CN102453685B - 一种利用二氧化碳培养海洋绿藻积累淀粉的方法 - Google Patents

一种利用二氧化碳培养海洋绿藻积累淀粉的方法 Download PDF

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Abstract

一种利用CO2培养海水绿藻积累淀粉的方法涉及海洋绿藻培养积累淀粉，具体的说是一种利用气体中的二氧化碳及添加营养盐的培养方式，在光照生物反应器中培养海水绿藻并积累淀粉。以海洋绿藻亚心型四爿藻为实验材料，在气升式平板光照生物反应器中，利用气体中的CO2，在海水中添加营养盐，控制培养基中KNO3浓度在0.4～0.6g/L并连续照光，培养4～6天后收获进入稳定期的藻细胞，其淀粉含量达到藻干重的45％～55％，淀粉产率达到0.25～0.31g·L-1·d-1。本发明培养海洋绿藻具有成本低、淀粉积累迅速、能实现CO2减排等优点。

Description

一种利用二氧化碳培养海洋绿藻积累淀粉的方法
技术领域
本发明涉及海洋绿藻培养积累淀粉，具体的说是一种利用气体中的二氧化碳(CO2)(包括工厂排放尾气中的CO2)及添加营养盐的培养方式，在光照生物反应器中，采用合适的光照、温度、pH和通气条件，培养海水绿藻并积累淀粉。可用于CO2减排和循环利用、藻类培养以及淀粉生产和以淀粉为原料的能源、食品、医药等相关领域。
背景技术
人类目前正面临日趋严重的环境问题。大规模的工业发展带来了二氧化碳的过量排放。由CO2所引起的温室效应和全球气候变化正逐渐威胁到人类的生存和发展。CO2的减排成为了全世界关注的焦点。
海洋绿藻(Marine Green Algae)是生长于海洋中的低等绿色植物，它们能够通过光合作用将CO2和太阳光转化成生物质并释放氧气。海洋绿藻因其生长速度快、CO2固定效率高、环境适应力强、不占耕地、易于人工控制、能实现连续生产等优点，被认为是生物固定CO2非常可行的方法之一，同时其产生的高附加值物质使其在经济上具有可行性。
淀粉是绿藻光合作用的积累产物，它以淀粉粒(granule)的形式储存于细胞中。能大量积累淀粉的绿藻很多集中在淡水藻中，如小球藻(Chlorellavulgaris)在蛋白合成受阻的情况下能积累占干重50％以上的淀粉；斜栅藻(Scenedesmus basilensis)在异养和混合养时能积累占干重40％～60％以上的淀粉；莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)也能达到50％以上的淀粉含量。而海洋绿藻能大量积累淀粉的报道不多。利用占地球水体积97％的海水生产海藻淀粉，可以大大减少对淡水资源的需求，在淡水资源紧张的今天，其环保意义尤为突出。此外，目前大多数能积累淀粉的微藻培养方法都为添加有机物的异养或混合养，这使得淀粉生产成本较高，而利用CO2，尤其是利用乙醇发酵尾气或烟道气等工业废气中的CO2为唯一碳源进行微藻淀粉积累，则将明显降低生产成本。
发明内容
本发明目的是提供一种利用CO2培养海水绿藻，并积累大量绿藻淀粉的方法。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
将CO2与空气混合后通入藻培养光照反应器中，通过控制营养元素、光照、温度和pH等培养条件，以光合自养的方式使海洋绿藻积累大量淀粉并在合适的时机收获藻细胞。
以海洋绿藻亚心型四爿藻(Tetraselmis subcordiformis)为实验材料，在光照生物反应器中，利用气体中的CO2及添加营养盐的培养方式，连续照光，使藻细胞生长并积累淀粉。
可按如下步骤具体操作：
1)藻细胞种子液的获得
藻种培养基的配制：于0.3μm孔径的微滤膜过滤的海水中添加营养盐及其最终浓度为：NaNO3 100mg/L，NaH2PO4·2H2O 20.0mg/L，EDTA-Na245.0mg/L，H3BO3 33.6mg/L，MnCl2·4H2O 0.36mg/L，FeCl3·6H2O 1.3mg/L，ZnCl2 0.21mg/L，CoCl2·6H2O 0.20mg/L，(NH4)4Mo7O24·4H2O 0.09mg/L，CuSO4·5H2O 0.20mg/L，KNO3 1g/L，KH2PO4 0.05g/L，Tris 0.81g/L，CH3COOH0.346g/L。110℃高压蒸汽灭菌15min，冷却后备用。
藻细胞种子液的培养：挑取平板分离纯化的亚心型四爿藻(Tetraselmissubcordiformis)单藻落，在摇瓶中逐级放大培养，培养条件为：温度25～30℃，光照强度30～70μmol E·m-2·s-1，白色荧光灯，光暗比14～24h∶10～0h，静置培养，每天手工摇动3次以上。
2)光照生物反应器培养
培养基的配制：于0.3μm孔径的微滤膜过滤的海水中添加营养盐及其最终浓度为：NaH2PO4·2H2O 20.0mg/L，EDTA-Na2 45.0mg/L，H3BO333.6mg/L，MnCl2·4H2O 0.36mg/L，FeCl3·6H2O 1.3mg/L，ZnCl2 0.21mg/L，CoCl2·6H2O 0.20mg/L，(NH4)4Mo7O24·4H2O 0.09mg/L，CuSO4·5H2O0.20mg/L；并加入KNO3终浓度0.4～0.6g/L。110℃高压蒸汽灭菌15min，冷却后备用。
藻细胞的培养：用NaClO浸泡灭菌后的反应器用无菌水清洗干净，接入培养基和藻细胞种子液。培养条件为：细胞接种时初始干重0.4～0.5g/L，温度25～30℃，海水pH 6～8，光照强度100～250μmol E·m-2·s-1，连续光照，通入空气流量0.125～0.375VVM，CO2含量1％～3％，培养4～6天后在细胞进入稳定期时收获藻细胞，细胞淀粉含量达到藻干重的45％～55％，可进行间歇或者半连续培养。整个过程淀粉产率可达到0.25～0.31g·L-1·d-1。
所述海水为天然海水或人工海水；人工海水配方为：NaCl 27g/L，MgSO4·7H2O 6.6g/L，MgCl2·6H2O 5.6g/L，CaCl2·2H2O 1.5g/L，NaHCO30.04g/L。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
1.环境友好：海洋绿藻培养过程无污染，可利用CO2为唯一碳源进行光合自养，CO2利用效率高，从而实现CO2减排，缓解温室效应。
2.淀粉生产的可持续性好：利用资源充沛的海水通过绿藻进行淀粉生产，减少淡水资源的消耗；同时绿藻淀粉生产可以在不适合粮食种植和人类居住的地域进行，解决淀粉生产的与人争粮、争地的问题。
3.培养成本低，淀粉积累迅速：海洋绿藻培养基配方简单，所需营养元素来源广泛，成本低；淀粉在藻细胞内迅速积累，生产周期短。
总之，本发明利用气体中的二氧化碳(包括工厂排放尾气中的CO2)培养海洋绿藻积累淀粉，实现CO2减排和循环利用，可以广泛应用于淀粉生产和以淀粉为原料的能源、食品、医药等相关领域。
附图说明
图1为本发明绿藻培养装置示意图；注：1.光照生物反应器主体；2.光源；3.挡板；4.曝气管；5.气体过滤器；6.气体流量计；7.空气压缩机；8.气体减压阀；9.CO2气瓶；箭头代表气流方向。
图2为本发明不同光暗时间比下绿藻细胞生长动力学曲线；
图3为本发明不同光暗时间比下绿藻淀粉积累动力学曲线；
图4为本发明不同光暗时间比下绿藻淀粉所占单位细胞干重比例动力学曲线；
图5为本发明不同KNO3浓度下绿藻细胞生长动力学曲线；
图6为本发明不同KNO3浓度下绿藻淀粉积累动力学曲线；
图7为本发明不同KNO3浓度下绿藻淀粉所占单位细胞干重比例动力学曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的方法和结果进行说明。本发明以海洋绿藻亚心型四爿藻(Tetraselmis subcordiformis)为实验材料，在光照生物反应器中，利用气体中的CO2及添加营养盐的培养方式，连续照光，使绿藻积累淀粉。
所述光照生物反应器为气升式平板光照生物反应器，反应器底部中间位置插有曝气管将导入的气体分散成小气泡，提高气液传质效率，曝气管通过管路与气源相连；反应器内悬置有两平行挡板，挡板与反应器底部间设有间隙，反应器中藻液没过挡板，曝气管置于两平行挡板之间，使气体于挡板中间上升，带动反应器中藻液在挡板中间上升，于挡板两侧下降，形成循环，避免死角；反应器所用材质为二氯甲烷粘结成的透明有机玻璃；反应器两侧均设白色荧光灯；所述气源为空气压缩机和CO2气瓶，其流量通过管路上设置的气体减压阀和气体流量计控制；由空气压缩机产生的空气与来自于气瓶的CO2经过流量调节达到所需CO2浓度后导入反应器。
实施例1
考察光暗周期对藻细胞生长和淀粉积累的影响。亚心型四爿藻(Tetraselmis subcordiformis)由辽宁省大连水产研究所提供，并经过本实验室平板纯化。
1)藻细胞种子液的获得
营养盐母液的配制：用去离子水配制1000倍营养盐母液，其配方为：NaNO3 100g/L，NaH2PO4·2H2O 20.0g/L，EDTA-Na2 45.0g/L，H3BO3 33.6g/L，MnCl2·4H2O 0.36g/L，FeCl3·6H2O 1.3g/L，ZnCl2 0.21g/L，CoCl2·6H2O 0.20g/L，(NH4)4Mo7O24·4H2O 0.09g/L，CuSO4·5H2O 0.20g/L。110℃高压蒸汽灭菌15min，冷却后备用。
藻种培养基的配制：0.3μm孔径的微滤膜过滤天然海水。每升过滤海水中加入1mL上述营养盐母液，KNO3 1g，KH2PO4 0.05g，Tris 0.81g，CH3COOH 0.346g。110℃高压蒸汽灭菌15min，冷却后备用。
藻细胞种子液的培养：挑取平板分离纯化的亚心型四爿藻(Tetraselmissubcordiformis)单藻落，分别在试管、100mL摇瓶、1000mL摇瓶和3000mL摇瓶中逐级放大培养，培养条件为：温度25℃，光照强度50μmol E·m-2·s-1，白色荧光灯，光暗比14h∶10h，静置培养，每天手工摇动3次以上。
2)光照生物反应器培养
无氮营养盐母液的配制：用去离子水配制1000倍无氮营养盐母液，其配方为：NaH2PO4·2H2O 20.0g/L，EDTA-Na2 45.0g/L，H3BO3 33.6g/L，MnCl2·4H2O 0.36g/L，FeCl3·6H2O 1.3g/L，ZnCl2 0.21g/L，CoCl2·6H2O 0.20g/L，NH4)4Mo7O24·4H2O 0.09g/L，CuSO4·5H2O 0.20g/L。110℃高压蒸汽灭菌15min，冷却后备用。
培养基的配制：0.3μm孔径的微滤膜过滤天然海水。每升过滤海水中加入1mL上述无氮营养盐母液和0.4g KNO3。110℃高压蒸汽灭菌15min，冷却后备用。
藻细胞的培养：用NaClO浸泡灭菌后的反应器用无菌水清洗干净，接入培养基和藻细胞种子液。培养条件为：细胞接种时初始干重0.5g/L，温度25℃，海水pH 7，光照强度140μmol E·m-2·s-1，通入空气流量0.25VVM，CO2含量3％，光暗时间(h)比分别设为24∶0、14∶10和12∶12。
所述光照生物反应器如图1所示，为气升式平板光照生物反应器，其主体1尺寸为照光面长80mm，高750mm，光径40mm，装液量1.6L。反应器底部***曝气管4，离反应器底高25mm，能将导入的气体分散成小气泡，提高气液传质效率。反应器内置两挡板3，高度为510mm，挡板下边缘离反应器底高26mm，能使气体于中部上升，带动反应器中藻液在中部上升，两边下降，形成循环，避免死角。反应器所用材质为二氯甲烷粘结成的透明有机玻璃。反应器两侧均设白色荧光灯2。所述气源为空气压缩机7和CO2气瓶9，其流量通过气体减压阀8和气体流量计6控制。由空气压缩机7产生的空气与来自于气瓶9的CO2经过气体流量计6的流量调节达到所需CO2浓度，经过空气过滤器5除菌后导入反应器。
从图2可以看出，利用上述光照生物反应器进行海洋绿藻培养，在初始接种量、温度、光照强度、通气速率、CO2浓度和营养供给等培养条件均一样的情况下，采用连续光照(光暗比24∶0)的反应器内藻干重从初始的0.5g/L在4天之内上升到2.1g/L，而采用光暗比为14∶10和12∶12时藻干重上升速度明显低于连续光照的情况。采用连续光照的方式可以使藻细胞在较短的时间内固定较多的CO2并迅速生长。
从图3和图4可以看出，利用上述光照生物反应器进行海洋绿藻培养，在初始接种量、温度、光照强度、通气速率、CO2浓度和营养供给等培养条件均一样的情况下，采用连续光照(光暗比24∶0)的反应器内淀粉浓度从初始的0.05g/L在4天之内上升到1.18g/L，藻细胞淀粉含量从接种时的10％上升到55％左右，而采用光暗比为14∶10和12∶12时反应器内淀粉浓度的上升速度明显低于连续光照的情况。采用连续光照的方式培养4天后进入稳定期，收获藻细胞，细胞淀粉含量达到藻干重的55％，淀粉产率可达到0.28g·L-1·d-1。
实施例2
考察初始KNO3浓度对藻细胞生长和淀粉积累的影响。亚心型四爿藻(Tetraselmis subcordiformis)由辽宁省大连水产研究所提供，并经过本实验室平板纯化。
藻细胞种子液的获得和无氮营养盐母液的配制同“实施例1”。
培养基的配制：0.3μm孔径的微滤膜过滤人工海水。人工海水配方为：NaCl 27g/L，MgSO4·7H2O 6.6g/L，MgCl2·6H2O 5.6g/L，CaCl2·2H2O 1.5g/L，NaHCO3 0.04g/L。每升过滤海水中加入1mL无氮营养盐母液。110℃高压蒸汽灭菌15min，冷却后备用。
藻细胞的培养：用NaClO浸泡灭菌后的反应器用无菌水清洗干净，接入培养基和藻细胞种子液。培养条件为：细胞接种时初始干重0.4g/L，温度25℃，pH 7，光照强度140μmol E·m-2·s-1，连续光照，通入空气流量0.25VVM，CO2含量3％，加入KNO3使其浓度分别为0、0.12、0.6和1.2g/L。
从图5可以看出，在初始接种量、温度、光照强度、光照周期、通气速率和CO2浓度等培养条件均一样的情况下，KNO3浓度为0.6g/L和1.2g/L的反应器内藻干重从初始的0.4g/L在6天之内分别上升到3.4g/L和3.8g/L，明显高于KNO3浓度较低的实验组，说明较高的KNO3浓度有利于藻细胞固定CO2和积累生物质。但是从图6和图7可以看出，KNO3浓度为1.2g/L时淀粉含量最高只能达到35％；虽然藻细胞淀粉含量在KNO3浓度较低时上升很快且能达到48％，但在培养两天后淀粉含量迅速下降，且由于生物量的限制，反应器内淀粉浓度远远低于KNO3浓度为0.6g/L的实验组。在KNO3浓度为0.6g/L时，藻细胞在培养6天后进入稳定期，淀粉含量从初始的6％上升到45％，淀粉产率达到0.25g·L-1·d-1。

Claims (3)

1.一种利用CO2培养海水绿藻积累淀粉的方法，其特征在于：
在光照生物反应器中进行海洋绿藻培养，以KNO3为氮源，利用空气中的CO2为唯一碳源，在添加营养盐的海水中，连续光照培养，使藻细胞生长并积累淀粉，培养4～6天后在细胞进入稳定期时收获藻细胞；通入空气气体流量0.125～0.375VVM，空气中CO2体积含量1％～3％，海水中KNO3浓度0.4～0.6g/L；
所用的海水绿藻为亚心型四爿藻(Tetraselmis subcordiformis)；
所述海水中添加营养盐的最终浓度为：NaH2PO4·2H2O20.0mg/L，EDTA-Na245.0mg/L，H3BO333.6mg/L，MnCl2·4H2O0.36mg/L，FeCl3·6H2O1.3mg/L，ZnCl20.21mg/L，CoCl2·6H2O0.20mg/L，(NH4)4Mo7O24·4H2O0.09mg/L，CuSO4·5H2O0.20mg/L。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述海水为天然海水或人工海水。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述光照生物反应器培养海洋绿藻的培养条件为：细胞初始接种时干重0.4～0.5g/L，温度20～30℃，海水pH＝6～8，光照强度100～250μmol E·m-2·s-1，连续光照，通入空气流量0.125～0.375VVM，空气中CO2含量1％～3％，KNO3浓度0.4～0.6g/L，培养4～6天后在细胞进入稳定期时收获藻细胞，细胞淀粉含量达到藻干重的45％～55％，进行间歇或者半连续培养；整个过程淀粉产率可达到0.25～0.31g·L-1·d-1。
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