CN102424830A - 一种添加还原型谷胱甘肽提升酮古龙酸菌产2-酮基-l-古龙酸生产强度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明阐述了一种添加还原型谷胱甘肽(GSH)提升酮古龙酸菌产2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法，属于维生素C发酵生产领域。本发明利用酮古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)混合菌系为生产菌株，通过向发酵培养基中添加1g/L的还原型谷胱甘肽，促进混菌体的生产，提高生物量，缩短发酵周期，提高生产强度，实现2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)的高效生产。添加1g/L GSH条件下，发酵周期为60h，2-KLG产量为66.3g/L，生产强度为1.11(g(L·h)-1)，与对照组相比发酵周期缩短了11.8％，2-KLG产量和生产强度分别提高了5.07％和27.6％。
Description
技术领域
一种添加还原型谷胱甘肽提升酮古龙酸菌产2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法，属于发酵制备维生素C技术领域。
背景技术
维生素C(即L-抗坏血酸)是人体必需的一种水溶性维生素，动物体内不能自身合成，一般通过食用水果蔬菜获得。维生素C在食品、医药、化工、化妆品、饲料等行业应用广泛。其应用范围在不断拓展，随着人们对营养保健的关注，维生素C的需求将会不断扩大。
目前，我国生产维生素C的方法基本沿用了60年代尹光琳等人发明的“二步发酵法”，第一步发酵使用黑醋杆菌将山梨醇转化为L-山梨糖，第二步发酵为大小菌混菌发酵，即使用俗称大菌的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和俗称小菌的酮古龙酸菌(Ketogulonigeniumvulgare)混合菌系发酵，将山梨糖转化为维生素C的前体物2-酮基-L-古龙酸，第一步反应技术相对成熟，转化率高，而第二步由于涉及混菌混合发酵，一直是维生素C生产领域的难题。
随着维生素C发酵行业竞争越来越激烈，发酵工艺的优化、资源的合理利用的要求不断提高。减少发酵过程环境的污染、提高原料的利用率，提高生产强度等等技术要求是今后生产发展的趋势。维生素C发酵第二步中糖酸转化率已经很高，一般都有90％以上，所以优化的重点就是缩短发酵周期，提高发酵生产强度。本专利就是基于这点，通过向发酵培养基中添加还原型谷胱甘肽提升酮古龙酸菌产2-酮基-L-古龙酸的生产强度。
谷胱甘肽(glutathione)是一种自然界广泛存在、同时具有γ-谷氨酰基和巯基的活性三肽，在生物体内有多种重要的生理功能，特别是具有抵抗渗透压和维持体内正常的氧化还原环境的能力。目前，添加谷胱甘肽旨在促进混菌体系更好的适应发酵环境，提高菌体特别是酮古龙酸菌生物量，从而缩短发酵周期，提高发酵生产强度。
发明内容
本发明的目的是添加还原型谷胱甘肽促进菌体生长，缩短发酵周期和产量，从而提高产2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法。
1.菌株
酮古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)DSM 4025及巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)ATCC 21916，由江山制药有限公司(靖江)提供。
2.培养基和培养方法
种子培养基(g/L)：L-山梨糖20，玉米浆1.5，牛肉膏3，酵母浸出物3，大豆蛋白胨10，磷酸二氢钾1，无水硫酸镁0.2，尿素1，碳酸钙1。
发酵培养基(g/L)：L-山梨糖80，玉米浆5，尿素12，磷酸二氢钾1，无水硫酸镁0.1，碳酸钙5，其中碳酸钙、L-山梨糖和氮源分别单独灭菌，接种时添加，还原型谷胱甘肽用超纯水配制，0.22μm过滤除菌，接种时添加。
培养基都由自来水配制，用氢氧化钠调节pH到6.7-7.0，灭菌121℃，15min。
3.大菌和小菌混合培养方法
用接种环挑取平板上的小菌两环，再挑取大菌一环制成混菌悬液，取混菌悬液涂斜面，30℃培养48h；取斜面混合菌活化后菌液0.4mL接种种子培养基75mL/750mL摇瓶中。30℃，200rpm下培养18h，即制成大小菌混菌混合菌系，接入甘油管中进行保藏。
4.培养方法
从冷冻甘油管中取混菌保藏培养物种液10mL接入发酵培养基(75mL/750mL摇瓶)，30℃，200rpm培养，定期取样测定参数。
5.分析方法
菌体浓度测定：取适量的菌悬液置于10mL容量瓶中，加入适量的4mol/L盐酸溶解菌悬液中的碳酸钙，再加入去离子水定容至10mL，摇匀，用UV7500型可见光分光光度计，于660nm处比色测OD值。
2-KLG与L-山梨糖含量测定：采用高效液相色谱(HPLC)测定。色谱柱：Aminex HPX-87H(Bio-Rad)，流动相：0.005mol/L H2SO4，流速：0.5mL/min，柱温：35℃，进样量：5μL，检测器：示差折光检测器。
本发明的有益效果：在发酵培养基中添加1g/L的还原型谷胱甘肽，与对照组相比较，发酵周期缩短了11.8％(60h)，2-KLG产量提高了5.07％(66.3g)，生产强度提高了27.6％(1.11g(L·h)-1)。
附图说明
图1，为添加1g/L GSH对混合菌系生长的影响，图例：■：未添加GSH；○添加1g/L的GSH。
图2，为添加1g/L GSH对混合菌系发酵产2-酮基-L-古龙酸的影响，图例：■未添加GSH；○：添加1g/L GSH。
具体实施方式
对照实施例：本发明所用的菌种为酮古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)与巨大芽孢杆菌(Bacillus meegaterium)混合菌系。从冷冻甘油管中取混菌保藏培养物0.3mL接入种子培养基(75mL/750mL摇瓶)，30℃，200rpm培养。正常发酵2-KLG终产量为63.1g/L，发酵周期为68h，生产强度为0.87g(L·h)-1。
实施例1：在发酵培养基中添加1g/L的还原型谷胱甘肽(GSH)，接种时添加，其余条件同对照实施例。添加实验组发酵周期60h，相比对照组缩短8h；2-KLG产量为66.3g/L，提高了5.07％；生产强度为1.11(g(L·h)-1)，提高了27.6％。
Claims (1)
1.一种添加还原型谷胱甘肽提升酮古龙酸菌产2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法，其特征为：利用酮古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的混合菌系为生产菌株，发酵生产维生素C前体物质2-酮基-L-古龙酸，通过向发酵培养基中添加1g/L的谷胱甘肽，促进混菌菌体生长，主要促进小菌生物量提高和2-酮基-L-古龙酸生产，提升生产强度，实现2-酮基-L-古龙酸高效生产。
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