CN102449482A - 侧向流动分析时的信号放大方法 - Google Patents
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Abstract
在用于以高敏感方式探测分析物的侧向流动式分析的背景下,参考三明治分析方法,本发明涉及一种高敏感性侧向流动分析中的信号放大方法,其中所述信号是通过使用纳米粒子作为种子加入金属离子和还原剂引发反应而放大。本发明还涉及一种使用该方法的侧向流动分析装置。
Description
技术领域
本发明涉及以高灵敏度检测分析物的侧向流动(Lateral flow)方式的分析过程中的信号放大方法及利用上述方法的侧向流动分析装置。尤其涉及在三明治(sandwich)分析法中将金纳米粒子作为种子并添加金离子及还原剂进行反应,以放大信号的高灵敏度侧向流动分析中的信号放大方法及利用上述方法的侧向流动分析装置。
背景技术
免疫色谱分析法是利用生物学物质或化学物质相互特异性附着的性质,在短时间内对分析物质进行定性及定量分析的方法,尤其是,三明治型免疫分析法是广为利用的方法,其在作为存在与否及浓度调查对象的分析物的第一抗原决定部位(epitope)的固体支撑体中,固定可特异性结合的第一抗体并在分析物的第二抗原决定部位利用特异性第二抗体。
进行上述分析的装置有分析带或将上述分析带设置于壳体内部进行组装的分析装置。此时,若将包含分析物的流体施加于多孔性带的一面,则流体通过毛细管现象流动,从而使分析对象物与包含标识体的抗体及固定抗体结合并完成分析。
更具体而言,在侧向流动装置中,在可使液体试料通过毛细管现象流动的多孔薄膜上固定抗体,且在薄膜的上游一侧具有样品片和接合片,而在下游一侧连接有吸收片。上述样品片吸收包含分析物的液体试料并保证均匀的流动,而接合片上干燥有附着有可选择性地与分析物结合的抗体的标识体。在上述薄膜上,可与分析物现则性结合的固定抗体及可与固定于标志的抗体结合的物质固定在各个不同的位置,以形成检测部及控制部。可与上述分析物选择性结合的固定于薄膜的抗体和固定于标识体的抗体,可与分析物以三明治形式结合。上述吸收片由可吸收液体试料的物质构成。在上述免疫色谱分析装置中,若将包含分析物的液体试料滴加于样品片,则对分析物具有选择性的抗体-标识体和固定于薄膜的抗体以三明治形式结合,从而在固定上述抗体的薄膜位置形成可用肉眼观察的带。
在现有技术中,有在第一接合体和抗原结合之后追加接合第二接合体,并最终与固定于薄膜的抗体结合的免疫色谱的信号放大方法,但因利用现有技术的免疫色谱法测量的灵敏度太低,因此,若需要更高灵敏度的试料的情况下,难以进行测量。另外,将金离子和还原剂进行反应生成金纳米粒子的方法,也可参考其他研究人员的报告(Angew.Chem.Int.Ed.2002,41,2176-2179;Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2005,44,99-103)。但是,还未曾公开将金纳米粒子的生成用作免疫色谱传感器中的信号放大方法,尤其是,将包含金离子及还原剂的单独的分离片设置于免疫色谱中容易放大信号的技术。
因此,本发明的发明人在侧向流动提供一种侧向流动分析中,在结合第一抗体或第一特异性结合物质结合于金纳米粒子的接合体和分析物,并使其通过三明治反应与固定的抗体或固定的特异性结合物质结合之后,后续使金离子及还原剂进行反应以还原金离子,并以上述金纳米粒子为种子形成金纳米粒子,以提高信号放大的灵敏度,从而完成本发明的方法及利用上述方法的侧向流动分析。
发明内容
本发明的目的在于,提供一种侧向流动分析中的信号放大方法。
本发明的另一目的在于,利用上述信号放大方法提供灵敏度得到提高的侧向流动分析装置。
根据本发明的一方面,提供侧向流动分析中的信号放大方法,包括如下步骤:结合可特异性结合于分析物(analyte)的第一抗原决定部位或第一结合部位(配位体)的第一抗体或第一特异性结合物质结合于金纳米粒子的接合体和分析物;结合上述结合接合体的分析物和可特异性结合于上述分析物的第二抗原决定部位或第二结合部位(配位体)的固定的第二抗体或第二特异性物质;及添加金离子及还原剂进行反应。
根据本发明的另一方面,提供侧向流动分析装置,包括:接合片,包括可特异性结合于分析物的第一抗原决定部位或第一结合部位(配位体)的第一抗体或第一特异性结合物质结合于金纳米粒子的接合体;薄膜,包括检测部,而固定有可特异性结合于结合上述接合体的分析物的第二抗原决定部位或第二结合部位(配位体)的第二抗体或第二特异性物质;信号放大片,包含金离子及还原剂。
根据本发明的信号放大方法,接合体与分析物一起固定于捕获抗体或特异性结合物质之后,后续添加包含金离子和还原剂的反应液进行反应,从而提供优秀的信号放大效果,而且,可利用上述放大方法制造灵敏度得到提高的侧向流动分析装置。
附图说明
图1为利用本发明的方法分析抗原时发生信号放大的过程的模式图,其中,1为第一抗体、2为金纳米粒子、3为接合体、4为分析物、5为第二抗体、6为还原金离子所形成金纳米粒子;
图2(a)为本发明的免疫色谱装置内各片的概略模式图,其中,10为样品片、11为接合片、12为薄膜、13为检测部、14为控制部、15为吸收片、16为信号放大片;
图2(b)为本发明的免疫色谱装置内安装各片之后的结构概略模式图;
图2(c)为在未接触信号放大片16的状态下将本发明的免疫色谱组装于壳体内的示例剖面图;
图3及图4为利用肌红蛋白实验随金离子还原的信号放大效果的结果示意图;
图5及图6为利用肌红蛋白实验本发明的免疫色谱分析中的信号放大效果的结果示意图。
具体实施方式
本发明的信号放大方法,在免疫色谱分析法中,由第一抗体及金纳米粒子构成的接合体与抗原结合之后,与作为固定的捕获抗体的第二抗体通过三明治反应结合,后续添加金离子及还原剂,其在侧向流动中,由第一抗体或第一特异性结合物质及金纳米粒子构成的接合体与分析物结合之后,结合于作为固定的捕获抗体的第二抗体或固定的第二特异性结合物质,后续添加金离子及还原剂进行反应,以金纳米粒子为种子在金纳米粒子周围还原Au(III)离子并显示很强的颜色,从而放大信号。
本发明的信号放大方法可适用于侧向流动方式的分析法,而上述侧向流动方式包括垂直流动(vertical flow)或通过流通(flow though)方式。在上述垂直流动方式的情况下,试料垂直叠加于并列设置的多孔膜等。
另外,上述侧向流动方式不限于抗体-抗原反应,本说明书中的“结合部位(配位体)”包括各种分析物中的蛋白质配位体(Ligand)、核酸(DNA或RAN)分析序列的结合部位等,而“特异性结合物质”是包括可选择性地、特异性地结合于上述结合部位的蛋白质、病毒噬菌体、核酸分子适体(Aptamer)、半抗原(hapten;DNP)等在内的生命体分子,而且,不限于上述记载事项。
本说明书中的“接合体”由第一抗体或第一特异性结合物质及金纳米粒子构成,而上述接合体在与分析物结合之后,在分析带上流动的过程中固定于捕获第二抗体或第二特异性结合物质。
若参考图1更详细了解本发明的侧向流动分析中的信号放大方法,则图1表示在侧向流动分析中利用抗原-抗体反应的情况。如图1所示,可特异性结合于分析物的第一抗原决定部位的第一抗体1结合于金纳米粒子2的接合体3与分析物4结合,而与上述接合体结合的分析物在分析带上流动的过程中,与可与上述分析物的第二抗原决定部位结合的固定的第二抗体5结合,而且,作为上述三明治结合的后续过程,使金离子与还原剂进行反应,从而通过以上述金纳米粒子2作为种子形成的金纳米粒子6,放大侧向流动分析中的信号。
可用于本发明的上述金离子可用作金纳米粒子的前体,只要是可利用Au(III)离子的形式则没有特别的限制,而较佳地,可使用氯金酸(HAuCl4)。
可用于本发明的还原剂,例如有柠檬酸、抗坏血酸、硼氢化钠、羟甲基氯化鏻等,而上述还原剂可两种以上混合使用。而较佳地,使用羟胺及柠檬酸。柠檬酸不仅起到还原剂的作用,而且,通过粘附于金纳米粒子表面起到防止纳米粒子相互粘结的作用。
通过本发明的方法检测的分析物不限于通过免疫学反应,即抗原抗体反应与第一抗体及第二抗体结合以形成三明治型免疫复合体的物质,而还可适用于蛋白质或DNA、包含环境荷尔蒙等的环境污染物质、病毒等。
在本发明中,只要是可通过抗原-抗体反应与分析物特异性结合的物质,抗原及抗体没有特别的限制,而在分析物为抗体的情况下,可将与之特异性结合的物质作为抗原。上述抗原及抗体可根据分析物选用已公开的抗原及抗体。进而,将分析物识别为“结合部位(配位体)”选择性地结合“特异性结合物质”的反应,广义上也可视为包含于抗原-抗体反应中。
在实施例3中,以肌红蛋白为分析物确认随金离子还原的信号放大效果,而如图4所示,其结果表明,较之未放大信号的情况,其强度增加了10倍左右。
本发明的侧向流动分析装置利用上述信号放大方法,包括:样品片,施加包含分析物的液体试料;接合片,包括可特异性结合于分析物的第一抗原决定部位或第一结合部位(配位体)的第一抗体或第一特异性结合物质结合于金纳米粒子的接合体;信号放大片,包含金离子及还原剂;多孔性薄膜,包括固定有可特异性结合于结合上述接合体的分析物的第二抗原决定部位或第二结合部位(配位体)的第二抗体或第二特异性物质的检测部及检查错误的控制部(control site);及吸收片,通过毛细管现象吸收液体试料。
图2(a)为本发明的侧向流动分析装置内各片的示例性结构概略模式图,其中,10为样品片、11为接合片、12为薄膜、13为检测部、14为控制部、15为吸收片、16为包含金离子及还原剂的信号放大片。图2(b)为本发明的侧向流动分析装置内安装各片之后的结构概略模式图,图2(c)为在使信号放大片16未接触于基本分析带(包括样品片、接合片及薄膜)的状态下组装的本发明的侧向流动分析装置的示例剖面图。
可用于本发明的侧向流动分析装置的制造的片为多孔性材料,可用天然或合成材料且并没有特殊限制。较佳地,使用硝化纤维。
上述样品片(sample pad)是包含分析物的液体试料首先被吸收的部分,直接使用薄膜的一侧末端或用其他的材料构成,吸收包含分析物的试料并通过毛细管现象移动至接合片。另外,在一实施例中,不设置样品片而直接将包含对象分析物的试料直接施加于接合片。
在上述接合片上接合体以干燥状态存在,而在吸收包含分析物的液体试料之后,获得流动性并移动至薄膜。上述接合片可由玻璃纤维、纤维素等材料构成。
信号放大片可使用与上述接合片相同的材料或其他材料。上述信号放大片上涂布金离子及还原剂并进行干燥。上述金离子及还原剂可以混合或分离状态涂布于信号放大片并进行干燥,而在以分离的状态制造的情况下,例如可使用多个信号放大片。信号放大片以不与侧向流动分析装置的样品片、接合片及薄膜接触的状态存在,并在包含分析物的液体试料被吸收片吸收并通过三明治反应与作为由第一抗体及金纳米粒子构成的接合体与抗原结合固定形成的捕获抗体的第二抗体结合之后,后续与侧向流动分析装置的接合片及薄膜中的一个接触以使金离子及还原剂进行反应,以金纳米粒子为种子还原金纳米粒子周围的Au(III)离子,从而放大信号。
因此,上述信号放大片以不与侧向流动分析装置基本分析带接触的状态下存在,例如,信号放大片在不与侧向流动分析装置的基板分析带接触的状态下附着于外壳,并从向样品片投入试料的时间经过一定时间之后,以手动方式接触或通过自动装置施加压力,从而使信号放大片与侧向流动分析装置的基本分析带接触。信号放大片以在不与侧向流动分析装置的基本分析带接触的状态下存在,并在投入试料之后经过一定时间之后,通过主动或手动方式接触的任意方式附着于侧向流动分析装置的外壳等,而不受特定附着方式的限制。例如,如图2(c)所示,将信号放大片的两末端附着于侧向流动分析装置的外壳,从而在之后施压时,可与侧向流动分析装置的基本分析带接触。另外,不与分析装置的基本分析带接触,而在经过一定时间之后通过其他测量仪器自动接触。
上述信号放大片需在由第一抗体或第一特异性结合物质及金纳米粒子构成的接合体与作为与分析物结合固定而成的捕获抗体的第二抗体或第二特异性结合物质结合之后,后续进行接触,因此,在投入试料的约1至10分钟之后与侧向流动分析装置的基本分析带接触,而较佳地,在3~7分钟之后接触。但是,不受上述范围的限制,例如,在侧向流动分析装置的基本分析带的孔隙(pore)大的情况下,因反应在很短时间内结束,因此,在从投入时间经较短时间之后接触,而这样根据不同的情况改变到接触的时间。
在信号放大片一开始就与侧向流动分析装置的基本分析带接触的情况下,上述信号放大片可在接合片和薄膜之间接触。另外,上述信号放大片可设置于与接合片接触的位置。另外,信号放大片可设置于与薄膜接触的位置。另外,信号放大片可设置于与接触片及薄膜接触的位置。
只要是可确保液体试料的流动的材料,上述薄膜没有特殊的限制,而较佳地,由多孔膜构成。更具体而言,可使用固定抗体或特异性结合物质及酶蛋白并最大限度地减少非特异性反应的硝化纤维、纤维素、PVDF(聚偏二氟乙烯(Poly-vinylidene fluoride))、PET(聚(对苯二甲酸亚乙酯)(poly(ethylene terephthalate)))、PES(聚醚砜(polyethersulfone))、玻璃纤维、尼龙等可调节一定微孔(Micropore)大小的疏水性多孔膜。薄膜包括固定有可特异性结合于结合上述接合体的分析物的第二抗原决定部位或第二结合部位(配位体)的第二抗体或第二特异性物质的检测部及用于判断错误引起的反应的存在与否的控制部。检测部是用于显示测试结果的部分。控制部的作用是确认金离子接合体和捕获抗体或固定的第二特异性结合物质的错误,并确认具有移动性的物质是否直至检测部/控制部而无错误地完成反应。
只要是可充分吸收通过毛细现象的反应后剩余的残留物的材料,吸收片(absorbing pad)没有特殊的限制,例如,可使用纤维素、棉布、亲水性多孔聚合物等。
下面,通过实施例对本发明进行更详细的说明,而这些实施例是对本发明的示例,而本发明的范围不受这些实施例的限制。
实施例1:金纳米粒子-抗体接合体的合成
金离子胶体溶液(BBInternational,20nm)1mL中添加0.1mL的0.1M的硼酸缓冲液(Borate buffer)(pH 8.5)和1mg/mL的第一抗体10μL进行30分钟的反应。上述反应之后,在常温条件下,添加将1%(w/v)的BSA(牛血清蛋白(Bovine serum albumin),Sigma)溶解于PBS(磷酸盐缓冲盐水(Phosphate buffered saline))的溶液0.1mL并进行15分钟的反应。上述反应之后,以10,000rpm、4℃的条件进行20分钟的离心分离,分3次添加在10mM的PBS中以1mg/mL的浓度溶解的BSA(牛血清蛋白,Sigma)溶液1mL并提纯之后回收。在对肌红蛋白进行免疫分析时,上述第一抗体可使用M012607(Fitzgerald)。
实施例2:免疫色谱的制造
在塑料片(Millipore)上附着硝化纤维薄膜(Millipore,180secNitrocellulose)和吸收片(Millipore)之后,使用分配器(Dispenser)***(ZetaCo.)添加溶解于PBS的捕获抗体(第二抗体)的1mg/mL溶液和作为对照组的溶解于PBS的羊抗小鼠(Goat anti-mouse)IgG抗体(Sigma,M8642)的1mg/mL溶液,并各以6cm/sec的速度在薄膜上划线以形成检测线(detectionsite)和控制线(control line)。对上述薄膜进行干燥之后,放入切割机以3mm的间隔进行切割。为进行对肌红蛋白的免疫分析,作为上述捕获抗体的第二抗体可使用肌红蛋白捕获抗体(Fitzgerald)。将接合片(GFC,Millipore公司)切割成5×3mm的大小之后,涂布在上述实施例1中制造而成的接合体5μL并进行干燥。样品片浸渍于1%的BSA、0.5%的Tween 20、5%的蔗糖、5%的右旋糖苷、0.05%的叠氮化钠(sodium azide)的水溶液之后进行干燥并切割成10×3mm左右的大小。在组装有上述薄膜和吸收片的塑料片上,将接合片和样品片组装成如图2b所示的形式。
实施例3:随金离子还原的信号放大效果的确认
将在上述实施例2中组装的免疫色谱传感器浸渍于以0ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL及100ng/mL的浓度浸渍溶解肌红蛋白抗原的PBS 70μL的96孔(well)板上。在不放大信号的情况下,将浸渍时间设定为10分钟,而在放大信号的情况下,在浸渍5分钟之后,将上述免疫色谱传感器浸渍于溶解有50mM的HAuCl4、10mM的羟胺(HONH2)的柠檬酸(citrate)缓冲溶液(5mM,pH4.0)50μL中5分钟之后,观察信号。测量的结果如图3及图4所示,图3为用带状表示实验结果的图,而图4为用图表表示实验结果的图。结果表明,与不放大信号的情况相比,其强度增加10倍以上。
实施例4:随利用信号放大片的金离子的还原的信号放大效果
将在上述实施例2中组装的免疫色谱传感器浸渍于以0ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL及100ng/mL的浓度浸渍溶解肌红蛋白抗原的PBS 70μL的96孔(well)板上。在不放大信号的情况下,将浸渍时间设定为10分钟,而在放大信号的情况下,在浸渍5分钟之后,在浸渍上述免疫色谱传感器的状态下,在接合片上层叠信号放大片。信号放大片是在将Fusion 5(Whatman)切割成5×3mm大小的片上涂布250mM的HAuCl4 10μl,并在将另外Fusion5(Whatman)切割成5×3mm大小的片上涂布将溶解25mM的羟胺(HONH2)的柠檬酸(citrate)缓冲溶液(25mM,pH4.0)10μL之后,进行干燥。其测量结果如图5及图6所示,图5为用带状表示实验结果的图,而图6为用图表表示实验结果的图。结果表明,与不放大信号的情况相比,其强度增加5倍以上。
本发明不受上述实施例的限制,而由如下的权利要去限定。本领域技术人员可对本发明进行各种变形及修改。下面,示例性地公开几个变形事项。
虽然未在图中显示,但也可考虑在由样品片10(可选)、接合片11、薄膜12及吸收片15(可选)构成的分析装置中,将包含金离子和还原剂的信号放大溶液和包含分析物的试料向上述装置的侧方移动并在上述薄膜12的测试线中进行反应之后,经过一定时间之后在应用于样品片或接合片的情况。在此情况下,包含金离子及还原剂的溶液装在单独的容器中并与上述分析装置一起成套提供。另外,在非定性测量的定量测量的情况下,在投入试料并经过一定时间之后,由具备用于读取测试线13的读取部的测试仪器使还未接触的信号放大片16与上述接合片及薄膜中的一个以上接触。在此情况下,该测试仪器包括用于使信号放大片接触的部件。因此,包含于信号放大片的金离子通过扩散流动向测试线13移动。另外,在投入试料并经过一定时间之后,由用户向装置外壳的一部分施压以使平时未接触的信号放大片与上述接合片及薄膜中的一个以上接触。另外,可在开始制造时,使信号放大片位于基板测试带上或接触***于基本测试带中间。最后,具有测量分析装置的测试线的结果的读取部的测试仪器,包括装有上述信号放大溶液的容器及在投入分析试料并经过一定时间之后,将此溶液投入施加至接合片或薄膜上的部件。这些各种方法及结构将包含于以下的权利要求书的技术思想范围之内。
工业实用性
本发明可用于测量生命体数据。
Claims (14)
1.一种侧向流动分析中的信号放大方法,包括如下步骤:结合可特异性结合于分析物的第一抗原决定部位或第一结合部位(配位体)的第一抗体或第一特异性结合物质结合于金纳米粒子的接合体和分析物;结合所述结合接合体的分析物和可特异性结合于所述分析物的第二抗原决定部位或第二结合部位(配位体)的固定的第二抗体或第二特异性物质;及添加金离子及还原剂进行反应。
2.根据权利要求1所述的侧向流动分析中的信号放大方法,其特征在于:所述结合部位(配位体)为选自蛋白质配位体、核酸(DNA或RAN)分析序列中的至少一种,而特异性结合物质是选自可特异性地结合于所述结合部位的蛋白质、病毒噬菌体、核酸分子适体、半抗原中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的侧向流动分析中的信号放大方法,其特征在于:所述还原剂是选自羟胺及柠檬酸中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的侧向流动分析中的信号放大方法,其特征在于:所述分析物是选自DNA、环境荷尔蒙、抗原蛋白中的至少一种。
5.一种侧向流动分析装置,包括:接合片,包括可特异性结合于分析物的第一抗原决定部位或第一结合部位(配位体)的第一抗体或第一特异性结合物质结合于金纳米粒子的接合体;薄膜,包括检测部,而固定有可特异性结合于结合所述接合体的分析物的第二抗原决定部位或第二结合部位(配位体)的第二抗体或第二特异性物质;信号放大片,包含金离子及还原剂。
6.根据权利要求5所述的侧向流动分析装置,其特征在于:还包括被施加包含分析物的液体试料的样品片。
7.根据权利要求5所述的侧向流动分析装置,其特征在于:还包括设置于所述薄膜的下游并通过毛细管现象吸收液体试料的吸收片。
8.根据权利要求5所述的侧向流动分析装置,其特征在于:所述信号放大片在投入试料之前也与所述接合片和所述薄膜之间接触,或所述信号放大片在投入试料之前与所述接合片和所述薄膜中的至少一个接触。
9.根据权利要求5所述的侧向流动分析装置,其特征在于:所述信号放大片在投入试料之前以不与所述接合片和所述薄膜中的任何一个接触的状态存在,而在投入试料之后,才与所述接合片和所述薄膜中的至少一个接触。
10.根据权利要求9所述的侧向流动分析装置,其特征在于:所述信号放大片在投入试料并经过1~10分钟之后,才与所述接合片和所述薄膜中的至少一个接触。
11.根据权利要求9所述的侧向流动分析装置,其特征在于:由用户施加压力以使所述信号放大片与所述接合片和薄膜中的至少一个接触。
12.一种生命体数据分析***,包括由侧向流动分析装置和用以读取侧向流动分析装置的测试结果的读取部构成的测试仪器,所述侧向流动分析装置为根据权利要求9所述的侧向流动分析装置,而所述测试仪器包括在投入所述试料之后,可使所述信号放大片接触于所述接合片和薄膜中的至少一种的部件。
13.一种侧向流动分析装置套装,包括侧向流动分析装置和装载信号放大溶液的单独的容器,而所述信号放大溶液包含金离子及还原剂。
14.一种生命体数据分析***,包括由侧向流动分析装置和用以读取侧向流动分析装置的测试结果的读取部构成的测试仪器,所述测试仪器包括用以保管信号放大溶液的保管部及将所述信号放大溶液施加于所述侧向流动分析装置的部件,而所述信号放大溶液包含金离子及还原剂。
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