CN102423310B

CN102423310B - 丹酚酸c在制备防治高尿酸血症药物中的应用

Info

Publication number: CN102423310B
Application number: CN 201210000772
Authority: CN
Inventors: 陈君; 李萍; 高雯
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2012-01-04
Filing date: 2012-01-04
Publication date: 2012-12-12
Anticipated expiration: 2032-01-04
Also published as: CN102423310A

Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体涉及丹酚酸C在制备防治高尿酸血症药物中的应用。药理试验证明，丹酚酸C可作为黄嘌呤氧化酶抑制剂防治高尿酸血症及其并发症，高尿酸血症可引起的并发症包括痛风、痛风性关节炎、痛风性肾病、***和心血管病等疾病。

Description

丹酚酸C在制备防治高尿酸血症药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及丹酚酸C在制备防治高尿酸血症药物中的应用。

背景技术

黄嘌呤氧化酶广泛分布于人体心、肺、肝等组织的胞浆内，能催化黄嘌呤和次黄嘌呤氧化生成尿酸，并产生过氧化物自由基。人体内嘌呤物质的新陈代谢发生紊乱，尿酸的合成增加或排出减少，尿酸以钠盐的形式沉积在关节、软骨和肾脏中，引起组织异物炎性反应，即痛风。通常认为高尿酸血症是痛风的标志，据统计约有5％～12％的高尿酸血症患者最终发展为痛风。高尿酸血症是痛风最重要的生化基础，可引起痛风性关节炎、痛风性肾病、***和心血管病等并发症，降低过高的尿酸是其主要治疗策略。黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)是尿酸生成的关键酶，为治疗高尿酸血症重要靶点之一。XO抑制剂通过抑制体内XO的活性来减少尿酸形成，对高尿酸血症和痛风产生了良好的防治效果。近年又发现，XO抑制剂对缺血再灌注损伤、内皮损伤、心功能衰竭具有明显的保护作用(PeterHiggins，Jesse Dawson，Matthew Walters.The potential for xanthine oxidase inhibition in the prevention and treatment ofcardiovascular and cerebrovascular disease.Cardiovascular Psychiatry and Neurology，2009，2009：282059)。目前，黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌醇是治疗痛风的一线药物，但其在临床使用中有药疹、发热以及肝功能、肾功能、血液***损害等不良反应，且死亡率高(黄玉斌.381例别嘌醇不良反应分析.中国药物应用与检测，2005，(1)：32-34)，在一定程度上限制了其运用。因此，发现和寻找新的有效、低毒的黄嘌呤氧化酶抑制剂在医学和人体代谢研究方面具有重要意义。

丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)为唇形科鼠尾草属植物，其根供药用，具有活血祛瘀、镇静安神、消肿止痛等良好功效，在心脑血管疾病如冠心病、高脂血症、脑血管疾病等的治疗中发挥着重要作用。丹参的化学成分主要可分为脂溶性成分和水溶性成分两大部分。丹参的传统应用方式为水煎液，因此，水溶性成分应是其重要的药效成分。最初分离出的水溶性成分为丹参素(β-3，4-二羟苯乳酸)，是各种丹酚酸的基本化学结构，如丹酚酸A是由一分子丹参素与两分子咖啡酸缩合而成，而丹酚酸B为三分子丹参素与一分子咖啡酸缩合而成。其它酚酸类化合物还包括丹酚酸C、丹酚酸D、丹酚酸E、丹酚酸F、丹酚酸G、丹酚酸H、丹酚酸I、迷迭香酸、紫草酸等。药理实验研究表明，丹酚酸在心脑血管方面有重要的药理作用，如具有保护心脏、保护脑损伤等作用，对血栓的形成也有重要的影响。丹酚酸类化合物具有很强的抗氧化作用，可以清除超氧阴离子和羟基自由基，抑制脂质过氧化反应，并且影响细胞内钙离子浓度及ATP酶活性。朱大元等发现，丹参中的丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸和丹参素具有黄嘌呤氧化酶抑制作用，并能降低高尿酸血症小鼠的血清尿酸水平(专利申请号：CN200410084620.4)。本发明所述丹酚酸C，是大量筛选研究过程发现的一个非嘌呤类黄嘌呤氧化酶抑制剂，其防治高尿酸血症和痛风的作用尚未见有报道。

发明内容

本发明的目的是提供酚酸类单体化合物丹酚酸C(salvianolic acid C)的新用途，具体是丹酚酸C作为黄嘌呤氧化酶抑制剂在制备防治高尿酸血症及其并发症药物中的应用，高尿酸血症可引起的并发症包括痛风、痛风性关节炎、痛风性肾病、***和心血管病等疾病。

丹酚酸C的结构如下所示：

丹酚酸C Salvianolic acid C(CAS No.115841-09-3)

药理实验证明：丹酚酸C可逆性抑制黄嘌呤氧化酶活性，其IC₅₀为9.07μmol/L，其抑制类型为混合型(竞争型与非竞争型)，Ki(酶-抑制剂复合物解离常数)和KI(酶-抑制剂-底物复合物解离常数)分别为3.30μmol/L和13.67μmol/L，并提供了丹酚酸C和黄嘌呤氧化酶直接相互作用的证据。

丹酚酸C可剂量依赖性抑制氧嗪酸钾所致小鼠血清尿酸水平升高，与模型对照组相比有显著性差异，作用机制与其抑制黄嘌呤氧化酶有关。

下面结合实施例进行部分药效学试验。

附图说明

图1是丹酚酸C和别嘌醇对黄嘌呤氧化酶的抑制作用

图2是用Lineweaver-Burk作图法求丹酚酸C对黄嘌呤氧化酶抑制的动力学常数

图3是丹酚酸C二维涡流色谱图(其中(A)PB；(B)丹酚酸C；(C)丹酚酸C-XO共孵样品)

具体实施方式

实施例1

丹酚酸C的制备和结构鉴定：

取丹参药材10kg，用水煎煮后，将提取液过滤，减压浓缩得到浸膏，将浸膏加水溶解后，调节pH值为酸性，采用大孔吸附树脂进行纯化，得到总酚酸，总酚酸再经Sephadex LH-20柱纯化和ODS柱纯化，得到化合物丹酚酸C。

根据HRESI-MS计算分子式为C₂₆H₂₀O₁₀([M-H]^-m/z 491.0994，计算值：491.0984)。¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)δppm：6.73(1H，d，J＝8.25Hz，H-5)，7.36(1H，d，J＝8.25Hz，H-6)，7.92(1H，d，J＝16.0Hz，H-7)，6.46(1H，d，J＝16.0Hz，H-8)，6.72(1H，d，J＝8.0Hz，H-5″)，6.66(1H，d，J＝8.0Hz，1.9Hz，H-6″)，6.80(1H，d，J＝1.9Hz，H-2″)，3.14(1H，dd，J＝14.4Hz，4.3Hz，H-7α″′)，3.06(1H，dd，J＝14.4Hz，8.2Hz，H-7β″′)，5.25(1H，dd，J＝8.2Hz，4.3Hz，H-8″)，7.40(1H，d，J＝2.0Hz，H-2″′)，6.88(1H，dd，J＝8.2Hz，H-5″′)，7.39(1H，dd，J＝8.2Hz，2.0Hz，H-6″′)，7.20(1H，s，H-8″′)。¹³C-NMR(300MHz，DMSO-d₆)δppm：120.93(C-1)，130.94(C-2)，144.94(C-3)，146.93(C-4)，110.77(C-5)，117.25(C-6)，143.28(C-7)，116.06(C-8)，166.16(C-9)，127.39(C-1′)，116.69(C-2′)，144.00(C-3′)，142.33(C-4′)，115.39(C-5′)，120.05(C-6′)，36.15(C-7′)，72.93(C-8′)，170.92(C-9′)，117.35(C-1″)，113.85(C-2″)，144.80(C-3″)，145.60(C-4″)，112.47(C-5″)，125.74(C-6″)，157.33(C-7″)，98.72(C-8″)。

上述化合物波谱数据与文献[周长新，罗厚蔚，丹羽正武.丹参水溶性化学成分的研究.中国药科大学学报，1999，30(6)：411-416]一致，其TLC的Rf值、荧光颜色均与丹酚酸C相同，故可推断该化合物为丹酚酸C。

实施例2

丹酚酸C的黄嘌呤氧化酶抑制活性

通过尿酸生成法测定丹酚酸C的黄嘌呤氧化酶抑制活性。具体实验方法如下：固定黄嘌呤氧化酶(Sigma公司，批号119K3793)浓度为0.2units，在反应体系中加入不同浓度的丹酚酸C(5μmol/L，12.5μmol/L，25μmol/L，50μmol/L，75μmol/L，100μmol/L)，25℃孵育3min后，加入黄嘌呤120μmol/L，测定295nm的紫外吸光度，计算抑制率。结果如图1，其IC₅₀＝9.07μmol/L，阳性对照药物别嘌醇的IC₅₀＝2.55μmol/L，说明丹酚酸C具有强的黄嘌呤氧化酶抑制活性。根据Lineweaver-Burk氏作图法计算丹酚酸C对黄嘌呤氧化酶抑制的动力学常数，具体实验方法如下：固定丹酚酸C的浓度分别为5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L，黄嘌呤氧化酶浓度为0.24units，在一系列不同底物浓度下(20μmol/L，30μmol/L，40μmol/L，50μmol/L，60μmol/L)测定反应吸光值，同时以75mM的磷酸盐缓冲液(PB)代替丹酚酸C，在上述浓度下测定反应吸光值，每一测定平行做3个重复，利用Lineweaver-Burk双倒数作图法，以1/V为纵坐标轴，1/[Xanthine]为横坐标作图。结果如图2，在无抑制剂情况下，计算黄嘌呤氧化酶Km为34.63μmol/L。丹酚酸C对黄嘌呤氧化酶的抑制类型为混合型(竞争型与非竞争型)，Ki(酶-抑制剂复合物解离常数)和KI(酶-抑制剂-底物复合物解离常数)分别为3.30μmol/L和13.27μmol/L。

实施例3

丹酚酸C与黄嘌呤氧化酶的直接相互作用

根据靶蛋白亲和-二维涡流色谱-LC/MS在线连用分析方法[Jian-Liang Zhou，Jing-Jing An，Ping Li，Hui-Jun Li，Yan Jiang，Jie-Fei Cheng.Two-dimensional turbulent flow chromatographycoupled on-line to liquid chromatography-mass spectrometry for solution-based ligand screeningagainst multiple proteins.Journal of Chromatography A，2009，1216：2394-2403]，鉴定丹酚酸C和黄嘌呤氧化酶(XO)可直接相互作用。浓度20μmol/L的丹酚酸C和黄嘌呤氧化酶25℃避光孵育1h，进样20μL，二维涡流色谱-MSD分析检测，同时进样20μL磷酸盐缓冲液(PB)和20μmol/L的丹酚酸C做对照。结果如图3，表明仅丹酚酸C和黄嘌呤氧化酶孵育后在此***上能够检测到丹酚酸C，说明丹酚酸C和黄嘌呤氧化酶可以形成复合物，丹酚酸C和黄嘌呤氧化酶可直接相互作用，与丹酚酸C是黄嘌呤氧化酶抑制剂的结论一致。

实施例4丹酚酸C对氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症小鼠血尿酸的影响

雄性ICR小鼠60只，体重25-28g。随机分为6组：(1)正常组，(2)模型对照组，(3)丹酚酸C I组：20mg/kg，(4)丹酚酸CII组：40mg/kg，(5)丹酚酸CIII组：80mg/kg，(6)阳性对照组：别嘌醇20mg/kg。受试化合物用0.5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)配制成适宜浓度。受试动物给药前2小时禁食。正常小鼠腹腔注射0.5％CMC-Na溶液，其余各组小鼠腹腔注射氧嗪酸钾300mg/kg；1小时后正常组和模型组小鼠腹腔注射0.5％CMC-Na溶液10mL/kg，其余各组小鼠腹腔注射给药。1小时后尾静脉取血，室温放置1小时，3000×g离心10min，取血清，按试剂盒法测定小鼠血清中尿酸水平。同时取小鼠肝脏100mg，9倍体积磷酸盐缓冲液制备肝匀浆，按试剂盒说明书方法测定肝匀浆蛋白含量和黄嘌呤氧化酶活力。结果见表1，腹腔注射氧嗪酸钾后动物血清尿酸水平显著升高，与正常组相比，有显著性差异，提示模型成功。丹酚酸C 20、40、80mg/kg腹腔注射给药，剂量依赖性抑制氧嗪酸钾所致小鼠血清尿酸水平升高，在40和80mg/kg剂量下可显著降低小鼠肝匀浆的黄嘌呤氧化酶活力。

表1丹酚酸C对氧嗪酸钾所致小鼠高尿酸血症的影响(n＝10，x±s)

注：药物治疗组与模型对照组相比：^*p＜0.05，^**p＜0.01。

Claims

1.丹酚酸C在制备用于预防和/或治疗高尿酸血症的药物的用途。

2.丹酚酸C在制备用于预防和/或治疗高尿酸血症引起的痛风或痛风并发症的药物的用途。

3.权利要求2的用途，其中痛风并发症是痛风性关节炎、痛风性肾病、***或心血管病。