CN102419374A - 促黄体生成激素(lh)定量测定试剂盒及其检测方法 - Google Patents
促黄体生成激素(lh)定量测定试剂盒及其检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102419374A CN102419374A CN201110257444XA CN201110257444A CN102419374A CN 102419374 A CN102419374 A CN 102419374A CN 201110257444X A CN201110257444X A CN 201110257444XA CN 201110257444 A CN201110257444 A CN 201110257444A CN 102419374 A CN102419374 A CN 102419374A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- add
- container
- fully
- mentioned
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明公开了一种促黄体生成激素LH的定量测定试剂盒,其特征在于,该试剂盒包含LH磁分离试剂,酶反应物,反应增强剂,稀释液,LH校准品、LH质控品,清洗液浓缩液以及底物溶液。本发明还公开了该试剂盒的制备方法。本发明试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合,提供了一种接近均相的反应体系,与现有技术相比,本发明试剂盒具有更高的检测灵敏度和特异性,并达到了较佳的性能参数,并且大大降低了产品成本。
Description
技术领域
本发明涉及测定血清的试剂盒及其测试方法,尤其是涉及测定血清中促黄体生成激素(LH)含量的试剂盒及其测试方法。
背景技术
促黄体生成激素(LH)是由垂体前叶分泌的糖蛋白激素,其分子量大约为30,000,由两条多肽链(即α和β亚单位)组成。在女性中,LH在***与FSH一起促进卵泡的成熟、***的合成和分泌;促进***和使***后的卵泡转变为黄体,促进间质的生长,并促进黄体合成和孕激素与***的分泌,对女体内LH的定量检测常被用来判断女性的***状况;男性LH促进***细胞增生,促进其合成和分泌***,由于LH和FSH的作用是互相协同的,故二者常同时测定。LH常与其他性腺激素一起用于男女***不育症的诊断与治疗,也用于分析月经性疾病和下丘脑-垂体-性腺轴功能的评价。LH还可作为青少年性早熟和发育迟缓的诊断依据之一。
过去以放免为代表的促黄体生成激素(LH)测定试剂盒受方法学的限制,其灵敏度和抗干扰能力严重不足,存在很大的弊端,已基本上退出市场,目前应用较多的为酶联免疫检测技术和化学发光技术。化学发光技术兴起于上个世纪80年代是继酶联免疫技术和放免技术之后发展起来的新兴技术,由于其高灵敏度、高特异性,同时方法简便、快速,标记结合物稳定,无放射性同位素损伤和污染等特点,在近些年得到了飞速发展。
磁微粒分离酶联免疫检测技术是一种以磁性微粒为固相分离载体,将免疫磁微粒分离技术与酶联免疫检测技术相结合而建立的一种新型免疫检测方法。传统ELISA方法,抗原、抗体的结合反应是在固相(ELISA板反应孔)表面进行的,而磁微粒分离酶联免疫检测方法,抗原、抗体的结合反应也在近似液相的条件下进行,因而反应快速、彻底。与传统ELISA相比具有灵敏度高,检测用时少的优点。
发明内容
本发明需要解决的技术问题在于提供一种促黄体生成激素(LH)定量测定试剂盒及其检测方法,采用该试剂盒进行LH检测具有较高的灵敏度和特异性,和更短的获得检测结果的时间和更简便的操作方式。
本发明提供了一种促黄体生成激素(LH)的定量测定试剂盒,其包含的试剂有LH磁分离试剂,酶反应物,反应增强剂,稀释液,校准品、质控品,清洗液浓缩液以及底物溶液。
所述的磁分离试剂含有标记有抗LH单克隆抗体的磁性微球。
所述的酶反应物是含有碱性磷酸酶标记的抗LH单克隆抗体。
所述的反应增强剂是含有Tris的缓冲液。
所述稀释液是含有BSA溶液。
所述的校准品及质控品是含有一定量的LH抗原的BSA蛋白溶液。
所述清洗液浓缩液是含有TWEEN-20和Proclin-300的缓冲液。
所述的底物溶液为酶促化学发光底物溶液。
本发明促黄体生成激素(LH)的定量测定试剂盒的制备方法,包括下述步骤:
第一步:磁分离试剂的制备过程
一、磁珠缓冲液配制操作步骤,配制1L:
1、称取TRIS 4.58g和NaCl6.81g于1L容器中,称取0.96g TWEEN-20于20ml容器中加适量水使其完全溶解后,倒入上述容器中;
2、用移液器将Proclin-300量取0.2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后,倒入上述1L容器中,然后在上述1L容器中加入800ml纯化水,充分搅拌;
3、调节PH计测量其PH值,调PH,控制PH在7.95-8.05之间;
4、称取BSA 3g倒入上述1L容器中;
5、最后定容至1000ml,用0.2um滤器过滤;过滤完后贴好标签于28℃冷库贮存。
二、磁分离试剂的制备过程
1、将1.0mg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50ul DMSO中,取2mg抗LH单克隆抗体溶于PH 9.5的0.1mol/L PB缓冲液中至总体积为1ml;
2、确定辛二酸二琥珀酰亚胺酯的投入量,用移液枪吸取辛二酸二琥珀酰亚胺酯加入到步骤1的抗体溶液中,置室温90min;
3、将步骤2抗体溶液加入到Centricon-10浓缩管中然后放入到高速冷冻离心机中在3000g下浓缩30min至体积为0.5ml;
4、取0.5ml磁珠,加入5ml反应杯中,放入专用试管架,经磁铁吸附2分钟后吸取上清;
5、每次加入1.5ml PH9.5 0.1mol/L PB,混匀30秒,上架,去上清,重复操作3次;将步骤4获得的抗体溶液加入到上述磁珠中,混匀后室温反应4小时;
6、加入0.3ml 1mol/L的TRIS溶液37℃15分钟;
7、每次加入1.5ml PH7.2 0.1mol/L PB清洗已经标记的磁珠,混匀30秒,上架,去上清,重复操作3次;
8、用100ml磁珠保存液将磁珠转入125ml玻璃瓶,即为0.05%的LH磁分离试剂;磁珠保存液配方为0.1%BSA,0.05%吐温-20,0.02%NaN3,20%乙醇,4℃保存。
9、将步骤9获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照1∶1的比例混匀,即得本发明试剂盒中磁分离试剂。
第二步:酶反应物制备过程
一、酶反应物稀释液配制操作步骤,配制1L:
1、取Tris 6.06g、NaCl 13.0g、Zncl2 0.05g、Proclin-300 0.2ml和MgCl2 0.05g于烧瓶中,然后在烧瓶中加入800ml纯化水,充分搅拌,使试剂完全溶解;
2、调PH,控制PH在7.35-7.45范围内;
3、称取BSA 3g倒入上述烧杯中;
4、最后定容至1000ml,用0.2um滤器过滤即得。
二、碱性磷酸酶ALP与抗LH单克隆抗体的偶联
1、取10mgALP加入5ml生理盐水中,加入到浓缩管中,3000RPM离心20分钟,浓缩至1毫升;
2、向步骤1获得浓缩液中加入0.2ml的0.1M NaIO4溶液,室温下避光搅拌20分钟,然后装入透析袋中,用1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析,4℃过夜,收集保留液;
3、向步骤3获得保留液中加入0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液,使PH升高到9.0,然后立即加入2.5mg抗LH单克隆抗体,室温避光轻轻搅拌2小时,再加入0.1ml的4mg/ml NaBH4溶液,混匀,置4℃下2小时;
4、将上述液装入透析袋中,对0.15M PH7.4PBS透析,4℃过夜,收集保留液;
5、向步骤4获得保留液中逐滴加入等体积饱和硫酸铵,置4℃1小时,然后3000rpm离心半小时,弃上清,沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次,最后沉淀物溶于20ml的0.15M PH7.4的PBS中;
6、将步骤5获得的溶液装入透析袋中,用0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析5个小时去除铵离子,收集保留液后10,000rpm离心30分钟去除沉淀,收集上清液,按照体积比为1∶100的比例添加1M MgCl2溶液,即得碱性磷酸酶(ALP)与LH单克隆抗体的偶联物,最后将收集到的碱性磷酸酶(ALP)与LH单克隆抗体的偶联物用上述酶反应物稀释液以1∶1000的体积比混合均匀,即得酶反应物。
第三步:
反应增强剂配制步骤,配制1L:
1、称取TRIS1.56g和NaCl 4.23g于1L容器中;用移液器将Proclin-300量取0.2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后,倒入上述1L容器中;
2、用量筒量取800ml纯化水于上述1L容器中,充分搅拌,直至完全溶解调PH,控制PH在7.35-7.45之间;
3、称取Mak33 0.9g于上述1L容器中;最后定容1000ml,完全溶解后,用0.2um滤器过滤。
第四步:
稀释液配制步骤,配制1L:
1、称取NaCl9.0g和BSA 60g于1L的容器中;
2、用移液器将Proclin-300量取0.5ml加10ml纯化水溶解,倒入上述1L的容器中;3、最后定容1000ml,完全溶解后,用0.2um滤器过滤,贴好标签于2-8℃冷库贮存,有效期为12个月。
第五步:
校准品和质控品的配制:
校准品浓度分别为1,3,10,50,150mIU/ml;质控品浓度分别为3、50mIU/ml。
第六步:
清洗浓缩液配制步骤,配制1L:
1、称取TRIS 12.54g和NaCl 325.6g于1L容器中;
2、称取5g Tween-20于100ml容器中加20ml水使其完全溶解后,倒入上述1L容器中;
3、用移液器将Proclin-300量取0.2ml于盛有10ml纯化水的烧杯中完全溶解后,倒入上述1L容器中;
4、用量筒量取800ml纯化水于上述1L容器中,充分搅拌,直至完全溶解;
5、调PH,控制其范围在7.35-7.45之间;
6、最后定容1000ml,完全溶解后用0.2um滤器过滤即得。
第七步:
底物溶液配制步骤,配制1L:
1、称取TRIS 2.35g、NaCl 6.41g、Na2SO3 0.002g和Proclin-300 0.2ml于1L烧杯中;
2、用量筒量取600ml纯化水于1L烧杯中,充分搅拌,直至完全溶解,调PH,控制其范围在7.95-8.05之间;
3、加入250ml Lumi-Phos 480后,用0.2um滤器过滤收集滤液,用纯化水定容至1000ml,混匀后即得。
本发明工作原理:本品为夹心法化学发光免疫分析法与磁性微粒分离技术相结合的一种检测方法。在标本、校准品和质控品中加入定量的酶标LH单抗、结合着磁性微粒的LH单克隆抗体及稳定增强剂。37℃孵育后,磁性微粒上结合的LH单克隆抗体与酶标单克隆抗体分别与LH分子的不同表位结合,形成“三明治”结构。在外加磁场中直接沉淀,不需离心即可分离。倒去上清液,清洗沉淀的复合物,然后加入酶促化学发光底物。底物在酶作用下被催化裂解,形成不稳定的激发态中间体,当激发态中间体回到基态时便发出光子,形成发光反应,即可使用发光仪检测反应的发光强度,根据标准曲线即可算出样品中的LH含量。在检测范围内,发光强度与样本中的LH浓度成正比。
本发明的主要创新之处在于:
1、本发明试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合,提供了一种接近均相的反应体系,与现有技术相比,本发明试剂盒具有更高的检测灵敏度和特异性,同时在出结果时间上相对现有技术缩短了至少10分钟,并达到了较佳的性能参数。
2、本发明公开了一种新的专用稳定增强剂以及清洗液浓缩液,使得反应过程更加稳定可靠,实验数据灵敏有效,在提高产品性能的同时,并且大大降低了产品成本;
3、试剂盒中的磁分离试剂,酶反应物,稳定增强剂,校准品、质控品,清洗液浓缩液、稀释液以及底物溶液均是该反应体系下的最优配方,给该试剂盒的使用效期及检测性能提供了有力保障。
具体实施方式
实施例1、
一、磁珠缓冲液配制操作规程:配方见表1,以配制1L为例:
1、称取TRIS 4.58g和NaCl6.81g于1L容器中,称取0.96g TWEEN-20于20ml容器中加适量水使其完全溶解后,倒入上述容器中;
2、用移液器将Proclin-300量取0.2ml于少量纯化水的烧杯中完全溶解后,倒入上述1L容器中;然后在1L容器中加入800ml纯化水,充分搅拌,使试剂完全溶解;
3、调节PH计测量其PH值;用HCl或NaOH调PH,测量其PH在7.95-8.05之间即符合要求;
4、称取BSA(牛血清白蛋白)3g倒入上述容器中;
5、最后定容至1000ml,测PH值,范围在7.95-8.05之间即符合要求,用0.2um滤器过滤;过滤完后贴好标签于2-8℃冷库贮存,磁珠缓冲液有效期为12个月;
磁珠缓冲液表1
二、磁分离试剂的制备过程
1、将1.0mg DSS(辛二酸二琥珀酰亚胺酯)溶于50ul DMSO中,即浓度为20mg/ml;取2mg抗LH单克隆抗体(天健生物制药(天津)有限公司,浓度为5.6mg/ml)溶于PH 9.5的0.1mol/LPB缓冲液中至总体积为1ml;
2、计算DSS的投入量,按照以下公式计算:(抗体质量/16000)×10×368/CDSS),其中CDSS指代DSS的物质的量浓度mol/L;
3、用移液枪吸取相应体积的DSS加入到步骤1的抗体溶液中,置室温90min;
4、将步骤3抗体溶液加入到Centricon-10浓缩管中然后放入到sigma2-16k高速冷冻离心机中在3000g的离心力下浓缩约30min至体积为0.5ml;
5、取0.5ml磁珠,磁珠浓度为0.5g/ml,所述的磁珠直径在0.9μm之间,加入5ml反应杯中,放入专用试管架,经磁铁吸附2分钟后吸取上清;
6、每次加入1.5ml PH9.5 0.1mol/L PB,混匀30秒,上架,去上清,重复操作3次;将步骤4获得的抗体溶液加入到磁珠中,混匀后室温反应4小时,保持混匀状态;
7、加入0.3ml 1mol/L的TRIS溶液37度15分钟,其中TRIS的加样量为1mg抗体加0.15mlTRIS;
8、每次加入1.5ml PH 7.2 0.1mol/L PB清洗已经标记的磁珠,混匀30秒,上架,去上清,重复操作3次;
9、用100ml磁珠保存液将磁珠转入125ml玻璃瓶,即为0.05%的LH磁分离试剂;磁珠保存液配方为0.1%BSA,0.05%吐温-20,0.02%NaN3,20%乙醇,4℃保存。
10、将步骤9获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照1∶1的比例混匀;
11、贴好标签于2-8℃冷库贮存,磁分离试剂有效期为12个月;
实施例2
一、酶反应物稀释液配制操作规程:配方见表2,以配制1L为例:
1、取Tris 6.06g、NaCl 13.0g、Zncl2 0.05g、Proclin-300 0.2ml和MgCl2 0.05g于烧瓶中;然后在烧瓶中加入800ml纯化水,充分搅拌,使试剂完全溶解;
2、用HCl或NaOH调PH,测量使PH在7.35-7.45范围内;
3、称取BSA 3g倒入上述容器中;
4、最后定容至1000ml,测PH值,范围在7.35-7.45之间即符合要求,用0.2um滤器过滤;过滤完后,贴好标签于2-8℃冷库贮存,有效期为12个月;
酶反应物稀释液表2
二、碱性磷酸酶(ALP)与抗LH单克隆抗体的偶联
1、取10mgALP加入5ml生理盐水中,加入到Centriprep YM10浓缩管中,3000RPM离心大约20分钟,浓缩至1毫升。
2、向步骤1获得浓缩液中加入0.2ml的0.1M NaIO4溶液,室温下避光搅拌20分钟,然后装入透析袋中,用1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析,4℃过夜,收集保留液;
3、向步骤2获得保留液中加入0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液,使PH升高到9.0~9.5,然后立即加入2.5mg抗LH单克隆抗体(天健生物制药(天津)有限公司,浓度为5.6mg/ml),室温避光轻轻搅拌2小时,再加入0.1ml的4mg/ml NaBH4(硼氢化钠)溶液,混匀,再置4℃下2小时;
4、将上述液装入透析袋中,对0.15M PH7.4PBS透析,4℃过夜,收集保留液;
5、向步骤4获得保留液中逐滴加入等体积饱和硫酸铵,置4℃1小时,然后3000rpm离心半小时,弃上清,沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次,最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中;
6、将步骤5获得的溶液装入透析袋中,用0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析约5个小时去除铵离子,收集保留液后10,000rpm离心30分钟去除沉淀,收集上清液,按照体积比为1∶100的比例添加1M Mgcl2溶液,即得碱性磷酸酶(ALP)与LH单克隆抗体的偶联物,最后将收集到的碱性磷酸酶(ALP)与LH单克隆抗体的偶联物用上述酶反应物稀释液以1∶1000的体积比混合均匀,即得酶反应物。
实施例3
反应增强剂配制操作规程:配方见(表3),以配制1L为例:
1、称取TRIS(三羟甲基氨基甲烷,分子式:(HOCH2)3CNH2)1.56g和NaCl 4.23g于1L容器中;用移液器将Proclin-300量取0.2ml于少量纯化水的烧杯中完全溶解后,倒入上述1L容器中;
2、用量筒量取800ml纯化水于1L容器中,充分搅拌,直至完全溶解;用HCL或NaOH调PH,测量其范围在7.35-7.45之间;
3、称取Mak33 0.9g于上述1L容器中;
4、最后定容1000ml,完全溶解后,测PH值,范围在7.35-7.45之间即符合要求,用0.2um滤器过滤;过滤完后,贴好标签于2-8℃冷库贮存,有效期为12个月;
反应增强剂的配制(表3)
实施例4
稀释液配方见(表4),以配制1L为例:
1、称取NaCl9.0g和BSA 60g于1L的容器中;
2、用移液器将Proclin-300量取0.5ml加10ml纯化水溶解,倒入上述1L的容器中;
3、最后定容1000ml,完全溶解后,用0.2um滤器过滤,贴好标签于2-8℃冷库贮存,有效期为12个月。
稀释液的配制(表4)
实施例5
校准品和质控品的配制:
1、最高点:最高浓度点为X,目标点浓度为A,B,C,D,E,F,配制V体积的溶液时,需加入原料的体积为分别为:表5
浓度 | 加入校准品稀释液体积 | 加入X体积 |
A | V-A*V/X | A*V/X |
B | V-B*V/X | B*V/X |
C | V-C*V/X | C*V/X |
D | V-D*V/X | D*V/X |
E | V-E*V/X | E*V/X |
OF | V-F*V/X | F*V/X |
2、促黄体生成激素(LH)定量测定试剂盒LH校准品原料(购于PPS公司,浓度为1000U/ml)用稀释液(具体配方见实施例4)配制成浓度点为1,3,10,50,150mIU/ml;质控品用稀释液配制的浓度点为3、50mIU/ml。
3、完全溶解后,贴好标签于2-8℃冷库贮存,有效期为12个月。
实施例6:
清洗浓缩液配制操作规程:配方见(表6),以配制1L为例:
1、称取TRIS 12.54g和NaCl 325.6g于1L容器中;
2、称取5g Tween-20于100ml容器中加适量水使其完全溶解后,倒入上述容器中;
3、用移液器将Proclin-300量取0.2ml于盛有10ml纯化水的烧杯中完全溶解后,倒入上述1L容器中;
4、用量筒量取800ml纯化水于上述1L容器中,充分搅拌,直至完全溶解;
5、用HCL或NaOH调PH,测量其范围在7.35-7.45之间;
6、最后定容1000ml,测PH值,范围在7.35-7.45之间即符合要求,完全溶解后用0.2um滤器过滤;过滤完后,贴好标签于2-8℃冷库贮存,有效期为12个月;
清洗浓缩液的配制(表6)
实施例7
底物溶液配制操作规程:配方见(表7),以配制1L为例:
1、称取TRIS 2.35g、NaCl 6.41g、Na2SO3 0.002g和Proclin-300 0.2ml于1L烧杯中;
2、用量筒量取600ml纯化水于1L烧杯中,充分搅拌,直至完全溶解;用HCl或NaOH调PH,测量其范围在7.95-8.05之间;
3、加入250ml Lumi-Phos 480后,用0.2um滤器过滤收集滤液,用纯化水定容至1000ml,混匀后,贴好标签于2-8℃冷库贮存,有效期为12个月。
化学发光底物的配制(表7)
本发明的测试方法如下
1、加30μl LH校准品、质控品、待测标本至对应试管底部。
2、加30μl酶反应物至每一试管中。
3、加30μl反应增强剂至每一试管中。
4、加30μl磁分离试剂至每一试管中。
5、用塑料薄膜覆盖试管,多管混匀器轻轻振荡试管架30s后,置37℃水浴30分钟。
6、试管连架放至磁分离器上,确保每支试管都与分离器表面接触,沉淀2分钟。缓慢的倒转分离器倒出上清液,把倒转的试管连同分离器一起放在滤纸上,用力拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴。
7、清洗液浓缩液用纯化水稀释20倍后,加200μl稀释后的清洗液至每一试管中,置多管混匀器上轻轻振荡混匀30s。加样时应避免加样力度过大而导致磁珠溅出。混匀要彻底。
8、重复步骤6、7、6一遍。
9、加200μl底物溶液至试管中混匀3秒,迅速用准备好的发光检测仪进行检测。
10、如遇到高值HOOK样本,为了避免出现高值HOOK效应,建议临床医师根据其余测试指标选择合适的稀释倍数对样品进行稀释。
临床试验:
1、检测数据
本方法检测正常男性和正常***的女性血清标本,血清样本体检结果均无肝、脑、肾、消化道疾病,半年内无输血和大手术史,妇女不在妊娠期和哺乳期。将测值进行统计学分析,平均值和参考范围如下:
本数据仅供参考,不同地区、不同个体以及采用不同方法进行检测,所测得的LH水平也会有所不同,建议各实验室建立自己的正常值范围。不可仅凭本方法得出的LH值作出诊断,应结合临床其他资料分析结果,包括病人的具体情况和治疗状况。
2、本发明试剂盒性能指标
分析灵敏度定义为:对20次零校准品的测定,取其2倍的平均偏差,其在标准曲线上所对应的浓度即为分析灵敏度;
分析灵敏度:0.15mIU/ml;精密性:批内变异CV%≤10.0%;批间变异CV%≤15.0%;线性系数:r≥0.9900;线性范围:0.15~150mIU/ml;特异性:测定高浓度的交叉反应物质,结果如下:
Claims (5)
1.一种促黄体生成激素LH的定量测定试剂盒,其特征在于,该试剂盒包含LH磁分离试剂,酶反应物,反应增强剂,稀释液,LH校准品、LH质控品,清洗液浓缩液以及底物溶液。
2.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述的LH磁分离试剂含有标记有抗LH单克隆抗体的磁性微球;
所述的酶反应物是含有碱性磷酸酶标记的抗LH单克隆抗体;
所述的反应增强剂是含有Tris的缓冲液;
所述稀释液是含有BSA的溶液;
所述的校准品及质控品是含有一定量的LH抗原的BSA溶液;
所述清洗液浓缩液是含有TWEEN-20和Proclin-300的缓冲液;
所述的底物溶液为酶促化学发光底物溶液。
3.如权利要求1-2任其一所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒中各组分按照如下制备方法制得:
一、磁分离试剂的制备过程
一)、磁珠缓冲液配制操作步骤,配制1L:
1、称取TRIS 4.58g和NaCl6.81g于1L容器中,称取0.96g TWEEN-20于20ml容器中加适量水使其完全溶解后,倒入上述1L容器中;
2、用移液器将Proclin-300量取0.2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后,倒入上述1L容器中,然后在上述1L容器中加入800ml纯化水,充分搅拌;
3、调节PH,控制PH在7.95-8.05之间;
4、称取BSA 3g倒入上述1L容器中;
5、最后定容至1000ml,用0.2um滤器过滤即得;
二)、磁分离试剂的制备过程
1、将1.0mg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50ul DMSO中,取2mg抗LH单克隆抗体溶于PH 9.5的0.1mol/L PB缓冲液中至总体积为1ml;
2、用移液枪吸取上述辛二酸二琥珀酰亚胺酯加入到步骤1的抗体溶液中,置室温90min;
3、将步骤2的溶液加入到浓缩管中,然后放入到高速冷冻离心机中在3000g下离心30min浓缩至0.5ml;
4、取0.5ml磁珠,加入5ml反应杯中,经磁铁吸附2分钟后吸取上清,然后加入1.5mlPH9.50.1mol/L PB,混匀30秒,然后加入步骤3获得的抗体溶液,混匀后室温反应4小时;
5、加入0.3ml 1mol/L的TRIS溶液37℃15分钟,然后加入1.5ml PH 7.2 0.1mol/L PB清洗已经标记的磁珠,混匀30秒;
6、用100ml磁珠保存液将磁珠转入玻璃瓶;
7、将步骤6获得的溶液与上述磁珠缓冲液按照1∶1的体积比例混匀,即得权利要求1或2所述试剂盒中的磁分离试剂;
二、酶反应物的制备过程
一)、酶反应物稀释液配制操作步骤,配制1L:
1、取Tris 6.06g、NaCl 13.0g、Zncl2 0.05g、Proclin-300 0.2ml和MgCl2 0.05g于烧瓶中,然后在烧瓶中加入800ml纯化水,充分搅拌,使试剂完全溶解;
2、调PH,控制PH在7.35-7.45范围内;
3、称取BSA 3g倒入上述烧杯中;
4、最后定容至1000ml,用0.2um滤器过滤即得;
二)、碱性磷酸酶ALP与抗LH单克隆抗体的偶联
1、取10mgALP加入5ml生理盐水中,加入到浓缩管中,3000RPM离心20分钟,浓缩至1毫升;
2、向步骤1获得浓缩液中加入0.2ml的0.1M NaIO4溶液,室温下避光搅拌20分钟,然后装入透析袋中,用1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析,4℃过夜,收集保留液;
3、向步骤2获得保留液中加入0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液,使PH升高到9.0,然后立即加入2.5mg抗LH单克隆抗体,搅拌2小时,再加入0.1ml的4mg/ml NaBH4溶液,混匀,置4℃下2小时;
4、将上述溶液装入透析袋中,用0.15M PH7.4PBS透析,4℃过夜,收集保留液;
5、向步骤4获得保留液中逐滴加入等体积饱和硫酸铵,置4℃1小时,然后3000rpm离心半小时,弃上清,沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次,最后沉淀物溶于20ml的0.15M PH7.4的PBS中;
6、将步骤5获得的溶液装入透析袋中,用0.15M PH7.4的PB缓冲液透析5个小时去除铵离子,收集保留液后10,000rpm离心30分钟去除沉淀,收集上清液,按照体积比为1∶100的比例添加1M MgCl2溶液,即得碱性磷酸酶ALP与抗LH单克隆抗体的偶联物;
将收集到的碱性磷酸酶ALP与抗LH单克隆抗体的偶联物用上述步骤一)获得的酶反应物稀释液以1∶1000的体积比混合均匀,即得酶反应物。
三、反应增强剂的制备过程,配制1L:
1、取TRIS1.56g和NaCl 4.23g于1L容器中,取0.2ml Proclin-300于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后,倒入上述1L容器中;
2、取800ml纯化水于上述1L容器中,充分搅拌直至完全溶解,调PH在7.35-7.45之间;
3、称取Mak33 0.9g于上述1L容器中;最后定容1000ml,完全溶解后,用0.2um滤器过滤即得;
四、稀释液的制备过程,配制1L:
1、称取NaCl9.0g和BSA 60g于1L的容器中;
2、取0.5ml Proclin-300加10ml纯化水溶解,倒入上述1L的容器中;
3、最后定容1000ml,完全溶解后,用0.2um滤器过滤即得;
五、LH校准品和LH质控品的配制:
LH校准品中LH抗原的浓度分别为1,3,10,50,150mIU/ml;LH质控品中LH抗原的浓度分别为3、50mIU/ml;
六、清洗液浓缩液的制备过程,配制1L:
1、取TRIS 12.54g和NaCl 325.6g于1L容器中;
2、取5g Tween-20于100ml容器中加20ml水使其完全溶解后,倒入上述1L容器中;
3、取0.2ml Proclin-300于盛有10ml纯化水的烧杯中完全溶解后,倒入上述1L容器中;
4、取800ml纯化水于上述1L容器中,充分搅拌,直至完全溶解;
5、调PH,控制其范围在7.35-7.45之间;
6、最后定容1000ml,完全溶解后用0.2um滤器过滤即得;
七、底物溶液的制备过程,配制1L:
1、取TRIS 2.35g、NaCl 6.41g、Na2SO3 0.002g和Proclin-300 0.2ml于1L烧杯中;
2、取600ml纯化水于1L烧杯中,充分搅拌直至完全溶解,调PH在7.95-8.05之间;
3、加入250ml Lumi-Phos 480,用0.2um滤器过滤收集滤液,用纯化水定容至1000ml,混匀后即得。
4.如权利要求1-3任其一所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒的使用方法如下:
1)、加30μl LH校准品、LH质控品、待测标本至对应试管底部;
2)、加30μl酶反应物至每一试管中;
3)、加30μl反应增强剂至每一试管中;
4)、加30μl磁分离试剂至每一试管中;
5)、用塑料薄膜覆盖试管,多管混匀器轻轻振荡试管架30s后,置37℃水浴30分钟;
6)、然后放至磁分离器上,确保每支试管都与分离器表面接触,沉淀2分钟,倒转分离器倒出上清液;
7)、清洗液浓缩液用纯化水稀释20倍后,加200μl稀释后的清洗液至每一试管中,置多管混匀器上轻轻振荡混匀30s;
8)、加200μl底物溶液至试管中混匀3秒,发光检测仪检测。
5.如权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述待测标本为高值HOOK样本时,根据需要使用稀释液对标本进行稀释。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201110257444XA CN102419374A (zh) | 2011-08-31 | 2011-08-31 | 促黄体生成激素(lh)定量测定试剂盒及其检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201110257444XA CN102419374A (zh) | 2011-08-31 | 2011-08-31 | 促黄体生成激素(lh)定量测定试剂盒及其检测方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102419374A true CN102419374A (zh) | 2012-04-18 |
Family
ID=45943883
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201110257444XA Pending CN102419374A (zh) | 2011-08-31 | 2011-08-31 | 促黄体生成激素(lh)定量测定试剂盒及其检测方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN102419374A (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104569441A (zh) * | 2015-01-19 | 2015-04-29 | 成都大熊猫繁育研究基地 | 大熊猫尿液促黄体素的酶联检测方法及其应用 |
CN105445256A (zh) * | 2014-09-02 | 2016-03-30 | 江苏泽成生物技术有限公司 | 促***lh定量测定试剂盒及其制备方法与检测方法 |
CN110988367A (zh) * | 2019-11-18 | 2020-04-10 | 迈克生物股份有限公司 | 一种贮存剂、用于检测lh的校准品及检测试剂盒 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101377490A (zh) * | 2007-08-30 | 2009-03-04 | 北京科美东雅生物技术有限公司 | 用于检测疾病相关标志物的磁微粒分离化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法 |
CN101614742A (zh) * | 2009-07-23 | 2009-12-30 | 清华大学 | 促黄体生成激素的磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒 |
-
2011
- 2011-08-31 CN CN201110257444XA patent/CN102419374A/zh active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101377490A (zh) * | 2007-08-30 | 2009-03-04 | 北京科美东雅生物技术有限公司 | 用于检测疾病相关标志物的磁微粒分离化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法 |
CN101614742A (zh) * | 2009-07-23 | 2009-12-30 | 清华大学 | 促黄体生成激素的磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
《细胞与分子免疫学杂志》 20060518 刘振世等 人绒毛膜***游离beta亚单位磁分离酶联免疫方法的建立 第22卷, 第3期 * |
刘振世等: "人绒毛膜***游离β亚单位磁分离酶联免疫方法的建立", 《细胞与分子免疫学杂志》, vol. 22, no. 3, 18 May 2006 (2006-05-18) * |
章尧等: "血清FSH、L H 磁微粒分离酶联免疫法检测评价", 《蚌埠医学院学报》, vol. 22, no. 6, 15 November 1997 (1997-11-15) * |
范林霄: "磁分离酶联免疫法测定***患者血清性激素的结果分析", 《临床医药实践杂志》, vol. 12, no. 6, 30 June 2003 (2003-06-30) * |
郑铁生等: "磁分离酶联免疫测定男性生殖激素方法性能评价", 《江苏大学学报(医学版)》, vol. 12, no. 4, 31 August 2002 (2002-08-31) * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105445256A (zh) * | 2014-09-02 | 2016-03-30 | 江苏泽成生物技术有限公司 | 促***lh定量测定试剂盒及其制备方法与检测方法 |
CN104569441A (zh) * | 2015-01-19 | 2015-04-29 | 成都大熊猫繁育研究基地 | 大熊猫尿液促黄体素的酶联检测方法及其应用 |
CN104569441B (zh) * | 2015-01-19 | 2016-02-03 | 成都大熊猫繁育研究基地 | 大熊猫尿液促黄体素的酶联检测方法及其应用 |
CN110988367A (zh) * | 2019-11-18 | 2020-04-10 | 迈克生物股份有限公司 | 一种贮存剂、用于检测lh的校准品及检测试剂盒 |
CN110988367B (zh) * | 2019-11-18 | 2024-02-09 | 迈克生物股份有限公司 | 一种贮存剂、用于检测lh的校准品及检测试剂盒 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102435752B (zh) | 人的肌红蛋白(Myoglobin)定量测定试剂盒 | |
CN102435738A (zh) | 肌酸激酶同工酶(ck-mb)定量测定试剂盒及其检测方法 | |
CN102426246A (zh) | 人肌钙蛋白I(Troponin I)定量测定试剂盒及其检测方法 | |
CN102323419B (zh) | 地高辛(Digoxin)定量测定试剂盒及其检测方法 | |
CN102323418A (zh) | B型利钠肽原前体(proBNP)定量测定试剂盒及其检测方法 | |
CN102426245A (zh) | 细胞角质蛋白19片段(cyfra21-1)定量测定试剂盒及其检测方法 | |
CN102288766B (zh) | 糖类抗原15-3(ca15-3)定量测定试剂盒及其检测方法 | |
CN102426256A (zh) | 糖类抗原19-9(ca19-9)定量测定试剂盒及其检测方法 | |
CN102426236A (zh) | 胃蛋白酶原ii(pgii)定量测定试剂盒及其检测方法 | |
CN102426255A (zh) | 游离甲状腺素(ft4)定量测定试剂盒及其检测方法 | |
CN102435741A (zh) | 人高敏c反应蛋白(hs-crp)定量测定试剂盒及其检测方法 | |
CN102426249A (zh) | 促甲状腺激素(tsh)定量测定试剂盒及其检测方法 | |
CN102288767B (zh) | 糖类抗原72-4(ca72-4)定量测定试剂盒及其检测方法 | |
CN102435755A (zh) | 总三碘甲状腺原氨酸(tt3)定量测定试剂盒及其检测方法 | |
CN102323417B (zh) | 胃蛋白酶原i(pgi)定量测定试剂盒及其检测方法 | |
CN102426248A (zh) | 促卵泡生成激素(fsh)定量测定试剂盒及其检测方法 | |
CN105510593A (zh) | 一种甲状腺球蛋白(tg)测试试剂盒及其测试方法 | |
CN102435751B (zh) | C肽(c-p)定量测定试剂盒 | |
CN102360014A (zh) | 甲胎蛋白(afp)定量测定试剂盒及其检测方法 | |
CN102435739A (zh) | 糖类抗原242(ca242)定量测定试剂盒及其检测方法 | |
CN102323252A (zh) | 糖类抗原125(ca125)定量测定试剂盒及其检测方法 | |
CN102331502B (zh) | 人s100蛋白(s-100)定量测定试剂盒 | |
CN102338804A (zh) | 游离人绒毛膜***β亚单位(F-β-hCG)定量测定试剂盒及其检测方法 | |
CN102419374A (zh) | 促黄体生成激素(lh)定量测定试剂盒及其检测方法 | |
CN102419372A (zh) | 神经元特异性烯醇化酶(nse)定量测定试剂盒及其检测方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
AD01 | Patent right deemed abandoned |
Effective date of abandoning: 20120418 |
|
C20 | Patent right or utility model deemed to be abandoned or is abandoned |