去除废水中的有机污染物。

本发明亚硝酸型脱氮微生物菌剂，微生物菌剂含有节杆菌(Arthrobactercreatinolyticus)FDN-1和水氏黄杆菌(Flavobacterium mizutaii)FDN-2中的一种或两种，同时含有脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)DN-3和甲基杆菌(Methylobacterium phyllosphaerae)SDN-3中的一种或两种，四种菌株均于2010年3月11日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，FDN-1的保藏编号为CGMCC No.3657，FDN-2的保藏编号为CGMCC No.3659，DN-3的保藏编号为CGMCC No.3658，SDN-3的保藏编号为CGMCC No.3660。

其中：节杆菌FDN-1和水氏黄杆菌FDN-2可以是其中的一种，也可以是两种任意比例的混合菌体；脱氮副球菌DN-3和甲基杆菌SDN-3可以是其中的一种，也可以是两种任意比例的混合菌体。“节杆菌FDN-1和/或水氏黄杆菌FDN-2”与“脱氮副球菌DN-3和/或甲基杆菌SDN-3”两类菌体的比例为1∶3～3∶1(按菌体体积计，菌体体积为培养后经离心或过滤等方法浓缩得到的菌体体积)，优选为1∶2～2∶1。

本发明微生物菌剂中，节杆菌FDN-1菌落颜色为黄色、菌株个体呈棒状，无芽孢，能运动；革兰氏染色为阳性，接触酶阳性，氧化酶阴性，能利用多种碳源。水氏黄杆菌FDN-2菌落颜色为白色、菌株个体呈杆状，无芽孢；革兰氏染色为阴性，接触酶阳性，氧化酶阳性，能利用多种碳源。脱氮副球菌DN-3菌落呈乳黄色；菌株个体呈椭圆形；革兰氏染色为阴性，接触酶阳性，氧化酶阳性；能利用廉价的碳源。甲基杆菌SDN-3菌落呈橘红色，为革兰氏阴性菌，菌体为杆状，能运动；圆形细小，边缘整齐光滑；接触酶阳性，氧化酶阳性，可利用多种碳源。

本发明菌剂中的节杆菌FDN-1、水氏黄杆菌FDN-2、脱氮副球菌DN-3和甲基杆菌SDN-3在有氧和缺氧环境下均能完成脱氮过程。其中节杆菌FDN-1和水氏黄杆菌FDN-2能以亚硝氮为氮源进行反硝化脱氮，在脱氮的同时能去除COD；脱氮副球菌DN-3和甲基杆菌SDN-3均能以氨氮作为氮源进行异养硝化-好氧反硝化同步脱氮，在脱氮的同时能去除COD。

本发明微生物菌剂中，节杆菌FDN-1、水氏黄杆菌FDN-2可以按任意比例混合但必须包含其中一种，脱氮副球菌DN-3和甲基杆菌SDN-3也可以按照任意比例进行混合但必须包含其中一种，四种菌株通常按照1∶1∶1∶1的配置比例进行混合。应用时可以根据废水的实际处理效果而定，当硝化效果比反硝化效果差时，脱氮副球菌DN-3和甲基杆菌SDN-3所占的比例大于节杆菌FDN-1和水氏黄杆菌FDN-2；当反硝化效果比硝化效果差时，氮副球菌DN-3和甲基杆菌SDN-3所占的比例小于节杆菌FDN-1和水氏黄杆菌FDN-2。本发明微生物菌剂中，可以含有适宜的添加剂，如营养物质、保藏助剂等，具体的添加剂种类及用量是本领域技术人员熟知的。

本发明微生物菌剂应用于含氨氮污水的同步硝化-反硝化脱氮处理过程。

本发明亚硝酸型脱氮微生物菌剂的一种具体制备方法包括以下内容：

1、将本发明节杆菌FDN-1、水氏黄杆菌FDN-2、氮副球菌DN-3和甲基杆菌SDN-3分别接种于固体培养基上进行活化；

2、用接菌环取平板上的菌落分别接种于相应的液体培养液中，在温度25～35℃、150～240rpm好氧条件下震荡培养1～3天至对数生长期，获得液体菌剂种子液；

3、将上述种子液放大培养后收集菌体，过滤浓缩后按所需的比例混合即为本发明亚硝酸型脱氮微生物菌剂。每种菌的种子液可以单独放大培养，也可以FDN-1种子液和FDN-2种子液按比例混合共同放大培养，DN-3种子液和SDN-3种子液按比例混合共同放大培养，也可以是四种菌的种子液混合进行放大培养。

本发明微生物菌剂所涉及的节杆菌FDN-1和水氏黄杆菌FDN-2的菌体活化和种子液培养所用的培养基配方为：牛肉膏：3～7g/L，蛋白胨：7～13g/L，NaNO₂：0.8～1.5g/L，固体培养基加入1.5～2.5％的琼脂。本发明微生物菌剂所涉及的脱氮副球菌DN-3和甲基杆菌SDN-3的菌体活化和种子液培养所用的培养基配方为：硫酸铵：0.1～0.5g/L，KNO₃：0.5～1.0g/L，丁二酸钠2～8g/L，甲醇：0.25～1.0mL/L，固体培养基加入2％的琼脂；此外培养液中还含有少量的铁离子和镁离子等。培养条件均为：温度为20～35℃、150～240rpm震荡培养至对数期即可收获菌体用于制备微生物菌剂。

本发明微生物菌剂放大培养所用的培养液可以是自配或者实际的含氨废水，培养液中的总氮和氨氮浓度为100mg/L～1000mg/L，碳氮质量比2∶1～10∶1；培养条件为温度15℃～35℃；pH6.5～10.0；溶解氧低于3.0mg/L。本发明所用的放大培养反应器可以是各种适宜结构，具有良好的曝气和搅拌***。培养过程中pH值不需要调节。

上述放大培养的菌体浓缩后得到浓度较高的菌悬液，将这些菌悬液加入营养液或者营养液和保护剂的混合液后可以制备成液态菌剂，也可以利用本领域现有的方法制备成干粉状的菌剂。可以采用塑料袋、塑料瓶或者塑料桶等耐储存、防冻、便于运输等材质的容器或者设备进行包装。包装方法采用本领域现有常规技术，包装量为50～5000g/包(袋或者瓶)包装后的菌剂可以根据具体情况在室温或者低温条件下保存。室温保存保质期为1～6个月，低温保存保质期为1～5年，保存后活性降低率小于10％。

本发明所用的浓缩方法可以通过离心或者过滤等不影响菌体活性的方法。本发明菌剂制备过程首先进行菌体活化；然后进行种子液培养，最后将种子液放大培养后收集菌体、浓缩、包装并保存备用。所获得的微生物菌剂耐受性和适应性强，抗冲击性好，总氮的去除负荷高、处理效果好；可以直接投加到污水处理***中或者与活性污泥混合或者在各种填料上挂膜后处理废水，使用性能好；经过一定时间保藏的微生物菌剂恢复速度快，生物活性高，可实现脱氮微生物的产业化、商品化。

本发明微生物菌剂由节杆菌(Arthrobacter creatinolyticus)FDN-1、水氏黄杆菌(Flavobacterium mizutaii)、FDN-2、脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)DN-3和甲基杆菌(Methylobacterium phyllosphaerae)SDN-3菌株组成。在含氮废水处理过程中，特别是采用一级工艺进行生物脱氮处理过程中，这四种微生物互相配合、互相竞争底物，氨氮和总氮去除速率高于任何一种微生物单独使用时的效果，由于群体效应所以对废水的耐受冲击能力比纯化的菌体强、对废水水质的适用范围宽，能有效促进短程硝化反硝化的进程，真正实现短程硝化反硝化脱氮，使得废水脱氮效果明显提高。

本发明的脱氮微生物菌剂主要由生长条件相近的异养微生物制备而成，其中节杆菌FDN-1和水氏黄杆菌FDN-2的培养条件和生长速率相近，脱氮副球菌DN-3和甲基杆菌SDN-3的培养条件和生长速率相近，所以混合液中各个菌株的比例不受放大倍数的影响，有利于快速培养。该菌剂一方面可以投加到传统的污水构筑物中改善原有微生物的组成、强化生化处理中的脱氮效果，另一方面在新建污水处理构筑物时可以把脱氮构筑物系列省去，使脱氮反应直接发生在一级生物池中，减少了基建投资，降低了运行费用。

具体实施方式

本发明提出了一种亚硝酸型生物脱氮菌剂及其应用。本发明液态菌剂生长速度快，收集量大，菌剂具有较强的耐受性和适应性，具有较好的抗冲击性；可以直接投加到污水处理厂活性污泥中使用，也可以在适宜的生化反应器内处理含高浓度氨氮和COD的废水。投入使用后能够缩短***启动时间，拓宽废水水质的适用范围，可以实现短程硝化反硝化脱氮微生物的产业化、商品化。

实施例1微生物菌剂的制备

1、菌体活化：节杆菌FDN-1和水氏黄杆菌FDN-2的活化培养基配方为：牛肉膏：5g/L，蛋白胨：10g/L，NaNO₂：1g/L，加入2.0％的琼脂；脱氮副球菌DN-3的活化培养基配方为：KNO₃：1g/L，丁二酸钠：8g/L，KH₂PO₄：1g/L，FeCL₂：0.5g/L，加入2.0％的琼脂；甲基杆菌SDN-3的活化培养基配方为：硫酸铵：0.5g/L，甲醇：0.75mL/L，KH₂PO₄：1g/L，FeCL₂：0.5g/L，；加入2％琼脂。在平板上涂布均匀后放置在温度为30℃恒温培养箱中进行活化。

2、用接菌环刮取平板上的菌体分别接种于相应的液体培养液中，在温度25～35℃、150～240rpm好氧条件下震荡培养1～3天至对数生长期，获得液体菌剂种子液；培养基配方同活化培养基配方，不用加琼脂。

3、将上述节杆菌FDN-1和水氏黄杆菌FDN-2混合作为I号种子液(菌体按照1∶1和0.5∶1两种比例组合分别编号I-1和I-2)，将上述脱氮副球菌DN-3和甲基杆菌SDN-3混合作为II号种子液(菌体按照1∶1和0.5∶1两种比例组合分别编号II-1和II-2)，将I号种子液中的任一组或任一种微生物与II号种子液中的任一组或任一种微生物再按照1∶1和0.5∶1两种比例混合分别在具有良好搅拌***的反应器中进行放大培养，培养液中的氨氮浓度为200mg/L～800mg/L，碳氮质量比2∶1～10∶1；培养条件为温度25℃～35℃；pH6.5～10.0；溶解氧低于3.0mg/L。

对经过放大培养获得的液态菌悬液A(种子液I-1和种子液II-1混合比例0.5∶1)、B(种子液I-2和种子液II-2混合比例1∶1)、C(种子液I-1和种子液II-2混合比例1∶1)、D(节杆菌FDN-1和种子液II-2混合比例0.5∶1)、E(种子液I-2和脱氮副球菌DN-3混合比例1∶1)进行收集、浓缩，然后加入菌悬液两倍体积的营养液。每升营养液中NH4⁺-N、Fe²⁺、Mg²⁺、K⁺、Ca²⁺这五种阳离子的摩尔配置比例为2000∶5∶20∶20∶15，再加入菌悬液体积2.5％的保藏剂后分装到500ml的塑料瓶中，置-70℃条件下保存备用。

实施例2本发明菌剂在氮肥废水脱氮过程中的应用

取一定量实施例1获得的菌悬液A按照5％(体积)的接种量接种到曝气反应器内，在温度30℃、pH 7.7、DO(溶解氧)为0.9～2.9mg·L^-1条件下，处理氮肥生产过程中产生的含氨废水，NH₃-N浓度平均为450mg/L、总氮(TN)浓度平均为500mg/L、COD_Cr浓度平均为150mg/L。处理过程中补加甲醇作为碳源。经过处理后出水NH₃-N、TN浓度分别为5mg/L～14.7mg/L、24mg/L～40.7mg/L，去除速率分别可达19.77mg/(L.h)和20.88mg/(L·h)，NH₃-N、TN和COD去除率分别大于96.7％、91.8％和90％。而在接种量相同的情况下，单独使用DN-3处理同样水质的废水时，氨氮和总氮去除速率为9.38mg/(L·h)，单独使用SDN-3处理同样水质的废水时氨氮去除速率为9.64mg/(L·h)。由此可见四种菌株混合制备的菌悬液对氨氮和总氮的去除效果最好。

实施例3本发明菌剂在味精废水脱氮过程中的应用

实验在3个100L的SBR反应器中进行，氨氮浓度300mg/L～450mg/L，COD浓度平均为1500mg/L。首先在三个反应器中加入相同浓度的硝化活性污泥，其中一个补加实施例1的菌悬液C(体积比为2％)，一个补加SDN-3(体积比为2％)菌液，另一个只加活性污泥。在温度28℃、pH 8.0、DO(溶解氧)为2.5mg·L^-1条件下处理味精废水，处理时间均为22h。从表1的效果比较来看，只加活性污泥时，氨氮和总氮的去除率分别为52.9％和43.7％，补加菌悬液C后氨氮和总氮的去除效果最好，氨氮和总氮的去除率比只有活性污泥时分别提高了28.6％和32.7％。

表1加菌剂和不加菌剂对废水的脱氮效果比较

实施例4本发明菌剂在某污水处理厂脱氮过程中的应用

某污水处理厂的SBR脱氮***长期运行时氨氮去除率达60％，总氮去除率低于50％，按照体积比0.2％的投加量向反硝化池中投加实施例1的菌剂D，投加10天后分析水样中的氨氮和总氮去除率分别达到了69％和60％，继续反应一段时间后，氨氮和总氮去除率始终稳定在70％以上，说明加菌剂后明显提高了废水的处理效果。

实施例5本发明菌剂在某污水处理厂脱氮过程中的应用

某污水处理厂的A//O脱氮***长期运行时氨氮去除率达50％，每天按照体积比0.2％的投加量向反硝化池中投加实施例1的菌剂E，投加10天后分析水样中的氨氮去除率达到了65％，继续反应一段时间后，氨氮和总氮去除率始终稳定在80％以上，说明加菌剂后明显提高了废水的处理效果。

Claims (8)

1.一种亚硝酸型脱氮微生物菌剂，其特征在于：微生物菌剂含有节杆菌(Arthrobacter creatinolyticus)FDN-1和水氏黄杆菌(Flavobacterium mizutaii)FDN-2中的一种或两种，同时含有脱氮副球菌(Paracoccus denitrifircans)DN-3和甲基杆菌(Methylobacterium phyllosphaerae)SDN-3中的一种或两种，四种菌株均于2010年3月11日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，FDN-1的保藏编号为CGMCC No.3657，FDN-2的保藏编号为CGMCCNo.3659，DN-3的保藏编号为CGMCC No.3658，SDN-3的保藏编号为CGMCCNo.3660。

2.按照权利要求1所述的微生物菌剂，其特征在于：节杆菌FDN-1和水氏黄杆菌FDN-2是其中的一种，或者是两种任意比例的混合菌体；脱氮副球菌DN-3和甲基杆菌SDN-3是其中的一种，或者是两种任意比例的混合菌体。

3.按照权利要求1或2所述的微生物菌剂，其特征在于：“节杆菌FDN-1和/或水氏黄杆菌FDN-2”与“脱氮副球菌DN-3和/或甲基杆菌SDN-3”两类菌体的比例为1∶3～3∶1。

4.按照权利要求1所述的微生物菌剂，其特征在于：微生物菌剂中含有营养物质、保藏助剂。

5.权利要求1至4任一权利要求所述的微生物菌剂，在含氨氮污水的同步硝化-反硝化脱氮处理过程中的应用。

6.权利要求1至4任一权利要求所述微生物菌剂的制备方法，包括以下内容：

(1)节杆菌FDN-1、水氏黄杆菌FDN-2、氮副球菌DN-3和甲基杆菌SDN-3分别接种于固体培养基上进行活化；

(2)用接菌环取平板上的菌落分别接种于相应的液体培养液中，培养得到液体菌剂种子液；

(3)将上述种子液放大培养后收集菌体，过滤浓缩后按所需的比例混合即为亚硝酸型脱氮微生物菌剂。

7.按照权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤(2)液体菌剂种子液的培养方法为在温度25～35℃、150～240rpm好氧条件下培养1～3天至对数生长期，获得液体菌剂种子液。

8.按照权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤(3)中每种菌的种子液单独放大培养；或者FDN-1种子液和FDN-2种子液按比例混合共同放大培养，DN-3种子液和SDN-3种子液按比例混合共同放大培养；或者是四种菌的种子液混合进行放大培养。