CN102453681A - 用于约氏乳杆菌真空冷冻干燥的保护剂及其应用 - Google Patents

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本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于约氏乳杆菌真空冷冻干燥的保护剂及其应用。本发明的保护剂中无山梨醇类物质，成本较低；该保护剂可对约氏乳杆菌在真空冷冻干燥过程中提供有效保护，保护率高，生产出的活菌得率在109以上，有利于乳酸菌微生物饲料添加剂利用效率的提高。

Description

用于约氏乳杆菌真空冷冻干燥的保护剂及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于约氏乳杆菌真空冷冻干燥的保护剂及其应用。
背景技术
约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)是一种重要的乳杆菌，属益生菌，它对动物益生功能主要体现在以下三方面：1.调控动物天然防御***及免疫机能作用；2.预防动物特异性皮炎作用；3.排他性竞争作用。但约氏乳杆菌对生长条件要求苛刻，在生产制备、贮藏期间极易失活。
真空冷冻干燥技术是保存发酵益生菌最有效的方法之一，但真空冻干过程中，由于细胞内还有大量的水分，低温冻存细胞时，胞内的水分以两种方式固化：一种是形成冰晶，另一种是形成无定型的玻璃化状态。当以冰晶的形式固化时，水的体积增大及冰晶的机械力使细胞内部电解质浓度增高，pH改变，蛋白质和酶变性，从而引起细胞内部结构的破坏，最终使细胞死亡；而在玻璃化的固化过程中，水分子没有发生重排，不会产生结构和体积的变化，因而不会由于机械或溶液效应造成组织和细胞伤害，复苏后的细胞仍具有活力。胞内水分子固化处于冰晶和玻璃态动态平衡。因此，在细胞冻干技术的关键就是要使水分尽可能多的以玻璃态的形式固化，同时降低细胞内的水分，减少冰晶的形成。
在益生菌菌粉真空干燥过程中加入适当的保护剂，有利于微生物抵御冷冻的机械伤害以及长期存放，已成为保存益生菌的必然要求。根据保护剂所起作用的不同可分为两种，渗透性保护剂和非渗透性保护剂。渗透性保护剂是指一些分子量较小的有机物，易于穿透细胞膜与胞内水分子结合，从而降低细胞冰点，同时提高细胞膜对水分子的通透性。冻存时，可促使胞内水分渗出，从而减少胞内冰晶的形成。非渗透性保护剂是一些易溶于水的大分子物质，不能渗透到胞内，但可降低胞外含水量，减小胞外冰晶的形成。两种保护剂的作用方式不同，在冷冻过程中配合使用，可有效提高冻干菌粉的存活率。在冻干过程中还常常加入抗氧化剂，以防止氧化作用对细胞的伤害，保持细胞活性并提高细胞的稳定性。
目前，有关冻干保护剂的研究主要集中在医学医药领域，应用于生产微生物饲料添加剂活菌制剂的冻干保护剂的研究不多且结果差异大，存在活菌数不高的缺点。有些保护剂中有 山梨醇类物质，保护效果有一定提高，但山梨醇类物质的成本较高，限制了它在农业生产中的应用且目前无针对约氏乳杆菌真空冷冻干燥的保护剂。
发明内容
本发明提供一种用于约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)真空冷冻干燥的保护剂，减小冷冻干燥对菌体的损伤，提高冻干后产物活菌数及利用效率，可制备出高活性的约氏乳杆菌冻干菌粉。
本发明的另一目的是提供该用于约氏乳杆菌真空冷冻干燥的保护剂在制备约氏乳杆菌冻干菌粉中的应用。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
本发明提供一种用于约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)真空冷冻干燥的保护剂，每克湿菌体或湿菌泥使用如下重量配比的保护剂：脱脂乳0.25-0.5g、海藻糖0.25-0.5g、可溶性淀粉0.25-1g、谷氨酸钠0.25-1g、甘油0.25-0.5g。
为更好的达到本发明的发明效果：每克湿菌体或湿菌泥使用如下重量配比的保护剂：脱脂乳∶海藻糖∶可溶性淀粉∶谷氨酸钠∶甘油＝1∶1∶1∶1∶1。
为更好的达到本发明的发明效果：每克湿菌体或湿菌泥也可使用如下重量配比的保护剂：脱脂乳∶海藻糖∶可溶性淀粉∶谷氨酸钠∶甘油＝2∶1∶2∶4∶1。
为更好的达到本发明的发明效果：每克湿菌体或湿菌泥也可使用如下重量配比的保护剂：脱脂乳∶海藻糖∶可溶性淀粉∶谷氨酸钠∶甘油＝2∶2∶4∶1∶2。
本发明的用于约氏乳杆菌真空冷冻干燥的保护剂可应用于制备约氏乳杆菌冻干菌粉。
进一步，制备约氏乳杆菌冻干菌粉的过程如下：(1)约氏乳杆菌种子基培养；(2)高密度发酵；(3)发酵菌泥的收集；(4)冻干菌粉的制备。
更进一步，制备约氏乳杆菌冻干菌粉的过程如下：(1)约氏乳杆菌种子基培养：从平板上挑取约氏乳杆菌的单菌落至50mL的MRS培养基中，37度恒温培养18h，然后以5％的接种量转接至500mL的MRS培养基中，继续37度下静止培养18h，即得到种子基；(2)高密度发酵：高密度发酵的参数设置如下：氨水调节维持pH值5.0；转速50转/分钟；温度37度；罐压保持0.05MPa；发酵时间12小时；(3)发酵菌泥的收集：发酵液4000g离心10分钟，弃去上清；用生理盐水将菌体重悬；4000g离心10分钟，弃去上清；(4)冻干菌粉的制备：向制备的菌泥中加入5倍体积的保护剂，混匀，平衡30分钟；于-80度预冻3小时；在真空冷冻干燥机中冻干30-36小时，冻干参数设置如下：真空度0.1Mba-0.2Mba；冷阱温度为-50度至-55度，即得。
有益效果
本发明为乳酸菌的保藏，尤其是约氏乳杆菌的保藏，提供了一个新的保护剂组方；该保护剂中无山梨醇类物质，成本较低；该保护剂可对约氏乳杆菌在真空冷冻干燥过程中起有效保护作用，保护率高，生产出的活菌得率在109以上，有利于乳酸菌微生物饲料添加剂利用效率的提高。
通过下列实施例将更具体的说明本发明，但是应理解所述实施例仅是为了说明本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。
具体实施方式
实施例1-实施例18
(1)种子基的制备
挑取约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)的单菌落至50mL的MRS培养基(蛋白胨10克，肉膏10克，酵母提取物5克，磷酸氢二钾2克，柠檬酸二铵2克，乙酸钠5克，葡萄糖20克，土温1mL，七水硫酸镁0.58克，四水硫酸锰0.25克，蒸馏水1L，pH6.2-6.4)中，37度恒温培养18小时，然后5％的接种量转接至500mL的MRS培养基中，继续37度下静止培养18小时，值OD600nm为5.0即得到种子基。
(2)高密度发酵
1％的接种量将种子基接入5L的发酵罐中，发酵过程中以氮气保持罐压为0.05MPa，转速为50转/分钟，温度为37度，流加氨水保持pH为5.0；培养4小时后开始流加葡萄糖继续培养8小时。
(3)发酵菌泥的收集及(4)冻干菌粉的制备
发酵液于4度，4000g离心10分钟收集菌体；弃去上清，沉淀用无菌生理盐水重悬，按上述条件再次离心，弃去上清，分别用5倍体积37度预热各种配比的本发明的保护剂(见表1)重悬菌体，搅拌平衡30分钟，置于-80度冰箱预冻3小时，置于真空冷冻干燥机中。冻干条件为真空度0.2mba，冷阱温度为-55度，冻干30小时，即得到约氏乳杆菌冻干粉。
(5)存活率测定
称取1克干菌粉溶于9mL生理盐水中，混匀；依次10倍稀释至10-10；每个稀释度取100微升涂布MRS琼脂培养基(蛋白胨10克，肉膏10克，酵母提取物5克，磷酸氢二钾2克，柠檬酸二铵2克，乙酸钠5克，葡萄糖20克，土温1mL，七水硫酸镁0.58克，四水硫酸锰0.25克，琼脂15克，蒸馏水1L，pH6.2-6.4)，每个梯度做三个平行，37度培养18小时， 采用平板菌落计数法，得出发酵液和冻干样品中的活菌数，并计算乳酸菌的存活率(结果见表1)。
表1保护剂配方设计及结果
Figure DEST_PATH_GDA0000137334450000011
结果分析：本发明的实施例1、实施例13和实施例14的保护剂的配方，得出的约氏乳杆菌活菌率最高。本发明的保护剂可对约氏乳杆菌在真空冷冻干燥过程中起有效保护作用，活菌数高达3.73×109。
实施例19 不同保护剂对约氏乳杆菌的保护效果比较
本发明在同等实验条件下研究了除保护剂外，其它实验材料及用量均同实施例1，实验方法也与实施例1相同的情况下，现有技术中的保护剂与本发明保护剂的保护效果等。结果见表2。
表2  约氏乳杆菌不同保护剂保护效果及成本比较
Figure DEST_PATH_GDA0000137334450000021

Claims (7)

1.一种用于约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)真空冷冻干燥的保护剂，其特征在于：每克湿菌体或湿菌泥使用如下重量配比的保护剂：脱脂乳0.25-0.5g、海藻糖0.25-0.5g、可溶性淀粉0.25-1g、谷氨酸钠0.25-1g、甘油0.25-0.5g。
2.如权1所述的用于约氏乳杆菌真空冷冻干燥的保护剂，其特征在于：每克湿菌体或湿菌泥使用如下重量配比的保护剂：脱脂乳∶海藻糖∶可溶性淀粉∶谷氨酸钠∶甘油＝1∶1∶1∶1∶1。
3.如权1所述的用于约氏乳杆菌真空冷冻干燥的保护剂，其特征在于：每克湿菌体或湿菌泥使用如下重量配比的保护剂：脱脂乳∶海藻糖∶可溶性淀粉∶谷氨酸钠∶甘油＝2∶1∶2∶4∶1。
4.如权1所述的用于约氏乳杆菌真空冷冻干燥的保护剂，其特征在于：每克湿菌体或湿菌泥使用如下重量配比的保护剂：脱脂乳∶海藻糖∶可溶性淀粉∶谷氨酸钠∶甘油＝2∶2∶4∶1∶2。
5.如权1-4任一项所述的用于约氏乳杆菌真空冷冻干燥的保护剂在制备约氏乳杆菌冻干菌粉中的应用。
6.如权5所述的应用，其特征在于：制备约氏乳杆菌冻干菌粉的过程如下：
(1)约氏乳杆菌种子基培养；(2)高密度发酵；(3)发酵菌泥的收集；(4)冻干菌粉的制备。
7.如权6所述的应用，其特征在于：制备约氏乳杆菌冻干菌粉的过程如下：
(1)约氏乳杆菌种子基培养：从平板上挑取约氏乳杆菌的单菌落至50mL的MRS培养基中，37度恒温培养18h，然后以5％的接种量转接至500mL的MRS培养基中，继续37度下静止培养18h，即得到种子基；(2)高密度发酵：高密度发酵的参数设置如下：氨水调节维持pH值5.0；转速50转/分钟；温度37度；罐压保持0.05MPa；发酵时间12小时；(3)发酵菌泥的收集：发酵液4000g离心10分钟，弃去上清；用生理盐水将菌体重悬；4000g离心10分钟，弃去上清；(4)冻干菌粉的制备：向制备的菌泥中加入5倍体积的保护剂，混匀，平衡30分钟；于-80度预冻3小时；在真空冷冻干燥机中冻干30-36小时，冻干参数设置如下：真空度0.1Mba-0.2Mba；冷阱温度为-50度至-55度，即得。
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