CN102413839A

CN102413839A - 人源化抗cd19抗体制剂

Info

Publication number: CN102413839A
Application number: CN2010800197310A
Authority: CN
Inventors: M·莎玛; A·莎赫
Original assignee: MedImmune LLC
Current assignee: MedImmune LLC
Priority date: 2009-03-06
Filing date: 2010-03-08
Publication date: 2012-04-11
Also published as: CA2754266A1; KR20110125664A; WO2010102276A3; EP2403532A4; EP2403532A2; JP2012519712A; RU2011140486A; ZA201106480B; WO2010102276A2; US20120148576A1; MX2011009312A; BRPI1013237A2; AU2010221099A1

Abstract

本发明提供了包含嵌合和人源化形式的抗CD 19小鼠单克隆抗体的稳定液体制剂，所述抗CD 19小鼠单克隆抗体可介导ADCC、CDC和/或凋亡以用于治疗B细胞疾病和病症。

Description

人源化抗CD19抗体制剂

【序列表】

本申请包含已通过EFS-Web提交的并且在此通过引用整体并入本文的序列表。于2010年3月5日创建的所述ASCII拷贝被命名为00058000.txt，并且大小为79,932字节。

【1.优先权资料】

本申请要求于2009年3月6日提交的美国专利申请No.61/158,153的优先权，其通过引用整体并入本文。

【2.序言】

本发明涉及特异性结合人CD 19抗原并且可介导下述中的一种或多种的人、人源化或嵌合的抗体的液体制剂：补体依赖性细胞介导的细胞毒作用(CDC)、抗原依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和程序性细胞死亡(凋亡)。所述制剂表现出稳定性、低至不可检测水平的抗体片段化、低至不可检测水平的聚集以及抗体生物学活性损失很少至不损失，即使经长时间储存。

本发明还涉及利用包含结合人CD 19抗原的治疗性人、人源化或嵌合的抗CD 19抗体的液体制剂治疗人受治疗者的B细胞病症或疾病(包括B细胞恶性肿瘤)的方法。本发明涉及利用包含结合人CD 19抗原的治疗性人、人源化或嵌合的抗CD 19抗体的液体制剂治疗和预防自身免疫性疾病，以及治疗和预防人移植物接受者的移植物抗宿主病(GVHD)、移植排斥和移植后淋巴增殖性病症的方法。

【3.背景】

B细胞在其分化和增殖期间表达各种细胞表面分子。例子包括 CDlO、CD 19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD72、CD74、CD75、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85和CD86白细胞表面标记物。这些标记物通常被认为是治疗B细胞病症或疾病例如B细胞恶性肿瘤、自身免疫性疾病和移植排斥的治疗靶点。已开发了特异性结合它们的抗体，并且一些抗体经测试成为治疗疾病和病症的治疗剂。

例如，针对对成熟B细胞及其恶性对应物特异的CD20细胞表面分子的基于嵌合或放射标记的单克隆抗体(mAb)的疗法已显示能在体内治疗非霍奇金淋巴瘤(Tedder等，Immunol.Today15：450-454(1994)；Press等，Hematology：221-240(2001)；Kaminski等，N.Engl.J.Med.329：459-465(1993)；Weiner，Semin.Oncol.26：43-51(1999)；Onrust等，Drugs 58：79-88(1999)；McLaughlin等，Oncology 12：1763-1769(1998)；Reff等，Blood 83：435-445(1994)；Maloney等，Blood 90：2188-2195(1997)；Malone等，J.Clin.Oncol.15：3266-3274(1997)；Anderson等，Biochem.Soc.Transac.25：705-708(1997))。也已发现，抗CD20单克隆抗体疗法在减轻类风湿性关节炎、***性红斑狼疮、特发性血小板减少性紫癜和溶血性贫血以及其它免疫介导性疾病表现的方面部分有效(Silverman等，Arthritis Rheum.48：1484-1492(2002)；Edwards等，Rheumatology 40：1-7(2001)；De Vita等，Arthritis Rheumatism 46：2029-2033(2002)；Leandro等，Ann.Rheum.Dis.61：883-888(2002)；Leandro等，ArthritisRheum.46：2673-2677(2001))。抗CD20(IgG1)抗体利妥昔单抗(RITUXAN)已成功用于治疗某些疾病例如成人免疫血小板减少性紫癜、类风湿性关节炎和自身免疫溶血性贫血(Cured等，WO 00/67796)。尽管这些疗法有效，但在B细胞不表达CD20或低水平表达CD20(例如，前B细胞或未成熟B细胞)或经过CD20免疫疗法后表达缺失(Smith等，Oncogene 22：7359-7368(2003))的情况下，B细胞消耗的有效性降低。

本领域已经描述了鼠单克隆抗CD 19抗体，例如HD37(IgG1， κ)(DAKO North America公司，Carpinteria，CA)、BU12(Callard等，J.Immunology，148(10)：2983-7(1992))、4G7(IgG1)(Meeker等，Hybridoma，3(4)：305-20(1984Winter))、J4.119(Beckman Coulter，Krefeld，Germany)、B43(PharMingen，San Diego，CA)、SJ25C1(BDPharMingen，San Diego，CA)、FMC63(IgG2a)(Zola等，Immunol.Cell.Biol.69(PT6)：411-22(1991)；Nicholson等，MoI.Immunol.，34：1157-1165(1997)；Pietersz等，Cancer Immunol.Immunotherapy，41：53-60(1995))、89B(B4)(IgG1)(Beckman Coulter，Miami，FL；Nadler等，J.Immunol.，131：244-250(1983))和/或HD237(IgG2b)(Fourth International Workshop on human LeukocyteDifferentiation Antigens，Vienna，Austria，1989；和ezzutto等，J.Immunol.，138(9)：2793-2799(1987))。在B细胞病症和疾病的各种动物模型中，抗CD 19抗体或其偶联物也显示出治疗潜能(Falvell等，Br.J.Hematol.134(2)：157-70(2006)；Vallera等，Clin.Cancer Res.11(21)：7920-8(2005)；Yazawa等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(42)：15178-83(2005))。

具体来说，已经描述过人源化CD 19抗体在治疗B细胞疾病例如淋巴瘤、白血病或自身免疫性疾病中的应用(参见，Hansen美国专利申请公布No.US2005/0070693)。

尽管近年来癌症治疗取得很多进展，但B细胞恶性肿瘤，例如非霍奇金淋巴瘤的B细胞亚型和慢性淋巴细胞性白血病仍然是主要的癌症相关死亡原因。因此，非常需要进一步改进的治疗方案来治疗B细胞恶性肿瘤。

目前已知细胞(T细胞介导的)和体液(抗体，B细胞介导的)免疫在移植物排斥中起到重要的作用。虽然已经充分了解移植物排斥中T细胞介导的免疫的重要性，但是最近才逐步了解急性和慢性排斥中体液免疫的重要作用。因此，治疗和预防移植物排斥中的大部分进展是从靶向T细胞活化的治疗剂开始的。FDA批准用于治疗移植物排斥的第一种治疗性单克隆抗体是鼠单克隆抗体ORTHOCLONE-OKT3^TM(莫罗单抗CD3)，其针对T细胞的CD3受体。OKT3与许多其它抗淋巴细胞导向抗体相连接，这些抗淋巴细胞导向抗体包括单克隆抗CD52CAMPATH^TM抗体、CAMPATH-IG、CAMPATH-1H(阿仑单抗)和CAMPATH-IM)以及多克隆抗-胸腺细胞抗体制备(称为抗-胸腺细胞球蛋白，或“ATG”，也称为“即复宁(thymoglobin)”或“兔抗胸腺细胞球蛋白(thymoglobulin)”)。批准用于预防移植排斥的其它T细胞抗体包括嵌合单克隆抗体SIMULECT^TM(巴利昔单抗)和人源化单克隆抗体ZENAP AX^TM(达利珠单抗)，它们均靶向活化T细胞的高亲和IL-2受体。

最初认为，移植物排斥中体液免疫的重要性仅限于超急性排斥，其中移植物接受者在移植前具有抗-供体HLA抗体，导致在没有给予有效的抗体抑制治疗方案时移植物被快速破坏。近年来，越来越多的证据表明：体液免疫也是介导急性和慢性排斥的重要因素。例如，临床观察证明，能够产生I类或II类抗-HLA同种抗体(也称为“抗-MHC同种抗体”)的患者中的移植物存活率比无法产生这类抗体的患者中的移植物存活率低。临床和实验数据也表明，其它供体特异性的同种抗体和自身抗体是重要的排斥介导物。最近支持供体特异性抗体在同种移植物排斥中的作用的综述可参见Rifle等，Transplantation，79：S14-S18(2005)。因此，由于近年来对体液免疫在急性和慢性移植物排斥中的作用的理解，与靶向细胞免疫的治疗剂和方案相比，目前对靶向体液免疫的治疗剂和方案的开发不足。因此，本领域需要治疗和预防人移植物接受者的移植物排斥，即移植物抗宿主病(GVHD)、体液排斥和移植后淋巴增殖性疾病的改进的试剂和方法。

自身免疫性疾病整体而言发病率和残疾率都很高。根据1965至1995收集的发病率数据，估计在接下来的五年中约有120万新生自身免疫疾病患者。Jacobsen等(Clin Immunol.Immunopathol.84：223(1997))对超过130篇发表的研究作出评价并估计，在1996年美国有850万人(占人群的3.2％)患有这些研究中检测的24种自身免疫性疾病中的至少一种。鉴于自身免疫性疾病对公众健康的显著影响，需要安全有效的治疗来解决这些疾病的负担。因此，本领域需要治疗自身免疫性疾病的改进的试剂和方法。

现有液体抗体制剂具有短的半衰期并且可能因为储存期间化学和物理不稳定性而损失抗体的生物学活性。化学不稳定性可能因为脱酰胺、外消旋、水解、氧化、β消除或二硫键交换造成，物理不稳定性可能因为抗体变性、聚集、沉淀或吸附造成。其中，已知聚集、脱酰胺和氧化是抗体降解的最常见原因(Wang等，1988，J.of ParenteralScience & Technology 42(Suppl)：S4-S26；Cleland等，1993，CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 10(4)：307-377)。因此，对抗体的稳定液体制剂，尤其是稳定的液体抗-人CD 19抗体存在需求。

【4.概述】

本发明提供了包含特异性结合人CD 19抗原的嵌合、人或人源化抗体的无菌、稳定含水制剂。在一个实施方案中，本发明提供了包含嵌合和人源化形式的抗CD 19小鼠单克隆抗体HB 12A和HB 12B的制剂。在另一个实施方案中，本发明提供了包含于2007年9月7日提交的美国专利申请11/852,106中描述的抗CD 19抗体的制剂，该公开内容为了所有目的整体并入本文。在又一个实施方案中，本发明提供了包含可以介导下述中的一种或多种：补体依赖性细胞介导的细胞毒作用(CDC)、抗原依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和程序性细胞死亡(凋亡)并且具有增强的效应功能的本发明抗CD 19抗体的制剂。在另一个实施方案中，本发明的制剂包含的本发明的抗CD 19抗体包含具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不与所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖结合。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含的抗CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ IDNO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不与所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖结合。

本发明提供了稳定嵌合、人或人源化本发明的抗CD 19抗体的方法。

本发明还涉及制备包含特异性结合人CD 19抗原的本发明的嵌合、人或人源化抗体的无菌、稳定含水制剂的方法。

本发明还涉及利用液体制剂治疗人受治疗者的B细胞病症或疾病(包括B细胞恶性肿瘤)的方法，所述方法包括结合人CD 19抗原的本发明的治疗性人、人源化或嵌合的抗CD 19抗体。本发明涉及利用液体制剂治疗和预防自身免疫性疾病以及治疗和预防人移植物接受者的移植物抗宿主病(GVHD)、移植排斥和移植后淋巴增殖性病症的方法，所述方法包括结合人CD 19抗原的本发明的治疗性人、人源化或嵌合的抗CD 19抗体。

本发明涉及结合人CD 19抗原的人、人源化或嵌合的抗CD 19抗体，以及包含那些抗体的组合物。在一个实施方案中，本发明提供了嵌合和人源化形式的抗CD 19小鼠单克隆抗体HB12A和HB12B。

在另一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体包含HB12A(克隆B410F12-2-A6-C2于2005年2月11日保藏于美国典型培养物保藏中心(“ATCC”)，ATCC保利保藏号：PTA-6580)或HB12B(克隆B43H12-3-B2-B6于2005年2月11日保藏于美国典型培养物保藏中心(“ATCC”)，ATCC保利保藏号：PTA-6581)的CDR中的一个、两个、三个、四个、五个或所有六个。

根据Kabat确定的HB12A重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列(参见，Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD(1991)分别被鉴定为SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10。根据Kabat定义的HB12A的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别被鉴定为SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16。

根据Kabat确定的HB12B重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别被鉴定为SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24和SEQ IDNO：26。根据Kabat定义的HB12B的轻链可变区的CDR1、CDR2和 CDR3的氨基酸序列分别被鉴定为SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：32。

在一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体包含具有表1(见下)所列的CDR的氨基酸序列的一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。

在一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体可以包含一个或多个HB 12A或HB 12B的构架区。在一个实施方案中，本发明的抗体还可包含人抗体(例如，人种系抗体序列例如VH3-72、JH4、Vk AlO或Jk4)的重链和/或轻链构架(FW)区，其中所述人构架区可以包含一个或多个突变，其中人FW残基被更换为亲代小鼠(如HB 12A或HB 12B)重链或轻链中出现的对应残基。

在一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体可以包含具有表1(同上)所列CDR氨基酸序列的一个或多个CDR，并且还可包含HB12B-(3-72/JH4)的VH区(SEQ ID NO：34)的一个或多个重链构架(FW)区。在另一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体包含具有表1(同上)所列CDR氨基酸序列的一个或多个CDR，并且还包含称为HB12B-(3-72/JH4)的VH区(SEQ ID NO：34)的一个或多个重链构架(FW)区。在一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体可以包含具有表1(同上)所列CDR氨基酸序列的一个或多个CDR，还可包含称为HB12B-(A10-Jk4)的VK区(SEQ ID NO：52)的一个或多个轻链构架(FW)区。在一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体包含具有表1(同上)所列CDR氨基酸序列的一个或多个CDR，并且还包含称为HB12B-(A10-Jk4)的VK区(SEQ ID NO：52)的一个或多个轻链构架(FW)区。在另一个实施方案中，本文所述的抗CD 19抗体可以包含具有表1(同上)所列CDR氨基酸序列的一个或多个CDR、称为HB12B-(A10-Jk4)的VK区的一个或多个轻链构架区以及称为HB12B-(3-72/JH4)的VH区的一个或多个重链构架区。在又一个实施方案中，本文所述的抗CD 19抗体包含具有表1(同上)所列CDR氨基酸序列的一个或多个CDR、称为HB12B-(A10-Jk4)的VK区的一个或多个轻链构架区以及称为HB 12B-(3-72/JH4)的VH区的一个或多个重链构架区。

例如，在一个实施方案中，本发明的人源化抗CD 19抗体可以包含含有四个构架区FW1、FW2、FW3和FW4的重链可变区，其中FW1包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列，FW2包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列，FW3包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列，以及FW4包含SEQID NO：42的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明的人源化抗CD19抗体包含含有四个构架区FW1、FW2、FW3和FW4的重链可变区，其中FW1包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列，FW2包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列，FW3包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列，以及FW4包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列。

此外，本发明的人源化抗CD 19单克隆抗体可以包含含有四个构架区FW1、FW2、FW3和FW4的轻链可变区，其中FW1包含SEQ IDNO：54的氨基酸序列；其中FW2包含选自SEQ ID NO：56、SEQ IDNO：64和SEQ ID NO：72的氨基酸序列的那些；其中FW3包含选自SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：66的氨基酸序列的那些；以及其中FW4包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列的那些。在一个实施方案中，本发明的人源化抗CD 19单克隆抗体包含含有四个构架区FW1、FW2、FW3和FW4的轻链可变区，其中FW1包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列；其中FW2包含选自SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：64和SEQ IDNO：72的氨基酸序列的那些；其中FW3包含选自SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：66的氨基酸序列的那些；以及其中FW4包含SEQ IDNO：60的氨基酸序列的那些。

在一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体可以包含含有SEQ IDNO.：237的氨基酸序列的VH或含有SEQ ID NO.：238的氨基酸序列的VL，其中所述抗体结合人CD 19抗原。在另一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体包含含有SEQ ID NO.：237的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO.：238的氨基酸序列的VL。

在具体的实施方案中，本发明的抗CD 19抗体可以包含选自下组的轻链可变区：HB12B VK(SEQ ID NO：20)、HB 12B-(A10-Jk4)(SEQID NO：52)、HB12B-364987(SEQ ID NO：62)、HB12B-3649(SEQ IDNO：68)、HB12B-36(SEQ ID NO：70)、HB12A VK(SEQ ID NO：4)、7E12VK(SEQ ID NO：110)、14H5 VK(SEQ ID NO：111)、15D1 VK(SEQ IDNO：112)、16C9 VK(SEQ ID NO：113)、3C3 VK(SEQ ID NO：193)、3E5VK(SEQ ID NO：194)、3D4 VK(SEQ ID NO：195)、3F1 VK(SEQ IDNO：196)、5B5 VK(SEQ ID NO：197)、6F7 VK(SEQ ID NO：198)、1C11VK(SEQ ID NO：199)、2B11 VK(SEQ ID NO：200)、2D10 VK(SEQ IDNO：201)、5C11 VK(SEQ ID NO：202)、5D4 VK(SEQ ID NO：203)、6C11VK(SEQ ID NO：204)、9G7 VK(SEQ ID NO：205)、1H4 VK(SEQ IDNO：206)和5C4 VK(SEQ ID NO：207)。

在特定的实施方案中，本发明还涉及包含选自下组的重链可变区的抗CD 19抗体：HB12B VH(SEQ ID NO：18)、HB12B-(3-72/JH4)(SEQ ID NO：34)、HB12A VH(SEQ ID NO：2)、7E12VH(SEQ ID NO：102)、14H5 VH(SEQ ID NO：103)、15D1 VH(SEQ IDNO：104)、15D7 VH(SEQ ID NO：105)、16C4 VH(SEQ ID NO：106)、14H5-YG(SEQ ID NO：107)、14H5-DG(SEQ ID NO：108)、14H5-LG(SEQ ID NO：109)、1A7 VH(SEQ ID NO：191)、3C3 VH(SEQID NO：191)、6C11 VH(SEQ ID NO：191)、9G7(SEQ ID NO：191)、3B4VH(SEQ ID NO：236)和3F11 VH(SEQ ID NO：192)。

在特定实施方案中，本发明的抗CD 19抗体包含HB12B-3649(SEQ ID NO：68)轻链可变区和HB12B-(3-72/JH4)(SEQID NO：34)重链可变区。包含人源化抗-hCD 19VH HB12B-(3-72/JH4)的DNA克隆于2006年10月26日保藏于美国典型培养物保藏中心(“ATCC”)；“3649Heavy in TOPO”ATCC专利保藏号PTA-7952。包含人源化抗-hCD 19VK HB12B-3649的DNA克隆于2006年10月26日保藏于美国典型培养物保藏中心(“ATCC”)；“3649Light inTOPO”ATCC专利保藏号PTA-7953。

在一个实施方案中，本发明的人源化抗CD 19抗体可结合于人CD 19，其亲和性相当于小鼠单克隆抗体HB12A和/或HB 12B，或其亲和性相当于包含HB 12B VH(SEQ ID NO：18)和HB12B VK(SEQ IDNO：20)的chHB 12B抗体。

本发明还提供了多核苷酸，其包含编码本发明的人、人源化或嵌合的抗CD 19抗体或其片段的核苷酸序列。本发明也包括在本文所述的严谨或较低严谨杂交条件下与编码特异性结合人CD 19的人、人源化或嵌合的抗体杂交的多核苷酸。

本发明的另一个实施方案是包含编码本文所述的人、人源化或嵌合的抗CD 19抗体或其片段的一种或多种核苷酸序列的载体。

本发明还涉及包含载体的分离细胞，其中所述载体包含编码本发明的人、人源化或嵌合的抗CD 19抗体或其片段的一种或多种核苷酸序列。

本文所述的嵌合、人和人源化抗CD 19单克隆抗体包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4人同种型的那些。

在一个实施方案中，本文所述的人源化抗CD 19抗体介导抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)、补体依赖性细胞介导的细胞毒作用(CDC)和/或凋亡。

在又一个实施方案中，本文所述的人源化抗CD 19抗体抑制抗-IgM/CpG刺激的B细胞增殖。

本发明还涉及包含嵌合、人和人源化抗CD 19抗体的药物组合物。

在又一个其它方面，本发明涉及治疗人的B细胞恶性肿瘤的方法，所述方法包括给需要其的人施用治疗有效量的嵌合、人或人源化抗CD19单克隆抗体。

在另一方面，本发明涉及治疗人的自身免疫性疾病或病症的方法，所述方法包括给需要其的人施用治疗有效量的嵌合、人或人源化抗CD19单克隆抗体。

本发明还涉及治疗或预防人移植患者的体液排斥的方法，所述方法包括给需要其的人施用治疗有效量的嵌合、人或人源化抗CD 19单克隆抗体。

本发明涉及增强包含嵌合、人源化或人抗CD 19抗体的含水制剂的贮存稳定性的方法，其中所述抗体包含重链可变区包含SEQ IDNO：104的序列，轻链可变区包含SEQ ID NO：111的序列和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不与所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖结合，所述方法包括向所述制剂添加以有效增强制剂的贮存稳定性的量的表面活性剂。依照本发明的这个方面，所述表面活性剂可以是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一个实施方案中，所述表面活性剂是聚山梨醇酯80并且以约0.01％、约0.02％、约0.04％、约0.08％或约0.1％的量存在。而且，本发明还涉及为了贮存稳定性对制剂进行额外灭菌，包括在添加表面活性剂之前和/或之后过滤组合物。

【4.1.定义】

本文所用的术语“抗体”(免疫球蛋白)包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(如双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、骆驼化抗体、嵌合抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、单结构域抗体、结构域抗体、Fab片段、F(ab′)₂片段、表现所需生物学活性的抗体片段、二硫键连接的Fv(sdFv)和抗独特型(抗-Id)抗体(包括例如，本发明抗体的抗-Id抗体)、细胞内抗体和包括但不限于下述中任一种的表位结合片段：Fab、Fab′、F(ab′)₂和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子以及由抗体片段形成的多特异性抗体。具体来说，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性片段，即含有抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。

天然抗体通常是约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，它们由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。各轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链之间的二硫键连接数不同。各重链和轻链也具有规则间隔的链内二硫桥键。各重链的一端具有可变域(VH)，后接若干恒定域。各轻链的一端具有可变域(VL)，另一端具有恒定域；轻链的恒定域与重链的第一恒定域对齐，轻链可变域与重链可变域对齐。根据轻链恒定区的氨基酸序列，将轻链分为λ链或κ链。在本文中，κ轻链的可变域也可被称为VK。术语“可变区”也可用于描述重链或轻链的可变域。相信某些特定氨基酸残基会形成轻链可变域和重链可变域之间的界面。这类抗体可衍生自任何哺乳动物，包括但不限于人、猴、猪、马、兔、犬、猫、小鼠等。

术语“可变”指以下事实：不同抗体之间可变域的某些部分的序列广泛不同，这些序列负责产生各种具体抗体与其特定抗原的结合特异性。然而，可变性并不是均匀地分布在抗体的可变域上。在轻链可变域和重链可变域中称为互补决定区(CDR)的区段中比较集中。可变域中更高度保守的部分称为构架区(FW)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FW区，主要采取β-片层构型，通过三个CDR连接，形成环连接β-片层结构，在一些情况下形成β-片层结构的一部分。各链中的CDR被FW区聚集在一起，紧密相邻，与另一条链的CDR一起形成抗体的抗原结合位点(参见，Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest(免疫学上重要蛋白质的序列)，第5版，PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))。恒定域通常不直接参与抗原结合，但可能影响抗原结合亲和性，并可能具有各种效应功能，如抗体参与ADCC、CDC和/或凋亡。

本文所用的术语“高变区”指与结合抗原有关的抗体的氨基酸残基。高变区包括“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，轻链可变域的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重链可变域的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，Sequences of Proteinsof Immunological Interest(免疫学上重要蛋白质的序列)，第5版PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))和/或来自“高变环”的残基(例如轻链可变域的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)，以及重链可变域的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.，196：901-917(1987))。“构架”或“FW”残基是侧接于CDR的那些可变域残基。嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、结构域抗体、双抗体、疫苗抗体、线性抗体和双特异性抗体中均存在FW残基。

本文所用的术语“单克隆抗体”指获自基本均一抗体群体的抗体，即除了可能出现的少量天然产生的突变外，包含群体的单独抗体是相同的。单克隆抗体具有针对单个抗原性位点的高度特异性。而且，与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制品不同，每一单克隆抗体针对抗原的单一决定簇。除了其特异性外，单克隆抗体的优势还在于可通过杂交瘤细胞合成，这些杂交瘤细胞不被其他产生免疫球蛋白的细胞污染。本领域技术人员了解其他生产方法，例如，单克隆抗体可由编码单克隆抗体重链和轻链的基因稳定转染或瞬时转染的细胞产生。

修饰词“单克隆”表明抗体的特征在于获自基本均一的抗体群体，而不解释为需要通过任何特定方法对抗体进行工程改造。本文所用的术语“单克隆”指起源于克隆细胞群体的抗体，所述细胞包括任何真核、原核或噬菌体克隆，而非工程改造抗体的方法。例如，本发明所用单克隆抗体可通过Kohler等，Nature，256：495(1975)首次描述的杂交瘤方法产生，或通过任何重组DNA方法产生(参见例如，美国专利No.4,816,567)，包括使用例如Clackson等，Nature，352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)所述技术从噬菌体抗体文库中分离产生。可使用这些方法产生单克隆的哺乳动物抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、结构域抗体、双抗体、疫苗抗体、线性抗体和双特异性抗体。

术语“嵌合”抗体包括重链和/或轻链的至少一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类或子类的抗体中的相应序列相同或同源，链的至少另一部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类型或子类的抗体中的相应序列相同或同源的抗体，以及这类抗体的片段，只要它们具有所需生物学活性(美国专利No.4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。本文感兴趣的嵌合抗体包括包含衍生自非人灵长动物(例如，旧大陆猴，如狒狒、恒河猴或猕猴)的可变域抗原结合序列和人恒定区序列(美国专利No.5,693,780)的“灵长化”抗体。

非人(如鼠)抗体的“人源化”形式是包含最少衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在大多数情况下，人源化抗体是天然CDR残基被具有所需特异性、亲和性和容量的非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠、兔或非人灵长动物的相应CDR残基所取代的人免疫球蛋白(接受抗体)。在一些例子中，人免疫球蛋白的FW区残基被相应的非人残基所取代。而且，人源化抗体可包含接受抗体或供体抗体中不存在的残基。进行这些修饰，以便进一步改善抗体性能。通常，人源化抗体重链或轻链包含基本上所有至少一个或多个可变区，其中所有或基本上所有CDR对应于非人免疫球蛋白的CDR，所有或基本上所有FW均为人免疫球蛋白序列。在某些实施方案中，人源化抗体包含免疫球蛋白、一般是人免疫球蛋白的恒定区(Fc)的至少一部分。其它细节参见Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596(1992)。

“人抗体”可为源于人的抗体，或获自经“工程改造”对抗原性攻击响应产生特异性人抗体的转基因生物体的抗体，并能通过本领域任何已知方法产生。在某些技术中，将人重链和轻链基因座元件引入起源于胚胎干细胞系的生物体品系中，品系包含对内源性重链和轻链基因座的靶向破坏。转基因生物体可合成人抗原特异性的人抗体，并且可使用该生物体产生人抗体-分泌性杂交瘤。人抗体可为重链和轻链由起源于一种或多种人DNA来源的核苷酸序列编码的抗体。也可通过本领域所知的遗传学或染色体转染方法，以及噬菌体展示技术或体外活化的B细胞来构建完全人抗体。

“抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用”和“ADCC”指细胞介导的反应，其中非特异性细胞毒性细胞(如自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，随后引起靶细胞裂解。在一个实施方案中，这类细胞是人细胞。虽然不希望受任何特定作用机理的限制，但介导ADCC的这些细胞毒性细胞通常表达Fc受体(FcR)。介导ADCC的原代细胞NK细胞表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII、FcγRIII和/或FcγRIV。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.，9：457-92(1991)概述了造血细胞上的FcR表达情况。为了评估分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定，如美国专利No.5,500,362或5,821,337所述。可用于这类测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。可选地或此外，可在体内评价感兴趣分子的ADCC活性，例如在dynes等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，95：652-656(1998)所公开的动物模型中进行评价。

“补体依赖性细胞毒作用”或“CDC”指分子启动补体活化和在补体存在下裂解靶的能力。通过补体***第一组分(C1q)与复合关联抗原的分子(如抗体)结合，启动补体活化途径。为了评估补体活化，可进行CDC测定，例如Gazzano-Santaro等，J.Immunol.Methods，202：163(1996)所述。

“效应细胞”表达一种或多种FcR并执行效应功能的白细胞。该细胞至少表达FcγRI、FcγRII、FcγRIII和/或FcγRIV，并执行ADCC效应功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞。

使用术语“Fc受体”或“FcR”描述结合于抗体Fc区的受体。在一个实施方案中，FcR是天然序列人FcR。而且，在某些实施方案中，FcR结合于IgG抗体(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcγRIV亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和另外剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，主要是其胞质结构域不同。活化受体FcγRIIA的胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB的胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(参见，Daeron，Annu.Rev.Immunol.，15：203-234(1997))。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.，9：457-92(1991)；Capel等，Immunomethods，4：25-34(1994)；以及de Haas等，J.Lab.Clin.Med.，126：330-41(1995)对FcR进行了综述。本文所用的术语“FcR”还涵盖其他FcR，包括那些将来鉴定的FcR。该术语还包括新生儿受体FcRn，该受体负责将母体IgG转移到胎儿(Guyer等，Immunol.，117：587(1976)和Kim等，J.Immunol.，24：249(1994))。

“Fv”是含有完整的抗原识别位点和结合位点的最小抗体片段。该区域由一个重链和一个轻链可变域紧密、非共价或共价缔合的二聚体组成。在这种构型中，各一可变区的三个CDR相互作用，以确定VH-VL二聚体表面上的抗原-结合位点。总之，六个CDR产生该抗体的抗原结合特异性。然而，即使单个可变区(或仅含三个抗原特异性 CDR的Fv的一半)也能够识别和结合抗原，虽然其亲和性低于整个结合位点。

本文所述处理所用的抗体与表位的“亲和性”是本领域熟知的术语，指抗体与表位结合的程度或强度。亲和性可以本领域已知的数种方式测量和/或表示，包括但不限于：平衡解离常数(KD或Kd)、表观平衡解离常数(KD′或Kd′)和IC50(在竞争实验中实现50％抑制所需的量)。应当理解的是，出于本发明的目的，亲和性是与表位结合的给定抗体群体的平均亲和性。本文所报道以mg IgG/mL或mg/mL表示的KD′值表示每mL血清中Ig的mg数，尽管也可使用血浆。当抗体亲和性用作施用本文所述治疗方法或选择本文所述治疗方法的基础时，可在治疗前和/或治疗期间测量抗体亲和性，并且所获的值可用于临床医生评估患者是否是该治疗的合适候选人。

本文所用的术语“亲合力”是抗体结合抗原的总体结合强度(即抗体的双臂)的量度。可使用本领域任何已知方法在抗原过量时测量抗原-抗体键的解离从而确定抗体亲合力，所述方法例如但不限于，Gray等，J.Virol.Meth.，44：11-24(1993)所述对间接荧光抗体的修饰。

“表位”是本领域熟知的术语，指表现特异性结合抗体的任何化学部分。“抗原”是含有表位的部分或分子，同样也能与抗体特异性结合。

本文所用的“B细胞表面标记”是在B细胞表面上表达的抗原，可用与其结合的物质靶向B细胞。B细胞表面标记包括CD10、CD 19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CD75、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85和CD86白细胞表面标记。与哺乳动物的其他非B细胞组织相比，B细胞上优先表达特别感兴趣的B细胞表面标记，这些表面标记可以在前体B细胞和成熟B谱系细胞上表达。在一个实施方案中，该标记是CD 19，它出现在不同分化阶段的B细胞上。

本文所用的术语“抗体半衰期”指抗体的一种药代动力学特性，是施用后抗体分子平均残留时间的量度。抗体的半衰期可表示为从患者体内或其特定部位将已知量的免疫球蛋白清除50％所需的时间，例如在血清或血浆中测量，即循环半衰期，或在其它组织中测量。一种免疫球蛋白或一类免疫球蛋白的半衰期与另一种不同。通常，增加抗体半衰期引起所给抗体在循环中的平均滞留时间(MRT)增加。

术语“同种型”指抗体的重链或轻链恒定区的分类。抗体的恒定域不参与抗原结合，但具有各种效应功能。根据重链恒定区的氨基酸序列，可将给定的人抗体或免疫球蛋白指定为五种主要免疫球蛋白类型之一：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。这些类型中的若干类型可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1(γ1)、IgG2(γ2)、IgG3(γ3)、和IgG4(γ4)以及IgA1和IgA2。对应于不同类型的免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类型的免疫球蛋白的结构和三维构型是众所周知的。在各种人免疫球蛋白分亚类型中，已知只有人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgM能活化补体。已知人IgG1和IgG3在人体中介导ADCC。人轻链恒定区可分成两个主要类型，即κ和λ。

本文所用的术语“免疫原性”指能够引起免疫应答(刺激产生特异性抗体和/或特异性T细胞增殖)的化合物。

本文所用的术语“抗原性”指某化合物被抗体识别，或可结合于抗体并诱导免疫应答。

术语“治疗”(或语法等同术语)指受治疗者病症的严重性减轻或至少部分改善或好转和/或达到至少一种临床症状的缓和、缓解或减轻和/或抑制或延迟症状进展和/或阻止或延迟疾病或病症的发作。因此，术语“治疗”(或语法等同术语)指预防性和治疗性治疗方案二者。

本文所用的“足量”或“足以实现特定结果的量”指有效产生所需效应，任选为治疗效应(即，通过施用治疗有效量)的本发明抗体或组合物的量。例如，“足量”或“足以...的量”可以是有效消耗表达B细胞的量。

本文所用的“治疗有效”量指为受治疗者提供某些改善或受益的量。换言之，“治疗有效”量是对至少一种临床症状提供一定的缓和、缓解和/或减轻作用的量。本领域技术人员熟知本发明的方法可治疗的病症相关的临床症状。此外，本领域技术人员将意识到治疗效应无需完全或治愈，只要为受治疗者提供某些益处。

本文所用的术语“赋形剂”指通常用作药物稀释剂、媒介物、防腐剂、粘合剂或稳定剂的惰性物质，向制剂赋予有益的物理性质，诸如蛋白稳定性增加、蛋白溶解度增加、粘度降低。赋形剂的例子包括但不限于，蛋白(例如但不限于，血清白蛋白)、氨基酸(例如但不限于，天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸)、氨基酸(例如但不限于天冬氨酸、谷氨酸，lysine，精氨酸，甘氨酸)、表面活性剂(例如但不限于，SDS、吐温20、吐温80、聚山梨醇酯和非离子型表面活性剂)、糖类(例如但不限于，葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和海藻糖)、多元醇(例如但不限于，甘露醇和山梨醇)、脂肪酸和磷脂(例如但不限于，烷基磺酸酯和辛酸酯)。关于赋形剂的其它信息参见Remington′sPharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)(由Joseph P.Remington编辑，第18版，Mack Publishing Co.，Easton，PA)，通过引用整体并入本文。

本文所用的短语“药学上可接受的”指由联邦或州政府的管理机构批准，或列在美国药典、欧洲药典或其它公认药典用于动物，尤其是用于人。

本文所用的术语术语“稳定性”和“稳定的”在形容包含特异性结合感兴趣的抗原(如CD 19)的抗体(包括其抗体片段)的液体制剂时，是指制剂中的抗体(包括其抗体片段)在给定的生产、制备、运输和贮存条件下不发生聚集、降解或片段化。本发明的“稳定”制剂在给定的生产、制备、运输和贮存条件下保持生物学活性。可通过HPSEC、反相色谱、静态光散射(SLS)、动态光散射(DLS)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、圆二色性(CD)、尿素解折叠技术、色氨酸固有荧光、差示扫描量热法和/或ANS结合技术测量所述制剂与参考制剂相比的聚集、降解或片段化程度，从而评估所述抗体(包括其抗体片段)的稳定性。例如，参考制剂可以是冷冻于-70℃下，在包含75mM NaCl和4％海藻糖的10mM组氨酸(pH 6.0)中含有10mg/ml抗体(包括其抗体片段)(例如但不限于，包含16C4可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区并且其中岩藻糖不结合于所述糖链还原端中的N-乙酰基葡糖胺的抗体)的参考标准品，该参考制剂由HPSEC规则地获得单个单体峰(如，≥95％面积)。可利用分离的抗原分子用多种免疫实验评价含抗体(包括其抗体片段)的制剂的总体稳定性，包括例如，ELISA实验和放射性免疫实验。

本文所用的短语“低至不可检测水平的聚集”指由高效尺寸排阻色谱(HPSEC)或静态光散射(SLS)技术测量，样品包含按蛋白重量比不超过约5％、不超过约4％、不超过约3％、不超过约2％、不超过约1％和不超过约0.5％的聚集。

本文所用的术语“低至不可检测水平的片段化”指样品包含等于或超过约80％、约85％、约90％、约95％、约98％或约99％的总蛋白，例如，由HPSEC或反相色谱确定为单个峰或由还原性毛细管凝胶电泳(rCGE)确定为两个峰(如，重链和轻链)(或峰数等于亚基数目)，表示未降解抗体或其未降解片段，并各自不包含具有超过约5总蛋白％、超过约4％、超过约3％、超过约2％、超过约1％或超过约0.5％的其它单峰。本文所用的术语“还原性毛细管凝胶电泳”指在足以还原抗体中二硫键的还原条件下的毛细管凝胶电泳。

本文所用的术语“控制”指受治疗者从疗法(如，预防剂或治疗剂)获得的有益效果，该效果不导致疾病治愈。在某些实施方案中，向受治疗者施用一种或多种疗法(如，一种或多种预防剂或治疗剂)来“控制”疾病以便阻止疾病的进展或恶化。

本文所用的术语“预防”指由施用疗法(如，预防剂或治疗剂)或施用疗法组合(如，预防剂或治疗剂组合)产生的在受治疗者中抑制疾病或病症的发展或发作或者阻止疾病或病症的一种或多种症状的复发、发作或发展。

本文所用的“足量”或“足以实现特定结果的量”指有效产生所需效应，任选为治疗效应(即，通过施用治疗有效量)的本发明抗体或组合物的量。例如，“足量”或“足以...的量”可以是有效耗尽表达B细胞的量。

本文所用“治疗有效”量指为受治疗者提供某些改善或受益的量。换言之，“治疗有效”量是对至少一种临床症状提供一定的缓和、缓解和/或减轻作用的量。本领域技术人员熟知本发明方法可治疗的病症相关的临床症状。此外，本领域技术人员将意识到治疗效应无需完全或治愈，只要为受治疗者提供某些益处。

本文所用的术语“受治疗者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如但不限于，哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人灵长类动物、绵羊、犬、猫、马、牛、鸡、两栖类、爬行动物等等。

浓度、量、细胞计数、百分比和其它数值在本文可以范围形式表示。应理解的是，这种范围形式仅为了方便和简洁而使用，应灵活地解释为不仅包括列举为范围限值的数值，而且包括该范围内的所有单独数值或该范围内涵盖的亚范围，如同明确列举各个数值和亚范围。

【5.附图简述】

图1A-B：(A)HB 12B VK(SEQ ID NO：20)、HB12B-(A10-Jk4)(SEQ ID NO：52)、HB12B-364987(SEQ ID NO：62)、HB12B-3649(SEQ ID NO：68)和HB12B-36(SEQ ID NO：70)轻链可变区的氨基酸序列比对。根据Kabat对序列残基编号。框中显示根据Kabat确定的CDR残基。用浅灰色特别标明HB12B VK(SEQ IDNO：20)的Vernier、链间和经典残基。用深灰色特别标明HB12B-364987(SEQ ID NO：62)(Y40F、K53H、Y91F)、HB12B-3649(SEQ ID NO：68)(Y40F、K53H)和HB12B-36(SEQ IDNO：70)(Y40F)相对于移植抗体HB12B-(A10-Jk4)(SEQ ID NO：52)可变域的氨基酸取代。(B)HB12B VH(SEQ ID NO：18)、HB12B-(3-72/JH4)(SEQ ID NO：34)和HB12B-9m(SEQ ID NO：44)重链可变区的氨基酸序列比对。根据Kabat对序列残基编号。框中显示根据Kabat确定的CDR残基。用深灰色特别标明HB12B VH的Vernier、链间和经典残基。用深灰色特别标明HB12B-9m(SEQ ID NO：44)(L20I、F27Y、T28A、R38I、V49I、F67A、R71A、L80M、19IY)相对于移植抗体HB12B-(3-72/JH4)(SEQ ID NO：34)可变域的氨基酸取代。

图2.551非岩藻糖化人源化抗CD 19抗体的DSC谱图。

图3.551非岩藻糖化人源化抗CD 19抗体在不同pH下的胶体稳定性。该图显示作为温度函数的在350nm的吸光度。

图4.551非岩藻糖化人源化抗CD 19抗体在不同pH的热稳定性。该图显示作为温度函数的在326nm的色氨酸荧光。

图5.551非岩藻糖化人源化抗CD 19抗体在不同温度的热去稳定化速率。该图显示作为时间函数的在350nm的吸光度。

图6.551非岩藻糖化人源化抗CD 19抗体在包含各种赋形剂的制剂中的热去稳定化速率。该图显示作为时间函数的在350nm的吸光度。

图7.551非岩藻糖化人源化抗CD 19抗体包含各种浓度的NaCl的制剂中的热去稳定化速率。该图显示作为时间函数的在350nm的吸光度。

图8.551非岩藻糖化人源化抗CD 19抗体在包含各种浓度的海藻糖的制剂中的热去稳定化速率。该图显示作为时间函数的在350nm的吸光度。

图9.551非岩藻糖化人源化抗CD 19抗体在包含各种浓度的NaCl和海藻糖的制剂中的热去稳定化速率。该图显示作为时间函数的在350nm的吸光度。

图10.各种551非岩藻糖化人源化抗CD 19抗体制剂在40℃的聚集速率。显示作为时间函数的单体浓度(总蛋白％)。

图11.各种551非岩藻糖化人源化抗CD 19抗体制剂在40℃的聚集速率。显示作为时间函数的聚集体浓度(总蛋白％)。

图12.各种551非岩藻糖化人源化抗CD 19抗体制剂在40℃的片段化率。显示作为时间函数的片段浓度(总蛋白％)。

图13.在40℃测量的包含不同抗体浓度的551非岩藻糖化人源化抗CD 19抗体制剂的聚集速率。显示作为时间函数的单体浓度(总蛋白％)。

图14.在40℃测量的包含不同抗体浓度的551非岩藻糖化人源化抗CD 19抗体制剂的二聚体形成速率。显示作为时间函数的二聚体浓度(总蛋白％)。

图15.包含不同抗体浓度的551非岩藻糖化人源化抗CD 19抗体制剂聚集速率。显示作为时间函数的多聚体浓度(总蛋白％)。

图16.在40℃测量的包含不同抗体浓度的551非岩藻糖化人源化抗CD 19抗体制剂的片段化率。显示作为时间函数的片段浓度(总蛋白％)。

图17.551抗体在不同pH的DSC谱图。

图18.551抗体在不同pH的DSC谱图。

图19.包含10mg/ml抗体的各种551非岩藻糖化人源化抗CD 19抗体制剂在5℃的聚集速率。显示作为时间函数的单体浓度(总蛋白％)。

图20.包含10mg/ml抗体的各种551非岩藻糖化人源化抗CD 19抗体制剂在5℃的聚集速率。显示作为时间函数的多聚体浓度(总蛋白％)。

图21.包含10mg/ml抗体的各种551非岩藻糖化人源化抗CD 19抗体制剂在5℃的聚集速率。显示作为时间函数的总聚集体浓度(总蛋白％)。

图22.包含10mg/ml抗体的551非岩藻糖化人源化抗CD 19抗体制剂在不同温度的聚集速率。显示作为时间函数的单体浓度(总蛋白％)。

图23.包含10mg/ml抗体的551非岩藻糖化人源化抗CD 19抗体制剂在不同温度的聚集速率。显示作为时间函数的总聚集体和多聚体浓度(总蛋白％)。

图24.包含10mg/ml抗体的551非岩藻糖化人源化抗CD 19抗体制剂在不同温度的片段化率。显示作为时间函数的片段浓度(总蛋白％)。

图25.包含10mM组氨酸、75mM NaCl和4％海藻糖的551非岩藻糖化人源化抗CD 19抗体制剂在pH 6.0的稳定特性。

图26.经受4小时振摇的包含各种浓度的聚山梨醇酯80(PS80)551非岩藻糖化人源化抗CD 19抗体制剂中的聚集体形成。显示最终的单体浓度(总蛋白％)。

图27.经受4小时振摇的包含各种浓度的聚山梨醇酯80(PS80)的551非岩藻糖化人源化抗CD 19抗体制剂中的聚集体形成。显示最终的总聚集体浓度(总蛋白％)。

图28.经受24小时振摇的包含各种浓度的聚山梨醇酯80(PS80)的551非岩藻糖化人源化抗CD 19抗体制剂中的聚集体形成。显示最终的总聚集体浓度(总蛋白％)。

图29.在存在和不存在聚山梨醇酯80(PS80)下551非岩藻糖化人源化抗CD 19抗体制剂在25℃和40℃的聚集速率。显示作为时间函数的聚集体浓度(总蛋白％)。

图30.在存在和不存在聚山梨醇酯80(PS80)下551非岩藻糖化人源化抗CD 19抗体制剂在25℃和40℃的聚集速率。显示作为时间函数的总多聚体浓度(总蛋白％)。

图31.AN BL6、H929和RPMI8226多发性骨髓瘤细胞系的CD138/CD 19表达谱。

图32.表达CD138或CD 19的细胞在ANBL6培养物中的分数随时间变化。显示作为时间函数的表达CD 19和CD 138的细胞的比率。

图33.CD 19+CD 138-细胞，而不是从ANBL6培养物分离的CD19-CD 138+细胞，能够在软琼脂中形成集落。

图34.抗CD 19mAb对多发性骨髓瘤细胞的ADCC活性。抗CD19-aFuc从未分选的多发性骨髓瘤细胞培养物特异性消耗CD 19+细胞。

图35.551非岩藻糖化抗CD 19抗体抑制SCID小鼠中的骨髓瘤异种移植物生长。作为时间函数的肿瘤体积示出。

图36.颗粒计数vs.仅经受VDF过滤的抗CD 19样品小瓶的大小的双对数图。

图37.颗粒计数vs.经受VDF过滤并且随后PS80添加的抗CD 19样品小瓶的大小的双对数图。

图38.颗粒计数vs.经受VDF过滤、然后PS80添加并且经受另一轮PVDF过滤的抗CD 19样品小瓶的大小的双对数图。

【6.详述】

本发明提供了包含特异性结合人CD 19抗原的嵌合、人或人源化抗体的无菌、稳定含水制剂。在一个实施方案中，本发明提供了包含嵌合和人源化形式的抗CD 19小鼠单克隆抗体HB12A和HB12B的制剂。在另一个实施方案中，本发明提供了包含于2007年9月7日提交的美国专利申请11/852,106中描述的抗CD 19抗体的制剂，该公开内容为了所有目的整体并入本文。在又一个实施方案中，本发明提供了包含可介导下述中的一种或多种的本发明的抗CD 19抗体的制剂：补体依赖性细胞介导的细胞毒作用(CDC)、抗原依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和程序性细胞死亡(凋亡)和具有增强的效应功能。在另一个实施方案中，本发明的制剂包含本发明的抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不与所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖结合。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ IDNO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不与所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖结合。在某些实施方案中，包含本发明的抗CD 19抗体的稳定液体制剂适用于向人受治疗者胃肠外施用。在特定的实施方案中，本发明的稳定液体制剂适用于向人受治疗者皮下施用。

【6.1.抗体制剂】

在特定的实施方案中，本发明包括特异性结合人CD 19并且具有增强的效应功能(例如，抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)、补体依赖性细胞介导的细胞毒作用(CDC)、和/或抗体依赖性吞噬作用)的抗体的稳定液体制剂，其中该制剂在生产、制备、运输和长时间储存期间表现出低至不可检测水平的抗体聚集和/或片段化，生物学活性损失很少至不损失。本发明还包括特异性结合人CD 19、具有增强的效应功能并且具有增加的体内半衰期的抗体的稳定液体制剂，所述制剂在生产、制备、运输和长时间储存期间表现出低至不可检测水平的抗体聚集和/或片段化，抗体的生物学活性(例如，抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)、补体依赖性细胞介导的细胞毒作用(CDC)、和/或抗体依赖性吞噬作用)损失很少至不损失。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含具有增加的体内ADCC活性的抗-人CD 19抗体，所述制剂在生产、制备、运输和长时间储存期间表现出低至不可检测水平的抗体聚集和/或片段化以及抗体的生物学活性损失很少至不损失。

在一个实施方案中，本发明的液体制剂是含水制剂。在特定的实施方案中，本发明的液体制剂是含水制剂，其中含水载体是蒸馏水。

在一个实施方案中，本发明的制剂是无菌的。

在一个实施方案中，本发明的制剂是均质的。

在一个实施方案中，本发明的制剂是等渗的。

在特定的实施方案中，本发明提供了包含具有增强的效应功能的抗CD 19抗体的稳定液体制剂。在一个实施方案中，本发明的制剂包含于2007年9月7日提交的美国专利申请11/852,106中所述的抗CD19抗体，其公开内容为了所有目的整体并入本文。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含本发明的抗CD 19抗体，其中所述抗体包含具有SEQ ID NO：104的氨基酸序列的VH结构域和具有SEQ ID NO：111的氨基酸序列的VL结构域。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗-人CD 19抗体，所述抗-人CD 19抗体包含具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不结合于所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖。

本发明包括包含单种目标抗体(包括其抗体片段)，例如特异性结合CD 19多肽的本发明抗体的稳定液体制剂。本发明也包括包含两种或多种目标抗体(包括抗体其片段)，特异性结合CD 19多肽的本发明抗体的稳定液体制剂。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含至少约1mg/ml、至少约2mg/ml、至少约3mg/ml、至少约4mg/ml、至少约5mg/ml、至少约6mg/ml、至少约7mg/ml、至少约8mg/ml、至少约9mg/ml、至少约10mg/ml、至少约11mg/ml、至少约12mg/ml、至少约13mg/ml、至少约14mg/ml、至少约15mg/ml、至少约16mg/ml、至少约17mg/ml、至少约18mg/ml、至少约19mg/ml、至少约20mg/ml、至少约30mg/ml、至少约40mg/ml、至少约50mg/ml、至少约60mg/ml、至少约70mg/ml、至少约80mg/ml、至少约90mg/ml、至少约100mg/ml、至少约110mg/ml、至少约120mg/ml、至少约130mg/ml、至少约140mg/ml、至少约150mg/ml、至少约160mg/ml、至少约170mg/ml、至少约180mg/ml、至少约190mg/ml、至少约200mg/ml、至少约250mg/ml或至少约300mg/ml的本发明的抗CD 19抗体。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含至少约5mg/ml的本发明的抗CD 19抗体。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含至少约10mg/ml的本发明的抗CD 19抗体。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含至少约15mg/ml的本发明的抗CD 19抗体。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含至少约20mg/ml的本发明的抗CD 19抗体。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含至少约30mg/ml的本发明的抗CD 19抗体。在另一个实施方案中，本发明的制剂包含约1mg/ml至约25mg/ml、约1mg/ml至约30mg/ml、约5mg/ml至约25mg/ml、约5mg/ml至约30mg/ml、约7.5mg/ml至约25mg/ml或约7.5mg/ml至约30mg/ml的本发明的抗CD 19抗体。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含约1mg/ml至约25mg/ml的本发明的抗CD 19抗体。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含约5mg/ml至约25mg/ml的本发明的抗CD 19抗体。在又一个实施方案中，本文所述的制剂包含约1mg/ml、约2mg/ml、约3mg/ml、约4mg/ml、约5mg/ml、约6mg/ml、约7mg/ml、约8mg/ml、约9mg/ml、约10mg/ml、约11 mg/ml、约12mg/ml、约13mg/ml、约14mg/ml、约15mg/ml、约16mg/ml、约17mg/ml、约18mg/ml、约19mg/ml、约20mg/ml、约30mg/ml、约40mg/ml、约50mg/ml、约60mg/ml、约70mg/ml、约80mg/ml、约90mg/ml、约100mg/ml、约110mg/ml、约120mg/ml、约130mg/ml、约140mg/ml、约150mg/ml、约160mg/ml、约170mg/ml、约180mg/ml、约190mg/ml、约200mg/ml、约250mg/ml或约300mg/ml的本发明的抗CD 19抗体。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含约5mg/ml的本发明的抗CD 19抗体。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含约10mg/ml的本发明的抗CD 19抗体。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含约15mg/ml的本发明的抗CD 19抗体。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含约25mg/ml的本发明的抗CD 19抗体。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含约50mg/ml的本发明的抗CD 19抗体。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不与所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖结合。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含至少1mg/ml、至少2mg/ml、至少3mg/ml、至少4mg/ml、至少5mg/ml、至少6mg/ml、至少7mg/ml、至少8mg/ml、至少9mg/ml、至少10mg/ml、至少11mg/ml、至少12mg/ml、至少13mg/ml、至少14mg/ml、至少15mg/ml、至少16mg/ml、至少17mg/ml、至少18mg/ml、至少19mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少60mg/ml、至少70mg/ml、至少80mg/ml、至少90mg/ml、至少100mg/ml、至少110mg/ml、至少120mg/ml、至少130mg/ml、至少140mg/ml、至少150mg/ml、至少160mg/ml、至少170mg/ml、至少180mg/ml、至少190mg/ml、至少200mg/ml、至少250mg/ml或至少300mg/ml的本发明的抗CD 19抗体。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含至少5mg/ml的本发明的抗CD 19抗体。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含至少10mg/ml的本发明的抗CD 19抗体。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含至少15mg/ml的本发明的抗CD 19抗体。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含至少20mg/ml的本发明的抗CD 19抗体。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含至少30mg/ml的本发明的抗CD 19抗体。在另一个实施方案中，本发明的制剂包含1mg/ml至25mg/ml、1mg/ml至30mg/ml、5mg/ml至25mg/ml、5mg/ml至30mg/ml、7.5mg/ml至25mg/ml或7.5mg/ml至30mg/ml的本发明的抗CD 19抗体。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含1mg/ml至25mg/ml的本发明的抗CD 19抗体。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含5mg/ml至25mg/ml的本发明的抗CD 19抗体。在又一个实施方案中，本文所述的制剂包含1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、11mg/ml、12mg/ml、13mg/ml、14mg/ml、15mg/ml、16mg/ml、17mg/ml、18mg/ml、19mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml、110mg/ml、120mg/ml、130mg/ml、140mg/ml、150mg/ml、160mg/ml、170mg/ml、180mg/ml、190mg/ml、200mg/ml、250mg/ml或300mg/ml的本发明的抗CD 19抗体。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含5mg/ml的本发明的抗CD 19抗体。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含10mg/ml的本发明的抗CD 19抗体。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含15mg/ml的本发明的抗CD 19抗体。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含25mg/ml的本发明的抗CD 19抗体。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含50mg/ml的本发明的抗CD 19抗体。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含100mg/ml的本发明的抗CD 19抗体。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ IDNO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不结合于所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖。

任选地，本发明的制剂还可包含常见赋形剂和/或添加剂，例如缓冲剂、糖类、盐和表面活性剂。另外或可选地，本发明的制剂还可包含常见赋形剂和/或添加剂，例如但不限于，增溶剂、稀释剂、粘合剂、稳定剂、盐、亲脂溶剂、氨基酸、螯合剂、防腐剂或类似物。

在某些实施方案中，该缓冲剂选自组氨酸、柠檬酸盐、磷酸盐、甘氨酸和乙酸盐。在其它实施方案中，该糖类赋形剂选自海藻糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖和棉子糖。在又其它实施方案中，该表面活性剂选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯80和普朗尼克F68。在另外其它实施方案中，该盐选自NaCl、KCl、MgCl₂和CaCl₂。

任选地，本发明的制剂还可包含其它常见辅助组分，例如但不限于，适合的赋形剂、多元醇，增溶剂、稀释剂、粘合剂、稳定剂、亲脂溶剂、螯合剂、防腐剂或类似物。

本发明的制剂包括缓冲剂或pH调节剂以提供改进的pH控制。在一个实施方案中，本发明的制剂具有约3.0至约9.0、约4.0至约8.0、约5.0至约8.0、约5.0至约7.0、约5.0至约6.5、约5.5至约8.0、约5.5至约7.0或约5.5至约6.5的pH。在又一个实施方案中，本发明的制剂具有约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5或约9.0的pH。在特定的实施方案中，本发明的制剂具有约6.0的pH。

本发明的制剂包括缓冲剂或pH调节剂以提供改进的pH控制。在一个实施方案中，本发明的制剂具有3.0至9.0、4.0至8.0、5.0至8.0、5.0至7.0、5.0至6.5、5.5至8.0、5.5至7.0或5.5至6.5的pH。在又一个实施方案中，本发明的制剂具有3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.5、8.0、8.5或9.0的pH。在特定的实施方案中，本发明的制剂具有6.0的pH。

制剂的pH通常应不等于制剂中所用具体抗体(包括其抗体片段) 的等电点(例如但不限于包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ IDNO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不结合于所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖的抗CD 19抗体的等电点)，可从约4.0至约8.0或可从约5.5至约6.5。

通常，缓冲剂是从有机或无机的酸或碱制备的盐。代表性缓冲剂包括但不限于，有机酸盐例如柠檬酸、抗坏血酸、葡糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或邻苯二甲酸的盐；Tris，氨丁三醇盐酸盐或磷酸盐缓冲液。此外，氨基酸组分也可在缓冲能力中起作用。可在本发明的制剂中用作缓冲剂的代表性氨基酸组分包括但不限于甘氨酸和组氨酸。在某些实施方案中，该缓冲剂选自组氨酸、柠檬酸盐、磷酸盐、甘氨酸和乙酸盐。在特定的实施方案中，该缓冲剂是组氨酸。在另一个特定的实施方案中，该缓冲剂柠檬酸盐。缓冲剂的纯度应为至少98％或至少99％或至少99.5％。本文所用的术语在用于组氨酸时的“纯度”是指本领域理解的组氨酸的化学纯度，例如，如The MerckIndex(Merck指数)，第13版，O’Neil等编著(Merck & Co.，2001)所述。

取决于期望的离子强度和所需缓冲能力，缓冲剂通常以约1mM至约200mM或本文的任何范围或值的浓度使用。胃肠外制剂中采用常规缓冲剂的通常浓度可见于：Pharmaceutical Dosage Form：Parenteral Medications(药物剂型：胃肠外药物)，第1卷，第2版，第5章，第194页，De Luca和Boylan，“Formulation of Small VolumeParenterals(小体积胃肠外制剂)”，表5：胃肠外产物中常用添加剂。在一个实施方案中，该缓冲剂的浓度为约1mM、或约5mM、或约10mM、或约15mM、或约20mM、或约25mM、或约30mM、或约35mM、或约40mM、或约45mM、或约50mM、或约60mM、或约70mM、或约80mM、或约90mM、或约100mM。在一个实施方案中，该缓冲剂的浓度为1mM、或5mM、或10mM、或15mM、或20mM、或25mM、或30mM、或35mM、或40mM、或45mM、或50mM、或60mM、或70mM、或80mM、或90mM、或100mM。在特定的实施方案中，该缓冲剂的浓度为约5mM至约50mM。在另一个特定的实施方案中，该缓冲剂的浓度为5mM至20mM。

取决于期望的离子强度和所需缓冲能力，缓冲剂通常以1mM至200mM或本文的任何范围或值的浓度使用。胃肠外制剂中采用常规缓冲剂的通常浓度可见于：Pharmaceutical Dosage Form：ParenteralMedications(药物剂型：胃肠外药物)，第1卷，第2版，第5章，第194页，De Luca和Boylan，“Formulation of Small VolumeParenterals(小体积胃肠外制剂)”，表5：胃肠外产物中的常用添加剂。在一个实施方案中，该缓冲剂的浓度为1mM、或5mM、或10mM、或15mM、或20mM、或25mM、或30mM、或35mM、或40mM、或45mM、或50mM、或60mM、或70mM、或80mM、或90mM、或100mM。在一个实施方案中，该缓冲剂的浓度为1mM、或5mM、或10mM、或15mM、或20mM、或25mM、或30mM、或35mM、或40mM、或45mM、或50mM、或60mM、或70mM、或80mM、或90mM、或100mM。在特定的实施方案中，该缓冲剂的浓度为5mM至50mM。在另一个特定的实施方案中，该缓冲剂的浓度为5mM至20mM。

在某些实施方案中，本发明的制剂包含缓冲剂。在一个实施方案中，所述缓冲剂选自组氨酸、柠檬酸盐、磷酸盐、甘氨酸和乙酸盐。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含组氨酸作为缓冲剂。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含至少约1mM、至少约5mM、至少约10mM、至少约20mM、至少约30mM、至少约40mM、至少约50mM、至少约75mM、至少约100mM、至少约150mM或至少约200mM组氨酸。在另一个实施方案中，本发明的制剂包含约1mM至约200mM、约1mM至约150mM、约1mM至约100mM、约1mM至约75mM、约10mM至约200mM、约10mM至约150mM、约10mM至约100mM、约10mM至约75mM、约10mM至约50mM、约10mM至约40mM、约10mM至约30mM、约20mM至约75mM、约20mM至约50mM、约20mM至约40mM或约20mM至约30mM 组氨酸。在本发明的进一步实施方案中，包含约1mM、约5mM、约10mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM、约100mM、约150mM或约200mM组氨酸。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含约10mM组氨酸。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含至少1mM、至少5mM、至少10mM、至少20mM、至少30mM、至少40mM、至少50mM、至少75mM、至少100mM、至少150mM或至少200mM组氨酸。在另一个实施方案中，本发明的制剂包含1mM至200mM、1mM至150mM、1mM至100mM、1mM至75mM、10mM至200mM、10mM至150mM、10mM至100mM、10mM至75mM、10mM至50mM、10mM至40mM、10mM至30mM、20mM至75mM、20mM至50mM、20mM至40mM或20mM至30mM组氨酸。在本发明的进一步实施方案中，包含1mM、5mM、10mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、150mM或200mM组氨酸。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含10mM组氨酸。

在某些实施方案中，本发明的制剂包含糖类赋形剂。糖类赋形剂可用作，例如，粘度增强剂、稳定剂、膨胀剂、增溶剂和/或类似物。糖类赋形剂通常以约1％至约99％重量或体积。在一个实施方案中，糖类赋形剂以约0.1％至约20％存在。在另一个实施方案中，糖类赋形剂以约0.1％至约15％存在。在特定的实施方案中，糖类赋形剂以约0.1％至约5％、或约1％至约15％、或约2％至约10％、或约2％至约8％、或约2％至约6％存在。在特定的实施方案中，糖类赋形剂以约0.1％至约5％存在、或1％至15％、或2％至10％、或2％至8％、或2％至6％存在。在另一个特定的实施方案中，糖类赋形剂以约0.1％至约10％存在。在另一个特定的实施方案中，糖类赋形剂以约1％至约8％存在。在又另一个特定的实施方案中，糖类赋形剂以约2％至约6％存在。在另外其它具体特定的实施方案中，糖类赋形剂以约1％、或约1.5％、或约2％、或约2.5％、或约3％、或约4％、或约5％、或约10％、或约15％、或约20％存在。

在某些实施方案中，本发明的制剂包含糖类赋形剂。糖类赋形剂可用作，例如，粘度增强剂、稳定剂、膨胀剂、增溶剂和/或类似物。糖类赋形剂通常以约1％至约99％重量或体积存在。在一个实施方案中，糖类赋形剂以约0.1％至约20％存在。在另一个实施方案中，糖类赋形剂以约0.1％至约15％存在。在特定的实施方案中，糖类赋形剂以约0.1％至约5％、或1％至15％、或2％至10％、或2％至8％、或2％至6％存在。在特定的实施方案中，糖类赋形剂以约0.1％至约5％、或1％至15％、或2％至10％、或2％至8％、或2％至6％存在。在另一个特定的实施方案中，糖类赋形剂以0.1％至10％存在。在另一个特定的实施方案中，糖类赋形剂以1％至8％存在。在又另一个特定的实施方案中，糖类赋形剂以2％至6％存在。在另外其它特定的实施方案中，糖类赋形剂以1％、或1.5％、或2％、或2.5％、或3％、或4％、或5％、或10％、或15％、或20％存在。

适合用于本发明的制剂的糖类赋形剂包括，例如，单糖例如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖和类似物；D-甘露糖、山梨糖等等；二糖，诸如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等等；多糖，诸如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等等；和糖醛，诸如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨醇(葡糖醇)和类似物。在一个实施方案中，用于本发明的糖类赋形剂选自蔗糖、海藻糖、乳糖、甘露糖和棉子糖。在特定的实施方案中，糖类赋形剂为海藻糖。在另一个特定的实施方案中，糖类赋形剂为甘露糖。在又另一个特定的实施方案中，糖类赋形剂为蔗糖。在另一个特定的实施方案中，糖类赋形剂为棉子糖。糖类赋形剂的纯度应为至少98％或至少99％或至少99.5％。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约6％、至少约8％、至少约20％、至少约30％或至少约40％海藻糖。在另一个实施方案中，本发明的制剂包含约1％至约30％、约1％至约20％、约1％至约10％、约2％至约30％、约2％至约20％、约2％至约10％、约2％至约8％、约2％至约6％或约3％至约6％海藻糖。在又一个实施方案中，本发明的制剂包含约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约8％、约20％、约30％或约40％海藻糖。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含约4％海藻糖。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少8％、至少20％、至少30％或至少40％海藻糖。在另一个实施方案中，本发明的制剂包含1％至30％、1％至20％、1％至10％、2％至30％、2％至20％、2％至10％、2％至8％、2％至6％或3％至6％海藻糖。在又一个实施方案中，本发明的制剂包含1％、2％、3％、4％、5％、6％、8％、20％、30％或40％海藻糖。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含4％海藻糖。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含赋形剂。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含至少一种选自下组的赋形剂：糖、盐、表面活性剂、氨基酸、多元醇、螯合剂、乳化剂和防腐剂。在一个实施方案中，本发明的制剂包含盐。在一个实施方案中，本发明的制剂包含选自下组的盐：NaCl、KCl、CaCl₂和MgCl₂。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含NaCl。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含至少约10mM、至少约25mM、至少约50mM、至少约75mM、至少约80mM、至少约100mM、至少约125mM、至少约150mM、至少约175mM、至少约200mM或至少约300mM氯化钠。在又一个实施方案中，本文所述的制剂包含约10mM至约300mM、约10mM至约200mM、约10mM至约175mM、约10mM至约150mM、约25mM至约300mM、约25mM至约200mM、约25mM至约175mM、约25mM至约150mM、约50mM至约300mM、约50mM至约200mM、约50mM至约175mM、约50mM至约150mM、约60mM至约300mM、约60mM至约200mM、约60mM至约175mM、约60mM至约150mM、约100mM 至约300mM、约100mM至约200mM、约100mM至约175mM或约100mM至约150mM氯化钠。在又一个实施方案中，本发明的制剂包含约10mM。约25mM、约50mM、约75mM、约80mM、约100mM、约125mM、约150mM、约175mM、约200mM或约300mM氯化钠。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含75mM氯化钠。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含至少10mM、至少25mM、至少50mM、至少75mM、至少80mM、至少100mM、至少125mM、至少150mM、至少175mM。至少200mM或至少300mM氯化钠。在又一个实施方案中，本文所述的制剂包含10mM至300mM、10mM至200mM、10mM至175mM、10mM至150mM、25mM至300mM、25mM至200mM、25mM至175mM、25mM至150mM、50mM至300mM、50mM至200mM、50mM至175mM、50mM至150mM、60mM至300mM、60mM至200mM、60mM至175mM、60mM至150mM、100mM至300mM、100mM至200mM、100mM至175mM或100mM至150mM氯化钠。在又一个实施方案中，本发明的制剂包含10mM。25mM、50mM、75mM、80mM、100mM、125mM、150mM、175mM、200mM或300mM氯化钠。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含75mM氯化钠。

本发明的制剂还可包含还可包含表面活性剂。本文所用的术语“表面活性剂”是指具有两亲结构的有机物质；即，它们由相反溶解趋势的基团构成，通常是油溶性烃链和水溶性离子基团。可根据表面活性基团上的电荷将表面活性剂分为阴离子、阳离子和非离子型表面活性剂。表面活性剂通常用作生物材料的各种药物组合物和制品的润湿剂、乳化剂、增溶剂和分散剂。药学上可接受的表面活性剂如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20或80)；泊洛沙姆(如泊洛沙姆188)；辛基葡糖苷钠；月桂基-、肉豆蔻基-、亚油烯基-或硬脂酰基-磺基甜菜碱；月桂基-、肉豆蔻基-、亚油烯基-或硬脂酰基-肌氨酸；亚油烯基-、肉豆蔻基-或鲸蜡基-甜菜碱；月桂酰氨基丙基-、椰油酰氨基丙基-、亚油烯酰氨基丙基-、肉豆蔻酰氨基丙基-、棕榈酰氨基丙基-或异硬脂酰氨基丙基- 甜菜碱(如月桂酰氨基丙基)；肉豆蔻酰氨基丙基-、棕榈酰氨基丙基-或异硬脂酰氨基丙基-二甲胺；甲基椰油基钠-或甲基油基二钠-牛胆酸；和MONAQUA^TM系列(Mona Industries，Inc.，Paterson，N.J.)、聚乙二醇、聚丙二醇、和乙二醇与丙二醇的共聚物(如普朗尼克、PF68等等)可任选地加入到本发明的制剂以减少聚集。表面活性剂尤其可用于施用制剂的泵或塑料容器。药学上可接受的表面活性剂的存在缓和蛋白聚集的倾向。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含以约0.001％至约1％、或约0.001％至约0.1％、或约0.01％至约0.1％的浓度的聚山梨醇酯。在其它特定的实施方案中，本发明的制剂包含以0.001％、或0.002％、或0.003％、或0.004％、或0.005％、或0.006％、或0.007％、或0.008％、或0.009％、或0.01％、或0.015％或0.02％的浓度的聚山梨醇酯。在另一个特定的实施方案中，该聚山梨醇酯是聚山梨醇酯-80。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含以0.001％至1％、或0.001％至0.1％、或0.01％至0.1％的浓度的聚山梨醇酯。在其它特定的实施方案中，本发明的制剂包含以0.001％、或0.002％、或0.003％、或0.004％、或0.005％、或0.006％、或0.007％、或0.008％、或0.009％、或0.01％、或0.015％、或0.02％的浓度的聚山梨醇酯。在另一个特定的实施方案中，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯-80。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含表面活性剂。在一个实施方案中，本发明的制剂包含聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60或聚山梨醇酯80。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含聚山梨醇酯80。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含至少约0.001％、至少约0.002％、至少约0.005％、至少约0.01％、至少约0.02％、至少约0.05％、至少约0.1％、至少约0.2％或至少约0.5％的聚山梨醇酯80。在另一个实施方案中，本发明的制剂包含约0.001％至约0.5％、约0.001％至约0.2％、约0.001％至约0.1％、约0.001％至约0.05％、约0.002％至约0.5％、约0.002％至约0.2％、约0.002％至约0.1％、约0.002％至约0.05％、约0.005％至约0.5％、约0.005％至约0.2％、约0.005％至约0.1％、约0.005％至约0.05％、约0.01％至约0.5％、约0.01％至约0.2％、约0.01％至约0.1％或约0.01％至约0.05％的聚山梨醇酯80。在又一个实施方案中，本发明的制剂包含约0.001％、约0.002％、约0.005％、约0.01％、约0.02％、约0.05％、约0.1％、约0.2％和约0.5％的聚山梨醇酯80。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含约0.02％聚山梨醇酯80。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含约0.04％聚山梨醇酯80。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含约0.05％聚山梨醇酯80。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含至少0.001％、至少0.002％、至少0.005％、至少0.01％、至少0.02％、至少0.05％、至少0.1％、至少0.2％或至少0.5％的聚山梨醇酯80。在另一个实施方案中，本发明的制剂包含0.001％至0.5％、0.001％至0.2％、0.001％至0.1％、0.001％至0.05％、0.002％至0.5％、0.002％至0.2％、0.002％至0.1％、0.002％至0.05％、0.005％至0.5％、0.005％至0.2％、0.005％至0.1％、0.005％至0.05％、0.01％至0.5％、0.01％至0.2％、0.01％至0.1％或0.01％至0.05％的聚山梨醇酯80。在又一个实施方案中，本发明的制剂包含0.001％、0.002％、0.005％、0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.2％和0.5％的聚山梨醇酯80。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含0.02％聚山梨醇酯80。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含0.04％聚山梨醇酯80。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含0.05％聚山梨醇酯80。

任选地，本发明的制剂还可包含其它常见赋形剂和/或添加剂，包括但不限于，稀释剂、粘合剂、稳定剂、亲脂溶剂、防腐剂、佐剂或类似物。药学上可接受的赋形剂和/或添加剂可用于本发明的制剂。常用的赋形剂/添加剂，例如药学上可接受的螯合剂(例如但不限于EDTA、DTPA或EGTA)可任选地加入到本发明的制剂以减少聚集。如果泵或塑料容器用于施用制剂，则这些添加剂尤其有用。

防腐剂，例如苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、亚硝酸苯汞、苯氧乙醇、甲醛、氯丁醇、氯化镁(例如但不限于，六水合物)、尼泊金烷基酯(甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等等)、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢醋酸钠和硫柳汞或其混合物可任选地以任何适当浓度诸如约0.001％至约5％或本文任何范围或值加入到本发明的制剂。用于本公开的制剂的防腐剂浓度是足以产生抗-微生物作用的浓度。这样的浓度取决于所选的防腐剂，本领域技术人员容易确定。

可用于本发明的制剂的其它预期赋形剂/添加剂包括例如，调味料、抗菌剂、甜味剂、抗氧化剂、杀菌剂、脂质诸如磷脂或脂肪酸、固醇诸如胆固醇、蛋白赋形剂例如血清白蛋白(人血清白蛋白(HSA)、重组人白蛋白(rHA))、明胶、酪蛋白、成盐抗衡离子诸如钠和类似物。适于用于本公开的制剂的这些和其它已知药物赋形剂和/或添加剂是本领域已知的，如，列在“Remington：The Science & Practice ofPharmacy(雷明顿药学理论和实践)”，第21版，Lippincott Williams &Wilkins，(2005)和“Physician′s Desk Reference(医师案头参考)”，第60版，Medical Economics，Montvale，N.J.(2005)。可常规地选择适用于如本领域已知或本文所述的Fc变异蛋白的施用方式、溶解度和/或稳定性的药学上可接受的载体。

本领域技术人员应理解的是，本发明的制剂可与人血等渗，即本发明的制剂具有与人血基本相同的渗透压。这种等渗的制剂通常具有约250mOSm至约350mOSm的渗透压。等渗性可通过例如，利用蒸汽压型或冰冻型渗透压计测量。制剂的张力使用张力调节剂调节。“张力调节剂”是药学上可接受的惰性物质，可加入到制剂以提供制剂等渗性。适用于本发明的张力调节剂包括但不限于，糖类、盐和氨基酸。

在某些实施方案中，本发明的制剂具有约100mOSm至约1200mOSm、或约200mOSm至约1000mOSm、或约200mOSm至约800mOSm、或约200mOSm至约600mOSm、或约250mOSm至约500mOSm、或约250mOSm至约400mOSm、或约250mOSm至约350mOSm的渗透压。

在某些实施方案中，本发明的制剂具有100mOSm至1200mOSm、或200mOSm至1000mOSm、或200mOSm至800mOSm、或200mOSm至600mOSm、或250mOSm至500mOSm、或250mOSm至400mOSm、或250mOSm至350mOSm的渗透压。

可调整本发明的制剂各种成分的任何一种或任何组合的浓度，以实现最终制剂的期望张力。例如，可按照本领域已知方法(例如，美国专利No.6,685,940)调整糖类赋形剂与抗体的比例。在某些实施方案中，糖类赋形剂与抗体的摩尔比可以是约100摩尔至约1000摩尔糖类赋形剂比约1摩尔抗体、或约200摩尔至约6000摩尔糖类赋形剂比约1摩尔抗体、或约100摩尔至约510摩尔糖类赋形剂比约1摩尔抗体、或约100摩尔至约600摩尔糖类赋形剂比约1摩尔抗体。

可调整本发明的制剂各种成分的任何一种或任何组合的浓度，以实现最终制剂的期望张力。例如，可按照本领域已知方法(例如，美国专利No.6,685,940)调整糖类赋形剂与抗体的比例。在某些实施方案中，糖类赋形剂与抗体的摩尔比可以是100摩尔至1000摩尔糖类赋形剂比约1摩尔抗体、或200摩尔至6000摩尔糖类赋形剂比约1摩尔抗体、或100摩尔至510摩尔糖类赋形剂比约1摩尔抗体、或100摩尔至600摩尔糖类赋形剂比约1摩尔抗体。

还可通过调整制剂盐浓度来实现最终制剂的期望等渗性。药学上可接受的并适于在本发明用作张力调节剂的盐包括但不限于氯化钠、琥珀酸钠、硫酸钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁和氯化钙。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含NaCl、MgCl₂和/或CaCl₂。在一个实施方案中，NaCl浓度是约75mM至约150mM。在另一个实施方案中，MgCl2浓度是约1mM至约100mM。药学上可接受的并适于在本发明用作张力调节剂的氨基酸包括但不限于，脯氨酸、丙氨酸、L-精氨酸、天冬酰胺、L-天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、赖氨酸和组氨酸。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含组氨酸、氯化钠、海藻糖和聚山梨醇酯80。在一个实施方案中，本发明的制剂包含组氨酸、氯化钠和海藻糖。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含组氨酸、氯化钠和海藻糖。在一个实施方案中，本发明的制剂包含约5mM至约100mM组氨酸、约10mM至约300mM氯化钠和约0.3％至约10％海藻糖，其中所述制剂具有约5.0至约7.0的pH。在另一个实施方案中，本发明的制剂包含约5mM至约50mM组氨酸、约50mM至约200mM氯化钠和约1％至约8％海藻糖，其中所述制剂具有约5.5至约6.5的pH。在又一个实施方案中，本发明的制剂包含约10mM组氨酸、约75mM氯化钠和约4％海藻糖，其中所述制剂具有约6.0的pH。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含组氨酸、氯化钠、海藻糖和聚山梨醇酯80。在一个实施方案中，本发明的制剂包含约5mM至约100mM组氨酸、约10mM至约300mM氯化钠、约0.3％至约10％海藻糖和约0.005％至约0.1％聚山梨醇酯80，其中所述制剂具有约5.0至约7.0的pH。在另一个实施方案中，本发明的制剂包含约5mM至约50mM组氨酸、约50mM至约200mM氯化钠、约1％至约8％海藻糖和约0.01％至约0.05％聚山梨醇酯80，其中所述制剂具有约5.5至约6.5的pH。在又一个实施方案中，本发明的制剂包含约10mM组氨酸、约75mM氯化钠、约4％海藻糖和约0.02％聚山梨醇酯80，其中所述制剂具有约6.0的pH。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含组氨酸、氯化钠和海藻糖。在一个实施方案中，本发明的制剂包含5mM至100mM组氨酸、10mM至300mM氯化钠和0.3％至10％海藻糖，其中所述制剂具有5.0至7.0的pH。在另一个实施方案中，本发明的制剂包含5mM至50mM组氨酸、50mM至200mM氯化钠和1％至8％海藻糖，其中所述制剂具有5.5至6.5的pH。在又一个实施方案中，本发明的制剂包含10mM组氨酸、75mM氯化钠和4％海藻糖，其中所述制剂具有6.0的pH。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含组氨酸、氯化钠、海藻糖和聚山梨醇酯80。在一个实施方案中，本发明的制剂包含5mM至100mM组氨酸、10mM至300mM氯化钠、0.3％至10％海藻糖和0.005％至0.1％聚山梨醇酯80，其中所述制剂具有5.0至7.0的pH。在另一个实施方案中，本发明的制剂包含5mM至50mM组氨酸、50mM 至200mM氯化钠、1％至8％海藻糖和0.01％至0.05％聚山梨醇酯80，其中所述制剂具有5.5至6.5的pH。在又一个实施方案中，本发明的制剂包含10mM组氨酸、75mM氯化钠、4％海藻糖和0.02％聚山梨醇酯80，其中所述制剂具有6.0的pH。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含约1mg/ml至约100mg/ml本发明的抗CD 19抗体、约20mM组氨酸、约75mM氯化钠、约4％海藻糖和约0.02％聚山梨醇酯80，其中所述制剂具有约6.0的pH。在另一个实施方案中，本发明的制剂包含约100mg/ml本发明的抗CD 19抗体、约20mM组氨酸、约75mM氯化钠、约4％海藻糖和约0.02％聚山梨醇酯80，其中所述制剂具有约6.0的pH。在另一个实施方案中，本发明的制剂包含约100mg/ml本发明的抗CD 19抗体、约20mM组氨酸；约75mM氯化钠；约4％海藻糖；和约0.01％、约0.02％、约0.04％、约0.08％或约0.1％聚山梨醇酯80；和约6.0的pH。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含约1mg/ml至约60mg/ml本发明的抗CD 19抗体、约10mM组氨酸、约75mM氯化钠和约4％海藻糖，其中所述制剂具有约6.0的pH。在另一个实施方案中，本发明的制剂包含约10mg/ml本发明的抗CD 19抗体、约10mM组氨酸、约75mM氯化钠和约4％海藻糖，其中所述制剂具有约6.0的pH。在另一个实施方案中，本发明的制剂包含约50mg/ml本发明的抗CD 19抗体、约10mM组氨酸、约75mM氯化钠和约4％海藻糖，其中所述制剂具有约6.0的pH。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不结合于所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含约1mg/ml至约60mg/ml本发明的抗CD 19抗体、约10mM组氨酸、约75mM氯化钠、约4％海藻糖和约0.02％聚山梨醇酯80，其中所述制剂具有约6.0的pH。在另一个实施方案中，本发明的制剂包含约10mg/ml本发明的抗CD 19抗体、约10mM组氨酸、约75mM氯化钠、约4％海藻糖和约0.02％聚山梨醇酯80，其中所述制剂具有约6.0的pH。在另一个实施方案中，本发明的制剂包含约50mg/ml本发明的抗CD 19抗体、约10mM组氨酸、约75mM氯化钠、约4％海藻糖和约0.02％聚山梨醇酯80，其中所述制剂具有约6.0的pH。在另一个实施方案中，本发明的制剂包含多达100mg/ml本发明的抗CD 19抗体、约10mM组氨酸、约75mM氯化钠、约4％海藻糖和约0.02％聚山梨醇酯80，其中所述制剂具有约6.0的pH。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ IDNO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不结合于所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含1mg/ml至60mg/ml本发明的抗CD 19抗体、10mM组氨酸、75mM氯化钠和4％海藻糖，其中所述制剂具有6.0的pH。在另一个实施方案中，本发明的制剂包含10mg/ml本发明的抗CD 19抗体、10mM组氨酸、75mM氯化钠和4％海藻糖，其中所述制剂具有6.0的pH。在另一个实施方案中，本发明的制剂包含50mg/ml本发明的抗CD 19抗体、10mM组氨酸、75mM氯化钠和4％海藻糖，其中所述制剂具有6.0的pH。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不与所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖结合。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含1mg/ml至60mg/ml本发明的抗CD 19抗体、10mM组氨酸、75mM氯化钠、4％海藻糖和0.02％聚山梨醇酯80，其中所述制剂具有6.0的pH。在另一个实施方案中，本发明的制剂包含10mg/ml本发明的抗CD 19抗体、10mM组氨酸、75mM氯化钠、4％海藻糖和0.02％聚山梨醇酯80，其中所述制剂具有6.0的pH。在另一个实施方案中，本发明的制剂包含50mg/ml本发明的抗CD 19抗体、10mM组氨酸、75mM氯化钠、4％海藻糖和0.02％聚山梨醇酯80，其中所述制剂具有6.0的pH。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQID NO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不与所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖结合。

在一个实施方案中，本发明的制剂包括约1mg/ml至约60mg/ml本发明的抗CD 19抗体、约10mM组氨酸、约75mM氯化钠和约4％海藻糖，其中所述制剂具有约6.0的pH。在另一个实施方案中，本发明的制剂包括约10mg/ml本发明的抗CD 19抗体、约10mM组氨酸、约75mM氯化钠和约4％海藻糖，其中所述制剂具有约6.0的pH。在另一个实施方案中，本发明的制剂包括约50mg/ml本发明的抗CD 19抗体、约10mM组氨酸、约75mM氯化钠和约4％海藻糖，其中所述制剂具有约6.0的pH。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不结合于所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖。

在一个实施方案中，本发明的制剂包括约1mg/ml至约60mg/ml本发明的抗CD 19抗体、约10mM组氨酸、约75mM氯化钠、约4％海藻糖和约0.02％聚山梨醇酯80，其中所述制剂具有约6.0的pH。在另一个实施方案中，本发明的制剂包括约10mg/ml本发明的抗CD 19抗体、约10mM组氨酸、约75mM氯化钠、约4％海藻糖和约0.02％聚山梨醇酯80，其中所述制剂具有约6.0的pH。在另一个实施方案中，本发明的制剂包括约50mg/ml本发明的抗CD 19抗体、约10mM组氨酸、约75mM氯化钠、约4％海藻糖和约0.02％聚山梨醇酯80，其中所述制剂具有约6.0的pH。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不与所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖结合。

在一个实施方案中，本发明的制剂包括1mg/ml至60mg/ml本发明的抗CD 19抗体、10mM组氨酸、75mM氯化钠和4％海藻糖，其中所述制剂具有6.0的pH。在另一个实施方案中，本发明的制剂包括10mg/ml本发明的抗CD 19抗体、10mM组氨酸、75mM氯化钠和4％海藻糖，其中所述制剂具有6.0的pH。在另一个实施方案中，本发明的制剂包括50mg/ml本发明的抗CD 19抗体、10mM组氨酸、75mM氯化钠和4％海藻糖，其中所述制剂具有6.0的pH。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不结合于所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖。

在一个实施方案中，本发明的制剂包括10、25、50或100mg/mL、60mg/ml本发明的抗CD 19抗体、10mM组氨酸、75mM氯化钠和4％海藻糖，其中所述制剂具有6.0的pH。在另一个实施方案中，本发明的制剂包括10mg/ml本发明的抗CD 19抗体、10mM组氨酸、75mM氯化钠和4％海藻糖，其中所述制剂具有6.0的pH。在另一个实施方案中，本发明的制剂包括25mg/ml本发明的抗CD 19抗体、10mM组氨酸、75mM氯化钠和4％海藻糖，其中所述制剂具有6.0的pH。在另一个实施方案中，本发明的制剂包括50mg/ml本发明的抗CD 19抗体、10mM组氨酸、75mM氯化钠和4％海藻糖，其中所述制剂具有6.0的pH。在另一个实施方案中，本发明的制剂包括100mg/ml本发明的抗CD 19抗体、10mM组氨酸、75mM氯化钠和4％海藻糖，其中所述制剂具有6.0的pH。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不结合于所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖。

在一个实施方案中，本发明的制剂包括1mg/ml至60mg/ml本发明的抗CD 19抗体、10mM组氨酸、75mM氯化钠、4％海藻糖和0.02％聚山梨醇酯80，其中所述制剂具有6.0的pH。在另一个实施方案中，本发明的制剂包括10mg/ml本发明的抗CD 19抗体、10mM组氨酸、75mM氯化钠、4％海藻糖和0.02％聚山梨醇酯80，其中所述制剂具有6.0的pH。在另一个实施方案中，本发明的制剂包括50mg/ml本发明的抗CD 19抗体、10mM组氨酸、75mM氯化钠、4％海藻糖和0.02％聚山梨醇酯80，其中所述制剂具有6.0的pH。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQID NO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不与所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖结合。

在一个实施方案中，本发明的制剂包括10、25、50或100mg/mL本发明的抗CD 19抗体、10mM组氨酸、75mM氯化钠、4％海藻糖和0.02％聚山梨醇酯80，其中所述制剂具有6.0的pH。在另一个实施方案中，本发明的制剂包括10mg/ml本发明的抗CD 19抗体、10mM组氨酸、75mM氯化钠、4％海藻糖和0.02％聚山梨醇酯80，其中所述制剂具有6.0的pH。在另一个实施方案中，本发明的制剂包括25mg/ml本发明的抗CD 19抗体、10mM组氨酸、75mM氯化钠、4％海藻糖和0.02％聚山梨醇酯80，其中所述制剂具有6.0的pH。在另一个实施方案中，本发明的制剂包括50mg/ml本发明的抗CD 19抗体、10mM组氨酸、75mM氯化钠、4％海藻糖和0.02％聚山梨醇酯80，其中所述制剂具有6.0的pH。在另一个实施方案中，本发明的制剂包括100mg/ml本发明的抗CD 19抗体、10mM组氨酸、75mM氯化钠、4％海藻糖和0.02％聚山梨醇酯80，其中所述制剂具有6.0的pH。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不结合于所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖。

在一个实施方案中，本发明的制剂是无热原制剂，其大致上不含内毒素和/或相关热原物质。内毒素包括局限在微生物内，只有当微生物破裂或死亡才释放的毒素。热原物质还包括来自细菌和其它微生物外膜、引起发烧的热稳定物质(糖蛋白)。这两种物质在施用人时都可导致发烧、低血压和休克。由于可能的有害作用，即使低量内毒素也必须从静脉施用药物溶液中去除。对于静脉药物应用，食品药品管理局(“FDA”)设定了在一小时阶段5内毒素单位(EU)/剂量/千克体重的上限(The United States Pharmacopeial Convention，PharmacopeialForum 26(1)：223(2000))。当以每千克体重数百或数千毫克施用治疗性蛋白时，如可以是用抗体的情况，必须去除即使痕量的有害和危险内毒素。在某些特定的实施方案中，组合物中内毒素和热原的水平少于10EU/mg、或少于5EU/mg、或少于1EU/mg、或少于0.1EU/mg、或少于0.01EU/mg、或少于0.001EU/mg。

用于体内施用时，本发明的制剂应当是无菌的。本发明的制剂可通过各种灭菌方法灭菌，包括无菌过滤、放射等。在一个实施方案中，抗体制剂用预灭菌的0.22-微米滤器过滤灭菌。注射用无菌组合物可按照常规药学实践配制，如“Remington：The Science & Practice ofPharmacy(雷明顿药学理论和实践)”，第21版，Lippincott Williams &Wilkins，(2005)所述。包含抗体(诸如本文公开的那些)的制剂通常可以冻干形式或以溶液储存。预期包含抗体的无菌组合物放置在具有无菌入口的容器中，例如，具有允许取回制剂的衔接头(诸如皮下注射针头可刺穿的瓶塞)的静脉溶液包或小瓶。在一个实施方案中，本发明的组合物以预填充注射器提供。在一个实施方案中，注射器具有高透明度、低水蒸气和氧渗透性、以及无钨残留。在另一个实施方案中，本发明的组合物以预填充无钨注射器提供，例如“ultra-100”注射器。在另一个实施方案中，注射器为Clearject^TM(Geresheimer，AG，Germany)或InJentle^TM(SCHOTT Pharmaceutical Packaging，Germany)注射器。

【6.2.制剂稳定性】

在一个实施方案中，本发明的制剂稳定抗CD 19抗体。在一个实施方案中，本发明的制剂阻止抗CD 19抗体或其片段聚集。在另一个实施方案中，本发明的制剂阻止抗CD 19抗体或其片段片段化。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不与所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖结合。

在一个实施方案中，本发明的制剂经在约40℃储存至少约1周、至少约2周、至少约3周或至少约4周后是稳定的。在一个实施方案中，本发明的制剂经在约40℃储存至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月或至少约6个月后是稳定的。在特定的实施方案中，本发明的制剂经在预填充注射器中储存后是稳定的。

在一个实施方案中，本发明的制剂经在约25℃储存至少约1周、至少约2周、至少约3周或至少约4周后是稳定的。在一个实施方案中，本发明的制剂经在约25℃储存至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月或至少约6个月后是稳定的。在特定的实施方案中，本发明的制剂经在预填充注射器中储存后是稳定的。

在一个实施方案中，本发明的制剂经在约5℃储存至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月或至少约12个月后是稳定的。在一个实施方案中，本发明的制剂经在约5℃储存至少约1年、至少约2年、至少约3年、至少约4年、至少约5年、至少约6年、至少约7年、至少约8年、至少约9年、至少约10年、至少约11年或至少约12年后是稳定的。在特定的实施方案中，本发明的制剂经在预填充注射器中储存后是稳定的。

在一个实施方案中，本发明的制剂经在约40℃储存约1周、约2周、约3周或约4周后是稳定的。在一个实施方案中，本发明的制剂经在约40℃储存约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月或约6个月后是稳定的。在特定的实施方案中，本发明的制剂经在预填充注射器中储存后是稳定的。

在一个实施方案中，本发明的制剂经在约25℃储存约1周、约2周、约3周或约4周后是稳定的。在一个实施方案中，本发明的制剂经在约25℃储存约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月或约6个月后是稳定的。在特定的实施方案中，本发明的制剂经在预填充注射器中储存后是稳定的。

在一个实施方案中，本发明的制剂经在约5℃储存约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月或约12个月后是稳定的。在一个实施方案中，本发明的制剂经在约5℃储存约1年、约2年、约3年、约4年、约5年、约6年、约7年、约8年、约9年、约10年、约11年或约12年后是稳定的。在特定的实施方案中，本发明的制剂经在预填充注射器中储存后是稳定的。

在一个实施方案中，本发明的制剂经在约-10℃、约-15℃、约-25℃、约-30℃、约-35℃、约-35℃、约-45℃、约-50℃、约-55℃、约-60℃、约-65℃、约-70℃约-75℃、约-80℃储存后是稳定的。在特定的实施方案中，本发明的制剂经在预填充注射器中于这些温度下储存后是稳定的。

本发明提供包含本发明的抗CD 19抗体的稳定液体制剂。可通过HPSEC、反相色谱、静态光散射(SLS)、动态光散射(DLS)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、圆二色性(CD)、尿素解折叠技术、色氨酸固有荧光、差示扫描量热法和/或ANS结合技术测量与包含参考抗体的参考制剂相比的聚集、降解或片段化程度，从而评估所述抗体的稳定性。例如，参考制剂可以是冷冻于-70℃下，在包含75mM NaCl和4％海藻糖的10mM组氨酸(pH 6.0)中由10mg/ml参考抗体(包括其抗体片段)(例如但不限于，包含16C4可变区且具有复杂的N-糖苷-连接的糖链的Fc区，其中岩藻糖不结合于所述糖链还原端中的N-乙酰基葡糖胺的抗体)组成的参考标准品，该参考制剂由HPSEC规则地获得单个单体峰(如，≥95％面积)。在某些实施方案中，参考制剂与检验稳定性的制剂相同；参考制剂在稳定性检验期间可在-70℃冷冻以保留参考制剂在其最初状态。例如，用于评价在40℃储存的制剂中CD 19结合活性的任何损失的参考标准品可以是在-70℃储存30天的相同制剂。可利用分离的抗原分子用多种免疫测定评价包含抗体(包括其抗体片段)的制剂的总体稳定性，包括例如，ELISA和利用分离的抗原分子的放射性免疫测定。而且，包含抗体的制剂的稳定性还可利用设计为测量抗体功能特征的各种测定来评价，例如，设计为测量抗原结合亲和性、体外ADCC活性、体内消耗活性、体外CDC活性的测定。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其具有参考抗体的CD 19结合活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的CD 19结合活性，其中所述制剂在约40℃储存至少约1周、至少约2周、至少约3周或至少约4周。在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其具有参考抗体的CD 19结合活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的CD 19结合活性，其中所述制剂在约40℃储存至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月或至少约6个月。在特定的实施方案中，本发明的制剂储存于预填充注射器中。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不结合于所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其具有参考抗体的CD 19结合活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的CD 19结合活性，其中所述制剂在约25℃储存至少约1周、至少约2周、至少约3周或至少约4周。在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其具有参考抗体的CD 19结合活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的CD 19结合活性，其中所述制剂在约25℃储存至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月或至少约6个月。在特定的实施方案中，本发明的制剂储存于预填充注射器中。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不与所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖结合。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其具有参考抗体的CD 19结合活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的CD 19结合活性，其中所述制剂在约5℃储存至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月或至少约12个月。在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其具有参考抗体的CD 19结合活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的CD 19结合活性，其中所述制剂在约5℃储存至少约1年、至少约2年、至少约3年、至少约4年、至少约5年、至少约6年、至少约7年、至少约8年、至少约9年、至少约10年、至少约11年或至少约12年。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不结合于所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其具有参考抗体的CD 19结合活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的CD 19结合活性，其中所述制剂在约40℃储存约1周、约2周、约3周或约4周。在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其具有参考抗体的CD 19结合活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的CD 19结合活性，其中所述制剂在约40℃储存约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月或约6个月。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不结合于所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其具有参考抗体的CD 19结合活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的CD 19结合活性，其中所述制剂在约25℃储存约1周、约2周、约3周或约4周。在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其具有参考抗体的CD 19结合活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的CD 19结合活性，其中所述制剂在约25℃储存约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月或约6个月。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不与所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖结合。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其具有参考抗体的CD 19结合活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的CD 19结合活性，其中所述制剂在约5℃储存约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月或约12个月。在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其具有参考抗体的CD 19结合活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的CD 19结合活性，其中所述制剂在约5℃储存约1年、约2年、约3年、约4年、约5年、约6年、约7年、约8年、约9年、约10年、约11年或约12年。在特定的实施方案中，本发明的制剂储存于预填充注射器中。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗 CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不与所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖结合。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其中在所述制剂在约40℃储存至少约1周、至少约2周、至少约3周或至少约4周的期间，该抗体损失至多50％、至多40％、至多30％、至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的其CD 19结合活性。在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其中在所述制剂在约40℃储存至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月或至少约6个月的期间，该抗体损失至多50％、至多40％、至多30％、至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的其CD 19结合活性。在特定的实施方案中，本发明的制剂储存于预填充注射器中。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不与所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖结合。本文所用的术语“至多”和“不超过”具有相同的含义。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其中在所述制剂在约40℃储存至少约1周、至少约2周、至少约3周或至少约4周的期间，该抗体损失至多50％、至多40％、至多30％、至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的其CD 19结合活性。在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其中在所述制剂在约40℃储存至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月或至少约6个月的期间，该抗体损失至多50％、至多40％、至多30％、至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的其CD 19结合活性。在特定的实施方案中，本发明的制剂储存于预填充注射器中。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不结合于所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其中在所述制剂在约25℃储存至少约1周、至少约2周、至少约3周或至少约4周的期间，该抗体损失至多50％、至多40％、至多30％、至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的其CD 19结合活性。在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其中在所述制剂在约25℃储存至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月或至少约6个月的期间，该抗体损失至多50％、至多40％、至多30％、至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的其CD 19结合活性。在特定的实施方案中，本发明的制剂储存于预填充注射器中。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不结合于所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其中在所述制剂在约5℃储存至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月或至少约12个月的期间，该抗体损失至多50％、至多40％、至多30％、至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的其CD 19结合活性。在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其中在所述制剂在约5℃储存至少约1年、至少约2年、至少约3年、至少约4年、至少约5年、至少约6年、至少约7年、至少约8年、至少约9年、至少约10年、至少约11年或至少约12年的期间，该抗体损失至多50％、至多40％、至多30％、至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的其CD 19结合活性。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ IDNO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不结合于所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其中在所述制剂在约40℃储存约1周、约2周、约3周或约4周的期间，该抗体损失至多50％、至多40％、至多30％、至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的其CD 19结合活性。在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其中在所述制剂在约40℃储存约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月或约6个月的期间，该抗体损失至多50％、至多40％、至多30％、至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的其CD 19结合活性。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不与所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖结合。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其中在所述制剂在约25℃储存约1周、约2周、约3周或约4周的期间，该抗体损失至多50％、至多40％、至多30％、至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的其CD 19结合活性。在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其中在所述制剂在约25℃储存约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月或约6个月的期间，该抗体损失至多50％、至多40％、至多30％、至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的其CD 19结合活性。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不与所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖结合。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其中在所述制剂在约5℃储存约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月或约12个月的期间，该抗体损失至多50％、至多40％、至多30％、至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的其CD 19结合活性。在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其中在所述制剂在约5℃储存约1年、约2年、约3年、约4年、约5年、约6年、约7年、约8年、约9年、约10年、约11年或约12年的期间，该抗体损失至多50％、至多40％、至多30％、至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的其CD 19结合活性。在特定的实施方案中，本发明的制剂储存于预填充注射器中。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不与所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖结合。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其中经在约40℃储存至少约1周、至少约2周、至少约3周或至少约4周后，通过HPSEC确定少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体形成聚集体。在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其中经在约40℃储存至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月或至少约6个月后，通过HPSEC确定少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体形成聚集体。在特定的实施方案中，本发明的制剂储存于预填充注射器中。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不与所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖结合。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其中经在约25℃储存至少约1周、至少约2周、至少约3周或至少约4周后，通过HPSEC确定少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体形成聚集体。在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其中经在约25℃储存至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月或至少约6个月后，通过HPSEC确定少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体形成聚集体。在特定的实施方案中，本发明的制剂储存于预填充注射器中。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不结合于所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其中在约5℃储存至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月或至少约12个月后，通过HPSEC确定少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体形成聚集体。在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其中在约5℃储存至少约1年、至少约2年、至少约3年、至少约4年、至少约5年、至少约6年、至少约7年、至少约8年、至少约9年、至少约10年、至少约11年或至少约12年后，通过HPSEC确定少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体形成聚集体。在特定的实施方案中，本发明的制剂储存于预填充注射器中。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ IDNO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不结合于所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其中经在约40℃储存约1周、约2周、约3周或约4周后，通过HPSEC确定少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体形成聚集体。在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其中经在约40℃储存约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月或约6个月后，通过HPSEC确定少于1％、少于 2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体形成聚集体。在特定的实施方案中，本发明的制剂储存于预填充注射器中。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不结合于所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其中经在约25℃储存约1周、约2周、约3周或约4周后，通过HPSEC确定少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体形成聚集体。在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其中经在约25℃储存约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月或约6个月后，通过HPSEC确定少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体形成聚集体。在特定的实施方案中，本发明的制剂储存于预填充注射器中。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不结合于所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其中经在约5℃储存约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月或约12个月后，通过HPSEC确定少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体形成聚集体。在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其中经在约5℃储存约1年、约2年、约3年、约4年、约5年、约6年、约7年、约8年、约9年、约10年、约11年或约12年后，通过HPSEC确定少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体形成聚集体。在特定的实施方案中，本发明的制剂储存于预填充注射器中。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不与所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖结合。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其中经在约40℃储存至少约1周、至少约2周、至少约3周或至少约4周后，通过RP-HPLC或SEC确定少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体被片段化。在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其中经在约40℃储存至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月或至少约6个月后，通过RP-HPLC或SEC确定少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体被片段化。在特定的实施方案中，本发明的制剂储存于预填充注射器中。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不与所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖结合。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其中经在约25℃储存至少约1周、至少约2周、至少约3周或至少约4周后，通过RP-HPLC或SEC确定少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体被片段化。在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其中经在约25℃储存至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月或至少约6个月后，通过RP-HPLC或SEC确定少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体被片段化。在特定的实施方案中，本发明的制剂储存于预填充注射器中。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不结合于所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其中经在约5℃储存至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月或至少约12个月后，通过RP-HPLC或SEC确定少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体被片段化。在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其中经在约5℃储存至少约1年、至少约2年、至少约3年、至少约4年、至少约5年、至少约6年、至少约7年、至少约8年、至少约9年、至少约10年、至少约11年或至少约12年后，通过RP-HPLC或SEC确定少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体被片段化。在特定的实施方案中，本发明的制剂储存于预填充注射器中。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不与所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖结合。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其中经在约40℃储存约1周、约2周、约3周或约4周后，通过RP-HPLC或SEC确定少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体被片段化。在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其中经在约40℃储存约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月或约6个月后，通过RP-HPLC或SEC确定少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体被片段化。在特定的实施方案中，本发明的制剂储存于预填充注射器中。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不结合于所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其中经在约25℃储存约1周、约2周、约3周或约4周后，通过RP-HPLC或SEC确定少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体被片段化。在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其中经在约25℃储存约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月或约6个月后，通过RP-HPLC或SEC确定少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体被片段化。在特定的实施方案中，本发明的制剂储存于预填充注射器中。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不与所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖结合。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其中经在约5℃储存约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月或约12个月后，通过RP-HPLC或SEC确定少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体被片段化。在一个实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其中经在约5℃储存约1年、约2年、约3年、约4年、约5年、约6年、约7年、约8年、约9年、约10年、约11年或约12年后，通过RP-HPLC或SEC确定少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体被片段化。在特定的实施方案中，本发明的制剂储存于预填充注射器中。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不与所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖结合。

在一个实施方案中，本发明的制剂经在约40℃储存至少约1周、至少约2周、至少约3周或至少约4周后，通过肉眼检查确定是澄清的和无色的。在一个实施方案中，本发明的制剂经在约40℃储存至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月或至少约6个月后，通过肉眼检查确定是澄清的和无色的。在特定的实施方案中，本发明的制剂储存于预填充注射器中。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不结合于所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖。

在一个实施方案中，本发明的制剂经在约25℃储存至少约1周、至少约2周、至少约3周或至少约4周后，通过肉眼检查确定是澄清的和无色的。在一个实施方案中，本发明的制剂经在约25℃储存至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月或至少约6个月后，通过肉眼检查确定是澄清的和无色的。在特定的实施方案中，本发明的制剂储存于预填充注射器中。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不结合于所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖。

在一个实施方案中，本发明的制剂经在约5℃储存至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月或至少约12个月后，通过肉眼检查确定是澄清的和无色的。在一个实施方案中，本发明的制剂经在约5℃储存至少约1年、至少约2年、至少约3年、至少约4年、至少约5年、至少约6年、至少约7年、至少约8年、至少约9年、至少约10年、至少约11年或至少约12年后，通过肉眼检查确定是澄清的和无色的。在特定的实施方案中，本发明的制剂储存于预填充注射器中。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不结合于所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖。

在一个实施方案中，本发明的制剂经在约40℃储存约1周、约2周、约3周或约4周后，通过肉眼检查确定是澄清的和无色的。在一个实施方案中，本发明的制剂经在约40℃储存约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月或约6个月后，通过肉眼检查确定是澄清的和无色的。在特定的实施方案中，本发明的制剂储存于预填充注射器中。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ IDNO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不与所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖结合。

在一个实施方案中，本发明的制剂经在约25℃储存约1周、约2周、约3周或约4周后，通过肉眼检查确定是澄清的和无色的。在一个实施方案中，本发明的制剂经在约25℃储存约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月或约6个月后，通过肉眼检查确定是澄清的和无色的。在特定的实施方案中，本发明的制剂储存于预填充注射器中。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ IDNO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不与所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖结合。

在一个实施方案中，本发明的制剂经在约5℃储存约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月或约12个月后，通过肉眼检查确定是澄清的和无色的。在一个实施方案中，本发明的制剂经在约5℃储存约1年、约2年、约3年、约4年、约5年、约6年、约7年、约8年、约9年、约10年、约11年或约12年后，通过肉眼检查确定是澄清的和无色的。在特定的实施方案中，本发明的制剂储存于预填充注射器中。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ IDNO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不与所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖结合。

在某些实施方案中，本发明的制剂经例如在室温或4℃储存长时间(例如但不限于：1周、1个月、6个月、1年、2年、3年或5年)或在高温例如38℃-42℃储存一段时间(诸如但不限于，1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月或6个月)后保持改进的聚集特性。在某些实施方案中，所述制剂经在暴露于光下储存或在多种湿度条件(包括但不限于多达10％、或多达20％、或多达30％、或多达40％、或多达50％、或多达60％、或多达70％、或多达80％、或多达90％、或多达100％的相对湿度)下于暗处储存后保持改进的聚集特性。本领域应理解的是，术语“环境”条件通常是指温度为约20℃、相对湿度为10％至60％，并暴露于光。类似地，温度为约2℃至约8℃、相对湿度少于约10％总称为“4℃”或“5℃”，温度为约23℃至约27℃、相对湿度为约60％总称为“25℃”，温度为约38℃至约42℃、相对湿度为约75％总称为“40℃”。在特定的实施方案中，本发明的制剂储存在预填充注射器中。

在某些实施方案中，本发明的制剂经在4℃储存至少一个月后，通过颗粒计数仪确定，包含(或由其作为聚集体级分组成)的颗粒特性是少于约3.4E+5个颗粒/ml且直径2-4μm、少于约4.0E+4个颗粒/ml且直径4-10μm、少于约4.2E+3个颗粒/ml且直径10-20μm、少于约5.0E+2个颗粒/ml且直径20-30μm、少于约7.5E+1个颗粒/ml且直径30-40μm、以及少于约9.4个颗粒/ml且直径40-60μm。在某些实施方案中，本发明的制剂包含大于40μm或大于30μm的不可检测的颗粒。在特定的实施方案中，本发明的制剂储存在预填充注射器中。

在某些实施方案中，表面活性剂可被加入到制剂中以增强包含抗CD 19抗体的组合物的贮存稳定性。已经发现，包含此类表面活性剂的本发明的制剂经更长的时间后同时在不同储存条件下具有增强的贮存稳定性。这种增强的稳定性可包括抑制在储存的制剂中的颗粒形成，同时保留抗CD 19抗体的纯度。这种增强的稳定性可进一步包括在不同的条件下抗CD 19抗体的活性的保留。在某些实施方案中，本发明的制剂包含表面活性剂、聚山梨醇酯80。在另一个实施方案中，聚山梨醇酯80以足以使组合物储存稳定化的量(例如约0.01％、约0.02、约0.04％、约0.08％或约0.1％聚山梨醇酯80重量每体积)被加入到抗CD 19抗体制剂。“贮存稳定化”由此是指抑制经一定时间后和在储存条件下污染物或颗粒在本发明的制剂中的生成以在药学上可接受的水平内，同时保留组合物的纯度。

本领域已知多种可用于确定蛋白制剂(例如，本发明的抗体制剂)中存在的聚集体的聚集程度、和/或类型和/或大小的方法，包括但不限于，尺寸排阻色谱(SEC)、高效尺寸排阻色谱(HPSEC)、静态光散射(SLS)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、圆二色性(CD)、脲引起的蛋白解折叠技术、色氨酸固有荧光、差示扫描量热法和1-苯胺基-8-萘磺酸(ANS)蛋白结合技术。例如，可经由将分子通过填充有适当树脂的柱来进行尺寸排阻色谱(SEC)以基于分子大小分离分子，较大分子(如，聚集体)将比较小的分子(如，单体)先洗脱。分子通常由紫外光在280nm检测，并可为进一步表征而收集。对SEC分析通常使用高压液相色谱柱(HP-SEC)。特定的SEC方法在以下题目为“实施例”的部分中详述。可选地，可使用分析超离心(AUC)。AUC是确定大分子在液体样品中沉降系数(在Svedberg，S中报告)的正交技术。可选地，可使用分析超离心(AUC)。类似SEC，AUC能够分离和检测抗体片段/聚集体与单体，并且进一步能够提供关于分子质量的信息。制剂中的蛋白聚集还可由利用库尔特计数器的颗粒计数器分析或利用浊度计的浊度测量来表征。浊度是溶液中的颗粒借此散射光的量的量度，因此可用作蛋白聚集的一般指示。此外，非还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)或毛细管凝胶电泳(CGE)可用于表征本发明制剂中抗体或其片段的聚集和/或片段化状态。

在一个实施方案中，本发明的制剂用于胃肠外施用。在一个实施方案中，本发明的制剂是注射制剂。在一个实施方案中，本发明的制剂用于静脉内、皮下或肌内施用。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其中所述制剂用于皮下注射。在特定的实施方案中，本发明的制剂储存于预填充注射器中。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，其包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不与所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖结合。

在一个实施方案中，本发明的制剂用于静脉内施用，其中所述制剂包含约1mg/ml至约40mg/ml的本发明的抗CD 19抗体。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不与所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖结合。

在一个实施方案中，本发明的制剂用于皮下施用，其中所述制剂包含约1mg/ml至约100mg/ml的本发明的抗CD 19抗体。在特定的实施方案中，本发明的制剂在预填充注射器中提供。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQID NO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不与所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖结合。

在一个实施方案中，本发明的制剂用于气溶胶施用。

本发明还提供了适用于胃肠外施用于人的药物单位剂型，其包含在适当容器中的抗CD 19抗体制剂。在一个实施方案中，本发明的药物单位剂量包含静脉内、皮下或肌内递送的抗CD 19抗体制剂。在另一个实施方案中，本发明的药物单位剂量包含气溶胶递送的抗CD 19抗体制剂。在特定的实施方案中，本发明的药物单位剂量包含皮下递送的抗CD 19抗体制剂。在另一个实施方案中，本发明的药物单位剂量包含气溶胶递送的抗CD 19抗体制剂。在又一个实施方案中，本发明的药物单位剂量包含鼻内施用的抗CD 19抗体制剂。在一个实施方案中，适当的容器是预填充注射器。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQ ID NO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不与所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖结合。

在一个实施方案中，本发明的制剂在密封容器中提供。在特定的实施方案中，本发明的制剂在预填充注射器中提供。在特定的实施方案中，本发明的制剂包含抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含SEQID NO：104的重链可变区、SEQ ID NO：111的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不结合于所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖。

本发明进一步提供包含抗CD 19本发明的抗体制剂的试剂盒。

本发明还涉及治疗和预防B细胞介导的疾病和病症的方法。本发明还提供了预防、控制、治疗或缓解B细胞介导的疾病和病症(例如炎性疾病或病症、自身免疫性疾病或病症或者增殖性疾病或病症)的方法。在一个实施方案中，本发明的方法包括向需要其的受治疗者施用预防性或治疗性有效量的抗CD 19抗体制剂。

在一个实施方案中，用于预防、治疗、控制或缓解疾病或病症的本发明的方法还包括向所述受治疗者施用除特异性结合CD 19的抗体或抗体片段之外的、预防性或治疗性有效量的预防或治疗剂。

在一个实施方案中，用于预防、治疗、控制或缓解疾病或病症的本发明的方法还包括向所述受治疗者施用除特异性结合CD 19的抗体或抗体片段之外的、预防性或治疗性有效量的预防或治疗剂，其中所述预防或治疗剂是抗炎剂、免疫调节剂、抗血管生成剂或抗癌剂。

【6.3.抗CD-19抗体】

本发明涉及结合人CD 19抗原的人、人源化或嵌合的抗CD 19抗体、以及包含那些抗体的组合物。在某些实施方案中，人、人源化或嵌合的抗CD 19抗体可介导抗原依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。在其它实施方案中，本发明涉及组合物，其包可介导人ADCC、CDC和/或凋亡的含IgG1和/或IgG3人同种型的人、人源化或嵌合的抗CD 19抗体、以及IgG2和/或IgG4人同种型的人、人源化或嵌合的抗CD 19抗体。在进一步的实施方案中，人、人源化或嵌合的抗CD 19抗体可抑制抗-IgM/CpG刺激的B细胞增殖。

本发明提供了嵌合和人源化形式的抗CD 19小鼠单克隆抗体HB12A和HB12B。在一个实施方案中，本发明的人源化抗CD 19抗体可结合于人CD 19，其亲和性相当于HB12A或HB12B的结合亲和性或相当于嵌合HB12B抗体的结合亲和性。

在一个实施方案中，本发明的人源化抗CD 19单克隆抗体可以包含VH和VK，其中VH包含四个构架区，V3-72(在Tomlinson，I.M.等，(1992)J.Mol Biol.，227，776-798中被称为DP29)的人种系VH区段的FW1、FW2和FW3和人种系JH4区段的FW4(Mattila，P.S.等，(1995)Eur.J.Immunol，25，2578-2582)；以及HB12B抗体的三个VH CDR序列-CDR1(SEQ ID NO：22)、CDR2(SEQ ID NO：24)和CDR3(SEQ ID NO：26)；并且VK包含四个构架区，人种系Vκ区段A10的FW1、FW2、FW3(Straubinger，B.I等，(1988)Biol.Chem.Hoppe-Seyler，369，601-607)和人种系免疫球蛋白κJ4区段的FW4(Hieter，P.A.等，(1982)J.Biol.Chem.，257，1516-1522)；以及HB12B抗体的三个VK CDR序列CDR1(SEQ ID NO：28)、CDR2(SEQID NO：30)和CDR3(SEQ ID NO：32)。在一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体可以包含VH和VK，其中VH包含四个构架区，V3-72的人种系VH区段的FW1、FW2和FW3(在Tomlinson，I.M.等，(1992)J.Mol Biol，227，776-798中被称为DP29)和人种系JH4区段的FW4(Mattila，P.S.等，(1995)Eur.J.Immunol，25，2578-2582)；和具有前文表1所列出的CDR的氨基酸序列的至少一个CDR；且VK包含四个构架区，人种系Vκ区段A10的FW1、FW2、FW3(Straubinger，B.I等，(1988)Biol.Chem.Hoppe-Seyler，369，601-607)和人种系免疫球蛋白κJ4区段的FW4(Hieter，P.A.等，(1982)J.Biol.Chem.，257，1516-1522)；和具有前文表1所列出的CDR的氨基酸序列的至少一个CDR。在一个实施方案中，这种抗体可包含一个或多个选自Y40F、K53H和Y91F的VK构架突变。在一个实施方案中，VK构架区可含有点突变Y40F、K53H和Y91F中的每一个。在另一个实施方案中，VK构架区可仅含有Y40F和K53H点突变。在另一个实施方案中，VK构架可仅包含Y40F点突变。

【6.3.1.抗CD 19抗体的CDR区】

在某些实施方案中，本发明的抗CD 19抗体可以包含重链可变区VH，所述VH包含至少一个具有选自SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：26的氨基酸序列的CDR；且还可包含至少一个具有选自SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：42的氨基酸序列的FW区。在另一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体可以包含重链可变区VH，所述VH包含至少一个具有选自SEQ IDNO：22、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：121的氨基酸序列的CDR；且还可包含至少一个选自SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ IDNO：40和SEQ ID NO：42的氨基酸序列的FW区。在又一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体可以包含重链可变区VH，所述VH包含至少一个具有选自SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：121的氨基酸序列的CDR；且还可包含至少一个选自SEQ ID NO：36、SEQID NO：38、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：42的氨基酸序列的FW区。在又一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体可以包含重链可变区VH，所述VH包含至少一个具有选自SEQ ID NO：208、SEQ IDNO：116和SEQ ID NO：121的氨基酸序列的CDR；且还可包含至少一个选自SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40和SEQ IDNO：42的氨基酸序列的FW区。在又一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体可以包含重链可变区VH，所述VH包含至少一个具有选自SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：121的氨基酸序列的CDR；且还可包含至少一个具有选自SEQ ID NO：36、SEQ IDNO：38、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：42的氨基酸序列的FW区。在另一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体可以包含重链可变区VH，所述VH包含至少一个具有前文表1所列出的VH CDR1、VH CDR2或VH CDR3的氨基酸序列的CDR；且还可包含至少一个具有选自 SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：42的氨基酸序列的FW区。

在进一步的实施方案中，本发明的抗CD 19抗体可以包含重链可变区VH，所述VH包含至少一个选自SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：26的CDR序列。

在另外的实施方案中，抗CD 19抗体可包含重链可变区VH，所述VH包含至少一个选自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ IDNO：10的CDR序列。

在一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体可以包含重链可变区VH，所述VH包含至少一个具有选自SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：121的氨基酸序列的CDR。在另一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体可以包含重链可变区VH，所述VH包含至少一个具有选自SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：121的氨基酸序列的CDR。在另一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体可以包含重链可变区VH，所述VH包含至少一个具有选自SEQ IDNO：208、SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：121的氨基酸序列的CDR。在另一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体可以包含重链可变区VH，所述VH包含至少一个选自SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：121的氨基酸序列的CDR。

在另一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体可以包含重链可变区VH，所述VH包含至少一个具有前文表1所列出的VH CDR1、VHCDR2或VH CDR3的氨基酸序列的CDR。

在另一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体可以包含重链可变区VH，所述VH包含前文表1所列出的抗体中的任何一个的VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列。本发明的抗CD 19抗体还可包含轻链可变区VL。

在另一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体可以包含轻链可变区VL，所述VL包含前文表1所列出的抗体中的任何一个的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列。本发明的抗CD 19抗体还可包含重链可变区VH。

在另一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体可以包含前文表1所列出的抗体中的任何一个的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列。

在某些实施方案中，抗CD 19抗体可包含称作HB 12B-(3-72/JH4)的人源化VH的VH结构域序列(SEQ ID NO：34)。

在一个实施方案中，本文所述的抗CD 19抗体可以包含重链可变区VH，所述VH具有选自SEQ ID NOs：103、106、191和192的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本文所述的抗CD 19抗体可以包含重链可变区VH，所述VH具有前文表1所列出的VH结构域的氨基酸序列。

在某些实施方案中，本发明的抗CD 19抗体可以包含轻链可变区VK，所述VK包含至少一个具有选自SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR；且还可包含至少一个具有选自SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：60的氨基酸序列的FW区。

在一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体可以包含轻链可变区VK，所述VK包含至少一个具有选自SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：125和SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR；且还可包含至少一个具有选自SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：60的氨基酸序列的FW区。在又一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体可以包含轻链可变区VK，所述VK包含至少一个具有选自SEQ IDNO：211、SEQ ID NO：218和SEQ ID NO：222的氨基酸序列的CDR；且还可包含至少一个具有选自SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQID NO：72、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：58、SEQ IDNO：66和SEQ ID NO：60的氨基酸序列的FW区。在又一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体可以包含轻链可变区VK，所述VK包含至少一个具有选自SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：220和SEQ ID NO：229的氨基酸序列的CDR，且还可包含至少一个具有选自SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：60的氨基酸序列的FW区。在又一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体可以包含轻链可变区VK，所述VK包含至少一个具有选自SEQ ID NO：215、SEQ IDNO：221和SEQ ID NO：222的氨基酸序列的CDR；且还可包含至少一个具有选自SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：72、SEQ IDNO：82、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：66和SEQ IDNO：60的氨基酸序列的FW区。在另一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体可以包含轻链可变区VK，所述VK包含至少一个具有前文表1所列出的VK CDR1、VK CDR2或VK CDR3的氨基酸序列的CDR；且还可包含至少一个具有选自SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：60的氨基酸序列的FW区。

在进一步的实施方案中，本发明的抗CD 19抗体可以包含轻链可变区VK，所述VK包含至少一个选自SEQ ID NO：28、30和32的CDR序列。

在进一步的实施方案中，本发明的抗CD 19抗体可以包含轻链可变区VK，所述VK包含至少一个选自SEQ ID NO：12、14和16的CDR序列。

在一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体可以包含轻链可变区VK，所述VK包含至少一个具有选自SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：125和SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR。在一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体可以包含轻链可变区VK，所述VK包含至少一个具有选自SEQ ID NO：211、SEQ ID NO：218和SEQ ID NO：222的氨基酸序列的CDR。在一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体可以包含轻链可变区VK，所述VK包含至少一个具有选自SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：220和SEQ ID NO：229的氨基酸序列的CDR。在一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体可以包含轻链可变区VK，所述VK包含至少一个具有选自SEQ ID NO：215、SEQ ID NO：221和SEQ IDNO：222的氨基酸序列的CDR。在另一个实施方案中，本发明的抗CD19抗体可以包含轻链可变区VK，所述VK包含至少一个具有前文表1所列出的VK CDR1、VK CDR2或VK CDR3的氨基酸序列的CDR。

在某些实施方案中，抗CD 19抗体可包含选自HB12B-(A10-Jk4)(SEQ ID NO：52)、HB12B-364987(SEQ ID NO：62)、HB12B-3649(SEQ ID NO：68)、HB12B-36(SEQ ID NO：70)、7E12VK(SEQ ID NO：110)、14H5 VK(SEQ ID NO：111)、16C9 VK(113)、15D1 VK(SEQ ID NO：112)、3C3 VK(SEQ ID NO：193)、6C11 VK(SEQID NO：204)和9G7 VK(SEQ ID NO：205)的人源化VK结构域序列。

本发明包括结合人CD 19的抗体，包含本文所述的可结合于人CD 19的VH结构域、VH CDR1s、VH CDR2s、VH CDR3s、VK结构域、VK CDR1s、VK CDR2s或VK CDR3s的衍生物(参见例如前文表1所列出的变体)。本领域技术人员已知的标准技术可用于引入在编码抗体的核苷酸序列中的突变(例如，添加、缺失和/或取代)，包括例如，常规用于产生氨基酸取代的定向诱变和PCR介导的诱变。在一个实施方案中，VH和/或VK CDR衍生物可包括相比于HB12A或HB12B抗CD 19抗体的原始VH和/或VK CDR的少于25个氨基酸取代、少于20个氨基酸取代、少于15个氨基酸取代、少于10个氨基酸取代、少于5个氨基酸取代、少于4个氨基酸取代、少于3个氨基酸取代、少于2个氨基酸取代或1个氨基酸取代。在另一个实施方案中，VH和/或VK CDR衍生物可具有在一个或多个预测的非必需氨基酸残基(即，对于特异性结合人CD 19的抗体而言并不关键的氨基酸残基)上发生的保守性氨基酸取代(例如前文)。突变也也可例如通过饱和突变，随机沿着所有或部分的VH和/或VK CDR编码序列引入突变，且可筛选所得突变体的生物活性以鉴定保留活性的突变。诱变后，所编码的抗体可被表达且抗体的活性可被测定。在一个实施方案中，本文公开的本发明的抗体可排除US20050070693A1中所述的hA19抗体的VH CDR1和VH CDR2。

在一个实施方案中，本文所述的人或人源化抗CD 19抗体可以包含前文表1所列出的VH CDR中的任何一个的变体，其中所述变体VH CDR包含氨基酸取代。在特定的实施方案中，本发明的抗CD 19抗体包含前文表1所列出的VH CDR的变体，其中所述变体VH CDR包含一个或多个根据Kabat编号的下面的天然或取代的氨基酸残基：VH CDR1的位置32上的苏氨酸(T)、VH CDR2的位置60上的酪氨酸(Y)、VH CDR2的位置60上的天冬氨酸(D)、VH CDR2的位置60上的亮氨酸(L)、VH CDR2的位置61上的丙氨酸(A)、VH CDR2的位置60上的缬氨酸(V)、VH CDR3的位置100B上的酪氨酸(Y)、VHCDR3的位置100B上的精氨酸(R)、和VH CDR3的位置100B上的天冬酰胺(N)(参见，Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)。

在一个实施方案中，本文所述的人或人源化抗CD 19抗体可以包含前文表1所列出的VH CDR的变体，其中所述变体VH CDR包含一个或多个根据Kabat编号的下面的天然或取代的氨基酸残基：VHCDR1的位置33上的谷氨酸(E)、VH CDR1的位置33上的亮氨酸(L)、VH CDR1的位置35上的苯丙氨酸(F)、VH CDR1的位置35上的酪氨酸(Y)、VH CDR1的位置35上的天冬氨酸(D)、VH CDR1的位置35上的亮氨酸(L)、VH CDR2的位置57上的丝氨酸(S)、VH CDR2的位置57上的脯氨酸(P)、VH CDR2的位置57上的天冬酰胺(N)、VH CDR3的位置100B上的组氨酸(H)、VH CDR3的位置100B上的苯丙氨酸(F)和VH CDR3的位置99上的脯氨酸(P)(参见，Kabat等，Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)。

在一个实施方案中，本文所述的人或人源化抗CD 19抗体可以包含前文表1所列出的VH CDR的变体，其中所述变体VH CDR包含一个或多个根据Kabat编号的下面的天然或取代的氨基酸残基：VH CDR1的位置32上的缬氨酸(V)和VH CDR2的位置52A上的亮氨酸(L)。

在另一个实施方案中，人或人源化本发明的抗CD 19抗体可以包含前文表1所列出的VK CDR的变体，其中所述VK CDR包含一个或多个根据Kabat编号的下面的天然或取代的氨基酸残基：VK CDR1的位置27D上的组氨酸(H)、VK CDR1的位置33上的异亮氨酸(I)、VH CDR2的位置50上的谷氨酸(E)、VH CDR3的位置91上的苏氨酸(T)和VH CDR3的位置96上的异亮氨酸(I)。

在另一个实施方案中，人或人源化本发明的抗CD 19抗体可以包含前文表1所列出的VK CDR的变体，其中所述VK CDR包含一个或多个根据Kabat编号的下面的天然或取代的氨基酸残基：VK CDR1的位置27C上的异亮氨酸(I)、VK CDR1的位置30上的亮氨酸(L)、VK CDR1的位置33上的精氨酸(R)、VK CDR1的位置33上的苏氨酸(T)、VK CDR2的位置50上的酪氨酸(Y)、VK CDR2的位置54上的苏氨酸(T)、VK CDR2的位置54上的脯氨酸(P)、VK CDR2的位置55上的酪氨酸(Y)和VK CDR3的位置96上的天冬酰胺(N)。

在另一个实施方案中，人或人源化本发明的抗CD 19抗体可以包含前文表1所列出的VK CDR的变体，其中所述VK CDR包含一个或多个根据Kabat编号的下面的天然或取代的氨基酸残基：VK CDR2的位置54上的精氨酸(R)、VK CDR2的位置54上的苏氨酸(T)、VKCDR2的位置54上的丙氨酸(A)和VK CDR3的位置89上的丙氨酸(A)。

本发明还包括结合人CD 19的抗体，所述抗体或抗体片段包含一个或多个CDR，其中所述CDR包含与HB12A或HB12B抗CD 19抗体的一个或多个CDR的氨基酸序列具有至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的氨基酸序列。两个氨基酸序列的同一性百分比可通过可通过本领域技术人员已知的任何方法测定，包括但不限于BLAST蛋白质搜索。

【6.3.2.抗CD 19抗体的构架区】

在一个实施方案中，本发明的人源化抗CD 19单克隆抗体的VH可以包含与HB12B-(3-72/JH4)VH(SEQ ID NO：34)的相应构架区的氨基酸序列同一性(即，与抗体Y的FW1相比抗体X的FW1)为约64％至约100％的范围的构架区。在实施方案的某些方面，本文所述的抗体的人或人源化VH构架区与HB12B-(3-72/JH4)VH(SEQ ID NO：34)氨基酸序列同一性可以是至少64％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。

在具体的实施方案中，本文所述的抗CD 19抗体的人或人源化VH构架区与HB12B-(3-72/JH4)VH(SEQ ID NO：34)的相应构架区的氨基酸序列同一性可以为87个氨基酸中至少56个氨基酸相同(56/87)。在具体的实施方案中，VH构架氨基酸序列同一性可以是至少56/87、57/87、58/87、59/87、60/87、61/87、62/87、63/87、64/87、65/87、66/87、67/87、68/87、69/87、70/87、71、87、72/87、73/87 74/87、75/87、76/87、77.87、78/87、79/87、80/87、81/87、82/87、83/87、84/87、85/87、86/87或87/87个氨基酸。本文所述的抗CD 19抗体的VH序列可与HB12B-(3-72/JH4)的游标(Vernier)氨基酸残基具有高序列同一性，例如游标序列同一性为16个残基中至少10个残基(10/16)、至少11/16、至少12/16、至少13/16、至少14/16或至少15/16个游标残基。在另一个实施方案中，游标氨基酸残基的错配可以是保守性氨基酸取代。作为保守性氨基酸取代的错配是指错配氨基酸的物理和化学特性类似于游标氨基酸，例如，错配残基与游标残基的极性特征(极性或非极性)、酸性特征(酸性或碱性)、侧链结构(例如，支链或直链，或包含苯环、羟基部分或硫部分)相似的情况。

在其它实施方案中，游标氨基酸残基的错配可能是非保守性氨基酸取代。作为非保守性氨基酸取代的错配是指错配氨基酸的物理和化学特性与游标氨基酸不相似，例如，与被取代的游标残基相比错配残基的极性、酸性或侧链结构(如，支链或直链，或含有苯环、羟基部分或硫部分)不同的情况。

在其它实施方案中，人或人源化本发明的抗CD 19抗体可以包含VH构架区，其中所述VH构架区可以包含一个或多个根据Kabat编号的以下残基：构架区1的位置20上的亮氨酸(L)、构架区1的位置27上的苯丙氨酸(F)、构架区1的位置28上的苏氨酸(T)、构架区2的位置38上的精氨酸(R)、构架区2的位置48上的缬氨酸(V)、构架区3的位置67上的苯丙氨酸(F)、构架区3的位置71上的精氨酸(R)，构架区3的位置80上的亮氨酸(L)和构架区3的位置91上的酪氨酸(Y)。

Kabat编号方案基于Kabat等的开创性工作(1991)《免疫学感兴趣的蛋白质的序列》(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)，出版号91-3242，由国立卫生研究院(National Institutes ofHealth)国家技术信息服务中心(National Technical InformationService)出版为三卷丛书(下面称为“Kabat”)。Kabat能够对来自许多物种的抗体同种型的免疫球蛋白链进行多序列比对。按照一种编号***，即Kabat编号***对比对序列进行编号。自1991年公开以来，Kabat序列已经升级，可以电子序列数据库的形式获得(最新可下载版本为1997版)。任何免疫球蛋白序列均可通过与Kabat参比序列的比对进行Kabat编号。因此，Kabat编号***为免疫球蛋白链的编号提供了统一的***。除非另有说明，本文所述的所有免疫球蛋白氨基酸序列均按照Kabat编号***编号。相似地，本文提及的所有单个氨基酸位置也是按照Kabat编号***编号的。

在其它特定的实施方案中，本文所述的抗CD 19抗体的人或人源化VH构架区可具有经选择在一个或多个以下游标、界面或经典(Canonical)残基位置上相同或发生保守性错配的构架区：20、22、24、26、27、28、29、30、36、37、39、45、47、48、49、67、69、71、73、78、80、90、91、92、93、94和103。可通过(例如)诱变改变一个或多个错配的游标、界面和经典残基，以便匹配HB 12A或HB 12BVH构架区的相应氨基酸残基。

在本发明的一个实施方案中，本文所述的抗CD 19抗体的人或人源化VK构架区与HB12B-(A10-Jk4)VK(SEQ ID NO：52)的构架区的氨基酸序列相同性可以是约65％至约100％。在该实施方案的某些方面，本文所述抗体的人或人源化VK构架区与HB12B-(A10-Jk4)抗体VK氨基酸序列相同性可以是至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。

在具体的实施方案中，本文所述的抗体的人或人源化VK构架区与HB12B-(A10-Jk4)VH(SEQ ID NO：52)的相应构架区(即，与抗体Y的FW1相比抗体X的FW1)的氨基酸序列相同性可以是80个氨基酸中至少52个氨基酸相同(52/80)。在具体的实施方案中，VH构架氨基酸序列同一性可以是至少52/80、53/80、54/80、55/80、56/80、57/80、58/80、59/80、60/80、61/80、62/80、63/80、64/80、65/80、66/80、67/80、68/80、69/80、70/80、71/80、72/80、73/80、74/80、75/80、76/80、77/80、78/80、79/80或80/80个氨基酸。本文所述的抗CD 19抗体的VK序列与HB 12B(参见图1)的游标氨基酸残基具有高序列同一性，例如游标序列相同性为14个残基中至少9个残基(9/14)、至少10/14、至少11/14、至少12/14、至少13/14个游标残基。在另一个实施方案中，游标氨基酸残基的错配可能是保守性氨基酸取代。作为保守性氨基酸取代的错配是指错配氨基酸的物理和化学特性类似于游标氨基酸，如错配残基与游标残基的极性特征(极性或非极性)、酸性特征(酸性或碱性)、侧链结构(如，支链或直链，或含有苯环、羟基部分或硫部分)相似的情况。

在其它实施方案中，本文所述的人或人源化VK构架区可以包含可包含一个或多个根据Kabat编号的以下残基：构架区2的位置36上的苯丙氨酸(F)、构架区2的位置49上的组氨酸(H)和构架区3的位置87上的苯丙氨酸(F)。

在其它特定的实施方案中，本文所述的抗体的人或人源化VK构架区可具有经选择在一个或多个以下游标、界面或经典残基位置上相同或发生保守性错配的构架区：2、3、4、23、35、36、38、44、56、47、48、49、64.66、68、69、71、87、88和98。可通过例如诱变改变一个或多个错配的游标、界面和经典残基，以便匹配HB 12A或HB12B构架区的相应氨基酸残基。

在具体的实施方案中，包含本发明人源化VH的重链可以与包含本发明人源化VK的轻链一起表达，以产生人源化抗CD 19抗体。在特定的实施方案中，本发明的人源化抗CD 19抗体可以包含选自下组的VH序列：HB12B-(3-72/JH4)(SEQ ID NO：34)、7E12 VH(SEQ IDNO：102)、14H5 VH(SEQ ID NO：103)、15D1 VH(SEQ ID NO：104)、15D7 VH(SEQ ID NO：105)、16C4 VH(SEQ ID NO：106)、14H5-YG(SEQ ID NO：107)、14H5-DG(SEQ ID NO：108)、14H5-LG(SEQ ID NO：109)、1A7 VH(SEQ ID NO：191)、3C3 VH(SEQID NO：191)、6C11 VH(SEQ ID NO：191)、9G7(SEQ ID NO：191)、3B4VH(SEQ ID NO：236)和3F11 VH(SEQ ID NO：192)；且还可包含选自下组的VK序列：HB12B-(A10/JK4)(SEQ ID NO：52)；HB12B-364987(或364987)(SEQ ID NO：62)；HB12B-3649(或3649)(SEQ ID NO：68)；HB12B-36(或36)(SEQ ID NO：70)、7E12VK(SEQ ID NO：110)、14H5(SEQ ID NO：111)、15D1(SEQ IDNO：112)、16C9(SEQ ID NO：113)、3C3 VK(SEQ ID NO：193)、3E5VK(SEQ ID NO：194)、3D4 VK(SEQ ID NO：195)、3F1 VK(SEQ IDNO：196)、5B5 VK(SEQ ID NO：197)、6F7 VK(SEQ ID NO：198)、1C11VK(SEQ ID NO：199)、2B11 VK(SEQ ID NO：200)、2D10 VK(SEQ IDNO：201)、5C11 VK(SEQ ID NO：202)、5D4 VK(SEQ ID NO：203)、6C11VK(SEQ ID NO：204)、9G7 VK(SEQ ID NO：205)、1H4 VK(SEQ IDNO：206)和5C4 VK(SEQ ID NO：207)。在特定实施方案中，人源化抗CD 19抗体包含VH序列HB12B-(3-72/JH4)(SEQ ID NO：34)和VK序列HB12B-364987(SEQ ID NO：62)。在特定实施方案中，人源化抗CD 19抗体包含VH序列HB12B-(3-72/JH4)(SEQ ID NO：34)和VK序列HB12B-3649(SEQ ID NO：68)。在又一个实施方案中，人源化抗CD 19抗体包含VH序列HB12B-(3-72/JH4)(SEQ ID NO：34)和VK序列HB12B-36(SEQ ID NO：70)。

在特定的实施方案中，本发明的抗CD 19抗体包含VH序列7E12VH(SEQ ID NO：102)和VK序列7E12 VK(SEQ ID NO：110)。在特定的实施方案中，本发明的抗CD 19抗体包含VH序列14H5 VH(SEQ IDNO：103)和VK序列14H5 VK(SEQ ID NO：111)。在特定的实施方案中，本发明的抗CD 19抗体包含VH序列14H5-YG VH(SEQ ID NO：107)和VK序列14H5 VK(SEQ ID NO：111)。在特定的实施方案中，本发明的抗CD 19抗体包含VH序列14H5-DG VH(SEQ ID NO：108)和VK序列14H5 VK(SEQ ID NO：111)。在特定的实施方案中，本发明的抗CD 19抗体包含VH序列14H5-LG VH(SEQ ID NO：109)和VK序列14H5 VK(SEQ ID NO：111)。在特定的实施方案中，本发明的抗CD 19抗体包含VH序列14H5 VH(SEQ ID NO：103)和VK序列16C9VK(SEQ ID NO：113)。在特定的实施方案中，本发明的抗CD 19抗体包含VH序列15D1 VH(SEQ ID NO：104)和VK序列15D1 VK(SEQ IDNO：112)。在特定的实施方案中，本发明的抗CD 19抗体包含VH序列15D7 VH(SEQ ID NO：105)和VK序列14H5 VK(SEQ ID NO：111)。在特定的实施方案中，本发明的抗CD 19抗体包含VH序列16C4VH(SEQ ID NO：106)和VK序列14H5 VK(SEQ ID NO：111)。在特定的实施方案中，本发明的抗CD 19抗体包含VH序列1A7 VH(SEQ IDNO：191)和VK序列14H5 VK(SEQ ID NO：111).在特定的实施方案中，本发明的抗CD 19抗体包含VH序列1A7 VH(SEQ ID NO：191)和VK序列3C3 VK(SEQ ID NO：193)。在特定的实施方案中，本发明的抗CD 19抗体包含VH序列1A7 VH(SEQ ID NO：191)和VK序列3E5 VK(SEQ ID NO：194)。在特定的实施方案中，本发明的抗CD 19抗体包含VH序列1A7 VH(SEQ ID NO：191)和VK序列3D4 VK(SEQID NO：195)。在特定的实施方案中，本发明的抗CD 19抗体包含VH 序列1A7 VH(SEQ ID NO：191)和VK序列5B5 VK(SEQ ID NO：197)。在特定的实施方案中，本发明的抗CD 19抗体包含VH序列1A7VH(SEQ ID NO：191)和VK序列6F7 VK(SEQ ID NO：198)。在特定的实施方案中，本发明的抗CD 19抗体包含VH序列1A7 VH(SEQ IDNO：191)和VK序列2D10 VK(SEQ ID NO：201)。在特定的实施方案中，本发明的抗CD 19抗体包含VH序列1A7 VH(SEQ ID NO：191)和VK序列5C11 VK(SEQ ID NO：202)。在特定的实施方案中，本发明的抗CD 19抗体包含VH序列1A7 VH(SEQ ID NO：191)和VK序列9G7VK(SEQ ID NO：205)。在特定的实施方案中，本发明的抗CD 19抗体包含VH序列1A7 VH(SEQ ID NO：191)和VK序列1H4 VK(SEQ IDNO：206)。在特定的实施方案中，本发明的抗CD 19抗体包含VH序列1A7 VH(SEQ ID NO：191)和VK序列5C4 VK(SEQ ID NO：207)。在特定的实施方案中，本发明的抗CD 19抗体包含VH序列3B4 VH(SEQID NO：236)和VK序列14H5 VK(SEQ ID NO：111)。在特定的实施方案中，本发明的抗CD 19抗体包含VH序列3F11 VH(SEQ ID NO：192)和VK序列3F11 VK(SEQ ID NO：196)。在特定的实施方案中，本发明的抗CD 19抗体包含VH序列16C4 VH(SEQ ID NO：106)和VK序列1C11 VK(SEQ ID NO：199)。在特定的实施方案中，本发明的抗CD19抗体包含VH序列16C4 VH(SEQ ID NO：106)和VK序列2B 11VK(SEQ ID NO：200)。在特定的实施方案中，本发明的抗CD 19抗体包含VH序列16C4 VH(SEQ ID NO：106)和VK序列5D4 VK(SEQ IDNO：203)。在特定的实施方案中，本发明的抗CD 19抗体包含VH序列16C4 VH(SEQ ID NO：106)和VK序列6F7 VK(SEQ ID NO：198)。在特定的实施方案中，本发明的抗CD 19抗体包含VH序列3F11VH(SEQ ID NO：192)和VK序列6C11 VK(SEQ ID NO：204)。在特定的实施方案中，本发明的抗CD 19抗体包含表1所列出的VH和VL的任何组合。

在某些实施方案中，包含本发明人源化VK的轻链可与包含本发明人源化VH的重链一起表达，以产生人源化抗CD 19抗体。在一个实施方案中，本文所述的人源化抗CD 19抗体包含选自下组的VK序列：HB12B-(A10/JK4)(SEQ ID NO：52)；HB12B-364987(或364987)(SEQ ID NO：62)；HB12B-3649(或3649)(SEQ ID NO：68)；HB12B-36(或36)(SEQ ID NO：70)、7E12 VK(SEQ ID NO：110)、14H5(SEQ ID NO：111)、15D1(SEQ ID NO：112)、16C9(SEQ IDNO：113)、3C3(SEQ ID NO：193)、3E5(SEQ ID NO：194)、3D4(SEQ IDNO：195)、3F11(SEQ ID NO：196)、5B5(SEQ ID NO：197)、6F7(SEQ IDNO：198)、1C11(SEQ ID NO：199)、2B11(SEQ ID NO：200)、2D10(SEQID NO：201)、5C11(SEQ ID NO：202)、5D4(SEQ ID NO：203)、6C11(SEQ ID NO：204)、9G7(SEQ ID NO：205)、1H4(SEQ ID NO：206)和5C4(SEQ ID NO：207)。上述VK序列可以与构架区中包含选自SEQID NO：36、38、40和42的氨基酸序列的VH序列配对。

在某些实施方案中，包含本发明人源化VH的重链可以与包含本发明人源化VK的轻链一起表达，人源化抗CD 19抗体。在一个实施方案中，本文所述的人源化抗CD 19抗体包含选自下组的VH序列：HB12B-(3-72/JH4)(SEQ ID NO：34)、7E12 VH(SEQ ID NO：102)、14H5VH(SEQ ID NO：103)、15D1 VH(SEQ ID NO：104)、15D7 VH(SEQ IDNO：105)、16C4 VH(SEQ ID NO：106)、14H5-YG(SEQ ID NO：107)、14H5-DG(SEQ ID NO：108)、14H5-LG(SEQ ID NO：109)、1A7(SEQ IDNO：191)、3C3 VH(SEQ ID NO：191)、6C11 VH(SEQ ID NO：191)、9G7(SEQ ID NO：191)、3B4 VH(SEQ ID NO：236)和3F11 VH(SEQ IDNO：192)。上述VH序列可以与构架区中包含选自SEQ ID NO：54、SEQID NO：56、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：64、SEQ IDNO：58、SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：60的氨基酸序列的VK序列配对。

在某些实施方案中，衍生自亲本HB 12A或HB 12B杂交瘤的人源化VH或VK可表达为嵌合免疫球蛋白轻链或嵌合免疫球蛋白重链，以产生嵌合的抗CD 19抗体。在特定实施方案中，人源化VH可表达为包含HB12A VK(SEQ ID NO：4)或HB 12B VK(SEQ ID NO：20)的嵌合抗体。在另一个具体的实施方案中，人源化VK可表达为包含HB12A VH(SEQ ID NO：2)或HB 12B VH(SEQ ID NO：18)的嵌合抗体。在另一个实施方案中，嵌合的抗CD 19抗体可包含HB12A VK(SEQ IDNO：4)或HB12B VK(SEQ ID NO：20)的VK序列，且还可包含HB12AVH(SEQ ID NO：2)或HB12B VH(SEQ ID NO：18)的VH序列。

在特定实施方案中，本发明的人源化VH还可包含前导序列MGDNDIHFAFLSTGVHS(SEQ ID NO：83)。

在另一个实施方案中，本发明的人源化VK还可包含选自人VKI-L 12基因的前导肽的前导序列MDMRVPAQLLGLLLLWLPGAKC(SEQ ID NO：84)。

本文所述的抗CD 19抗体与人CD 19(hCD 19)抗原的高结合亲和性可能很高。例如，本文所述的抗体的结合速率常数或k_on速率(抗体(Ab)+抗原(Ag)^Kon→Ab-Ag)可以为至少2×10⁵M^-1S^-1、至少5×10⁵M^-1S^-1、至少10⁶M^-1S^-1、至少5×10⁶M^-1S^-1、至少10⁷M^-1S^-1、至少5×10⁷M^-1S^-1或至少10⁸M^-1S^-1。

在另一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体的k_off速率((Ab-Ag) ^Koff→抗体(Ab)+抗原(Ag))可能少于5×10^-1s^-1、少于10^-1s^-1、少于5×10^-2s^-1、少于10^-2s^-1、少于5×10^-3s^-1、少于10^-3s^-1、少于5×10^-4s^-1或少于10^-4s^-1。在另一个实施方案中，本发明的抗体的k_off少于5×10^-5s^-1、少于10^-5s^-1、少于5×10^-6s^-1、少于10^-6s^-1、少于5×10^-7s^-1、少于10^-7s^-1、少于5×10^-8s^-1、少于10^-8s^-1、少于5×10^-9s^-1、少于10^-9s^-1或少于10^-10s^-1。

在另一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体的亲和性常数或K_a(k_on/k_off)可以为至少10²M^-1、至少5×10²M^-1、至少10³M^-1、至少5×10³M^-1、至少10⁴M^-1、至少5×10⁴M^-1、至少10⁵M^-1、至少5×10⁵M^-1、至少10⁶M^-1、至少5×10⁶M^-1、至少10⁷M^-1、至少5×10⁷M^-1、至少10⁸M^-1、至少5×10⁸M^-1、至少10⁹M^-1、至少5×10⁹M^-1、至少10¹⁰M⁴、至少5×10¹⁰M^-1、至少10¹¹M^-1、至少5×10¹¹M^-1、至少10¹²M^-1、至少5×10¹²M^-1、至少10¹³M^-1、至少5×10¹³M^-1、至少10¹⁴M^-1、至少5×10¹⁴ M^-1、至少10¹⁵M⁴或至少5×10¹⁵M⁴。在再一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体的解离常数或K_d(k_off/k_on)可以为少于5×10^-2M、少于10^-2M、少于5×10^-3M、少于10^-3M、少于5×10^-4M、少于10^-4M、少于5×10^-5M、少于10^-5M、少于5×10^-6M、少于10^-6M、少于5×10^-7M、少于10^-7M、少于5×10^-8M、少于10^-8M、少于5×10^-9M、少于10^-9M、少于5×10^-10M、少于10^-10M、少于5×10^-11M、少于10^-11M、少于5×10^-12M、少于10^-12M、少于5×10^-13M、少于10^-13M、少于5×10^-14M、少于10^-14M、少于5×10^-15M或少于10^-15M。

在一个实施方案中，依照本文所述方法所用的本发明抗体可免疫特异性结合人CD 19，并且利用本文所述或本领域技术人员已知的方法(例如，BIAcore测定、ELISA)(Biacore International AB，Uppsala，Sweden)评估，其解离常数(K_d)可能少于3000pM、少于2500pM、少于2000pM、少于1500pM、少于1000pM、少于750pM、少于500pM、少于250pM、少于200pM、少于150pM、少于100pM、少于75pM。在特定的实施方案中，依照本文所述方法所用的本发明抗体可免疫特异性结合人CD 19抗原，并且利用本文所述或本领域技术人员已知的方法(例如，BIAcore测定、ELISA)评估，其解离常数(K_d)可以为25至3400pM、25至3000pM、25至2500pM、25至2000pM、25至1500pM、25至1000pM、25至750pM、25至500pM、25至250pM、25至100pM、25至75pM、25至50pM。在另一个实施方案中，依照本文所述方法所用的本发明抗CD 19抗体可免疫特异性结合hCD 19，并且利用本文所述或本领域技术人员已知的方法(例如，BIAcore测定、ELISA)评估，其解离常数(K_d)可以为500pM、100pM、75pM或50pM。

本发明还提供了包含编码本文所述的人、人源化或嵌合的抗CD19抗体或其片段的核苷酸序列的多核苷酸。本发明也包括在严谨性或较低严谨性的杂交条件(例如，如本文所述)下与编码本文所述的结合hCD 19的人、人源化或嵌合的抗体的多核苷酸杂交的多核苷酸。

严谨性杂交条件包括但不限于：在6×氯化钠/枸橼酸钠(SSC)中，约45℃下与滤膜结合的DNA杂交，然后用0.2×SSC/0.1％SDS在约50-65℃下洗涤一次或多次，高严谨性条件例如，在6×SSC中，约45℃下与滤膜结合的DNA杂交，然后用0.1×SSC/0.2％SDS在约60℃下洗涤一次或多次，或者是本领域技术人员已知的任何其它严谨性杂交条件(参见，例如Ausubel，F.M.等编辑，1989Current Protocols inMolecular Biology，第1卷，Green Publishing Associates，Inc.和JohnWiley and Sons，Inc.，NY，第6.3.1至6.3.6和2.10.3页)。

可通过本领域已知的任何方法获得多核苷酸，并测定多核苷酸的核昔酸序列。例如，如果抗体的核苷酸序列已知，则可由化学合成的寡核苷酸组装编码该抗体的多核昔酸(如Kutmeier等，BioTechniques17：242(1994)所述)，简言之，该方法包括合成含有编码该抗体的序列的某部分的重叠寡核昔酸，使这些寡核昔酸退火和连接，然后通过PCR扩增连接的寡核苷酸。

也可由合适来源的核酸产生编码抗体的多核苷酸。如果无法获得含有编码特定抗体的核酸的克隆，但该抗体分子的序列己知，则可通过化学合成，或利用可与该序列3’和5’端杂交的合成引物进行PCR扩增、或利用具体基因序列的特异性寡核苷酸探针进行克隆以鉴定cDNA文库中编码该抗体的cDNA克隆，由合适来源(如抗体cDNA文库，或由表达该抗体的任何组织或细胞，如选择表达抗体的杂交瘤细胞分离的核酸，优选poly A+RNA产生的cDNA文库)获得编码该免疫球蛋白的核酸。然后，可利用本领域熟知的任何方法将PCR产生的扩增核酸克隆到可复制克隆载体中。

本发明还提供了编码本文所述抗体的VH和VK构架区以及CDR的多核苷酸序列，还提供使它们在哺乳动物细胞中有效表达的表达载体。

本发明还提供可在hCD 19转基因小鼠模型***中有效消耗表达重组人CD 19分子的B细胞的抗体(参见，Yazawa等，Proc Natl AcadSci USA.102(42)：15178-83(2005))。在特定的实施方案中，本发明的抗CD-19抗体可实现的B细胞消耗相当于HB 12B单克隆抗体实现的至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％消耗。在又一个实施方案中，与HB12B抗体实现的消耗相比，本发明的抗CD 19抗体可实现的B细胞消耗更完全。在一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体可消耗循环B细胞、血液B细胞、脾B细胞、边缘区B细胞、滤泡B细胞、腹膜B细胞和/或骨髓B细胞。在一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体可实现消耗消耗祖B细胞、早期祖B细胞、晚期祖B细胞、大前B细胞、小前B细胞、未成熟B细胞、成熟B细胞、抗原刺激的B细胞和/或浆细胞。在一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体的B细胞消耗作用可能持续至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少15天、至少20天、至少25天或至少30天。在另一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体的B细胞消耗作用可能持续至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周或至少10周。在又一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体的B细胞消耗作用可能持续至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月或至少12个月。

本发明还提供了能有效消耗人受治疗者中的B细胞的抗体。在特定的实施方案中，本发明的抗CD-19抗体可实现至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％的B细胞消耗。在另一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体可消耗人受治疗者中的B细胞亚类。在特定的实施方案中，本发明的抗CD 19抗体可消耗循环B细胞、血液B细胞、脾B细胞、边缘区B细胞、滤泡B细胞、腹膜B细胞和/或骨髓B细胞。CD存在于所有发育阶段的B细胞表面上。因此，抗CD 19抗体可消耗所有发育阶段的B细胞。在特定的实施方案中，本发明的抗CD 19抗体可实现消耗祖B细胞、早期祖B细胞、晚期祖B细胞、大前B细胞、小前B细胞、未成熟B细胞、成熟B细胞、抗原刺激的B细胞和/或浆细胞。可以在延长的时间内持续消耗B细胞。在一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体的B细胞消耗作用可能持续至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少15天、至少20天、至少25天或至少30天。在另一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体的B细胞消耗作用可能持续至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周或至少10周。在又一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体的B细胞消耗作用可能持续至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月或至少12个月。

在一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体消耗至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％的循环B细胞。在一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体消耗至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％的血液B细胞。在一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体消耗至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％的脾B细胞。在一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体消耗至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％的边缘区B细胞。在一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体消耗至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％的滤泡B细胞。在一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体消耗至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％的腹膜B细胞。在一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体消耗至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％的骨髓B细胞。在一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体消耗至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％的祖B细胞。在一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体消耗至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％的早期祖B细胞。在一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体消耗至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％的晚期祖B细胞。在一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体消耗至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％的大前B细胞。在一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体消耗至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％的小前B细胞。在一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体消耗至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％的未成熟B细胞。在一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体消耗至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％的成熟B细胞。在一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体消耗至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％的抗原刺激的B细胞。在一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体消耗至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％的浆细胞。可以在延长的时间内持续消耗B细胞。在一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体的B细胞消耗作用可能持续至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少15天、至少20天、至少25天或至少30天。在另一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体的B细胞消耗作用可能持续至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周或至少10周。在又一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体的B细胞消耗作用可能持续至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月或至少12个月。

B细胞恶性肿瘤的特征是特定B细胞亚类的病理性扩增，例如，前体B细胞急性淋巴细胞性白血病的特征是对应于祖B细胞/前B细胞发育阶段的B细胞的异常扩增。恶性B细胞的细胞表面保持表达正常B细胞标记物，例如CD 19。因此，抗CD 19抗体可消耗人受治疗者中的恶性B细胞。在特定的实施方案中，本发明的抗CD 19抗体可实现人受治疗者中的至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的恶性B细胞。

在一个实施方案中，本文所述的人源化抗CD 19抗体介导抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)、补体依赖性细胞介导的细胞毒作用(CDC)和/或凋亡。在一个实施方案中，本发明的人源化抗CD 19抗体介导抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)和/或凋亡。在一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体具有增强的抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)。在一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体包含介导增强的抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)的变异Fc区。在一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体包含具有N-糖苷-连接的复合糖链连接于Asn297的Fc区，其中岩藻糖不结合于还原端的N-乙酰基氨基葡萄糖，其中所述Fc区介导增强的抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)。

本发明进一步提供了可有效抑制体外刺激的B细胞增殖的抗CD 19抗体。可通过各种刺激诱导分离的外周B细胞的增殖，例如但不限于由抗-IgM抗体、CD40或CpG引起的刺激。这些刺激可以单独递送或联合给予。

在一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体抑制体外刺激的B细胞增殖。在另一个实施方案中，本文所述的抗CD 19抗体抑制由抗-IgM/CpG或抗-IgM/CD40刺激诱导的的体外B细胞增殖。在一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体将体外刺激的B细胞增殖抑制至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％或至少约75％。

在一个实施方案中，本发明的Fc变异抗CD 19抗体抑制由抗-IgM/CpG或抗-IgM/CD40刺激诱导的体外B细胞增殖，其中相对于相应的非变体分子，所述Fc变体与一种或多种Fc配体的结合亲和性改变。在特定的实施方案中，本发明的Fc变异抗CD 19抗体抑制由抗-IgM/CpG或抗-IgM/CD40刺激诱导的体外B细胞增殖，其中相对于相应的非变异Fc结构域，所述Fc变体与Fcγ受体IIB的结合增强。在进一步特定的实施方案中，本发明的Fc变异抗CD 19抗体将体外刺激的B细胞增殖抑制至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％或至少约75％。在另一个实施方案中，本发明的Fc变异抗CD 19抗体抑制体外刺激的B细胞增殖，其中所述变异Fc结构域与Fcγ受体IIB的亲和性是非变异Fc结构域的至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍、或至少200倍。

本发明还涉及一种治疗人的B细胞恶性肿瘤的方法，所述方法包括向需要其的人施用足以消耗循环B细胞的量的人、人源化或嵌合的抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体可介导人抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)、补体依赖性细胞介导的细胞毒作用(CDC)和/或凋亡。在一个具体方面，本发明还涉及治疗人的B细胞恶性肿瘤的方法，所述方法包括施用IgG1或IgG3人同种型的人、人源化或嵌合的抗CD 19 抗体的治疗有效方案。

本发明还涉及一种治疗人的自身免疫性疾病或病症的方法，所述方法包括给需要其的人施用足以消耗循环B细胞的量的人、人源化或嵌合的抗CD 19抗体，抗CD 19抗体所述可介导人ADCC、CDC和/或凋亡。本发明也涉及治疗自身免疫性疾病症的方法，所述方法包括给予IgG1或IgG3人同种型的人、人源化或嵌合的抗CD 19抗体的治疗有效方案。

本发明还提供了用于治疗或预防需要其的人移植物接受者的体液排斥的方法，所述方法包括给所述接受者施用可消耗循环B细胞或循环免疫球蛋白或二者的量的本发明的人、人源化或嵌合的抗CD 19抗体。在其它实施方案中，本发明提供了用于预防需要其的人移植物接受者的移植物排斥或移植物抗宿主病的方法，所述方法包括在移植前，使移植物接触可从该移植物消耗B细胞的量的人、人源化或嵌合的抗CD 19抗体。

【6.4.人源化抗CD 19抗体的产生】

可利用本领域已知的各种技术产生本文所述的人源化抗体，这些技术包括但不限于：CDR移植(参见例如，欧洲专利No.EP 239,400；国际公开No.WO 91/09967；和美国专利No.5,225,539、5,530,101和5,585,089，以上各篇文献通过引用整体并入本文)、镶面或表面再造(参见，例如，欧洲专利No.EP 592,106和EP 519,596；Padlan，1991，Molecular Immunology 28(4/5)：489-498；Studnicka等，1994，ProteinEngineering，7(6)：805-814；和Roguska等，1994，Proc.Natl.Acad.ScL，91：969-973，以上各篇文献通过引用整体并入本文)、链改组(参见，例如，美国专利No.5,565,332，以上各篇文献通过引用整体并入本文)以及以下文献所述的技术：美国专利No.6,407,213；美国专利No.5,766,886；国际公开No.WO 9317105、Tan等，J.Immunol，169：1119-25(2002)；Caldas等，Protein Eng，13(5)：353-60(2000)；Morea等，Methods，20(3)：267-79(2000)；Baca等，J.Biol.Chem.，272(16)：10678-84(1997)；Roguska等，Protein Eng，9(10)：895-904(1996)；Couto 等，Cancer Res.，55(23Supp)：5973s-5977s(1995)；Couto等，CancerRes.，55(8)：1717-22(1995)，Sandhu JS，Gene，150(2)：409-10(1994)和Pedersen等，J.Mol Biol，235(3)：959-73(1994)，以上各篇文献通过引用整体并入本文。FW区中的FW残基常常被CDR供体抗体的相应残基取代，以改变(例如改进)抗原结合。通过本领域熟知方法鉴定这些FW取代，例如通过对CDR和FW残基相互作用建模来鉴定对抗原结合至关重要的FW残基，并进行序列比较以鉴定特定位置上的不寻常FW残基。(参见，例如，Queen等，美国专利No.5,585,089；和Riechmann等，1988，Nature，332：323，其通过引用整体并入本文)。

人源化抗CD 19抗体具有从非人来源引入了一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称为“输入”残基，它们一般取自“输入”可变域。因此，人源化抗体包含一个或多个来自非人免疫球蛋白分子的CDR和来自人的构架区。本领域熟知抗体的人源化方法，并且可以基本依照以下文献的方法进行：Winter和同事(Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，239：1534-1536(1988))，用啮齿动物CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列，即CDR-移植(EP 239,400；PCT公开No.WO 91/09967；和美国专利No.4,816,567；6,331,415；5,225,539；5,530,101；5,585,089；6,548,640，其内容通过引用整体并入本文)。Insuch人源化嵌合抗体、在这类人源化嵌合抗体中，明显小于完整的人可变域被来自非人物种的相应序列所取代。在实践中，人源化抗体一般是一些CDR残基(可能是一些FW残基)被啮齿动物抗体中相似位点的残基所取代的人抗体。抗CD 19抗体的人源化也可通过镶面或表面再造(EP 592,106；EP 519,596；Padlan，1991，Molecular Immunology28(4/5)：489-498；Studnicka等，Protein Engineering，7(6)：805-814(1994)；和Roguska等，Proc.Natl.Acad.ScL，91：969-973(1994))或链改组(美国专利No.5,565,332)进行，其内容通过引用整体并入本文。

用于制备人源化抗体的人轻链和重链可变区的选择原则是降低抗原性。按照所谓的“最佳拟合”方法，针对整个已知人可变域序列的文库筛选啮齿动物抗体的可变域的序列。然后，筛选与啮齿动物最密切相关的人序列中存在对抗原结合、合适的结构形成和/或所需人源化mAb的稳定性至关重要的特定残基的序列。(Sims等，J.Immunol，151：2296(1993)；Chothia等，J.Mol Biol，196：901(1987)，其内容通过引用整体并入本文)。然后，将满足所需标准的所得FW序列用作该人源化抗体的人供体FW区。

另一种方法使用衍生自特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列的特定FW。相同FW可用于数种不同的人源化抗CD 19抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；Presta等，J.Immunol，151：2623(1993)，其通过引用整体并入本文)。

抗CD 19抗体可以在保留与CD 19的高亲和性和其它优良的生物学特性的情况下进行人源化。根据本发明的一个方面，利用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念人源化产物，来制备人源化抗体。本领域技术人员通常可获得并且熟悉三维免疫球蛋白模型。也可利用计算机程序说明和显示所选的免疫球蛋白序列候选物的可能的三维构象结构。检查这些显示能够分析所述残基在免疫球蛋白序列候选物功能中的可能作用，即分析影响免疫球蛋白候选物结合CD 19的能力的残基。可以此方式由接受者和输入序列选择和组合FW残基，以便获得所需的抗体特征，如实现对CD 19的亲和性。通常，CDR残基直接，或主要参与影响抗原结合。

“人源化”抗体可能保持与原始抗体相似的抗原特异性，即在本发明中，保持结合人CD 19抗原的能力。然而，使用某些人源化方法，可采用“定向演化”方法改变抗体与人CD 19抗原结合的亲和性和/或特异性，如Wu等，J.Mol Biol，294：151(1999)，其内容通过引用整体并入本文。

可通过选择用于移植HB 12A或HB 12B互补决定区或“CDR”(如以下章节所述)的不同人构架区，构建本文所述的人源化抗CD 19抗体。本发明包括多种小鼠HB 12A和HB 12B抗体以及称为chHB 12A和chHB 12B的嵌合抗体的人源化形式。

【6.5.单克隆抗CD 19抗体】

单克隆抗CD 19抗体显示与人CD 19抗原的结合特异性，并且可介导人ADCC、CDC和/或凋亡机制。可采用本领域已知的各种技术产生这种抗体，这些技术包括使用杂交瘤、重组技术和噬菌体展示技术，或它们的组合。抗体具有针对单个抗原性位点的高度特异性。可通过本领域已知的任何方法产生工程改造的抗CD 19抗体，这些方法包括但不限于：下述技术及其改进形式。大规模高产率生产一般包括培养产生工程改造的抗CD 19抗体的宿主细胞，和由所述宿主细胞培养物回收抗CD 19抗体。

【6.5.1.杂交瘤技术】

可采用杂交瘤技术产生单克隆抗体，该技术是本领域已知的，参见例如Harlow等，Antibodies：A Laboratory Manual(抗体：实验室手册)，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1988)；Hammerling等，Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas(单克隆抗体和T细胞杂交瘤)，563-681(Elsevier，N.Y.，1981)，其全文通过引用并入本文。例如，在杂交瘤方法中，对小鼠或其它合适的宿主动物(如仓鼠或猕猴)进行免疫，以引发产生或能够产生特异性结合免疫所用蛋白质的抗体的淋巴细胞。淋巴细胞也可体外免疫。然后，用合适的融合试剂如聚乙二醇使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice(单克隆抗体：原理和实践)，第59-103页(Academic Press，1986))。

将如此制备的杂交瘤细胞进行接种，并用含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质的合适培养基进行培养。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺少次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤培养基一般包含次黄嘌呤、氨蝶呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质能阻止HGPRT-缺陷细胞的生长。

特定实施方案采用能够有效融合、支持由所选抗体生产细胞稳定高水平产生抗体且对培养基(如HAT培养基)敏感的骨髓瘤细胞。这些骨髓瘤细胞系包括鼠骨髓瘤细胞系，如衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的细胞系(获自Salk Institute Cell Distribution Center，SanDiego，CA，USA)和SP-2或X63-Ag8.653细胞(获自美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD，USA)的细胞系。也记载过将人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系用于生产人单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications(单克隆抗体生产技术和应用)，第51-63页(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。

检测培养杂交瘤细胞的培养基中是否产生针对人CD 19抗原的单克隆抗体。杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性可通过免疫沉淀或体外结合试验，例如放射性免疫试验(RIA)或酶联免疫吸附实验(ELISA)确定。

鉴定到产生具有所需特异性、亲和性和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可通过有限稀释步骤和标准方法培养对该克隆进行亚克隆(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice(单克隆抗体：原理和实践)，第59-103页，(Academic Press，1986))。适用于此种目的培养基包括例如，D-MEM或RPMI 1640培养基。此外，杂交瘤细胞可以作为腹水瘤在动物体内培养。

通过常规免疫球蛋白纯化方法，例如蛋白A-琼脂糖、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱，适当地由培养基、腹水或血清分离所述亚克隆分泌的单克隆抗体。

【6.5.2.重组DNA技术】

不难用常规方法(例如，使用能够特异性结合编码抗CD 19抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)对编码本文所述的抗CD 19抗体的DNA进行分离和测序。杂交瘤细胞用作这类DNA的来源。分离后，则可将该DNA放置到表达载体中，然后转移到宿主细胞如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿COS细胞、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞或不另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞中，以在重组宿主细胞中获得抗CD 19抗体。

在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域展示在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒表面上。具体说，由动物cDNA文库(如人或鼠患病组织的cDNA文库)扩增编码V_H和V_L结构域的DNA序列。通过PCR将编码V_H和V_L结构域的DNA与scFv接头重组在一起，克隆到噬菌粒载体中。将该载体电穿孔到大肠杆菌中，用辅助噬菌体感染该大肠杆菌。用于这些方法的噬菌体一般是丝状噬菌体，包括fd和M13，通常将V_H和V_L结构域重组融合于噬菌体基因III或基因VIII。可以利用抗原，如标记抗原或者结合或捕获在固体表面或珠上的抗原来选择或鉴定表达能够结合特定抗原的抗原结合结构域的噬菌体。可用于制备本发明抗体的噬菌体展示法的例子包括Brinkman等，1995，J.Immunol.Methods，182：41-50；Ames等，1995，J.Immunol.Methods，184：177-186；Kettleborough等，1994，Eur.J.Immunol.，24：952-958；Persic等，1997，Gene，187：9-18；Burton等，1994，Advances in Immunology，57：191-280；国际申请No.PCT/GB91/01134；国际公开No.WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO92/18619、WO 93/11236、WO 95/15982、WO 95/20401和WO97/13844；以及美国专利No.5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743和5,969,108所公开的方法，上述文献通过引用整体并入本文。

如上述参考文献所述，噬菌体选择后，可从噬菌体分离抗体编码区，用于产生完整抗体，包括人抗体或任何其它所需的抗原结合片段，在任何所需宿主，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌中表达，如下所述。也可采用通过本领域已知方法，例如PCT公开No.WO 92/22324；Mullinax等，1992，BioTechniques 12(6)：864-869；Sawai等，1995，AJRI，34：26-34；和Better等，1988，Science，240：1041-1043所公开的方法，重组产生Fab、Fab′和F(ab′)₂片段的技术(所述文献通过引用整体并入本文)。

可以从McCafferty等，Nature，348：552-554(1990)所述技术产生的抗体噬菌体文库分离抗体。Clackson等，Nature，352：624-628(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)分别记载了利用噬菌体文库分离鼠和人抗体的方法。可以采用链改组产生高亲和(nM范围)人抗体(Marks等，Bio/Technology，10：779-783(1992))，以及联合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse等，Nucl.Acids.Res.，21：2265-2266(1993))。因此，这些技术是用于分离抗CD 19抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可选替代方案。

为了产生完整抗体，可采用PCR引物，包括VH或VL核苷酸序列、限制性位点和用来保护限制性位点的侧接序列，来扩增scFv克隆中的VH或VL序列。可利用本领域技术人员已知的克隆技术将PCR扩增的VH结构域克隆到表达重链恒定区，如人γ4恒定区的载体中，可将PCR扩增的VL结构域克隆到表达轻链恒定区，如人κ或λ恒定区的载体中。用于表达VH或VL结构域的载体可包含EF-1α启动子、分泌信号、可变结构域、恒定结构域的克隆位点和选择性标记如新霉素。也可将VH和VL结构域克隆到一个表达所需恒定区的载体中。然后，用本领域技术人员已知的技术将重链转化载体和轻链转化载体共转染到细胞系中，产生表达全长抗体如IgG的稳定或瞬时细胞系。

也可以(例如)利用同源鼠序列代替人重链和轻链恒定结构域的编码序列(美国专利No.4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851(1984))或将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的全部或一部分编码序列共价连接，对DNA进行修饰。

【6.6.嵌合抗体】

本文所述的抗-ICOS抗体具体包括重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类型或亚类的抗体的相应序列相同或同源，而该链的另一部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类型或亚类的抗体的相应序列相同或同源的嵌合抗体(免疫球蛋白)，以及这种抗体的片段，只要它们具有所需生物学活性(美国专利No.4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。本文感兴趣的嵌合抗体包括含有来自非人灵长类动物(例如，旧大陆猴，如狒狒、恒河猴或猕猴)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列的“灵长类动物化”抗体(美国专利No.5,693,780)。

【6.7.改变/突变的抗体】

本文所述的组合物和方法中的抗CD 19抗体可以是突变抗体。本文所用“抗体突变体”或“改变的抗体”指抗CD 19抗体的一个或多个氨基酸残基被修饰的抗CD 19抗体的氨基酸序列变体。对抗CD 19抗体氨基酸序列的修饰包括可提高抗体与其抗原的亲和性或亲合力的序列修饰，和/或可提高效应功能的抗体Fc部分的修饰。

因此，本发明涉及本文所述的效应功能增强的人、人源化和嵌合的抗CD 19抗体，及其改变/突变的衍生物，包括但不限于人CD 19结合特性改变的衍生物；如结合常数k_ON、解离常数k_OFF和/或平衡常数或结合亲和性K_D改变的衍生物。在某些实施方案中，本文所述的抗CD 19抗体或其改变/突变的衍生物与人CD 19的K_D可以不超过约10^-6M、10^-7M、10^-8M或10^-9M。适用于确定本发明抗体或其改变/突变的衍生物的这种结合特征的方法和试剂是本领域熟知和/或可购得的(见上，例如，美国专利No.6,849,425、美国专利No.6,632,926、美国专利No.6,294,391和美国专利No.6,143,574，各文献通过引用整体并入本文)。而且，可购得设计用于进行这种动力学分析的设备和软件(如

A100和

2000设备；Biacore International AB，Uppsala，Sweden)。

可对任何已知抗CD 19抗体或本文所述鉴定的抗CD 19抗体进行修饰。这种改变的抗体与已知抗CD 19抗体的序列同一性或相似性必定小于100％。例如，改变的抗体可具有与本文所述抗CD 19抗体的重链或轻链可变结构域的氨基酸序列约25％-约95％相同或相似的氨基酸序列。改变的抗体可具有与本文所述抗CD 19抗体的重链或轻链可变结构域的氨基酸序列的氨基酸序列同一性或相似性为至少25％、35％、45％、55％、65％、75％、80％、85％、90％或95％的氨基酸序列。在另一个实施方案中，改变的抗体可具有与本文所述抗CD 19抗体的重链CDR1、CDR2或CDR3的氨基酸序列的氨基酸序列同一性或相似性为至少25％、35％、45％、55％、65％、75％、80％、85％、90％或95％的氨基酸序列。在一个实施方案中，改变的抗体可保持人CD 19结合能力。在某些实施方案中，本文所述的抗CD 19抗体可包含与HB 12B-(3-72/JH4)(SEQ ID NO：34)、HB12A VH(SEQ ID NO：2)HB12B VH(SEQ ID NO：18)、7E12 VH(SEQ ID NO：102)、14H5VH(SEQ ID NO：103)、15D1 VH(SEQ ID NO：104)、15D7 VH(SEQ IDNO：105)、16C4 VH(SEQ ID NO：106)、14H5-YG(SEQ ID NO：107)、14H5-DG(SEQ ID NO：108)、14H5-LG(SEQ ID NO：109)、1A7 VH、3C3 VH、3E5 VH、3D4 VH、9G7 VH(SEQ ID NO：191)、3B4 VH(SEQID NO：236)、3F11 VH或6C11 VH(SEQ ID NO：192)的氨基酸序列的相同性为至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的VH。在某些实施方案中，本文所述的抗CD 19抗体可以包含与表1所列的VH结构域、VL结构域或CDR中任一个的氨基酸序列的相同性为至少或为约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的VH。

在另一个实施方案中，改变的抗体可具有HB12B-(3-72/JH4)(SEQID NO：34)、HB12A VH(SEQ ID NO：2)、HB12B VH(SEQ ID NO：18)、7E12 VH(SEQ ID NO：102)、14H5 VH(SEQ ID NO：103)、15D1VH(SEQ ID NO：104)、15D7 VH(SEQ ID NO：105)、16C4 VH(SEQ IDNO：106)、14H5-YG(SEQ ID NO：107)、14H5-DG(SEQ ID NO：108)、14H5-LG(SEQ ID NO：109)、1A7 VH、3C3 VH、3E5 VH、3D4 VH、9G7 VH(SEQ ID NO：191)、3B4 VH(SEQ ID NO：236)、3F11 VH或6C11 VH(SEQ ID NO：192)的FW1、FW2、FW3或FW4区的氨基酸序列的同一性或相似性为至少25％、35％、45％、55％、65％、75％、80％、85％、90％或95％的氨基酸序列。在另一个实施方案中，改变的抗体可具有与表1所列的VH或VL结构域中任一个的FW1、FW2、FW3或FW4区的氨基酸序列的同一性或相似性为至少25％、35％、 45％、55％、65％、75％、80％、85％、90％或95％的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，改变的抗体可具有与本文所述的抗CD 19抗体的轻链CDR1、CDR2或CDR3的氨基酸序列的同一性或相似性为至少25％、35％、45％、55％、65％、75％、80％、85％、90％或95％的氨基酸序列。在某些实施方案中，本发明的抗CD 19抗体可以包含与HB 12A VK(SEQ ID NO：4)、HB12B VK(SEQ ID NO：20)、HB12B-(A10-Jk4)(SEQ ID NO：52)、HB12B-364987(或364987)(SEQID NO：62)、HB12B-3649(或3649)(SEQ ID NO：68)、HB12B-36(或36)(SEQ ID NO：70)、7E12 VK(SEQ ID NO：110)、14H5(SEQ IDNO：111)、15D1(SEQ ID NO：112)、16C9(SEQ ID NO：113)、3C3VK(SEQ ID NO：193)、3E5 VK(SEQ ID NO：194)、3D4 VK(SEQ IDNO：195)、3F1 VK(SEQ ID NO：196)、5B5 VK(SEQ ID NO：197)、6F7VK(SEQ ID NO：198)、1C11 VK(SEQ ID NO：199)、2B11 VK(SEQ IDNO：200)、2D10 VK(SEQ ID NO：201)、5C11 VK(SEQ ID NO：202)、5D4 VK(SEQ ID NO：203)、6C11 VK(SEQ ID NO：204)、9G7 VK(SEQID NO：205)、1H4 VK(SEQ ID NO：206)或5C4 VK(SEQ ID NO：207)的氨基酸序列的同一性至少或约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的的VL。

在另一个实施方案中，改变的抗体可具有与HB12A VK(SEQ IDNO：4)、HB12B VK(SEQ ID NO：20)、HB12B-(A10-Jk4)(SEQ IDNO：52)、HB12B-364987(或364987)(SEQ ID NO：62)、HB12B-3649(或3649)(SEQ ID NO：68)、HB12B-36(或36)(SEQ ID NO：70)、7E12VK(SEQ ID NO：110)、14H5(SEQ ID NO：111)、15D1(SEQ IDNO：112)、16C9(SEQ ID NO：113)、3C3 VK(SEQ ID NO：193)、3E5VK(SEQ ID NO：194)、3D4 VK(SEQ ID NO：195)、3F1 VK(SEQ IDNO：196)、5B5 VK(SEQ ID NO：197)、6F7 VK(SEQ ID NO：198)、1C11VK(SEQ ID NO：199)，2B11 VK(SEQ ID NO：200)、2D10 VK(SEQ IDNO：201)、5C11 VK(SEQ ID NO：202)、5D4 VK(SEQ ID NO：203)、6C11 VK(SEQ ID NO：204)、9G7 VK(SEQ ID NO：205)、1H4 VK(SEQ IDNO：206)或5C4 VK(SEQ ID NO：207)的FW1、FW2、FW3或FW4区的氨基酸序列的同一性或相似性为至少25％、35％、45％、55％、65％、75％、80％、85％、90％或95％的氨基酸序列。

序列的同一性或相似性在本文中的定义为：经过比对序列和引入缺口(如果必要)以最大程度提高序列相同性百分比后，候选序列中与抗CD 19抗体残基相同(即相同残基)或相似(即侧链特性相同的同一组的氨基酸残基，见下)的氨基酸残基的百分比。可变结构域外抗体序列的N-末端、C-末端或内部的延伸、缺失或添加均不应被认为会影响序列相同性或相似性。

本领域已知的“％相同性”是通过比较序列确定的两种多核苷酸或两种多肽的关系的量度。通常，比对待比较的两个序列，以得到序列之间的最大相关性。检查两个序列的比对，确定两个序列之间氨基酸或核苷酸精确对应的位置数量，除以比对总长度并乘以100，得到％相同性数值。可以在整个待比较序列长度上确定此种％相同性数值，这特别适合长度相同或非常相似且高度同源的序列，或者可以在较短的确定长度上确定此种％相同性数值，这更适合长度不同或具有较低同源性的序列。

例如，可以用Unix平台下的软件clustalw比对序列，该软件产生以“.aln”为扩展名的文件，然后，可将此文件输入Bioedit程序(Hall，T.A.1999，BioEdit：a user-friendly biological sequence alignment editorand analysis program for Windows 95/98/NT(BioEdit：用于Windows95/98/NT的用户友好型生物序列比对编辑器和分析程序)，Nucl.Acids.Symp.Ser.41：95-98)，该程序能打开.aln文件。在Bioedit窗口中，可选择单独的序列(一次两个)并进行比对。此种方法能够比较整个序列。

本领域熟知比较两个或多个序列的相同性的方法。因此，例如，可以获得Wisconsin序列分析软件包9.1版中的程序(Devereux J.等，Nucleic Acids Res.，12：387-395，1984，可获自Genetics ComputerGroup，Madison，WI，USA)。可采用数学算法确定两个序列的相同性百分比。例如，可采用程序BESTFIT和GAP确定两个多核苷酸的％相同性和两个多肽序列的％相同性。BESTFIT使用Smith和Waterman的“局部同源性”算法(Advances in Applied Mathematics，2：482-489，1981)，发现两个序列之间相似性最高的单个区域。BESTFIT更适合比较长度不同的两个多核苷酸或两个多肽序列，该程序假定较短的序列代表较长序列的一部分。相比而言，GAP按照Neddleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.，48：443-354，1970)比对两个序列，发现“最大相似性”。GAP更适合比较长度大致相同的序列，预计在整个长度上进行比对。优选地，各程序中所用的参数“缺口权重”和“长度权重”对多核苷酸而言分别是50和3，对多肽而言分别是12和4。在本发明的某些方面中，优选地，确定当两个比较序列最优比对时的％相同性和相似性。

本领域也了解确定序列之间相同性和/或相似性的其它程序，例如BLAST程序系列(Karlin和Altschul，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：2264-2268，如Karlin和Altschul，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：5873-5877所述进行改进，可由国家生物技术信息中心(NCB)，Bethesda，MD，USA获得，可以在NCBI的主页www.ncbi.nlm.nih.gov上找到)。这些程序是用于比较两个序列的数学算法的非限制性例子。将这类算法结合到Altschul等，1990，J.Mol.Biol.，215：403-410的NBLAST和XBLAST程序中。可以用NBLAST程序进行BLAST核苷酸搜索(评分＝100，字长＝12)，以获得与编码本发明所有或一部分抗CD 19抗体的核酸分子同源的核苷酸序列。可利用XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索(评分＝50，字长＝3)，以获得与本发明蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了进行缺口比对(出于比较目的)，可如Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.，25：3389-3402所述利用缺口BLAST。也可利用PSI-Blast进行迭代搜索，其用来检测分子之间的远近关系(同上)。利用BLAST、缺口BLAST和PSI-Blast程序时，可使用各程序(如XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。

本领域已知的确定序列间相同性和/或相似性的程序的另一非限制性例子是FASTA(Pearson W.R.和Lipman D.J.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：2444-2448，1988，可以作为Wisconsin序列分析软件包的一部分获得)。优选地，可将BLOSUM62氨基酸取代矩阵(HenikoffS.和Henikoff J.G.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：10915-10919，1992)用于多肽序列比较，包括在比较前先将核苷酸序列翻译成氨基酸序列。

本领域已知用于确定氨基酸序列的相同性和/或相似性的程序的另一个非限制性例子是SeqWeb软件(GCG Wisconsin软件包：缺口程序中基于网页的界面)，该软件采用默认算法和参数设定：blosum62、缺口权重8、长度权重2。

可利用与上述技术相似的允许或不允许出现缺口的技术确定两个序列的相同性百分比。在相同性百分比的计算中，一般对精确匹配进行计数。

可用程序BESTFIT确定查询的多核苷酸或多肽序列与本发明的多核苷酸或多肽序列的％相同性，查询序列和参比序列进行优化比对，程序参数设定为默认值。

为了产生改变的抗体，将一个或多个氨基酸改变(如取代)引入物种依赖性抗体的一个或多个高变区。也可将构架区残基的一个或多个改变(如取代)引入抗CD 19抗体，这导致抗体突变体与来自第二哺乳动物物种的抗原的结合亲和性提高。准备修饰的构架区残基的例子包括：非共价直接结合抗原的残基(Amit等，Science，233：747-753(1986))；作用于/影响CDR构型的残基(Chothia等，J.Mol.Biol.，196：901-917(1987))；和/或参与VL-VH界面的残基(EP 239 400B1)。在某些实施方案中，对一个或多个这类构架区残基的修饰导致抗体与来自第二哺乳动物物种的抗原的结合亲和性提高。例如，在本发明的这个实施方案中，可改变约1-约5个构架区残基。有时，这可能足以产生适用于临床前试验的抗体突变体，即使没有改变高变区残基。然而，改变的抗体通常包含另外的高变区改变。

改变的高变区残基可以随机改变，特别是抗CD 19抗体与来自第二哺乳动物物种的抗原的初始结合亲和性使得能够容易地筛选这种随机产生的改变的抗体。

可用于产生这类改变抗体的一种方法被称为“丙氨酸扫描诱变”(Cunningham和Wells，Science，244：1081-1085(1989))。在本文中，一个或多个高变区残基被丙氨酸或聚丙氨酸残基取代，以影响氨基酸与来自第二哺乳动物物种的抗原的相互作用。随后，通过在取代位点上或为取代位点引入额外或其它突变，改良在功能上对该取代敏感的高变区残基。因此，虽然预先确定引入氨基酸序列变异的位点，但不需要预先确定突变本身的性质。如本文所述，筛选以此方式产生的Ala突变体的生物学活性。

产生这种改变抗体的另一种方法包括利用噬菌体展示的亲和性成熟(Hawkins等，J.Mol.Biol.，254：889-896(1992)和Lowman等，Biochemistry，30(45)：10832-10837(1991))。简要说，突变几个高变区位点(如，6-7个位点)，以便在各位点上产生所有可能的氨基酸取代。如此产生的抗体突变体以单价方式由丝状噬菌体颗粒展示为包装在各颗粒内的M13基因III产物的融合物。然后，如本文所述筛选噬菌体展示突变体的生物学活性(如结合亲和性)。

抗体序列中的突变可包括氨基酸序列内部或相邻位置上氨基酸残基的取代、缺失(包括内部缺失)、添加(包括产生融合蛋白的添加)或保守取代，但它们产生的是“沉默”改变，因为这种改变产生功能等同的抗CD 19抗体。可根据所涉及残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲特性的相似性，进行保守性氨基酸取代。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷胺酰胺；带正电(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；带负电(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。此外，甘氨酸和脯氨酸是可以影响链取向的残基。非保守取代指将一种类型的成员更换为另一种类型的成员。而且，如果需要，可以将非经典氨基酸或化学氨基酸类似物以取代或加入形式引入抗体序列。非经典氨基酸一般包括但不限于：普通氨基酸的D-异构体、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟基脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代-氨基酸、设计氨基酸如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸和氨基酸类似物。

在另一个实施方案中，选择修饰的位点是利用噬菌体展示经亲和性成熟的(见上)。

可利用本领域已知的任何诱变技术修饰DNA序列中的单个核苷酸，以便在抗体序列中产生氨基酸取代，或产生/消除限制性位点以利于进一步操作。这些技术包括但不限于：化学诱变，体外定点诱变(Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：488(1985)；Hutchinson，C等，J.Biol.Chem.，253：6551(1978))，寡核苷酸定点诱变(Smith，Ann.Rev.Genet.，19：423-463(1985)；Hill等，Methods Enzymol.，155：558-568(1987))，基于PCR的重叠延伸(Ho等，Gene，77：51-59(1989))，基于PCR的兆引物(megaprimer)诱变(Sarkar等，Biotechniques，8：404-407(1990))等。可通过双链双脱氧DNA测序验证修饰。

在本发明的某些实施方案中，可修饰抗CD 19抗体以产生融合蛋白；即与异源蛋白质、多肽或肽融合的抗体或其片段。在某些实施方案中，与抗CD 19抗体的一部分融合的蛋白质是抗体-导向的酶前药治疗(ADEPT)的酶组分。可工程改造为与抗CD 19抗体的融合蛋白形式的其它蛋白质或多肽的例子包括但不限于：毒素如蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗-病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素。参见例如，Pastan等，Cell，47：641(1986)，Goldenberg等，CancerJournal for Clinicians，44：43(1994)。可以使用的酶活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(Sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、米托洁林(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯族毒素(tricothecenes)。参见例如，1993年10月28日公开的WO 93/21232。

可通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(总称为“DNA改组”)的技术产生其它融合蛋白。可利用DNA改组改变抗CD 19抗体或其片段的活性(如具有较高亲和性和较低解离速率的抗体或其片段)。通常参见美国专利5,605,793；5,811,238；5,830,721；5,834,252；和5,837,458，和Patten等，1997，Curr.Opinion Biotechnol.，8：724-33；Harayama，1998，Trends Biotechnol.16(2)：76-82；Hansson等，1999，J.Mol.Biol.，287：265-76；以及Lorenzo和Blasco，1998，Biotechniques24(2)：308-313(这些专利和出版物各自通过引用并入本文)。该抗体还可以是结合结构域免疫球蛋白融合蛋白，如Ledbetter等在美国公开No.20030118592、美国公开No.200330133939和PCT公开WO 02/056910中所述，其通过引用整体并入本文。

在本发明的某些实施方案中，抗CD 19抗体是亲本抗体。“亲本抗体”是与本文所述的改变/突变的抗体相比，其一个或多个高变区中或其附近的一个或多个氨基酸残基可能发生缺失或缺陷的氨基酸序列的抗体。因此，亲本抗体的高变区可能比本文所公开的抗体突变体的相应高变区要短。亲本多肽可包含天然抗体序列(即天然产生的，包括天然产生的等位基因变体)或带有天然产生序列的预先存在氨基酸序列修饰(如其它添加、缺失和/或取代)的抗体序列。亲本抗体可以是人源化抗体或人抗体。

【6.8.双特异性抗体】

双特异性抗体是对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。示范性双特异性抗体可结合于B细胞表面标记的两种不同表位。其它这类抗体可结合第一种B细胞标记，进一步结合第二种B细胞表面标记。表达抗B细胞标记结合臂也可与结合白细胞上的引发分子如T细胞受体分子(如CD2或CD3)或IgG的Fc受体(FcγR)的臂联合，以便将细胞防御机制集中于B细胞。也可利用双特异性抗体将细胞毒剂定位于B细胞。这些抗体具有B细胞标记结合臂和结合细胞毒剂(如皂草毒蛋白、抗-干扰素-α、长春花生物碱、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤(metholaexate)或放射性同位素半抗原)的臂。可以全长抗体或抗体片段的形式制备双特异性抗体(如，F(ab′)：双特异性抗体)。

制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。(参见例如Millstein等，Nature，305：537-539(1983)；Traunecker等，EMBO J.，10：3655-3659(1991)；Suresh等，Methods in Enzymology，121：210(1986)；Kostelny等，J.Immunol.，148(5)：1547-1553(1992)；Hollinger等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)；Gruber等，J.Immunol.，152：5368(1994)；美国专利4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,81；95,731，168；4,676,980；和4,676,980、WO 94/04690；WO 91/00360；WO 92/200373；WO 93/17715；WO92/08802；和EP 03089。)

在一个实施方案中，当本发明组合物和方法的抗CD 19抗体为双特异性抗体时，该抗CD 19抗体可以是人或人源化抗体，并可具有对人CD 19和T细胞上表位的特异性，或者能够结合人效应细胞，如单核细胞/巨噬细胞和/或天然杀伤细胞，以实现细胞死亡。

在一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体是能够特异性结合第一种和第二种抗原的双特异性抗体，其中所述第一种抗原是人CD 19，所述第二种抗原是选自下组的Fcγ受体：FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA和/或FcγRIV。在又一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体是能够特异性结合人CD 19和FcγRIIB的双特异性抗体。在另一个实施方案中，本发明抗CD 19抗体是能够特异性结合人CD 19和人FcγRIIB的双特异性抗体。

【6.9.变异Fc区】

本发明提供了含有变异Fc区的蛋白质的制剂。就是说，非天然产生的Fc区，如含有一个或多个非天然产生氨基酸残基的Fc区。本发明变异Fc区也包括具有氨基酸缺失、加入和/或修饰的Fc区。

应理解，本文所用的Fc区包括含有除第一恒定区免疫球蛋白结构域之外的抗体恒定区的多肽。因此，Fc指IgA、IgD和IgG的后两个恒定区免疫球蛋白结构域，IgE和IgM的后三个恒定区免疫球蛋白结构域，以及这些结构域N末端的柔性绞链区。对IgA和IgM而言，Fc可包括J链。对IgG而言，Fc包括免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3以及Cγ1和Cγ2之间的绞链区。虽然Fc区的边界可变，但人IgG重链Fc区通常被定义为羧基端包括残基C226或P230，其中编号是按照Kabat等所述的EU索引进行的。(1991，NIH出版物91-3242，美国国家技术信息服务中心，Springfield，VA)。“Kabat所述的EU索引”指Kabat等，同上所述的人IgG1 EU抗体的残基编号。Fc可单独指这个区域，或抗体、抗体片段或Fc融合蛋白中的这个区域。Fc变异蛋白可以是抗体、Fc融合物或包含Fc区的任何蛋白质或蛋白质结构域，包括但不限于：含有变异Fc区，即Fc的非天然产生变体的蛋白。注：在许多Fc位置上观察到多态性，这些位置包括但不限于Kabat270、272、312、315、356和358，因此所述序列和现有技术的序列之间可能存在略微差异。

本发明包括相对于比较分子(如除含有野生型Fc区外其它氨基酸序列相同的蛋白质)对Fc配体(如Fc受体，C1q)的结合特性改变的Fc变异蛋白。结合特性的例子包括但不限于：结合特异性、平衡解离常数(K_D)、解离速率和结合速率(分别是k_off和k_on)、结合亲和性和/或亲合力。通常应理解，具有低K_D的结合分子(例如Fc变异蛋白，如抗体)可能比具有高K_D的结合分子更优选。然而，在一些情况下，k_on或k_off值可能比K_D值更相关。本领域技术人员可确定对给定抗体应用而言哪一个动力学参数最重要。

可通过本领域已知用于确定Fc-FcγR相互作用，即Fc区与FcγR的特异性结合的各种体外测定法(生化或免疫测定法)确定Fc结构域与其配体的亲和性和结合特性，这些方法包括但不限于：平衡法(如酶联免疫吸附实验(ELISA)、或放射性免疫实验(RIA))或动力学方法(如

分析)，以及其它方法，如间接结合实验、竞争性抑制实验、荧光共振能量转移(FRET)、凝胶电泳和色谱法(如凝胶过滤)。这些和其它方法可利用所检测的一种或多种组分上的标记和/或利用各种检测方法，包括但不限于显色标记、荧光标记、发光标记或同位素标记。有关结合亲和性和动力学的详细描述可参见Paul，W.E.编，Fundamental Immunology(基础免疫学)，第4版，Lippincott-Raven，Philadelphia(1999)，其关注于抗体-免疫原相互作用。

在一个实施方案中，相对于比较分子，Fc变异蛋白对一种或多种Fc配体的结合增强。在另一个实施方案中，Fc变异蛋白与Fc配体的亲和性是比较分子的至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍、或至少200倍。在特定的实施方案中，Fc变异蛋白与Fc受体的结合增强。在另一个特定的实施方案中，Fc变异蛋白与Fc受体FcγRIIIA的结合增强。在进一步特定的实施方案中，Fc变异蛋白与Fc受体FcγRIIB的结合增强。在另一个特定的实施方案中，Fc变异蛋白与Fc受体FcRn的结合增强。在又另一个特定的实施方案中，与比较分子相比，Fc变异蛋白与C1q的结合增强。

在一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体包含变异Fc结构域，其中与比较的非变异Fc结构域相比，所述变异Fc结构域与Fcγ受体IIB的结合亲和性增强。在又一个实施方案中，本发明的抗CD 19抗体包含变异Fc结构域，其中所述变异Fc结构域与Fcγ受体IIB的亲和性是比较非变异Fc结构域的至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍、或至少200倍。

可通过提高Fc区与FcRn的结合亲和性来延长含有Fc区的蛋白质的血清半衰期。在一个实施方案中，与比较分子相比，Fc变异蛋白的血清半衰期延长。

“抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用”或“ADCC”指分泌的Ig与某些细胞毒细胞(如天然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)结合，使得这些细胞毒效应细胞特异性结合于携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死该靶细胞的细胞毒形式。针对靶细胞表面的特异性高亲和性IgG抗体将细胞毒细胞“武装”起来，是进行这种杀伤作用绝对需要的。靶细胞裂解是细胞外过程，需要直接的细胞间接触，并且不涉及补体。认为除抗体外，能够特异性结合携带抗原的靶细胞的含有Fc区的其它蛋白，特别是Fc融合蛋白能够实施细胞介导的细胞毒作用。简要说，因Fc融合蛋白的活性所致的细胞介导的细胞毒作用在本文中也称为ADCC活性。

可测定任何具体Fc变异蛋白通过ADCC介导靶细胞裂解的能力。为了评价ADCC活性，将感兴趣的Fc变异蛋白和免疫效应细胞一起加到靶细胞中，通过抗原抗体复合物可激活该效应细胞，进而导致该靶细胞裂解。通常通过裂解细胞释放的标记(如放射性底物、荧光染料或天然的细胞内蛋白质)来检测细胞裂解。可用于这类测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。体外ADCC试验的具体例子参见Wisecarver等，1985J Immunol Methods 79：277-282；Bruggemann等，1987，J Exp Med 166：1351-1361；Wilkinson等，2001，J Immunol Methods 258：183-191；Patel等，1995J ImmunolMethods 184：29-38。也可在体内评价感兴趣的Fc变异蛋白的ADCC活性，例如在如Clynes等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：652-656所公开的动物模型中进行评价。

在一个实施方案中，与比较分子相比，Fc变异蛋白的ADCC活性增强。在特定的实施方案中，Fc变异蛋白的ADCC活性比比较分子高至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少50倍、或至少100倍。在另一个特定的实施方案中，与比较分子相比，Fc变异蛋白与Fc受体FcγRIIIA的结合水平提高且ADCC活性增强。在其它实施方案中，与比较分子相比，Fc变异蛋白的ADCC活性提高、血清半衰期延长。

在一个实施方案中，与比较分子相比，Fc变异蛋白的ADCC活性降低。在特定的实施方案中，Fc变异蛋白的ADCC活性比比较分子低至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少50倍、或至少100倍。在另一个特定的实施方案中，与比较分子相比，Fc变异蛋白与Fc受体FcγRIIIA的结合水平降低且ADCC活性降低。在其它实施方案中，与比较分子相比，Fc变异蛋白的ADCC活性降低、血清半衰期延长。

“补体依赖性细胞毒性”和“CDC”指在补体存在下裂解靶细胞。通过补体***第一组分(C1q)与复合关联抗原的分子(例如抗体)结合，启动补体活化途径。为了评估补体活化，可进行CDC测定，如Gazzano-Santoro等，1996，J.Immunol.Methods，202：163所述。在一个实施方案中，与比较分子相比，Fc变异蛋白的CDC活性增强。在特定的实施方案中，Fc变异蛋白的CDC活性比比较分子高至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少50倍、或至少100倍。在其它实施方案中，与比较分子相比，Fc变异蛋白的CDC活性提高、血清半衰期延长。

在一个实施方案中，相对于比较分子，Fc变异蛋白对一种或多种Fc配体的结合降低。在另一个实施方案中，Fc变异蛋白与Fc配体的亲和性是比较分子的至多1/2、或至多1/3、或至多1/5、或至多1/7、或至多1/10、或至多1/20、或至多1/30、或至多1/40、或至多1/50、或至多1/60、或至多1/70、或至多1/80、或至多1/90、或至多1/100、或至多1/200。在特定的实施方案中，Fc变异蛋白与Fc受体的结合降低。在另一个特定的实施方案中，Fc变异蛋白与Fc受体FcγRIIIA的结合降低。在进一步特定的实施方案中，本文所述的Fc变体与Fc受体FcγRIIIA的亲和性是比较分子的至多约1/5，其中所述Fc变体与Fc受体FcγRIIB的亲和性是比较分子亲和性的约2倍以下。在另一个特定的实施方案中，Fc变异蛋白与Fc受体FcRn的结合降低。在又另一个特定的实施方案中，与比较分子相比，Fc变异蛋白与C1q的结合降低。

在一个实施方案中，本发明提供了Fc变体，其中Fc区在一个或多个选自下组的位置上包含非天然产生的氨基酸残基：234、235、236、237、238、239、240、241、243、244、245、247、251、252、254、255、256、262、263、264、265、266、267、268、269、279、280、284、292、296、297、298、299、305、313、316、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、339、341、343、370、373、378、392、416、419、421、440和443，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。任选地，Fc区可在本领域技术人员己知的其它和/或可选的位置上包含非天然产生的氨基酸残基(参见例如，美国专利5,624,821；6,277,375；6,737,056；PCT专利公布WO 01/58957；WO02/06919；WO 04/016750；WO 04/029207；WO 04/035752；WO04/074455；WO 04/099249；WO 04/063351；WO 05/070963；WO05/040217、WO 05/092925和WO 06/020114)。

在一个实施方案中，本发明提供了制剂，其中其中Fc区在一个或多个选自下组的位置上包含非天然产生的氨基酸残基：234、235、236、237、238、239、240、241、243、244、245、247、251、252、254、255、256、262、263、264、265、266、267、268、269、279、280、284、292、296、297、298、299、305、313、316、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、339、341、343、370、373、378、392、416、419、421、440和443，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。任选地，Fc区可在本领域技术人员已知的其它和/或另选的位置上包含非天然产生的氨基酸残基(参见，例如，美国专利5,624,821；6,277,375；6,737,056；PCT专利公布WO 01/58957；WO 02/06919；WO 04/016750；WO 04/029207；WO 04/035752；WO04/074455；WO 04/099249；WO 04/063351；WO 05/070963；WO05/040217、WO 05/092925和WO 06/020114)。

在特定的实施方案中，本发明提供了Fc变体，其中Fc区包含至少一个选自下组的非天然产生的氨基酸残基：234D、234E、234N、234Q、234T、234H、234Y、234I、234V、234F、235A、235D、235R、235W、235P、235S、235N、235Q、235T、235H、235Y、235I、235V、235F、236E、239D、239E、239N、239Q、239F、239T、239H、239Y、240I、240A、240T、240M、241W、241L、241Y、241E、241R、243W、243L、243Y、243R、243Q、244H、245A、247L、247V、247G、251F、252Y、254T、255L、256E、256M、262I、262A、262T、262E、263I、263A、263T、263M、264L、264I、264W、264T、264R、264F、264M、264Y、264E、265G、265N、265Q、265Y、265F、265V、265I、265L、265H、265T、266I、266A、266T、266M、267Q、267L、268E、269H、269Y、269F、269R、270E、280A、284M、292P、292L、296E、296Q、296D、296N、296S、296T、296L、296I、296H、269G、297S、297D、297E、298H、298I、298T、298F、299I、299L、299A、299S、299V、299H、299F、299E、305I、313F、316D、325Q、325L、325I、325D、325E、325A、325T、325V、325H、327G、327W、327N、327L、328S、328M、328D、328E、328N、328Q、328F、328I、328V、328T、328H、328A、329F、329H、329Q、330K、330G、330T、330C、330L、330Y、330V、330I、330F、330R、330H、331G、331A、331L、331M、331F、331W、331K、331Q、331E、331S、331V、331I、331C、331Y、331H、331R、331N、331D、331T、332D、332S、332W、332F、332E、332N、332Q、332T、332H、332Y、332A、339T、370E、370N、378D、392T、396L、416G、419H、421K、440Y和434W，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。任选地，Fc区可包含本领域技术人员已知的其它和/或可选的非天然产生的氨基酸残基(参见，例如，美国专利5,624,821；6,277,375；6,737,056；PCT专利公布WO 01/58957；WO 02/06919；WO 04/016750；WO 04/029207；WO 04/035752和WO 05/040217)。

在特定的实施方案中，本发明提供了Fc变异蛋白制剂，其中Fc区包含至少一个选自下组的非天然产生的氨基酸残基：234D、234E、234N、234Q、234T、234H、234Y、234I、234V、234F、235A、235D、 235R、235W、235P、235S、235N、235Q、235T、235H、235Y、235I、235V、235F、236E、239D、239E、239N、239Q、239F、239T、239H、239Y、2401、240A、240T、240M、241W、241L、241Y、241E、241R、243W、243L、243Y、243R、243Q、244H、245A、247L、247V、247G、251F、252Y、254T、255L、256E、256M、262I、262A、262T、262E、263I、263A、263T、263M、264L、264I、264W、264T、264R、264F、264M、264Y、264E、265G、265N、265Q、265Y、265F、265V、265I、265L、265H、265T、266I、266A、266T、266M、267Q、267L、268E、269H、269Y、269F、269R、270E、280A、284M、292P、292L、296E、296Q、296D、296N、296S、296T、296L、296I、296H、269G、297S、297D、297E、298H、298I、298T、298F、299I、299L、299A、299S、299V、299H、299F、299E、305I、313F、316D、325Q、325L、325I、325D、325E、325A、325T、325V、325H、327G、327W、327N、327L、328S、328M、328D、328E、328N、328Q、328F、328I、328V、328T、328H、328A、329F、329H、329Q、330K、330G、330T、330C、330L、330Y、330V、330I、330F、330R、330H、331G、331A、331L、331M、331F、331W、331K、331Q、331E、331S、331V、331I、331C、331Y、331H、331R、331N、331D、331T、332D、332S、332W、332F、332E、332N、332Q、332T、332H、332Y、332A、339T、370E、370N、378D、392T、396L、416G、419H、421K、440Y和434W，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。任选地，Fc区可在本领域技术人员己知的其它和/或可选的位置上包含非天然产生的氨基酸残基(参见，例如，美国专利5,624,821；6,277,375；6,737,056；PCT专利公布WO 01/58957；WO 02/06919；WO 04/016750；WO 04/029207；WO 04/035752和WO 05/040217)。

在另一个实施方案中，本发明提供Fc变体，其中所述Fc区在选自239、330或332的一个或多个位置上包含至少一个非天然产生的氨基酸，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。在特定的实施方案中，本发明提供Fc变体，其中Fc区包含至少一个选自239D、330L或332E 的非天然产生的氨基酸，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。任选地，所述Fc区在选自252、254或256的一个或多个位置上还可包含其它非天然产生的氨基酸，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。在特定的实施方案中，本发明提供Fc变体，其中Fc区包含至少一个选自239D、330L或332E(按照Kabat所述EU索引编号)的非天然产生的氨基酸，并且在选自252Y、254T或256E(按照Kabat所述EU索引编号)的一个或多个位置上包含至少一个非天然产生的氨基酸。

在另一个实施方案中，本发明提供了Fc变体，其中所述Fc区在选自234、235或331的一个或多个位置上包含至少一个非天然产生的氨基酸，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。在特定的实施方案中，本发明提供了Fc变体，其中包含至少一个选自234F、235F、235Y或331S的非天然产生的氨基酸，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。在进一步特定的实施方案中，本发明的Fc变体包含234F、235F和331S非天然产生的氨基酸残基，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。在另一个特定的实施方案中，本发明的Fc变体包含234F、235Y和331S非天然产生的氨基酸残基，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。任选地，所述Fc区在选自252、254或256的一个或多个位置上还可包含其它非天然产生的氨基酸，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。在特定的实施方案中，本发明提供了Fc变体，其中Fc区包含至少一个选自234F、235F、235Y或331S(按照Kabat所述EU索引编号)的非天然产生的氨基酸，并且在选自252Y、254T或256E(按照Kabat所述EU索引编号)的一个或多个位置上包含至少一个非天然产生的氨基酸。

在另一个实施方案中，本发明提供了Fc变异蛋白制剂，其中所述Fc区在选自239、330或332的一个或多个位置上包含至少一个非天然产生的氨基酸，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。在特定的实施方案中，本发明提供了Fc变异蛋白制剂，其中Fc区包含至少一个选自239D、330L或332E的非天然产生的氨基酸，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。任选地，Fc区还可包含在选自252、254 或256的一个或多个位置上还可包含其它非天然产生的氨基酸，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。在特定的实施方案中，本发明提供了Fc变异蛋白制剂，其中Fc区包含至少一个选自239D、330L或332E(按照Kabat所述EU索引编号)的非天然产生的氨基酸，并且在选自252Y、254T或256E(按照Kabat所述EU索引编号)的一个或多个位置上包含至少一个非天然产生的氨基酸。

在另一个实施方案中，本发明提供了Fc变异蛋白制剂，其中Fc区在选自234、235或331的一个或多个位置上包含至少一个非天然产生的氨基酸，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。在特定的实施方案中，本发明提供Fc变异蛋白制剂，其中Fc区包含至少一个选自234F、235F、235Y或331S的非天然产生的氨基酸，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。任选地，所述Fc区在选自252、254或256的一个或多个位置上还可包含其它非天然产生的氨基酸，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。在特定的实施方案中，本发明提供了Fc变异蛋白制剂，其中Fc区包含至少一个选自234F、235F、235Y或331S(按照Kabat所述EU索引编号)的非天然产生的氨基酸，并且在选自252Y、254T或256E(按照Kabat所述EU索引编号)的一个或多个位置上包含至少一个非天然产生的氨基酸。

在一个实施方案中，本发明的Fc变体可与其它已知Fc变体组合，例如以下文献中所公开的Fc变体：Ghetie等，1997，Nat Biotech.15：637-40；Duncan等，1988，Nature 332：563-564；Lund等，1991，J.Immunol 147：2657-2662；Lund等，1992，Mol Immunol 29：53-59；Alegre等，1994，Transplantation 57：1537-1543；Hutchins等，1995，Proc Natl.Acad Sci USA 92：11980-11984；Jefferis等，1995，ImmunolLett.44：111-117；Lund等，1995，Faseb J 9：115-119；Jefferis等，1996，Immunol Lett 54：101-104；Lund等，1996，J Immunol157：4963-4969；Armour等，1999，Eur J Immunol 29：2613-2624；Idusogie等，2000，J Immunol 164：4178-4184；Reddy等，2000，JImmunol 164：1925-1933；Xu等，2000，Cell Immunol 200：16-26； Idusogie等，2001，J Immunol 166：2571-2575；Shields等，2001，J BiolChem 276：6591-6604；Jefferis等，2002，Immunol Lett 82：57-65；Presta等，2002，Biochem Soc Trans 30：487-490；美国专利5,624,821；5,885,573；5,677,425；6,165,745；6,277,375；5,869,046；6,121,022；5,624,821；5,648,260；6,528,624；6,194,551；6,737,056；6,821,505；6,277,375；美国专利公开2004/0002587和PCT公开WO 94/29351；WO 99/58572；WO 00/42072；WO 02/060919；WO 04/029207；WO04/099249；WO 04/063351。本发明也包括含有缺失、加入和/或修饰的Fc区。本领域技术人员可以明显看出还可对Fc结构域进行其它修饰/取代/加入/缺失。

产生非天然产生的Fc区的方法是本领域众所周知的。例如，可通过诱变法产生氨基酸取代和/或缺失，诱变法包括但不限于：定点诱变(Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492(1985))、PCR诱变(Higuchi，刊于″PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications(PCR实验方案：方法和应用指南)″，Academic Press，San Diego，第177-183页(1990))和盒式诱变(Wells等，Gene34：315-323(1985))。可通过重叠延伸PCR方法进行定点诱变(Higuchi，刊于″PCR Technology：Principles and Applications forDNA Amplification(PCR技术：用于DNA扩增的原理和应用)″，Stockton Press，New York，第61-70页(1989))。可利用重叠延伸PCR的技术(Higuchi，同上)，将任何所需突变引入靶序列(初始DNA)。例如，重叠延伸法中的第一轮PCR包括用外部引物(引物1)和内部诱变引物(引物3)扩增靶序列，分别用第二种外部引物(引物4)和内部引物(引物2)扩增，产生两种PCR区段(区段A和B)。设计内部诱变引物(引物3)，以使靶序列含有指向所需突变的错配。在第二轮PCR中，用两种外部引物(引物1和4)借助PCR扩增第一轮PCR的产物(区段A和B)。用限制性酶消化得到的全长PCR区段(区段C)，将得到的限制性片段克隆入合适载体中。诱变的第一个步骤是，将初始DNA(如编码Fc融合蛋白、抗体或仅Fc区的DNA)操作性克隆到诱变载体中。设计引物，以反映所需的氨基酸取代。本领域已知用于产生变异Fc区的其它方法(参见例如，美国专利5,624,821；5,885,573；5,677,425；6,165,745；6,277,375；5,869,046；6,121,022；5,624,821；5,648,260；6,528,624；6,194,551；6,737,056；6,821,505；6,277,375；美国专利公开2004/0002587或PCT公开WO 94/29351；WO 99/58572；WO00/42072；WO 02/060919；WO 04/029207；WO 04/099249；WO04/063351)。

在一些实施方案中，Fc变异蛋白包含一种或多种工程改造的糖形，即共价连接于含有Fc区的分子的糖组分。工程改造的糖形可用于各种目的，包括但不限于提高或降低效应功能。工程改造的糖形可通过本领域技术人员已知的任何方法产生，例如，采用工程改造或变异的表达株，与一种或多种酶如DIN-乙酰基葡糖胺基转移酶III(GnTI11)共表达，在各种生物体或来自各种生物体的细胞系中表达含有Fc区的分子，或者在含有Fc区的分子表达后修饰糖。本领域已知产生工程改造的糖形的方法，包括但不限于Umana等，1999，Nat.Biotechnol17：176-180；Davies等，20017Biotechnol Bioeng 74：288-294；Shields等，2002，J Biol Chem 277：26733-26740；Shinkawa等，2003，J BiolChem 278：3466-3473；美国专利6,602,684；美国专利序列10/277,370；美国专利序列10/113,929；PCT WO 00/61739A1；PCT WO01/292246A1；PCT WO 02/311140A1；PCT WO 02/30954A1所述的方法；Potelligent^TM技术(Biowa，Inc.Princeton，N.J.)；GlycoMAb^TM糖基化工程技术(GLYCART biotechnology AG，Zurich，Switzerland)。参见例如WO 00061739；EA01229125；US 20030115614；Okazaki等，2004，JMB，336：1239-49。

考虑到，本文所述Fc变体可来自本领域所述的任何抗体，或者可将本文所述的变异Fc区引入本领域所述的任何抗体中，这些抗体包括但不限于：抗荧光素单克隆抗体4-4-20(Kranz等，1982J.Biol.Chem.257(12)；6987-6995)；人源化抗TAG72抗体(CC49)(Sha等，1994Cancer Biother.341-9)；特异性结合Eph受体的抗体，包括但不限于 PCT公开No.WO 04/014292、WO 03/094859和美国专利申请No.10/863,729所述的抗体；特异性结合整联蛋白αVβ3的抗体，包括但不限于LM609(Scripps)，鼠单克隆抗体LM609(PCT公开WO89/015155和美国专利No.5,753,230)；人源化单克隆抗体MEDI-522(也称为

米迪缪尼公司(MedImmune，Inc.)，马里兰州盖瑟斯堡(Gaithersburg，MD)；Wu等，1998，PNAS USA95(11)：6037-6042；PCT公开WO 90/33919和WO 00/78815)，如WO/2005/05059106所述的干扰素α的抗体，如WO/2006/059106所述的干扰素受体1的抗体，Erbitux^TM(也称为IMC-C225)(因克隆***公司(ImClone Systems Inc.))，EGFR的嵌合单克隆抗体；贺赛 (曲妥珠单抗)(加州基因泰克公司(Genentech，CA))，它是用于治疗转移性乳腺癌患者的人源化抗-HER2单克隆抗体；

(阿昔单抗)(森托克公司(Centocor))，它是用于预防形成血凝块的血小板上的抗糖蛋白IIb/IIIa受体；

(达珠单抗)(瑞士的罗氏制药(Roche Pharmaceuticals，Switzerland))，它是用于预防急性肾脏同种异体移植排斥的免疫抑制性人源化抗CD25单克隆抗体。其它例子是人源化抗CD18F(ab′)2(基因泰克公司)；CDP860，它是人源化抗CD 18F(ab′)2(英国的赛尔泰克公司(Celltech，UK))；PR0542，它是与CD4融合的抗-HIV gp120抗体(普洛基尼公司鹰备转基因技术公司(Progenics/Genzyme Transgenics))；C14，它是抗CD 14抗体(ICOS制药公司(ICOS Pharm))；人源化抗-VEGF IgG1抗体(基因泰克公司)；OVAREX^TM，它是鼠抗-CA 125抗体(Altarex)；PANOREX^TM，它是鼠抗-17-IA细胞表面抗原IgG2a抗体(葛兰素史克(Glaxo Wellcome)麻托克公司)；IMC-C225，它是嵌合抗-EGFR IgG抗体(因克隆***公司(ImClone System))；维他辛(VITAXIN)^TM，它是人源化抗-αVβ3整联蛋白抗体(应用分子演化公司/米迪缪尼(Applied MolecularEvolution/MedImmune))；坎帕斯(Campath)1H/LDP-03，它是人源化抗CD52 IgG1抗体(刘克赛特公司((Leukosite))；Smart M195，它是人源化抗CD33 IgG抗体(蛋白质设计实验室(Protein Design Lab)/钟纺制药公司(Kanebo))；利妥昔(RITUXAN^TM)，它是嵌合抗CD20 IgG1抗体(IDEC制药公司/基因泰克公司，罗氏/泽塔(Zettyaku))；LYMPHOCIDE^TM，它是人源化抗CD22 IgG抗体(因缪麦迪公司(Immunomedics))；Smart ID 10，它是人源化抗-HLA抗体(蛋白质设计实验室)；ONCOLYM^TM(Lym-1)，它是放射性标记的鼠抗-HLA DR抗体(特尼克隆公司(Techniclone))；抗CD11a，它是人源化IgG1抗体(基因泰克/索马公司(Xoma))；ICM3，它是人源化抗-ICAM3抗体(ICOS制药公司)；IDEC-114，它是灵长化抗CD80抗体(IDEC制药公司/三菱公司(Mitsubishi))；ZEVALIN^TM，它是放射性标记的鼠抗CD20抗体(IDEC/舍林公司(Schering AG))；IDEC-131，它是人源化抗CD40L抗体(IDEC/卫材公司(Eisai))；IDEC-151，它是灵长化抗CD4抗体(IDEC)；IDEC-152，它是灵长化抗CD23抗体(IDEC/Seikagaku)；SMART抗CD3，它是人源化抗CD3 IgG(蛋白质设计实验室)；5G1.1，它是人源化抗-补体因子5(C5)抗体(阿来克申制药公司(Alexion Pharm))；IDEC-151，它是灵长化抗CD4 IgG1抗体(IDEC制药公司/史可必成公司(SmithKline Beecham))；MDX-CD4，它是人抗CD4 IgG抗体(麦得莱克斯公司(Medarex)/卫材公司/基麦公司(Genmab))；CDP571，它是人源化抗-TNF-αIgG4抗体(赛尔泰克公司)；LDP-02，它是人源化抗-α4β7抗体(刘克赛特公司/基因泰克公司)；OrthoClone OKT4A，它是人源化抗CD4 IgG抗体(奥索生物科技(Ortho Biotech))；ANTOVA^TM，它是人源化抗CD40L IgG抗体(百集公司(Biogen))；ANTEGREN^TM它是人源化抗-VLA-4IgG抗体(伊兰公司(Elan))；MDX-33，它是人抗CD64(FcγR)抗体(麦得莱克斯公司/森替昂公司(Centeon))；rhuMab-E25，它是人源化抗-IgE IgG1抗体(基因泰克公司/诺华公司/谭诺生物***公司(Tanox Biosystems))；IDEC-152，它是灵长化抗CD23抗体(IDEC制药公司)；ABX-CBL，它是鼠抗CD-147 IgM抗体(阿布吉尼公司(Abgenix))；BTI-322，它是大鼠抗CD2 IgG抗体(米迪缪尼公司/生物移植公司(Bio Transplant))；奥索克隆/OKT3(Orthoclone/OKT3)，它是鼠抗CD3 IgG2a抗体(奥索生物科技公司(ortho Biotech))；SIMULECT^TM，它是嵌合抗CD25 IgG1抗体(诺华制药)；LDP-01，它是人源化抗-β2-整联蛋白IgG抗体(刘克赛特公司)；抗-LFA-1，它是鼠抗CD18F(ab′)2(PM公司(Pasteur-Merieux)/因缪泰克公司(Immunotech))；CAT-152，它是人抗-TGF-β2抗体(剑桥科技公司(Cambridge Ab Tech))；和Corsevin M，它是嵌合抗-因子VII抗体(森托克公司)。

可包含本文所述Fc变异区的其它抗体可特异性结合癌或肿瘤抗原，包括例如但不限于：KS 1/4泛癌抗原(Perez和Walker，1990，J.Immunol.142：3662-3667；Bumal，1988，Hybridoma 7(4)：407-415)、卵巢癌抗原(CA125)(Yu等，1991，Cancer Res.468-475)、***酸性磷酸酶(Tailor等，1990，Nucl.Acids Res.4928)、***特异性抗原(Henttu和Vihko，1989，Biochem.Biophys.Res.Comm.160(2)：903-910；Israeli等，1993，Cancer Res.227-230)、黑色素瘤-相关抗原p97(Estin等，1989，J.Natl.Cancer Instit.445-446)、黑色素瘤抗原gp75(Vijayasardahl等，1990，J.Exp.Med.171(4)：1375-1380)、高分子量黑色素瘤抗原(HMW-MAA)(Natali等，1987，Cancer 59：55-63；Mittelman等，1990，J.Clin.Invest.86：2136-2144)、***特异性膜抗原、癌胚抗原(CEA)(Foon等，1994，Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.13：294)、多态性上皮粘蛋白抗原、人乳脂球状抗原、结直肠肿瘤-相关抗原，例如：CEA，TAG-72(Yokata等，1992，Cancer Res.52：3402-3408)、CO17-1A(Ragnhammar等，1993，Int.J.Cancer 53：751-758)；GICA 19-9(Herlyn等，1982，J.Clin.Immunol.2：135)、CTA-1和LEA、伯基特淋巴瘤抗原-38.13、CD 19(Ghetie等，1994Blood83：1329-1336)、人B-淋巴瘤抗原-CD20(Reff等，1994，Blood 83：435-445)、CD33(Sgouros等，1993，J.Nucl.Med.34：422-430)、黑色素瘤特异性抗原如神经节苷脂GD2(Saleh等，1993，J.Immunol.，151，3390-3398)、神经节苷脂GD3(Shitara等，1993，Cancer Immunol.Immunother.36：373-380)、神经节苷脂GM2(Livingston等，1994J.Clin.Oncol.12：1036-1044)、神经节苷脂GM3(Noon等，1993，Cancer Res.53：5244-5250)、肿瘤特异性移植类型的细胞表面抗原(TSTA)如病毒诱导的肿瘤抗原(包括DNA肿瘤病毒的T-抗原和RNA肿瘤病毒的包膜抗原)、癌胚抗原-甲胎蛋白如结肠癌CEA、***癌胚抗原(Hellstrom等，1985，Cancer Res.45：2210-2188)、分化抗原如人肺癌抗原L6、L20(Hellstrom等，1986，Cancer Res.46：3917-3923)、纤维肉瘤抗原、人白血病T细胞抗原-Gp37(Bhattacharya-Chatterjee等，1988，J.of Immun.141：1398-1403)、新糖蛋白、鞘脂、乳腺癌抗原如EGFR(表皮生长因子受体)、HER2抗原(p185HER2)、多态性上皮粘蛋白(PEM)(Hilkens等，1992，Trends in Bio.Chem.Sci.17：359)、恶性人淋巴细胞抗原-APO-1(B ernhard等，1989，Science 245：301-304)、分化抗原(Feizi，1985，Nature 314：53-57)如胎儿红细胞中发现的I抗原、成年人红细胞中发现的原内胚层I抗原、着床前胚胎、胃腺癌中发现的I(Ma)、乳腺上皮中发现的M18、M39、骨髓细胞中发现的SSEA-1、结直肠癌中发现的VEP8、VEP9、Myl、VIM-D5、D156-22)TRA-1-85(血型H)、结肠腺癌中发现的C14、肺腺癌中发现的F3、胃癌中发现的AH6、Y半抗原、胚胎癌细胞中发现的Ley、TL5(血型A)、A431细胞中发现的EGF受体、胰腺癌中发现的E1系列(血型B)、胚胎癌细胞中发现的FC 10.2、胃腺癌抗原、腺癌中发现的CO-514(血型Lea)、腺癌中发现的NS-10、CO-43(血型Leb)、A431细胞EGF受体中发现的G49、结肠腺癌中发现的MH2(血型ALeb/Ley)、结肠癌中发现的19.9、胃癌粘蛋白、骨髓细胞中发现的T5A7、黑色素瘤中发现的R24、胚胎癌细胞中发现的4.2、GD3、D 1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2和M1:22:25:8；4至8细胞胚胎阶段中发现的SSEA-3和SSEA-4。在一个实施方案中，抗原是来自皮肤T细胞淋巴瘤的T细胞受体衍生肽(参见Edelson，1998，The CancerJournal 4：62)。

本文所述的Fc变体可来自任何抗体，或者本文所述的变异Fc区可引入任何抗体。而且，本文所述的变异Fc区可用于产生Fc融合蛋白。因此，基本上任何分子均可被包含本文所述Fc变体的抗体和/或 Fc融合蛋白靶定和/或掺入，所述抗体和/或Fc融合蛋白包括但不限于以下蛋白质列表以及属于以下蛋白质列表的亚基、结构域、基序和表位：肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；a-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A-链；胰岛素B-链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；***；胰高血糖素；凝集因子，如因子VII、因子VIIIC、因子IX、组织因子(TF)和血管性血友病因子(von Willebrands factor)；抗凝集因子，如蛋白质C；心房钠元素；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物，如脲激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES(活化后可调节的、正常T细胞表达和分泌的因子)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白如人血清白蛋白；苗勒管抑制物；松弛素A-链；松弛素B-链；松弛素原；小鼠促性腺素-相关肽；微生物蛋白质，如β-内酰胺酶；DNA酶；IgE；细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原(CTLA)，如CTLA-4；抑制素；活化素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子受体，例如EGFR、VEGFR；干扰素如α干扰素(α-IFN)、β干扰素(β-IFN)和γ干扰素(γ-IFN)；干扰素受体组分，如干扰素受体1；蛋白质A或D；类风湿性因子；神经营养因子，如骨衍生的神经营养因子(BDNF)，神经营养因子-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或者神经生长因子；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子，如αFGF和βFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β，包括TGF-1、TGF-2、TGF-3、TGF-4或TGF-5；***-I和-II(IGF-I和IGF-II)；脱(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，***结合蛋白；CD蛋白，如CD2，CD3，CD4，CD8，CD11a、CD14、CD 18、CD 19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD33、CD34、CD40、CD40L、CD52、CD63、CD64、CD80和CD147；红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素，如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白介素(IL)，如IL-1至IL-13；TNFα； HMGB1；HMGB2；超氧化物歧化酶；T-细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，例如，AIDS包膜的一部分，如gp120；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；细胞粘着分子，如LFA-1、Mac1、p150.95、VLA-4、ICAM-1、ICAM-3和VCAM，a4/p7整联蛋白和(Xv/p3整联蛋白，包括其一个或多个亚基，整联蛋白α亚基例如CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、α7、α8、α9、αD、CD11a、CD11b、CD51、CD11c、CD41、αIIb、αIELb；整联蛋白β亚基例如CD29、CD18、CD61、CD104、β5、β6、β7和β8；整联蛋白亚基组合包括但不限于：αVβ3、αVβ5和α4β7；凋亡途径的成员；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；蛋白C；壳多糖酶或壳多糖酶样分子，如YKL-40和AMC酶；Eph受体，如EphA2、EphA4、EphB2等；人白细胞抗原(HLA)，如HLA-DR；补体蛋白，如补体受体CR1、C1Rq和其它补体因子，如C3和C5；糖蛋白受体如GpIbα、GPIIb/IIIa和CD200；共同刺激分子如CD28/CTLA-4、ICOS/AILIM、PD-1。

可包含本文所述变异Fc区的其它分子是能特异性结合癌抗原的分子，这些癌抗原包括但不限于：ALK受体(多效生长因子受体)，多效生长因子，KS 1/4泛癌抗原；卵巢癌抗原(CA 125)；***酸性磷酸酶；***特异性抗原(PSA)；黑色素瘤-相关抗原p97；黑色素瘤抗原gp75；高分子量黑色素瘤抗原(HMW-MAA)；***特异性膜抗原；癌胚抗原(CEA)；多态性上皮粘蛋白抗原；人乳脂球状抗原；结直肠肿瘤-相关抗原，如CEA、TAG-72、CO17-1A、GICA 19-9、CTA-1和LEA；伯基特淋巴瘤抗原-38.13；CD 19；人B-淋巴瘤抗原-CD20；CD33；黑色素瘤特异性抗原，如神经节苷脂GD2、神经节普脂GD3、神经节苷脂GM2和神经节苷脂GM3；肿瘤特异性移植型细胞表面抗原(TSTA)；病毒诱导的肿瘤抗原，包括DNA肿瘤病毒的T抗原和RNA肿瘤病毒的包膜抗原；癌胚抗原-甲胎蛋白，如结肠癌CEA、5T4癌胚滋养层糖蛋白和膀胱肽肿瘤癌胚抗原；分化抗原如人肺癌抗原L6和L20；纤维肉瘤抗原；人白血病T细胞抗原-Gp37；新糖蛋白；鞘脂；乳腺癌抗原，如EGFR(表皮生长因子受体)；NY-BR-16；NY-BR-16和HER2抗原(p185HER2)；多态性上皮粘蛋白(PEM)；恶性人淋巴细胞抗原-APO-1；分化抗原胎儿红细胞中发现的I抗原，成年人红细胞中发现的原内胚层I抗原；着床前胚胎；胃腺癌中发现的I(Ma)，乳腺上皮中发现的M18、M39，骨髓细胞中发现的SSEA-1，结直肠癌中发现的VEP8、VEP9、Myl、VIM-D5、D156-22；TRA-1-85(血型H)；睾丸癌和卵巢癌中发现的SCP-1；结肠腺癌中发现的C14；肺腺癌中发现的F3；胃癌中发现的AH6；Y半抗原；胚胎癌细胞中发现的Ley；TL5(血型A)；A431细胞中发现的EGF受体；胰腺癌中发现的E1系列(血型B)；胚胎癌细胞中发现的FC10.2；胃腺癌抗原；腺癌中发现的CO-514(血型Lea)；腺癌中发现的NS-10；CO-43(血型Leb)；A431细胞EGF受体中发现的G49；结肠腺癌中发现的MH2(血型ALeb/Ley)；结肠癌中发现的19.9；胃癌粘蛋白；骨髓细胞中发现的T5A7；黑色素瘤中发现的R24；胚胎癌细胞中发现的4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2和M1:22:25:8；4至8细胞胚胎阶段中发现的SSEA-3和SSEA-4；皮肤T细胞淋巴瘤抗原；MART-1抗原；唾液酸Tn(STn)抗原；结肠癌抗原NY-CO-45；肺癌抗原NY-LU-12变体A；腺癌抗原ART 1；癌旁相关性脑-睾丸-癌抗原(癌神经元抗原MA2；癌旁神经元抗原)；神经-肿瘤腹抗原2(NOVA2)；肝细胞癌抗原基因520；肿瘤相关抗原CO-029；肿瘤相关抗原MAGE-C1(癌症/睾丸抗原CT7)、MAGE-B1(MAGE-XP抗原)、MAGE-B2(DAM6)、MAGE-2、MAGE-4a、MAGE-4b和MAGE-X2；癌症-睾丸抗原(NY-EOS-1)；YKL-40以及上述多肽的片段。

【6.10.抗体的糖基化】

在另一个实施方案中，本发明中使用的抗体的糖基化可被改变。例如，可制备无糖基化抗体(即没有糖基化的抗体)。可改变糖基化状态，以(例如)提高抗体对靶抗原的亲和性。可通过(例如)改变抗体序列中一个或多个糖基化位点来进行这种糖修饰。例如，可进行一个或多个氨基酸取代，以消除一个或多个可变区构架糖基化位点，从而消除该位点上的糖基化。这种无糖基化可提高抗体对抗原的亲和性。这类方法详见美国专利No.5,714,350和6,350,861。也可进行一个或多个氨基酸取代，以消除Fc区中存在的糖基化位点(如IgG的天冬酰胺297)。而且，可在缺乏必要的糖基化机制的细菌细胞中产生无糖基化抗体。

也可制备糖基化类型改变的抗体，例如海藻糖残基数量减少的低海藻糖基化抗体或截开型G1cNAc结构增加的抗体。已证明，这类改变的糖基化模式能提高抗体的ADCC能力。可通过例如在糖基化机制改变的宿主细胞中表达该抗体来实现这类糖修饰。本领域已经描述过糖基化机制改变的细胞，它们可用作表达本发明重组抗体，从而产生糖基化改变的抗体的宿主细胞。参见例如，Shields，R.L.等(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740；Umana等(1999)Nat.Biotech.17：176-1，以及美国专利US 6,946,292；欧洲专利EP 1,176,195；PCT公开WO 03/035835；WO 99/54342，各篇文献的全文通过引用并入本文。

【6.11.工程改造效应功能】

可能需要根据效应功能修饰本发明抗CD 19抗体，以便提高(例如)该抗体在治疗B细胞恶性肿瘤介导疾病中的有效性。例如，可将半胱氨酸残基引入Fc区，从而在该区域中形成链间二硫键。如此产生的同源二聚体抗体可能具有改善的内化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和/或抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)。参见Caron等，J.ExpMed.，176：1191-1195(1992)和Shopes，B.，J.Immunol.，148：2918-2922(1992)。也可利用如Wolff等，Cancer Research，53：2560-2565(1993)所述的异源双功能交联剂制备抗肿瘤活性提高的同源二聚体抗体。也可工程改造具有双Fc区的抗体，从而其补体裂解能力和ADCC能力得到提高。参见Stevenson等，Anti-Cancer DrugDesign，3：219-230(1989)。

本领域了解工程改造抗体Fc区以改变效应功能的其它方法(例如，Koenig等的美国专利公开No.20040185045和PCT公开No.WO2004/016750，它们描述了改变Fc区，以便与对FCγRIIA的结合亲和性相比，提高与FcγRIIB的结合亲和性；也参见Armour等的PCT公开No.WO 99/58572、Idusogie等的WO 99/51642和Deo等的美国专利6,395,272；其公开内容通过引用整体并入本文)。本领域也了解修饰Fc区以降低与FcγRIIB的结合亲和性的方法(例如，Ravetch等的美国专利公开No.20010036459和PCT公开No.WO 01/79299，其公开内容通过引用整体并入本文)。也记载过具有与野生型Fc区相比，与FcγRIIIA和/或FcγRIIA结合亲和性提高的变异Fc区的修饰抗体(如，Stavenhagen等的PCT公开No.WO 2004/063351，其公开内容通过引用整体并入本文)。

可利用本领域已知的体外试验确定本发明组合物和方法所用的抗CD 19抗体是否能够介导ADCC，如本文所述。

【6.12.抗CD 19抗体的制造/生产】

工程改造得到所需的抗CD 19抗体后，则可利用本领域熟知的大规模抗体生产方法以商业规模生产抗CD 19抗体。例如，可利用重组表达***，例如但不限于以下所述的***来实现这种生产。

【6.13.重组表达***】

抗体或其变体的重组表达通常需要构建含有编码抗体的多核苷酸的表达载体。获得了编码抗体分子或者抗体的重链或轻链或其一部分的多核苷酸后，就可利用本领域熟知的技术，通过重组DNA技术产生用于生产该抗体分子的载体。参见例如，美国专利No.6,331,415，通过引用全文并入本文。因此，本文描述了通过表达含有编码抗体的核苷酸序列的多核苷酸制备蛋白质的方法。可利用本领域技术人员熟知的方法构建含有抗体编码序列和合适的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如，体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。因此，本发明提供包含操作性连接于启动子的编码抗体分子、抗体的重链或轻链、抗体的重链或轻链可变结构域或其一部分、或重链或轻链CDR的核苷酸序列的可复制载体。这种载体可包含编码抗体分子恒定区的核苷酸序列(参见例如，国际公开No.WO 86/05807和WO 89/01036；和美国专利No.5,122,464)，可将抗体可变结构域克隆到这种载体中，以表达整个重链、整个轻链或整个重链和轻链。

在另一个实施方案中，可利用靶向同源重组产生抗CD 19抗体，以产生完整或一部分抗CD 19抗体(参见美国专利6,063,630、6,187,305和6,692,737)。在某些实施方案中，可利用随机重组技术制备抗CD 19抗体，以产生完整或一部分抗CD 19抗体(参见美国专利6,361,972、6,524,818、6,541,221和6,623,958)。也可以在由包含修饰的免疫球蛋白基因座的细胞基因组序列表达抗体的细胞中，利用Cre-介导的定点同源重组产生抗CD 19抗体(参见美国专利No.6,091,001)。宿主细胞系可衍生自人或非人物种，包括但不限于：小鼠和中华仓鼠。需要产生人或人源化抗体时，宿主细胞系应该是人细胞系。可有益地利用这些方法工程改造永久表达该抗体分子的稳定细胞系。

通过常规技术将表达载体转移到宿主细胞中后，就可用常规技术培养转染细胞，以产生抗体。因此，本发明包括含有编码本发明抗体或其片段、或其重链或轻链、或其部分、或本发明单链抗体的多核苷酸的宿主细胞，所述多核苷酸操作性连接于异源启动子。在某些实施方案中，为了表达双链抗体，可以在宿主细胞中共表达编码重链和轻链的载体，以表达整个免疫球蛋白分子，如下所详述。

可利用各种宿主-表达载体***表达抗CD 19抗体或其部分，以用于工程改造和产生抗CD 19抗体(参见例如，美国专利No.5,807,715)。例如，哺乳动物细胞如中华仓鼠卵巢细胞(CHO)与载体如来自人巨细胞病毒的主要中间体早期基因启动子元件联用，是抗体的有效表达***(Foecking等，Gene，45：101(1986)；和Cockett等，Bio/Technology8：2(1990))。此外，可选择调节***抗体序列的表达、或以所需的特定方式修饰和加工该抗体基因产物的宿主细胞系。对蛋白质产物的这种修饰(如糖基化)和加工(如切割)可能对蛋白质功能至关重要。不同宿主细胞具有对蛋白质和基因产物进行翻译后加工和修饰的特征性和特定机制。可选择合适的细胞系或宿主***，以保证对所表达的抗体或其部分进行正确修饰和加工。至此，可采用具备能适当地加工初始转录物、对基因产物进行糖基化和磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。这类哺乳动物宿主细胞包括但不限于：CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O和T47D、NS0(不会内源性产生任何功能性免疫球蛋白链的鼠骨髓瘤细胞系)、CRL7O3O和HsS78Bst细胞。

在一个实施方案中，可利用通过永生化人淋巴细胞产生的人细胞系，以重组方式产生单克隆人抗CD 19抗体。在一个实施方案中，可利用人细胞系PER.C6.(Crucell，Netherlands)以重组方式产生单克隆人抗CD 19抗体。

在细菌***中，根据所表达抗体分子的预期应用对许多表达载体进行有利地选择。例如，为了产生含有抗CD 19抗体的药物组合物，准备产生大量这类抗体时，可能需要能够指导易于纯化的融合蛋白产物高水平表达的载体。这类载体包括但不限于：大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等，EMBO，12：1791(1983))，其中抗体编码序列可单独连接到载体内，与lac Z编码区位于同一读框内，以产生融合蛋白；pIN载体(Inouye & Inouye，1985，Nucleic Acids Res.13：3101-3109(1985)；Van Heeke & Schuster，1989，J.Biol.Chem.，24：5503-5509(1989))；等等。也可采用pGEX载体表达外来多肽与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的融合蛋白。通常，这类融合蛋白可溶，并可通过以下方法容易地由裂解细胞纯化：吸附和结合于谷胱甘肽琼脂糖亲和基质，然后在游离谷胱甘肽的存在下洗脱。设计pGEX载体，将凝血酶和/或因子Xa蛋白酶切割位点引入表达的多肽中，以便可由GST部分释放克隆的靶基因产物。

在昆虫***中，苜蓿银纹夜蛾(Autographa califomica)核多面体病病毒(AcNPV)用作表达外来基因的载体。该病毒在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。可将抗体编码序列单独克隆到病毒的非必需区(如多角体蛋白基因)中，并置于AcNPV启动子(如多角体蛋白启动子)的控制下。

在哺乳动物宿主细胞中，可利用许多基于病毒的表达***。在腺病毒用作表达载体的情况下，可将感兴趣的抗体编码序列连接于腺病毒转录/翻译控制复合物，例如晚期启动子和三联前导序列。然后，可通过体外或体内重组将该嵌合基因***腺病毒基因组中。***病毒基因组的非必需区(如E1或E3区)会产生活的并且能够在感染宿主中表达抗体分子的重组病毒(参见例如Logan和Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：355-359(1984))。为使***的抗体编码序列能够有效翻译，可能还需要特定的起始信号。这些信号包括ATG启动密码子和相邻序列。另外，该启动密码子通常应该与所需编码序列在同一阅读框内，以保证完整***物的翻译。这些外源性翻译控制信号和启动密码子可以是各种天然和合成来源。可通过包含合适的转录增强子元件、转录终止子等提高表达效率(参见例如Bittner等，Methods in Enzymol.，153：51-544(1987))。

可利用稳定表达来长期、高产率地产生重组蛋白。例如，可产生稳定表达抗体分子的细胞系。可利用适当工程改造的载体转化宿主细胞，所述载体包含表达控制元件(如启动子、增强子、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)和选择性标记基因。引入外来DNA后，使细胞在富营养培养基中生长1-2天，然后换到选择性培养基中。重组质粒中的选择性标记对选择产生抗性，使得将该质粒稳定整合到其染色体中的细胞生长形成细胞灶，进而可克隆并扩增成细胞系。可利用编码抗CD19抗体的质粒将基因/cDNA引入适合培养生产的任何细胞系。

可采用许多选择***，包括但不限于可分别用于tk^-、hgprt^-或aprT^-细胞的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等，Cell，11：223(1977))、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska和Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，48：202(1992))和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等，Cell，22：8-17(1980))基因。另外，抗代谢物抗性可用作选择以下基因的基础：dhfr，产生甲氨蝶呤抗性(Wigler等，Natl.Acad.Sci.USA，77：357(1980)；O′Hare等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78：1527(1981))；gpt，产生霉酚酸抗性(Mulligan和Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78：2072(1981))；neo，产生氨基糖苷G-418抗性(Wu和Wu，Biotherapy3：87-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol. 32：573-596(1993)；Mulligan，Science260：926-932(1993)；和Morgan和Anderson，Ann.Rev.Biochem.62：191-217(1993)；May，TIB TECH11(5)：155-215(1993))；和hygro，产生潮霉素抗性(Santerre等，Gene，30：147(1984))。通常应用重组DNA技术领域公知的方法以选择所需的重组克隆，这些方法参见例如：Ausubel等(编)，Current Protocols inMolecular Biology(新编分子生物学实验指南)，John Wiley & Sons，NY(1993)；Kriegler，Gene Transfer and Expression，A LaboratoryManual(基因转移和表达实验手册)，Stockton Press，NY(1990)；和Dracopoli等(编)，Current Protocols in Human Genetics(新编人基因组实验指南)的第12和13章，John Wiley & Sons，NY(1994)；Colberre-Garapin等，1981，J.Mol.Biol.，150：1，通过引用将其全文并入本文。

可通过载体扩增提高抗体分子的表达水平(综述参见Bebbington和Hentschel，The use of vectors based on gene amplification for theexpression of cloned gen es in mammalian cells in DNA cloning(在DNA克隆中基于基因扩增使用载体表达哺乳动物细胞中克隆的基因)，第3卷.Academic Press，New York(1987))。当表达抗体的载体***中的标记可扩增时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平提高会增加标记基因的拷贝数。由于扩增区域与抗体基因相连，所以也会提高抗体的产量(Crouse等，Mol.Cell.Biol.，3：257(1983))。可使用重组蛋白生产领域技术人员已知的重组方法和工具来提高抗体表达水平，这些方法和工具包括重塑周围染色质和提高活性人工转录域形式的转基因表达的技术。

可利用两个表达载体共转染宿主细胞，第一个载体编码重链衍生的多肽，第二个载体编码轻链衍生的多肽。这两个载体可包含相同或不同的选择性标记。也可使用编码且能够表达重链和轻链多肽的单一载体。在这种情况下，轻链应位于重链5’侧，以避免产生过多有毒的游离重链(Proudfoot，Nature 322：562-65(1986)；和Kohler，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：2197(1980))。重链与轻链的编码序列可包括cDNA或基因组DNA。

通过重组表达产生抗体分子后，可通过本领域已知的任何免疫球蛋白分子纯化方法进行纯化，这些方法例如色谱(如离子交换色谱，亲和性色谱，特别是对特定抗原蛋白A或蛋白G的亲和性色谱，以及尺寸柱色谱)、离心、差异溶解度或任何其它蛋白质纯化标准技术。另外，本发明抗体或其片段可与本文所述或本领域已知的异源多肽序列融合，以利于纯化。

【6.14.抗体纯化和分离】

使用重组技术时，可以在胞内、周质间隙产生抗体，或者抗体可直接分泌到培养基中。如果在胞内产生抗体，那么第一个步骤是通过(例如)离心或超滤去除颗粒碎片，不论是宿主细胞或是裂解片段。Carter等，Bio/Technology，10：163-167(1992)记载了分离分泌到大肠杆菌周质间隙中的抗体的方法。简要说，将细胞糊在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯基甲磺酰氟(PMSF)存在下解冻约30分钟。离心去除细胞碎片。如果抗体突变体分泌到培养基中，那么通常先采用市售蛋白质浓缩滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤装置浓缩这类表达***的上清液。任何上述步骤中可包含蛋白酶抑制剂如PMSF以抑制蛋白酶解，还可包含抗生素以阻止外来污染物的生长。

可单独利用或与其它纯化步骤联用羟基磷灰石色谱、疏水相互作用色谱、离子交换色谱、凝胶电泳、透析和/或亲和色谱，纯化由细胞制备的抗体组分。蛋白A作为亲和配体的适当性取决于抗体突变体中存在的免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。可利用蛋白A纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等，J.Immunol.Methods，62：1-13(1983))。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等，EMBO J.，5：15671575(1986))。最常见的连接亲和配体的基质是琼脂糖，但也可采用其它基质。与琼脂糖相比，机械稳定的基质如孔径受控的玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯可实现较快的流动速率和较短的加工时间。当抗体包含CH₃结构域时，可使用Bakerbond ABX树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)进行纯化。根据待回收抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术，例如在离子交换柱上分离、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅色谱、肝素色谱、在阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上进行SEPHAROSE色谱、色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。

在任何初步纯化步骤后，对包含感兴趣抗体和污染物的混合物进行低pH疏水相互作用色谱，该色谱使用pH为约2.5-4.5的洗脱缓冲液，在低盐浓度下进行(如约0-0.25M盐)。

【6.15.制备抗体制剂的方法】

本发明提供了特异性结合目的抗原(如，CD 19抗原)的抗体或衍生物、类似物或其片段的液体制剂的制备方法。用于制备本发明液体制剂的方法可包括：从条件培养基(单个批次或汇集培养基的多个批次)纯化抗体(包括其抗体片段)，浓缩纯化抗体(包括其抗体片段)的一部分至终浓度为约约10mg/ml、约15mg/ml、约20mg/ml、约30mg/ml、约40mg/ml、约50mg/ml、约60mg/ml、约70mg/ml、约80mg/ml、约90mg/ml、约100mg/ml、约150mg/ml、约175mg/ml、约200mg/ml、约250mg/ml或约300mg/ml。可对含抗体(包括其抗体片段)，例如，特异性结合CD 19的抗体的条件培养基进行CUNO过滤，将过滤的抗体进行HS50阳离子交换色谱。然后将来自HS50阳离子交换色谱的级分进行低pH处理，随后进行MEP Hypercel色谱。将来自MEPHypercel色谱的级分进行纳米过滤。然后将纳米过滤后获得的纯化抗体或其片段进行渗滤和超滤以交换缓冲液，利用相同的膜浓缩到配制缓冲液中。

通过制备包含一次使用的液体制剂等份的小瓶，本发明的液体制剂可制备为单位剂型。例如，每小瓶的单位剂量可包含1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、15ml或20ml的从约5mg/ml至约300mg/ml变化的不同浓度的特异性结合CD 19的抗体(包括其抗体片段)。如需要，可通过向每个小瓶加入无菌稀释剂来调整这些制品到期望浓度。在特定的实施方案中，本发明的液体制剂以无菌液体形式被配制到单剂量小瓶中，该无菌液体包含：10mM组氨酸缓冲液(pH 6.0)、75mM NaCl和4％海藻糖。在另一个实施方案中，本发明的液体制剂以无菌液体形式被配制到单剂量小瓶中，该无菌液体包含：10mM组氨酸缓冲液(pH 6.0)、75mM NaCl、4％海藻糖和0.02％聚山梨醇酯80。在另一个实施方案中，本发明的液体制剂以无菌液体形式被配制到单剂量小瓶中，该无菌液体包含：20mM组氨酸酸缓冲液(pH 6.0)、75mM NaCl、4％海藻糖和0.02％聚山梨醇酯80。每1.0mL溶液包含100mg抗体(包括其抗体片段)。在一个实施方案中，本发明的抗体(包括其抗体片段)以100mg/ml在3cc USP I型硼硅酸盐琥珀色小瓶(West Pharmaceutical Services-Part No.6800-0675)中供应。目标填充体积是1.2mL。在另一个实施方案中，本发明的抗体(包括其抗体片段)以在10mM组氨酸缓冲液(pH 6.0)、75mM NaCl、4％海藻糖中的100mg/ml在3cc小瓶中供应。在另一个实施方案中，本发明的抗体(包括其抗体片段)以在10mM组氨酸缓冲液(pH 6.0)、75mM NaCl、4％海藻糖和0.02％聚山梨醇酯80中的100mg/ml在3cc小瓶中供应。在另一个实施方案中，本发明的液体制剂以无菌液体形式被配制到单剂量小瓶中，该无菌液体包含：10mM组氨酸酸缓冲液(pH 6.0)、75mM NaCl、4％海藻糖和0.02％聚山梨醇酯80，其中制剂每1.0mL溶液包含25、50或100mg抗体(包括其抗体片段)。

通过制备包含一次使用的液体制剂等份的预填充注射器，本发明的液体制剂可制备为单位剂型。例如，每个预填充注射器的单位剂量可包含0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml、0.9ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、15ml或20ml的从约10mg/ml至约300mg/ml变化的不同浓度的特异性结合CD 19的抗体(包括其抗体片段)。在特定的实施方案中，本发明的液体制剂以无菌液体形式被配制到单剂量预填充注射器中，该无菌液体包含：10mM组氨酸缓冲液(pH 6.0)、75mM NaCl和4％海藻糖。在另一个实施方案中，本发明的液体制剂以无菌液体形式被配制到单剂量预填充注射器中，该无菌液体包含：10mM组氨酸缓冲液(pH 6.0)、75mM NaCl、4％海藻糖和0.02％聚山梨醇酯80。每1.0 mL溶液包含100mg抗体(包括其抗体片段)。在另一个实施方案中，本发明的液体制剂以无菌液体形式被配制到单剂量预填充注射器中，该无菌液体包含：10mM组氨酸酸缓冲液(pH 6.0)、75mM NaCl、4％海藻糖和0.02％聚山梨醇酯80，其中每1.0mL溶液包含25、50或100mg抗体(包括其抗体片段)。在另一个实施方案中，本发明的液体制剂以无菌液体形式被配制到单剂量预填充注射器中，该无菌液体包含：20mM组氨酸酸缓冲液(pH 6.0)、75mM NaCl、4％海藻糖和0.02％聚山梨醇酯80。每1.0mL溶液包含10mg抗体(包括其抗体片段)。在另一个实施方案中，本发明的液体制剂以无菌液体形式被配制到单剂量预填充注射器中，该无菌液体包含：20mM组氨酸酸缓冲液(pH6.0)、75mM NaCl、4％海藻糖和0.02％聚山梨醇酯80，其中每1.0mL溶液包含25、50或100mg抗体(包括其抗体片段)。在又一个实施方案中，液体制剂以任何适合的浓度水平(包括约5mg/ml至约300mg/m1)被配制到预填充注射器或用于皮下注射的自动注射器中。在另一个实施方案中，液体抗体制剂以多达100mg/mL的浓度在预填充注射器或用于皮下注射的自动注射器中。在另一个实施方案中，液体抗体制剂在预填充无钨注射器中，例如“ultra-100”。在另一个实施方案中，注射器为Clearject^TM(Geresheimer，AG，Germany)或InJentle^TM(SCHOTT Pharmaceutical Packaging，Germany)注射器。

本发明的液体制剂可以多种灭菌方法灭菌，包括无菌过滤、放射等等。在特定的实施方案中，渗滤的抗体制剂以预灭菌的0.2微米滤器过滤灭菌。在某些实施方案中，加入表面活性剂时，在加入表面活性剂之前和/或在加入表面活性剂之后可将抗体制剂过滤灭菌。在一些实施方案中，在加入表面活性剂之前将抗体制剂过滤灭菌。而且，制剂可被过滤灭菌一次或多次。在一些实施方案中，将聚山梨醇酯80加至抗体制剂中，然后过滤灭菌。在另一个实施方案中，将抗体制剂过滤灭菌，然后加入聚山梨醇酯80以用于制剂。在另一个实施方案中，首先将抗体制剂过滤灭菌，然后将聚山梨醇酯80加至制剂中，然后制剂经受第二次过滤灭菌。可将本发明的灭菌液体制剂施用于受治疗者以预防、治疗和/或控制B细胞介导的疾病或病症或其一种或多种症状。

尽管本发明涉及液体非冻干制剂，但是应注意出于等价形式的目的，如果需要的话，本发明的制剂可以是冻干的。因此，本发明涵盖本发明制剂的冻干形式。

【6.15.1.免疫偶联物和融合蛋白】

按照本发明的某些方面，可将治疗剂或毒素偶联于嵌合的人或人源化抗CD 19抗体，以用于本发明的组合物和方法。在某些实施方案中，这些偶联物可以融合蛋白的形式产生。治疗剂和毒素的例子包括但不限于：烯二炔类分子，如卡奇霉素和埃斯培拉霉素(esperamicin)。化学毒素也可选自：多卡霉素(duocarmycin)(参见例如，美国专利号5,703,080和美国专利号4,923,990)、甲氨蝶呤、多柔比星、美法仑、苯丁酸氮芥、ARA-C、长春地辛、丝裂霉素C、顺铂、依托泊苷、博来霉素或5-氟尿嘧啶。化疗药的例子也包括：阿霉素、多柔比星、5-氟尿嘧啶、胞嘧啶阿糖胞苷(Ara-C)、环磷酰胺、硫替派、泰索帝(多西他赛)、白消安、赛多辛(Cytoxin)、紫杉醇、甲氨蝶呤、顺铂、美法仑、长春碱、博来霉素、依托泊苷、异环磷酰胺、丝裂霉素C、米托蒽醌、长春新碱、长春瑞滨、卡铂、替尼泊苷、道诺霉素、洋红霉素、氨蝶呤、放线菌素D、丝裂霉素、埃斯培拉霉素(参见美国专利号4,675,187)、美法仑及其它相关氮芥。

在某些实施方案中，将抗CD 19抗体偶联于细胞抑制剂、细胞毒剂或免疫抑制剂，其中细胞毒剂选自：烯二炔、偏端霉素(lexitropsin)、多卡霉素(duocarmycin)、紫杉烷、嘌呤霉素、多拉司他汀、类美坦西醇或长春花生物碱。在某些更具体的实施方案中，细胞毒剂是紫杉醇、多西他赛、CC-1065、SN-38、拓扑替康、吗琳代-多柔比星、根霉素、氰基吗琳代-多柔比星、多拉司他汀-10、棘霉素、考布他汀、卡奇霉素、美登素、DM-1、耳他汀(auristatin)E、AEB、AEVB、AEFP、MMAE(参见美国专利申请No.10/983,340)或纺锤菌素。

在某些实施方案中，本发明的抗CD 19抗体-细胞毒剂偶联物中的细胞毒剂是抗微管蛋白剂。在特定实施方案中，细胞毒剂选自长春花生物碱、鬼臼毒素、紫杉烷、浆果赤霉素衍生物、隐花素(cryptophysin)、类美坦西醇、考布他汀或多拉司他汀。在其它实施方案中，细胞毒剂是长春新碱、长春碱、长春地辛、长春瑞滨、VP-16、喜树碱、紫杉醇、多西他赛、埃博霉素(epithilone)A、埃博霉素B、诺考达唑、秋水仙素、可西米(colcimid)、雌莫司汀、西马多丁、淅皮海绵内酯(discodermolide)、美登素、DM-1、AEFP、耳他汀E、AEB、AEVB、AEFP、MMAE或艾榴塞洛素(eleutherobin)。

在特定的实施方案中，抗CD 19抗体通过接头偶联于细胞毒剂，其中所述接头是肽接头。在其它实施方案中，抗CD 19抗体通过接头偶联于细胞毒剂，其中所述接头是val-cit接头、phe-lys接头、腙接头或二硫键接头。

在某些实施方案中，抗CD 19抗体-细胞毒剂偶联物的抗CD 19抗体通过接头偶联于细胞毒剂，其中所述接头在pH小于5.5时可水解。在一个特定实施方案中，所述接头在pH小于5.0时可水解。

在某些实施方案中，抗CD 19抗体-细胞毒剂偶联物的抗CD 19抗体通过接头偶联于细胞毒剂，其中所述接头可被蛋白酶切割。在一个具体实施方案中，所述蛋白酶是溶酶体蛋白酶。在其它实施方案中，所述蛋白酶尤其是膜结合蛋白酶、胞内蛋白酶或内涵体蛋白酶。

可用于本发明免疫偶联物的其它毒素包括：有毒的凝集素、植物毒素如蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、蒴莲根毒素、肉毒杆菌毒素和白喉毒素。当然，可将各种毒素的组合偶联于一个抗体分子，从而获得可变的细胞毒性。适合用于本发明联合治疗的毒素的例子是蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗-病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素。参见例如，Pastan等，Cell，47：641(1986)，和Goldenberg等，Cancer Journal for Clinicians，44：43(1994)。可以使用的酶活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲菌素、油桐(Aleuritesfordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPI和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(Sapaonariaofficinalis)抑制剂、白树毒素、米托洁林(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯族毒素(tricothecenes)。参见例如，1993年10月28日公开的WO 93/212320。

合适的毒素和化疗药参见Remington′s PharmaceuticalSciences(雷明顿药物科学)，第19版(Mack Publishing Co.1995)，以及Goodman和Gilman的The Pharmacological Basis ofTherapeutics(治疗的药理学基础)，第7版(MacMillan Publishing Co.1985)。本领域技术人员了解其它合适的毒素和/或化疗药。

本发明还包括含有或偶联适用于诊断目的的放射性物质的抗体(包括抗体片段或其变体)。合适的放射性物质的例子包括但不限于：碘(¹²¹I、¹²³I、¹²⁵I、¹³¹I)、碳(¹⁴C)、硫(³⁵S)、氚(³H)、铟(¹¹¹In、¹¹²In、 ^113mIn、^115mIn)、锝(⁹⁹Tc、^99mTc)、铊(²⁰¹Ti)、镓(⁶⁸Ga、⁶⁷Ga)、钯(¹⁰³pd)、钼(⁹⁹Mo)、氙(¹³⁵Xe)、氟(¹⁸F)、¹⁵³Sm、¹⁷⁷Lu、¹⁵⁹Gd、¹⁴⁹pm、¹⁴⁰La、 ¹⁷⁵Yb、¹⁶⁶Ho、⁹⁰Y、⁴⁷Sc、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁴²pr、¹⁰⁵Rh和⁹⁷Ru。

另外，用于为了治疗目的，本发明抗CD 19抗体(包括scFv或者包含或可选地由抗体片段或其变体组成的其它分子)可偶联或连接放射性金属离子。合适的放射性离子的例子包括但不限于：α发射体如 ²¹³Bi，或其他放射性同位素如¹⁰³pd、¹³⁵Xe、¹³¹I、⁶⁸Ge、⁵⁷Co、⁶⁵Zn、 ⁸⁵Sr、³²P、³⁵S、⁹⁰Y、¹⁵³Sm、¹⁵³Gd、¹⁶⁹Yb、⁵¹Cr、⁵⁴Mn、⁷⁵Se、¹¹³Sn、 ⁹⁰Y、¹¹⁷Tin、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re和¹⁶⁶Ho。在特定实施方案中，抗体或其片段连接于能螯合放射性金属离子与多肽的大环螯合剂，这些金属离子包括但不限于：¹⁷⁷Lu、⁹⁰Y、¹⁶⁶Ho和¹⁵³Sm。在特定实施方案中，所述大环鳌合剂是1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N″，N″′-四乙酸(DOTA)。在其它特定实施方案中，DOTA通过接头分子连接于本发明抗体或其片段。本领域通常了解用于将DOTA与多肽偶联的接头分子的例子--参见例如，DeNardo等，Clin Cancer Res 4(10)：2483-90， 1998；Peterson等，Bioconjug Chem 10(4)：553-7，1999；和Zimmerman等，Nucl Med Biol 26(8)：943-50，1999，其通过引用整体并入本文。

将抗体偶联于前药激活酶，所述前药激活酶能将前药(如肽基化疗药，参见WO81/01145)转变为活性抗癌药，从而使本发明抗CD 19抗体也可用于ADEPT。参见例如，WO 88/07378和美国专利号4,975,278。用于ADEPT的免疫偶联物的酶组分包括能够作用于前药，并使其转变为更具活性的细胞毒性形式的任何酶。

可用于本发明方法的酶包括但不限于：用于将含磷酸前药转变为游离药物的碱性磷酸酶；用于将含硫酸前药转变为游离药物的芳基硫酸酯酶；用于将无毒性5-氟胞嘧啶转变为抗癌药5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；用于将含肽前药转变为游离药物的蛋白酶，如沙雷菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧基肽酶和组织蛋白酶(如组织蛋白酶B和L)；用于转变含有D-氨基酸取代基的前药的D-丙氨酰羧基肽酶；用于将糖基化的前药转变为游离药物的糖切割酶如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；用于将α-内酰胺衍生药物转变为游离药物的β-内酰胺酶；和分别用于将在胺氮上用苯氧基乙酰基或苯基乙酰基衍生的药物转变为游离药物的青霉素酰胺酶，如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。在本领域中称为“抗体酶”的具有酶活性的抗体也可用于将前药转变为游离的活性药物(参见例如，Massey，Nature 328：457-458(1987))。可以如本文所述制备抗体-抗体酶偶联物，以便按需将该抗体酶递送至患有表达B细胞恶性肿瘤的人体部位。

本发明抗体可通过本领域熟知技术共价结合于酶，这些技术包括例如，使用上述异源双功能交联试剂。也可利用本领域熟知的重组DNA技术构建至少包含至少连接于酶的功能活性部分的抗CD 19抗体的抗原结合区的融合蛋白(参见例如，Neuberger等，Nature，312：604-608(1984))。

抗CD 19抗体的共价修饰也包括在本发明范围内。可通过化学合成或者对抗体进行酶学或化学切割(如果可能)实现共价修饰。抗CD 19抗体的其它类型的共价修饰可通过使抗体的靶向氨基酸残基与有机衍生剂反应而引入分子内，所述有机衍生剂能够与所选侧链或者N-或C-末端残基反应。

最常见的是，半胱氨酰残基与α-卤代乙酸酯(和相应的胺)，如氯代乙酸或氯代乙酰胺反应，得到羧甲基或羧基酰氨基甲基衍生物。相似地，也可采用碘化试剂。也可通过与以下物质的反应使半胱氨酰残基衍生化：溴代三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基(imidozoyl))丙酸、氯乙酰基磷酸酯、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对氯汞苯甲酸酯、2-氯汞-4-硝基苯酚或氯代-7-硝基苯并-2-噁-1，3-二唑。

在pH 5.5-7.0下与二乙基焦碳酸酯反应以便使组氨酰残基衍生化，因为这种物质对组氨酰侧链的特异性相对较高。也可使用对-溴苯甲酰甲基溴；可以在0.1M甲胂酸钠中，pH 6.0条件下进行该反应。

赖氨酰和氨基末端残基与琥珀酸酐或其它羧酸酐反应。用这些试剂衍生化具有逆转赖氨酰残基电荷的作用。适用于衍生化含α-氨基的残基和/或含ε-氨基的残基的其它试剂包括亚氨酸酯，如甲基吡啶亚氨酸甲酯(methylpicolinimidate)、磷酸吡哆醛、吡哆醛、氯代氢化硼(chloroborohydride)、三硝基苯磺酸、邻甲基异脲、2，4-戊二酮和转氨酶-催化的与乙醛酸的反应。

通过与一种或多种常规试剂反应来修饰精氨酰残基，这些试剂包括苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮和茚三酮。精氨酰残基的衍生化通常需要在碱性条件下进行反应，因为胍官能团的pKa高。而且，这些试剂可能与赖氨酸的ε-氨基以及精氨酸的ε-氨基发生反应。

可以对酪氨酰残基进行特定修饰，特别感兴趣的是通过与芳族重氮化合物或四硝基甲烷的反应将光谱标记引入酪氨酰残基。最常见的是，利用N-乙酰基咪唑(N-acetylimidizole)和四硝基甲烷分别形成O-乙酰基酪氨酰物质和3-硝基衍生物。利用¹²⁵I或¹³¹I碘化酪氨酰残基，以制备用于放射性免疫实验的标记蛋白。

通过与碳二亚胺(R--N＝C＝N--R’)反应选择性修饰羧基侧基(天冬氨酰或谷氨酰)，碳二亚胺中的R和R’是不同的烷基，如1-环己基 -3-(2-吗琳基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺。而且，通过与铵离子反应将天冬氨酰残基和谷氨酰残基转变为天冬酰胺酰残基和谷氨酰胺酰残基。

谷氨酰胺酰残基和天冬酰胺酰残基常常脱酰胺，分别形成相应的谷氨酰残基和天冬氨酰残基。这些残基在中性或碱性条件下脱酰胺。这些残基的脱酰胺形式落入本发明的范围。

其它修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，Proteins：Structure and Molecular Properties(蛋白质：结构和分子特性)，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，第79-86页(1983))，N末端胺的乙酰化和C-末端羧基的酰胺化。

另一种类型的共价修饰包括通过化学或酶学方式将糖苷偶联于抗体。这些方法的优点在于：它们不需要在具有将N-或O-连接糖基化的糖基化能力的宿主细胞中产生抗体。根据所用偶联方式，可将糖连接于(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基，(c)游离巯基，如半胱氨酸的游离巯基，(d)游离羟基，如丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸的游离羟基，(e)芳族残基，如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳族残基，或者(f)谷胺酰胺的酰胺基团。这些方法可参见1987年9月11日公开的WO87/05330以及Aplin和Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.，第259-306页(1981)。

【6.16.联合化疗】

在其它实施方案中，抗CD 19mAb可与一种或多种其它化疗药联合施用。例如，“CVB”(1.5g/m²环磷酰胺，200-400mg/m²依托泊苷和150-200mg/m²卡莫司汀)可与本发明治疗联合使用。CVB是用于治疗非霍奇金淋巴瘤的方案(Patti等，Eur.J.Haematol，51：18(1993)。本领域技术人员了解其它合适的联合化疗方案。参见例如Freedman等，“Non-Hodgkin′s Lymphomas(非霍奇金淋巴瘤)”，刊于《癌症医药》(Cancer Medicine)，第2卷，第3版，Holland等(编)，第2028-2068页(Lea和Febiger，1993)。例如，用于治疗中期非霍奇金淋巴瘤的第一代化疗方案包括C-MOPP(环磷酰胺、长春新碱、丙卡巴肼和氯***)和CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和氯***)。有用的第二代化疗方案是m-BACOD(甲氨喋呤、博来霉素、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、***和甲酰四氢叶酸)，而合适的第三代方案是MACOP-B(甲氨喋呤、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、氯***、博来霉素和甲酰四氢叶酸)。其它有用的药物包括丁酸苯酯和草苔虫内酯(brostatin)-1。

按照本发明，可通过联合施用抗CD 19抗体制剂与一种或多种治疗来预防、治疗、控制或改善癌症或其一种或多种症状，所述一种或多种治疗包括但不限于：化疗、放疗、激素治疗和/或生物治疗/免疫治疗。

在特定的实施方案中，本发明方法包括施用一种或多种血管新生拮抗剂，例如但不限于：血管他丁(纤溶酶原片段)；抗血管新生性抗凝血酶III；新生血管酶(Angiozyme)；ABT-627；Bay 12-9566；贝尼芬(Benefin)；贝伐单抗；BMS-275291；软骨衍生的抑制剂(CDI)；CAI；CD59补体片段；CEP-7055；Col 3；考布他汀A-4；内皮他汀(胶原XVIII片段)；纤连蛋白片段；Gro-β；卤夫酮；肝素酶；肝素己糖片段；HMV833；人绒毛膜促性腺素(hCG)；IM-862；干扰素α/β/γ；干扰素诱导蛋白(IP-10)；白介素-12；Kringle 5(纤溶酶原片段)；马立马司他；金属蛋白酶抑制剂(TIMP)；2-甲氧基***；MMI 270(CGS27023A)；MoAb IMC-1C11；新伐司他(Neovastat)；NM-3；盘泽(Panzem)；PI-88；胎盘核糖核酸酶抑制剂；纤溶酶原激活物抑制剂；血小板因子-4(PF4)；普琳司他；促乳素16kD片段；多育曲菌素-相关蛋白(PRP)；PTK 787/ZK 222594；类视黄醇；索利司他；角鲨胺；SS 3304；SU 5416；SU6668；SU11248；四氢皮质醇-S；四硫钼酸盐；沙利度胺；血小板反应蛋白-1(TSP-1)；TNP-470；转化生长因子-β(TGF-b)；血管抑制素(Vasculostatin)；血管抑制因子(Vasostatin)(钙网织蛋白片段)；ZD6126；ZD 6474；法尼基转移酶抑制剂(FTI)；和二膦酸盐(bisphosphonate)(例如但不限于：阿伦膦酸盐、氯屈膦酸盐、依替膦酸盐、伊班膦酸盐、帕米膦酸、利塞膦酸盐、替鲁膦酸盐和唑来膦酸盐)。

在特定的实施方案中，本发明方法包括施用一种或多种免疫调节剂，例如但不限于：化疗剂和非化疗性免疫调节剂。化疗剂的非限制性例子包括甲氨蝶呤、环孢菌素A、来氟米特、顺铂、异环磷酰胺、紫杉烷如泰素和紫杉醇、拓扑异构酶I抑制剂(如CPT-11、拓扑替康、9-AC和GG-211)、吉西他滨、长春瑞滨、奥沙利铂、5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲酰四氢叶酸、长春瑞滨、替莫唑胺(temodal)、松胞菌素B、短杆菌肽D、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、多柔比星、道诺霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素类、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、***和嘌呤霉素同系物以及环磷酰胺。非化疗性免疫调节剂的例子包括但不限于：抗-T细胞受体抗体(例如，抗CD4抗体(如cM-T412(Boeringer)、IDEC-

(IDEC和SKB)、mAB4162W94、奥索克隆(Orthoclone)和OKTcdr4a(Janssen-Cilag))、抗CD3抗体(如努为昂(Nuvion)(Product Design Labs)、OKT3(Johnson &Johnson)或RITUXAN(IDEC)，抗CD5抗体(如抗CD5蓖麻毒蛋白-连接的免疫偶联物)，抗CD7抗体(如CHH-380(Novartis))，抗CD8抗体，抗CD40配体单克隆抗体(如IDEC-131(IDEC))，抗CD52抗体(如坎帕斯1H(Ilex))，抗CD2抗体(如MEDI-507(MedImmune，国际公开号WO 02/098370和WO 02/069904)，抗CD11a抗体(如仙耐林(Xanelim)(Genentech))和抗-B7抗体(如IDEC-114)(IDEC))；抗-细胞因子受体抗体(如抗-IFN受体抗体、抗-IL-2受体抗体(如Zenapax(Protein Design Labs))，抗-IL-4受体抗体，抗-IL-6受体抗体，抗-IL-10受体抗体和抗-IL-12受体抗体)，抗-细胞因子抗体(如抗-IFN抗体、抗-TNF-α抗体、抗-IL-1β抗体、抗-IL-6抗体、抗-IL-8抗体(如ABX-IL-8(Abgenix))、抗-IL-12抗体和抗-IL-23抗体))；CTLA4-免疫球蛋白；LFA-3TIP(Biogen，国际公开号WO 93/08656和美国专利号6,162,432)；可溶性细胞因子受体(如TNF-α受体的胞外结构域或其片段、IL-1β受体的胞外结构域或其片段和IL-6受体的胞外结构域或其片段)；细胞因子或其片段(如白介素(IL)-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-23、TNF-α、TNF-β、干扰素(IFN)-α、IFN-β、IFN-γ和GM-CSF)；抗-细胞因子抗体(如抗-IL-2抗体、抗-IL-4抗体、抗-IL-6抗体、抗-IL-10抗体、抗-IL-12抗体、抗-IL-15抗体、抗-TNF-α抗体和抗-TNF-β抗体)和免疫特异性结合肿瘤相关抗原的抗体(如赫赛

)。在某些实施方案中，免疫调节剂是除化疗药以外的免疫调节剂。在其它实施方案中，免疫调节剂是除细胞因子或造血因子，如IL-1、IL-2、IL-4、IL-12、IL-15、TNF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、M-CSF、G-CSF、IL-3或红细胞生成素以外的免疫调节剂。在其它实施方案中，免疫调节剂是除化疗药和细胞因子或造血因子以外的物质。

在特定的实施方案中，本发明方法包括施用一种或多种抗炎药，例如但不限于：非甾体抗炎药(NSAID)、甾体抗炎药、β-激动剂、抗胆碱能药和甲基黄嘌呤。NSAID的例子包括但不限于：阿司匹林、布洛芬、塞来考昔(CELEBREX^TM)、双氯芬酸(VOLTAREN^TM)、依托度酸(LODINE^TM)、非诺洛芬(NALFON^TM)、吲哚美辛(INDOCIN^TM)、酮咯酸(ketoralac)(TORADOL^TM)、奥沙普秦(DAYPRO^TM)、萘丁美酮(RELAFEN^TM)、舒林酸(CLINORIL^TM)、托美丁(tolmentin)(TOLECTIN^TM)、罗非考昔(VIOXX^TM)、萘普生(ALEVE^TM、NAPROSYN^TM)、酮洛芬(ACTRON^TM)和萘丁美酮(RELAFEN^TM)。这类NSAID通过抑制环氧合酶(如COX-1和/或COX-2)起作用。甾体抗炎药的例子包括但不限于：糖皮质激素类、***(DECADRON^TM)、可的松、氢化可的松、氯***(DELTASONE^TM)、***龙、曲安西龙、柳氮磺吡啶和类花生酸，如***素、血栓烷和白三烯。

在另一个特定的实施方案中，本发明方法包括施用一种或多种抗病毒剂(例如，金刚烷胺、利巴韦林、金刚乙胺、阿昔洛韦、泛昔洛韦、膦甲酸、更昔洛韦、三氟尿苷、阿糖腺苷、去羟肌苷、司他夫定、扎西他滨、齐多夫定、干扰素)；抗生素(如放线菌素d(以前称为放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和氨茴霉素(AMC))；止吐剂(如阿普***、***、多潘立酮、屈***酚、氟哌利多、格拉司琼、氟哌啶醇、氟哌啶醇、劳拉西泮(iorazepam)、甲泼尼龙、甲氧氯普胺、***隆、昂丹司琼、丙氯拉嗪)；抗真菌剂(如两性霉素、克霉唑、益康唑、氟康唑、氟代胞嘧啶、灰黄霉素、伊曲康唑、酮康唑、咪康唑和制霉菌素)；抗寄生虫药(如脱氢吐根碱、糠酸二氯尼特、吐根碱、甲氟喹、美拉胂醇、甲硝唑、硝呋替莫、巴龙霉素、喷他必定(pentabidine)、羟乙磺酸喷他脒、伯氨喹、阿的平、奎尼丁)或它们的组合。

可用于本发明各种实施方案，包括药物组合物、剂型和药盒的抗癌剂的具体例子包括但不限于：阿西维辛；阿柔比星；盐酸阿考达唑；阿克罗宁；阿多来新；阿地白介素；六甲蜜胺；安波霉素；乙酸阿美蒽醌；氨鲁米特；安吖啶；阿那曲唑；安曲霉素；门冬酰胺酶；曲林菌素；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴马司他；苯佐替派；比卡鲁胺；盐酸比生群；二甲磺酸双奈法德；比折来新；硫酸博来霉素；布喹那钠；溴匹立明；白消安；放线菌素C；卡普睾酮；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡莫司汀；盐酸卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；苯丁酸氮芥；西罗霉素；顺铂；克拉屈滨；甲磺酸克立那托；环磷酰胺；阿糖胞苷；达卡巴嗪；放线菌素D；盐酸柔红霉素；地西他滨；右奥马铂；地扎胍宁；甲磺酸地扎胍宁；地吖醌；多西他赛；多柔比星；盐酸多柔比星；屈洛昔芬；柠檬酸屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮；达佐霉素；依达曲沙；盐酸依氟鸟氨酸；依沙芦星；恩洛铂；恩普氨酯；依匹哌啶；盐酸表柔比星；厄布洛唑；盐酸依索比星；雌莫司汀；雌莫司汀磷酸钠；依他硝唑；依托泊苷；磷酸依托泊苷；氯苯乙嘧胺；盐酸法倔唑；法扎拉滨；芬维A胺；氮尿苷；磷酸氟达拉滨；氟尿嘧啶；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星钠；吉西他滨；盐酸吉西他滨；羟基脲；盐酸伊达比星；异环磷酰胺；伊莫福新；白介素II(包括重组白介素II或rIL2)，干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α-n1；干扰素α-n3；干扰素β-Ia；干扰素γ-Ib；异丙铂；盐酸伊立替康；乙酸兰瑞肽；来曲唑；乙酸亮丙瑞林；盐酸利阿唑；洛美曲索钠；洛莫司汀；盐酸洛索蒽醌；马索罗酚；美登素；盐酸氮芥；乙酸基孕甾酮；乙酸美仑孕酮；苯丙氨酸氮芥；美诺立尔；巯嘌呤；氨甲喋呤；氨甲喋呤钠；氯苯氨啶；美妥替哌；米丁度胺；米托卡星；丝裂红素；米托洁林；丝裂马菌素；丝裂霉素；米托司培；米托坦；盐酸米托蒽醌；霉酚酸；诺考达唑；诺拉霉素；奥马铂；奥昔舒仑；紫杉醇；培门冬酶；培利霉素；奈莫司汀；硫酸培洛霉素；培磷酰胺；哌泊溴烷；哌泊舒凡；盐酸吡罗蒽醌；普卡霉素；普洛美坦；卟菲尔钠；泊非霉素；泼尼莫司汀；盐酸丙卡巴肼；嘌罗霉素；盐酸嘌罗霉素；吡唑呋喃菌素；利波腺昔；罗谷亚胺；沙芬戈；盐酸沙芬戈；司莫司汀；辛曲秦；磷乙酰天冬氨酸钠；司帕霉素；盐酸锗螺胺；螺莫司汀；螺铂；链黑霉素；链佐星；磺氯苯脲；他利霉素；替可加兰钠；替加氟；盐酸替洛蒽醌；替莫泊芬；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酪；硫咪嘌呤；硫鸟嘌呤；塞替派；噻唑呋林；替拉扎明；柠檬酸托瑞米芬；乙酸曲托龙；磷酸曲西立滨；三甲曲沙；葡糖醛酸三甲曲沙；曲普瑞林；盐酸妥布氯唑；乌拉莫司汀；乌瑞替派；伐普肽；维替泊芬；硫酸长春碱；硫酸长春新碱；长春地辛；硫酸长春地辛；硫酸长春匹定；硫酸长春甘酯；硫酸长春罗新；酒石酸长春瑞滨；硫酸长春罗定；硫酸长春利定；伏氯唑；折尼铂；净司他丁；盐酸佐柔比星。其它抗癌药包括但不限于：20-表-1，25羟基维生素D3；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龙；阿柔比星；酰基富烯；腺环戊醇(adecypenol)；阿多来新；阿地白介素；ALL-TK拮抗剂；六甲蜜胺；氨莫司汀；阿米多克斯(amidox)；氨磷汀；氨基乙酰丙酸；氨柔比星；安吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；穿心莲内酯；血管新生抑制剂；拮抗剂D；拮抗剂G；安雷利克斯；抗-背侧化形成蛋白-1；抗雄激素，***癌；抗***；抗瘤酮(antineoplaston)；反义寡核苷酸；甘氨酸阿非迪霉素；凋亡基因调节剂；凋両调节剂；脱嘌呤核酸；ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱氨酶；阿苏拉科林(asulacrine)；阿他美坦；阿莫司汀；阿西他汀(axinastatin)1；阿西他汀2；阿西他汀3；阿扎司琼；阿扎毒素；重氮酪氨酸；浆果赤霉素III衍生物；巴拉醇(balanol)；巴马司他；BCR/ABL拮抗剂；苯并二氢卟酚(benzochlorin)；苯甲酰星孢素；β内酰胺衍生物；β-阿里辛(β-alethine)；贝塔克拉霉素(betaclamycin)B；桦木酸；bFGF抑制剂；比卡鲁胺；比生群；双氮丙啶精胺；双奈法德；比特迪尼(bistratene)A；比折来新；贝伏特(breflate)；溴匹立明；布度钛；丁基硫堇亚胺；卡泊三醇；卡弗他丁(calphostin)C；喜树碱衍生物；金丝雀痘IL-2；卡培他滨；羧酰胺-氨基-***；羧基酰胺***；CaRest M3；CARN 700；软骨衍生的抑制剂；卡折来新；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)；澳粟精胺；杀菌肽B；西曲瑞克；双氢叶吩(chlorlns)；氯代喹喔啉磺酰胺；西卡前列素；顺-卟啉；克拉屈滨；恩氯米芬类似物；克霉唑；克利霉素(collismycin)A；克利霉素B；考布他汀A4；考布他汀类似物；克纳宁(conagenin)；科莱贝司丁(crambescidin)816；克立那托；自念珠藻环肽(cryptophycin)8；自念珠藻环肽A衍生物；麻疯树毒蛋白(curacin)A；环戊蒽醌(cyclopentanthraquinone)；环普拉坦(cycloplatam)；塞培霉素(cypemycin)；阿糖胞苷十八烷基磷酸钠；细胞裂解因子；磷酸己烷雌酚(cytostatin)；达昔单抗；地西他滨；脱氢代代宁B；地洛瑞林；***；右异环磷酰胺；右雷佐生；右维拉帕米；地吖酮；代代宁B；二羟基苯并氧肟酸(didox)；二乙基正精胺；二氢-5-氮杂胞苷；二氢紫杉醇，9-；二氧霉素(dioxamycin)；二苯基螺莫斯汀；多西他赛；二十二烷醇；多拉司琼；去氧氟尿苷；屈洛昔芬；屈***酚；多卡霉素SA；依布硒；依考莫司汀；依地福新；依决洛单抗；依氟鸟氨酸；榄香烯；乙嘧替氟；表柔比星；依立雄胺；雌莫司汀类似物；***激动剂；***拮抗剂；依他硝唑；磷酸依托泊苷；依西美坦；法倔唑；法扎拉滨；芬维A胺；非格司亭；非那雄胺；黄皮酮(flavopiridol)；氟卓斯汀；夫卢丝龙(fluasterone)；氟达拉滨；盐酸氟代柔红霉素(fluorodaunorunicin)；福酚美克；福美坦；福司曲星；福莫司汀；德卟啉钆(gadolinium texaphyrin)；硝酸镓；加洛他滨；加尼瑞克；明胶酶抑制剂；吉西他滨；谷胱甘肽抑制剂；赫舒反(hepsulfam)；调蛋白；环己基双乙酰胺；金丝桃蒽酮；伊班膦酸；黄胆素；艾多昔芬；伊决孟酮；伊莫福新；伊洛马司他；咪唑并吖啶酮；咪喹莫特；免疫刺激肽；***-1受体抑制剂；干扰素激动剂；干扰素；白介素；碘苄胍；碘阿霉素；甘薯苦醇，4-；伊罗普拉；伊索拉定；异本格唑(isobengazole)；异高软海绵素(isohomohalicondrin)B；伊他司琼；结丝立得(jasplakinolide)；卡哈拉得(kahalalide)F；片螺素(lamellarin)-N三乙酸；兰瑞肽；雷纳霉素(leinamycin)；来格司亭；硫酸蘑菇多糖；莱托斯汀(leptolstatin)；来曲唑；白血病抑制因子；白细胞α干扰素；亮丙瑞林+***+孕酮；亮丙瑞林；左旋咪唑；利阿唑；直链多胺类似物；亲脂性二糖肽；亲脂性铂化合物；利索纳得(lissoclinamide)7；洛铂；胍乙基磷酸丝氨酸；洛美曲索；氯尼达明；洛索蒽醌；HMG-CoA还原酶抑制剂(例如但不限于：洛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、他汀、辛伐他汀和阿托伐他汀)；洛索立宾；勒托替康；德卟啉镥(lutetium texaphyrin)；莱索菲林(lysofylline)；细胞裂解肽；美坦新；慢诺他汀(mannostatin)A；马立马司他；马索罗酚；马斯平(maspin)；基质溶解因子抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；美诺立尔；硫巴妥苯胺；美替瑞林；甲硫氨酸酶；甲氧氯普胺；MIF抑制剂；米非司酮；米替福新；米立司亭；错配的双链RNA；米托胍腙；二溴卫矛醇；丝裂霉素类似物；米托萘胺；米托毒素(mitotoxin)成纤维细胞生长因子-皂草毒蛋白；米托蒽醌；莫法罗汀；莫拉司亭；单克隆抗体，人绒毛膜***；单磷酰基脂质A+分支杆菌细胞壁骨架；莫哌达醇；多药耐药基因抑制剂；基于多肿瘤抑制物1的治疗；芥类抗癌剂；印度洋海绵(mycaperoxide)B；分枝杆菌细胞壁提取物；米亚普龙(myriaporone)；N-乙酰基地那林；N-取代的苯甲酰胺；那法瑞林；那瑞替喷(nagrestip)；纳洛酮+镇痛新；纳帕英(napavin)；萘萜二醇(naphterpin)；那托司亭；奈达铂；奈莫柔比星；奈立膦酸；中性内肽酶；尼鲁米特；尼萨霉素(nisamycin)；氮氧化物调节剂；硝基氧抗氧化剂；尼多林(nitrullyn)；06-苄基鸟嘌呤；奥曲肽；奥可斯酮(okicenone)；寡核苷酸；奥那司酮；昂丹司琼；昂丹司琼；奥莱辛(oracin)；口服细胞因子诱导物；奥马铂；奥沙特隆；奥沙利铂；氧杂奥诺霉素(oxaunomycin)；紫杉醇；紫杉醇类似物；紫杉醇衍生物；帕劳胺(palauamine)；棕榈酰根霉素；帕米磷酸；人参炔三醇；帕诺米芬；副菌铁素(parabactin)；帕折普汀；培门冬酶；培得星；戊聚硫钠；喷司他丁；喷托唑(pentrozole)；全氟溴烷；培磷酰胺；紫苏子醇；苯那霉素(phenazinomycin)；乙酸苯酯(phenylacetate)；磷酸酶抑制剂；皮西巴尼(picibanil)；盐酸匹鲁卡品；吡柔比星；吡曲克辛；胎盘素(placetin)A；胎盘素B；纤溶酶原激活物抑制剂；铂络合物；铂化合物；铂-三胺络合物；卟菲尔钠；泊非霉素；氯***；丙基双吖啶酮；***素J2；蛋白酶体抑制剂；基于蛋白A的免疫调节剂；蛋白激酶C抑制剂；蛋白激酶C抑制剂，微藻(microalgal)；蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂；嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；红紫素；吡唑啉吖啶；吡哆醛化的血红蛋白聚氧乙烯偶联物；raf拮抗剂；雷替曲塞；雷莫司琼；ras法尼基蛋白转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras-GAP抑制剂；去甲基化的瑞替普汀；依替膦酸铼Re 186；根霉素；核酶；RII维甲酰胺(retinamide)；罗谷亚胺；罗希吐碱(rohitukine)；罗莫肽；罗喹美克；卢比格酮(rubiginone)B1；卢伯西(ruboxyl)；沙芬戈；伞托平(saintopin)；SarCNU；萨可菲醇(sarcophytol)A；沙格司亭；Sdi 1模拟物；司莫司汀；衰老衍生的抑制剂1；有义寡核苷酸；信号转导抑制剂；信号转导调节剂；单链抗原结合蛋白；西佐喃；索布佐生；硼卡钠；苯基乙酸钠；索尔醇(solverol)；生长调节素结合蛋白；索纳明；膦门冬酸；斯卡霉素(spicamycin)D；螺莫司汀；脾脏五肽(splenopentin)；海绵他汀(spongistatin)1；角鲨胺；干细胞抑制剂；干细胞***抑制剂；斯提酰胺(stipiamide)；基质分解素抑制剂；斯菲诺辛(sulfinosine)；强效血管活性肠肽拮抗剂；素拉迪塔(suradista)；苏拉明；苦马豆碱；合成粘多糖；他莫司汀；他莫昔芬甲碘化物；牛磺莫司汀；他扎罗汀；替可加兰钠；替加氟；碲吡喃洋(tellurapyrylium)；端粒酶抑制剂；替莫泊芬；替莫唑胺；替尼泊苷；十氧化四氯(tetrachlorodecaoxide)；四佐胺(tetrazomine)；泰立拉汀(thaliblastine)；噻可拉林；血小板生成素；血小板生成素模拟物；胸腺法新；胸腺生成素受体激动剂；胸腺曲南；促甲状腺激素；本紫红素乙酯锡；替拉扎明；二氯环戊二烯钛；拓扑森汀(topsentin)；托瑞米芬；全能干细胞因子；翻译抑制剂；维甲酸；三乙酰基尿苷；曲西立滨；三甲曲沙；曲普瑞林；托烷司琼；妥罗雄脲；酪氨酸激酶抑制剂；酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostin)；UBC抑制剂；乌苯美司；泌尿生殖窦衍生的生长抑制因子；脲激酶受体拮抗剂；伐普肽；瓦立奥林(variolin)B；载体***，红细胞基因治疗；维拉雷琐；藜芦明；瓦尔丁(verdins)；维替泊芬；长春瑞滨；威科萨汀(vinxaltine)；维他辛

伏氯唑；扎诺特隆；折尼铂；亚苄维C；和净司他丁斯酯。其他抗癌药是5-氟尿嘧啶和甲酰四氢叶酸。这两种药物可用于采用沙利度胺和拓扑异构酶抑制剂的方法中。在具体实施方案中，抗癌剂不是化疗剂。

在更具体的实施方案中，本发明也包括联合施用抗CD 19mAb和一种或多种治疗，以治疗乳腺癌、卵巢癌、黑素瘤、***癌、结肠癌和肺癌(如上所述)，这些治疗包括但不限于：如表1所示的抗癌剂。用于联合治疗时可降低表1所列的施用物量和/或施用频率。

表1.抗癌剂

本发明也包括联合施用本发明的抗CD 19抗体制剂和放疗，放疗包括使用X射线、γ射线和其它放射源，以摧毁癌细胞。在具体实施方案中，以外束放疗或远距治疗形式施用放疗，其中射线由远程源发出。在其它实施方案中，以内部治疗或近程治疗的形式施用放疗，其中放射源放置在体内接近癌细胞或肿瘤的地方。

本领域了解癌症治疗和其剂量、施用途径和推荐用法，这类文献包括例如Physician’s Desk Reference(医师案头参考)(第56版，2002)。

【6.17.药物组合物】

本发明还涉及治疗人受治疗者的B细胞疾病和病症(包括例如但不限于B细胞恶性肿瘤)的免疫治疗性组合物和方法，涉及治疗和预防人移植物接受者的GVHD、移植物排斥和移植后淋巴细胞增殖性疾病的免疫治疗性组合物和方法，涉及治疗人受治疗者的自身免疫疾病和病症的免疫治疗性组合物和方法，这些组合物和方法包括利用结合CD19抗原并可介导人ADCC的治疗性抗体。

本发明涉及含有IgG1或IgG3人同种型的人、人源化或嵌合的抗CD 19抗体的药物组合物。本发明也涉及包含可介导人ADCC的IgG2或IgG4人同种型的人或人源化抗CD 19抗体的药物组合物。在某些实施方式中，本发明也涉及包含可由本领域已知方式产生的人、人源化或嵌合的单克隆抗CD 19抗体的药物组合物。

描述了用于治疗诊断患有衍生自B细胞和其前体的B细胞恶性肿瘤的人受治疗者的治疗制剂和方案，所述B细胞恶性肿瘤包括但不限于：急性淋巴细胞性白血病(ALL)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、多发性骨髓瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、幼淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病、普通急性淋巴细胞性白血病和一些非急性淋巴细胞性白血病。

在其它具体实施方式中，抗CD 19抗体可介导ADCC、补体依赖性细胞毒性凋亡。与其它B细胞导向的免疫治疗相比，本发明组合物和方法也具有靶向更广泛B细胞群的优点。例如，本发明抗CD 19抗体可以有效靶向骨髓细胞、循环B细胞和成熟的抗体分泌型B细胞。因此，本发明方法和组合物可有效减少或消耗循环B细胞以及循环免疫球蛋白。

因此，在一个方面，本发明提供了用于治疗和预防GVHD、移植物排斥和移植后淋巴增生性疾病的组合物和方法，与靶向性较低的治疗剂和方案相比，所述组合物和方法的并发症较少和/或严重程度较低。在一个实施方案中，与不使用本发明方法和组合物时相比，使用本发明组合物和方法时传统治疗剂的剂量较低。在另一个实施方案中，本发明的组合物和方法不需要较为严苛的治疗形式，如放疗、高剂量化疗或脾切除术。

在某些实施方案中，可在移植之前或之后，单独给予或与治疗或预防GVHD和移植物排斥的其它治疗剂或方案联合给予移植物接受者抗CD 19抗体和组合物。例如，可以在植入同种移植物之前或之后，利用抗CD 19抗体和组合物消耗移植物接受者的同种抗体。还可利用抗CD 19抗体和组合物在移植前离体消耗移植物中产生抗体的细胞，或在供体中消耗，或预防GVHD和移植物排斥。

【6.18.药物制剂、施用和剂量】

本发明的药物制剂含有人、人源化或嵌合的抗CD 19抗体作为活性成分。该制剂含有裸抗体、免疫偶联物或融合蛋白，其量能以适于向人患者施用的重量或体积单位有效地产生所需反应，该制剂优选是无菌的。所述反应可例如通过测定抗CD 19抗体组合物的生理作用进行确定，例如但不限于：循环B细胞消耗、组织B细胞消耗、B细胞恶性肿瘤消退或疾病症状减轻。其它测定是本领域普通技术人员已知的，也可用于测量该反应的水平。

【6.18.1.药物制剂】

可利用药学上可接受的载体配制抗CD 19抗体组合物。术语“药学上可接受的”指不干扰活性成分生物学活性的有效性的一种或多种无毒物质。这类制剂通常可含有盐、缓冲剂、防腐剂、相容性载体和任选的其它治疗剂。这类药学上可接受的制剂通常也可包含适合于施用于的相容性固体或液体填料、稀释剂或包囊材料。用于医药时，盐应该是药学上可接受的盐，但可方便地使用非药学上可接受的盐来制备药学上可接受的盐，不能将它们排除在本发明范围以外。这类药理学和药学上可接受的盐包括但不限于由以下酸制备的盐：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、柠檬酸、硼酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。药学上可接受的盐也可制备成碱金属盐或碱土金属盐，如钠盐、钾盐或钙盐。术语“载体”指有机或无机的天然或合成成分，将载体与活性成分混合以便于应用。药物组合物的各组分也能够与本发明抗体混合或互相混合，使其相互作用基本上不会削弱所需的药学功效。

按照本发明的某些方面，可将具有所需纯度的抗体或免疫偶联物与任选的生理学可接受载体、赋形剂或稳定剂(《雷明顿药物科学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第16版，Osol，A.编(1999))混合，以制备用于储存的冻干制剂或水溶液形式的抗CD 19抗体组合物。在所用剂量和浓度下，可接受的载体、赋形剂或稳定剂对接受者无毒，包括：缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸缓冲剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸烷酯，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷胺酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它糖，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；鳌合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的抗衡离子，如钠；金属络合物(如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，如吐温、普朗尼克(PLURONICS)^TM或聚乙二醇(PEG)。

任选地，抗CD 19抗体组合物也含有合适防腐剂，如苯扎氯铵；氯丁醇；对羟基苯甲酸酯类和硫柳汞。

抗CD 19抗体组合物可以是方便的单位剂型，可通过药学领域熟知的任何方法制造。所有方法均包括使活性成分与一种或多种构成附加成分的载体相结合的步骤。通常，使活性化合物与液体载体、细分固体载体或二者均匀且紧密地结合，然后在需要时使该产品成型，从而制备抗CD 19抗体组合物。

适合胃肠道外施用的组合物通常包括水性或非水性的抗CD 19抗体无菌制剂，其优选与接受者血液等渗。可利用合适的分散剂或湿润剂和助悬剂，按照已知方法配制该制剂。该无菌注射剂也可以是胃肠外可接受的无毒稀释剂或溶剂配制的无菌注射溶液或混悬液，例如，1，3-丁二醇配制的溶液。可以使用的可接受的运载体和溶剂是水、林格溶液和等张氯化钠溶液。此外，通常采用无菌非挥发油作为溶剂或悬浮介质。出于此种目的，可采用任何刺激性小的非挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，注射剂中也可使用脂肪酸如油酸。适合口服、皮下、静脉内、肌内等施用途径的载体制剂可参见《雷明顿药物科学》(Remirtgton′s Pharmaceutical Sciences)，MackPublishing Co.，Easton，PA。在某些实施方案中，适合各种施用途径的载体制剂可能与利妥昔^TM所述相同或相似。参见《医师案头参考》Medical Economics Company，Inc.，Montvale，NJ，2005)，第958-960页和第1354-1357页，通过引用整体并入本文。在本发明的某些实施方案中，在某些实施方案中，适合各种施用途径的载体制剂可能与利妥昔M所述相同或相似。参见《医师案头参考》(新泽西州蒙特威尔的医学经济学公司(Medical Economics Company}Inc.}Montvale}NJ)}2005)，第958-960页和第1354-1357页，通过参考全文纳入本文。在本发明的某些实施方案中，将抗CD 19抗体组合物与氯化钠、二水合枸橼酸钠、聚山梨酯80和无菌水配制在一起，用于静脉内施用，其中将所述组合物的pH调节为约6.5。本领域技术人员了解，静脉内注射是一种使抗体快速分布在整个循环***中的有用的施用方式。然而，静脉内施用受到包括血管内皮细胞和皮下基质的血管屏障的限制。另外，对实体瘤摄入治疗性抗体而言，血管屏障是更显著的问题。淋巴瘤的血液流动速度较高，有利于抗体的有效递送。淋巴内施用途径，如皮下或肌内注射，或***插管，也提供了一种可用于治疗B细胞淋巴瘤的有用方式。在某些实施方案中，本发明组合物和方法中的抗CD 19抗体是自身皮下施用的。在这类实施方案中，将该组合物配制成冻干药物或配制在液体缓冲液(如PBS和/或柠檬酸盐缓冲液)中，浓度约为50mg/mL。

根据所治疗特定适应症的需要，本文制剂也可含有一种以上活性化合物，优选相互间不会产生不良影响的具有补充活性的化合物。例如，可能还需要提供免疫抑制剂。这种分子适合以有效用于所需目的的量联合存在。

活性成分也可包入通过(例如)凝聚技术或界面聚合制备的微胶囊中，例子分别是羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯) 微胶囊，或包入胶体药物递送***(例如脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒和纳米胶囊)或包入大乳液中。这类技术可公开于《雷明顿药物科学》第16版，Osol，A.编(1980)。

用于体内施用的制剂一般是无菌的。这不难通过无菌滤膜过滤来实现。

可制备缓释制剂。缓释制剂的合适例子包括含有抗CD 19抗体的固体疏水性聚合物的半渗透基质，该基质是成型制品形式，例如膜或微胶囊。缓释基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林组成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够在超过100天中释放分子，但某些水凝胶能在较短时间内释放蛋白质。包入胶囊的抗体长期留存于体内时，它们可能因接触37℃和水分而变性或聚集，导致生物学活性降低、免疫原型可能改变。可设计合理方案，以依据所涉及的机理实现稳定化。例如，如果发现聚集机制是分子间通过巯基-二硫键互换形成S-S键，则可通过修饰巯基残基、由酸性溶液冻干、控制水分含量、使用合适添加剂和开发特定聚合物基质组成来实现稳定化。在某些实施方案中，用于本发明组合物的药学上可接受的载体不影响人ADCC或CDC。

本文所述的抗CD 19抗体组合物也可配制成免疫脂质体。“脂质体”是由不同类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的小囊泡，它可用于向人递送药物(如本文所述的抗CD 19抗体)。脂质体的组分通常排列成双层形式，类似于生物膜的脂质排列。可通过本领域已知方法制备含有本发明抗体的脂质体，这些方法参见例如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：3688(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：400(1980)；以及美国专利No.4,485,045和4,544,545。循环时间延长的脂质体参见美国专利No.5,013,556。可通过反相蒸发方法，利用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的液体组合物产生特别有用的脂质体使脂质体通过孔隙大小确定的滤器挤出，以得到具有所需直径的脂质体。可以如Martin等，J.Biol.Chem.，257：286-288(1982)所述，通过二硫互换反应将本发明抗体偶联于脂质体。脂质体中也可含有治疗剂。参见Gabizon等，J.NationalCancer Inst.，(19)1484(1989)。

一些药物制剂包括，但不限于：

(a)静脉内(i.v.)施用抗CD 19抗体的无菌、无防腐剂的浓缩液，浓度为10mg/ml，装在100mg(10mL)或500mg(50mL)单次使用药瓶中。可利用氯化钠、二水合枸橼酸钠、聚山梨酯和无菌注射用水配制用于静脉内施用的产品。例如，可在9.0mg/mL氯化钠、7.35mg/mL二水合柠檬酸钠、0.7mg/mL聚山梨酯80和无菌注射用水中配制该产品。将pH调整为6.5。

(b)装在单次使用玻璃药瓶中，用于皮下(s.c.)注射的无菌冻干粉末。可利用蔗糖、一水合L-组氨酸盐酸盐、L-组氨酸和聚山梨酯20配制该产品。例如，各单次使用的药瓶可含有150mg抗CD 19抗体、123.2mg蔗糖、6.8mg一水合L-组氨酸盐酸盐、4.3mg L-组氨酸和3mg聚山梨酯20。用1.3ml无菌注射用水重建单次使用的药瓶，得到约1.5ml溶液，每1.25ml溶液递送125mg抗体(100mg/ml)。

(c)静脉内(i.v.)施用的无菌、无防腐剂冻干粉末。可利用二水合α-海藻糖、L-组氨酸HCl、组氨酸和聚山梨酯20USP配制该产品。例如，各药瓶可含有440mg抗CD 19抗体、400mg二水合α，α-海藻糖、9.9mg L-组氨酸HCI、6.4mg L-组氨酸和1.8mg聚山梨酯20USP。利用含1.1％苯甲醇作防腐剂的20ml抑菌性注射用水(BWFI)USP重建后得到含有21mg/ml抗体的多剂量溶液，其pH约为6。

(d)静脉内输注的无菌冻干粉末，其中将抗CD 19抗体与蔗糖、聚山梨酯、一水合磷酸二氢钠和二水合磷酸氢二钠配制在一起。例如，各单次使用的药瓶可含有100mg抗体、500mg蔗糖、0.5mg聚山梨酯80、2.2mg一水合磷酸二氢钠和6.1mg磷酸氢二钠。不含防腐剂。用10ml无菌注射用水，USP重建后，得到的pH约为7.2。

(e)皮下施用的无菌、无防腐剂溶液，其装在单次使用的1ml预填充的注射器中。可用氯化钠、二水合磷酸二氢钠、二水合磷酸氢二钠、枸橼酸钠、一水合柠檬酸、甘露醇、聚山梨酯80和注射用水，USP配制该产品。可加入氢氧化钠，将pH调节至约5.2。

例如，可将各注射器配制成能递送0.8ml(40mg)药品。每0.8ml包含40mg抗CD 19抗体、4.93mg氯化钠、0.69mg二水合磷酸二氢钠、1.22mg二水合磷酸氢二钠、0.24mg柠檬酸钠、1.04一水合柠檬酸、9.6mg甘露醇、0.8mg聚山梨酯80和注射用水，USP。

(f)装在单次使用药瓶中的无菌、无防腐剂的冻干粉末，用无菌注射用水(SWFI)，USP重建后，通过皮下(s.c.)注射施用。可用蔗糖、一水合组氨酸盐酸盐、L-组氨酸和聚山梨酯配制该产品。例如，75mg药瓶中可装有129.6mg或112.5mg抗CD 19抗体、93.1mg蔗糖、1.8mg一水合L-组氨酸盐酸盐、1.2mg L-组氨酸和0.3mg聚山梨酯20，经设计用0.9ml SWFI，USP重建后0.6ml递送75mg抗体。150mg药瓶可装有202.5mg或175mg抗CD 19抗体、145.5mg蔗糖、2.8mg一水合L-组氨酸盐酸盐、1.8mg L-组氨酸和0.5mg聚山梨酯20，经设计用1.4ml SWFI，USP重建后1.2ml递送150mg抗体。

用无菌注射用水重建的无菌冻干产品。可利用甘露醇、组氨酸和甘氨酸将该产品配制成单次使用的药瓶，用于肌内(IM)注射。例如，各单次使用的药瓶可装有100mg抗CD 19抗体、67.5mg甘露醇、8.7mg组氨酸和0.3mg甘氨酸，经设计用1.0ml注射用水重建后1.0ml递送100mg抗体。例如，各单次使用的药瓶可装有50mg抗CD 19抗体、40.5mg甘露醇、5.2mg组氨酸和0.2mg甘氨酸，经设计用0.6ml注射用水重建后递送50mg抗体。

(h)用于肌内(IM)注射的无菌、无防腐剂溶液，浓度为100mg/ml。可利用组氨酸、甘氨酸和无菌注射用水在单次使用的药瓶中配制该产品。例如，各单次使用的药瓶中可装有体积为1.2ml的100mg抗体、4.7mg组氨酸和0.1mg甘氨酸，经设计在1ml中递送100mg抗体。例如，各单次使用的药瓶可装有体积为0.7ml或0.5ml的50mg抗体、2.7mg组氨酸和0.08mg甘氨酸，经设计0.5ml递送50mg抗体。

(i)用于皮下施用抗CD 19抗体的无菌、无防腐剂溶液，其以100mg/mL的浓度装在单次使用的1ml预填充的注射器(无钨ultra-100注射器或自动注射器)中。可用氯化钠、组氨酸、海藻糖、聚山梨醇酯和无菌注射用水配制该产品。例如，可以在10mM组氨酸、75mM氯化钠和4％海藻糖中配制产品，其中所述制剂具有6.0的pH。

(j)用于皮下施用抗CD 19抗体的无菌、无防腐剂溶液，其以50mg/mL的浓度装在单次使用的1ml预填充的注射器(无钨ultra-100注射器或自动注射器)中。可用氯化钠、组氨酸、海藻糖、聚山梨醇酯和无菌注射用水配制该产品。例如，可以在10mM组氨酸、75mM氯化钠和4％海藻糖中配制产品，其中所述制剂具有6.0的pH。

(k)用于皮下施用抗CD 19抗体的无菌、无防腐剂溶液，其以25mg/mL的浓度装在单次使用的1ml预填充的注射器(无钨ultra-100注射器或自动注射器)中。可用氯化钠、组氨酸、海藻糖、聚山梨醇酯和无菌注射用水配制该产品。例如，可以在10mM组氨酸、75mM氯化钠和4％海藻糖中配制产品，其中所述制剂具有6.0的pH。

(l)用于皮下施用抗CD 19抗体的无菌、无防腐剂溶液，其以10mg/mL的浓度装在单次使用的1ml预填充的注射器(无钨ultra-100注射器或自动注射器)中。可用氯化钠、组氨酸、海藻糖、聚山梨醇酯和无菌注射用水配制该产品。例如，可以在10mM组氨酸、75mM氯化钠和4％海藻糖中配制产品，其中所述制剂具有6.0的pH。

(m)用于静脉内(i.v.)施用抗CD 19抗体的无菌、无防腐剂溶液，其以10mg/mL的浓度装在100mg(10mL)或500mg(50mL)单次使用药瓶中。可用氯化钠、组氨酸、海藻糖、聚山梨醇酯和无菌注射用水配制用于静脉内施用的产品。例如，可以在10mM组氨酸、75mM氯化钠和4％海藻糖中配制产品，其中所述制剂具有6.0的pH。

在某些实施方案中，本发明药物组合物在4℃下稳定。在某些实施方案中，本发明药物组合物在室温下稳定。

【6.18.2.抗体半衰期】

在某些实施方案中，本发明组合物和方法的抗CD 19抗体的平均半衰期为至少约4至7天。在某些实施方案中，本发明组合物和方法的抗CD 19抗体的平均半衰期为至少约2至5天、3至6天、4至7天、5至8天、6至9天、7至10天、8至11天、8至12天、9至13天、10至14天、11至15天、12至16天、13至17，天、14至18天、15至19天或16至20天。在其它实施方案中，本发明组合物和方法的抗CD 19抗体的平均半衰期为至少约17至21天、18至22天、19至23天、20至24天、21至25天、22至26天、23至27天、24至28天、25至29天或26至30天。在又进一步的实施方案中，本发明组合物和方法的抗CD 19抗体的平均半衰期可至多约50天。在某些实施方案中，可通过本领域已知方法延长本发明组合物和方法的抗体的半衰期。进而，这种延长可降低抗体组合物的施用量和/或施用频率。体内半衰期改善的抗体及其制备方法参见美国专利No.6,277,375；和国际公开No.WO 98/23289和WO 97/3461。

也可利用或不用多功能接头，通过PEG与抗体N末端或C末端的位点特异性偶联或通过赖氨酰残基上的ε-氨基，将惰性聚合物分子如高分子量聚乙二醇(PEG)连接于抗体，从而延长抗CD 19抗体的体内血清循环时间。可利用导致生物活性损失最小的线型或分支聚合物衍生化。通过SDS-PAGE和质谱密切监测偶联程度，以确保PEG分子适当地偶联于所述抗体。可通过大小排阻或离子交换层析将未反应的PEG与抗体-PEG偶联物分离开。可利用本领域技术人员已知的方法，例如本文所述的免疫测定检测PEG-衍生化抗体的结合活性及体内功效。

另外，可将本发明组合物和方法的抗体与白蛋白偶联，以制备在体内更稳定或体内半衰期更长的抗体。本领域熟知这些技术，参见例如国际公开No.WO 93/15199、WO 93/15200和WO 01/77137；和欧洲专利No.EP 413,622，所有这些文献通过引用并入本文。

【6.18.3.施用和剂量】

可通过任何途径将本发明组合物施用于人患者，这些途径包括但不限于：静脉内、皮内、透皮、皮下、肌内、吸入(如通过气雾剂)、含服(如舌下)、局部(即皮肤和粘膜表面，包括气道表面)、鞘内、关节内、胸膜内、脑内、动脉内、胸膜内、口服、淋巴内、鼻内、直肠或***施用，通过局部导管灌注或病损内直接注射。在一个实施方案中，通过经给定时间(如0.5-2小时)静脉内推注或静脉内输注施用本发明组合物。可通过蠕动泵，或以储库形式递送本发明组合物，但如本领域所了解的那样，在任何给定情况下最合适的途径取决于以下因素，例如受治疗者的物种、年龄、性别和总体健康状况，所治疗疾病的特性和严重程度和/或所施用的特定组合物的特性(即剂量、剂型)。在具体实施方案中，施用途径是经一段时间，每周一次或每周两次推注或连续输注。在其它特定实施方案中，施用途径是皮下注射，任选每周一次或两次。在一个实施方案中，对门诊患者施用本发明的组合物和/或方法。

在某些实施方案中，包含抗CD 19抗体的组合物的剂量以mg/kg患者体重为单位计量。在其它实施方案中，包含抗CD 19抗体的组合物的剂量以mg/kg患者去脂体重(即体重减去体脂含量)为单位计量。在其它实施方案中，包含抗CD 19抗体的组合物的剂量以mg/m²患者体表面积为单位计量。在其它实施方案中，包含抗CD 19抗体的组合物的剂量以mg/施用患者的剂量为单位计量。剂量的任何测量方法均可与本发明组合物和方法联用，并且可通过本领域标准方式转换剂量单位。

本领域技术人员应理解，可根据多种因素选择剂量，包括受治疗者的年龄、性别、物种和病状(如B细胞恶性肿瘤的分期)，所需的细胞消除程度，所治疗疾病和/或所用的特定抗体或抗原结合片段，剂量可由本领域技术人员确定。例如，可由来自体外测试***或动物模型(如棉鼠或猴)测试***的剂量响应曲线外推得到本发明组合物的有效量。本领域了解评估抗体作用的模型和方法(Wooldridge等，Blood，89(8)：2994-2998(1997)，通过引用整体并入本文)。在某些实施方案中，对特定的B细胞恶性肿瘤而言，本领域的用于抗体治疗的治疗性方案标准可用于本发明组合物和方法。

可用于本发明方法的施用方案的例子包括但不限于：每天、每周三次(间歇性)、每周或每14天。在某些实施方案中，施用方案包括但不限于：每月施用或每6-8周施用。

本领域技术人员应理解，与维持方案相比，初始治疗的剂量通常较高和/或施用频率较高。

在本发明的一些实施方案中，抗CD 19抗体能结合B细胞，可导致B细胞有效消除(即，以低剂量)(如本文所述)。当患者B细胞表面上的人CD 19密度较高时，可实现较高的结合程度。在某些实施方案中，抗体(任选在药学上可接受的载体中，作为药物组合物的一部分)的剂量为至少约0.0005、0.001、0.05、0.075、0.1、0.25、0.375、0.5、1、2.5、5、10、20、37.5或50mg/m²和/或少于约500、475、450、425、400、375、350、325、300、275、250、225、200、175、150、125、100、75、60、50、37.5、20、15、10、5、2.5、1、0.5、0.375、0.1、0.075或0.01mg/m²。在某些实施方案中，剂量为约0.0005至约200mg/m²、约0.001至150mg/m²、约0.075至125mg/m²、约0.375至100mg/m²、约2.5至75mg/m²、约10至75mg/m²和约20至50mg/m²。在相关实施方案中，所用的抗CD 19抗体的剂量为至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5mg/kg患者体重。在某些实施方案中，所用裸露抗CD 19抗体的剂量为至少约1-10、5-15、10-20或15-25mg/kg患者体重。在某些实施方案中，所用抗CD 19抗体的剂量为至少约1-20、3-15或5-10mg/kg患者体重。在其它实施方案中，所用抗CD 19抗体的剂量为至少约5、6、7、8、9或10mg/kg患者体重。在某些实施方案中，所述抗体(任选在作为药物组合物一部分的药学上可接受的载体中)的单一剂量单位可以是至少约0.5、1、2、4、6、8、10、12、 14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248或250微克/m²。在其它实施方案中，剂量为至多1g/单个剂量单位。

所有上述剂量均为示范性的，可用于本发明组合物和方法，然而当抗CD 19抗体与毒素或放疗剂联合使用时，可能优选上述剂量中的较低剂量。在某些实施方案中，当患者的CD 19密度水平较低时，可能优选上述剂量中的较低剂量。

在本发明的某些实施方案中，使用嵌合抗CD 19抗体时，嵌合抗休的剂量或用量高于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16mg/kg患者体重。在本发明的其它实施方案中，使用嵌合抗CD 19抗体时，嵌合抗体的剂量或用量小于约1、0.9、0.8、0.7.0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1mg/kg患者体重。

在本发明方法的一些实施方案中，本发明抗体和/或组合物的施用剂量低于约375mg/m²；低于约37.5mg/m²；低于约0.375mg/m²；和/或约0.075mg/m²-125mg/m²。在本发明方法的某些实施方案中，剂量方案包括以重复间隔施用的低剂量。例如，在一个实施方案中，本发明组合物的施用剂量可低于约375mg/m²，施用间隔约为每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、14、15、20、21、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、125、150、175或200天。

特定剂量可导致用本发明组合物和方法治疗的人中的B细胞消耗持续至少约1、2、3、5、7、10、14、20、30、45、60、75、90、120、150或180天或更长时间。在某些实施方案中，消耗前B细胞(不表达表面免疫球蛋白)。在某些实施方案中，消耗成熟B细胞(表达表面免疫球蛋白)。在其它实施方案中，所有非恶性类型的B细胞均可被消耗。可利用这些类型的B细胞的任一种来测定B细胞消耗。可测定体液(如血清)或组织(如骨髓)中的B细胞消耗。在本发明方法的某些实施方案中，与使用本发明组合物和方法之前所治疗患者的B细胞水平相比，B细胞被消耗至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在本发明方法的其它实施方案中，与人典型的B细胞标准水平相比，B细胞被消耗至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在相关实施方案中，利用年龄、性别、体重和其它因素与治疗患者相当的患者确定人体典型的B细胞标准水平。

在本发明的某些实施方案中，约125mg/m²或较低剂量的抗体或抗原结合片段导致B细胞消耗持续至少约7、14、21、30、45、60、90、120、150或200天。在另一代表性实施方案中，约37.5mg/m²或更低的剂量使得B细胞消耗持续至少约7、14、21、30、45、60、90、120、150或200天。在其它实施方案中，约0.375mg/m²或更低剂量导致B细胞消耗持续至少约7、14、21、30、45或60天。在另一个实施方案中，约0.075mg/m²或更低的剂量导致B细胞消耗持续至少约7、14、21、30、45、60、90、120、150或200天。在其它实施方案中，约0.01mg/m²、0.005mg/m²或甚至0.001mg/m²或更低的剂量导致B细胞消耗持续至少约3、5、7、10、14、21、30、45、60、90、120、150或200天。根据这些实施方案，可通过任何合适的途径施用该剂量，但任选通过皮下途径或静脉内途径施用。

另一方面，本发明提供了以下发现：可以低于现有可得方法采用的剂量，使用抗体或抗体片段消耗B细胞和/或治疗B细胞病症。因此，在另一个实施方案中，本发明提供消耗B细胞和/或治疗T细胞介导疾病的方法，所述方法包括施用人有效量的特异性结合ICOS的抗体，其中约500、475、450、425、400、375、350、325、300、275、250、225、200、175、150、125、100、75、60、50、37.5、20、10、5、2.5、1、0.5、0.375、0.25、0.1、0.075、0.05、0.001、0.0005mg/m² 或更低的剂量导致B细胞(循环和/或组织中B细胞)在至少约3、5、7、10、14、21、30、45、60、75、90、120、150、180或200天或更长时间中被消耗25％、35％、50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或更多。在代表性实施方案中，约125mg/m²或75mg/m²或更低的剂量导致B细胞在至少约7、14、21、30、60、75、90、120、150或180天中被消耗至少约50％、75％、85％或90％。在其它实施方案中，约50、37.5或10mg/m²的剂量导致B细胞在至少约7、14、21、30、60、75、90、120或180天中被消耗至少约50％、75％、85％或90％。在其它实施方案中，约0.375或0.1mg/m²的剂量导致B细胞在至少约7、14、21、30、60、75或90天中被消耗至少约50％、75％、85％或90％。在其它实施方案中，约0.075、0.01、0.001或0.0005mg/m²的剂量导致B细胞在至少约7、14、21、30或60天中被消耗至少约50％、75％、85％或90％。

在本发明的某些实施方案中，可提高或降低剂量，以便在血液或组织(例如但不限于骨髓)中维持恒定剂量。在相关实施方案中，将剂量提高或降低约2％、5％、8％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和95％，以维持本发明组合物和方法的所需抗体水平。

在某些实施方案中，可根据患者对本发明组合物和方法的免疫反应来调整剂量和/或降低输注速率。

根据本发明方法的一个方面，可以先施用本发明抗CD 19抗体和/或组合物的加载剂量，随后施用维持剂量直到所治疗的B细胞恶性肿瘤发生进展或者随后给予确定的疗程(如CAMPATH^TM、MYLOTARG^TM或RITUXAN^TM，后者允许向待治疗的患者施用确定数量的剂量，该剂量数量根据额外产生的数据而增加)。

根据本发明方法的另一方面，可利用本发明组合物和方法预治疗患者，以检测、最大程度降低免疫应答，或最大程度减少本发明组合物和方法的不良作用。

【6.18.4.毒性测试】

可通过标准的药学方法，在细胞培养物或实验动物中确定本发明组合物和/或治疗方案的耐受性、毒性和/或功效，例如，用于确定LD50(使50％群体死亡的剂量)、ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)和IC50(实现50％有效抑制的剂量)。在一个实施方案中，该剂量是实现循环B细胞或循环免疫球蛋白或两者的至少60％、70％、80％、90％、95％或99％消耗的有效剂量。毒性和疗效的剂量比是治疗指数，可表示为LD50/ED50比。优选表现出较大的治疗指数的疗法。虽然可采用存在毒副作用的治疗，但应仔细设计使这类药物靶向表达CD 19的细胞的递送***，以最大程度降低对ICOS阴性细胞的潜在损伤，从而降低副作用。

可利用获自细胞培养测定和动物研究的数据制定人用组合物和/或治疗方案的一系列剂量。这类药物的剂量可属于毒性很小或无毒性的包含ED50在内的循环浓度范围。该剂量可根据所用的剂型和所用的施用途径在此范围内变化。在本发明方法中使用的任何治疗中，可通过合适的动物模型估计治疗有效剂量。根据动物模型的物种，按照本领域接受的公式，依比例确定人用剂量，如Freireich等，Quantitative comparison of toxicity of anticancer agents in mouse，rat，monkey，dog，and human(抗癌剂在小鼠、大鼠、猴、犬和人中的毒性的定量比较)，Cancer Chemotherapy Reports，NCI 196640：219-244所述。获自细胞培养实验的数据可用于预测潜在毒性。可利用动物研究制定具体剂量，以实现包括经细胞培养测定的IC50(即，测试化合物实现半数最大症状抑制的浓度)的循环血浆浓度范围。可利用这些信息更精确地确定人用剂量。可通过例如高效液相色谱法、ELISA或基于细胞的测定来测量血浆药物水平。

【6.19.患者诊断、分期和治疗方案】

【肿瘤学】

按照本发明的某些方面，根据许多因素选择用于本发明组合物和方法的治疗方案和剂量，这些因素包括但不限于所治疗的B细胞疾病或病症的分期。本领域技术人员可根据患者或患者群体中B细胞疾病或病症的特定分期确定合适的治疗方案。可利用本领域标准方法产生剂量反应曲线，以确定本发明组合物治疗患有不同分期B细胞疾病或病症的患者的有效量。与患有早期B细胞疾病或病症的患者相比，患有较晚期B细胞疾病或病症的患者通常需要较高的剂量和/或较高的施用频率，且施用期间可能较长。

可实施本发明的抗CD 19抗体、组合物和方法以治疗B细胞疾病，包括B细胞恶性肿瘤。术语“B细胞恶性肿瘤”包括任何衍生自B细胞谱系细胞的恶性肿瘤。示范性B细胞恶性肿瘤包括但不限于：B细胞亚型非霍奇金淋巴瘤(NHL)，包括低级/滤泡性NHL、小淋巴细胞性(SL)NHL、中级/滤泡性NHL、中级弥散性NHL、高级免疫母细胞性NHL、高级免疫母细胞性NHL、高级小非裂解细胞NHL；套细胞淋巴瘤和巨大疾病NHL；伯基特淋巴瘤；多发性骨髓瘤；前B急性淋巴细胞性白血病和早期B细胞前体产生的其它恶性肿瘤；普通急性淋巴细胞性白血病(ALL)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，包括免疫球蛋白-突变的CLL和免疫球蛋白-未突变的CLL；毛细胞白血病；非急性淋巴细胞性白血病；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，包括生发中心B细胞样(GCB)DLBCL，活化的B细胞样(ABC)DLBCL和3型DLBCL；前淋巴细胞白血病；轻链疾病；浆细胞瘤；骨硬化性骨髓瘤；浆细胞白血病；意义未明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)；郁积型多发性骨髓瘤(SMM)；无痛性多发性骨髓瘤(IMM)；霍奇金淋巴瘤，包括经典和结节状淋巴细胞优势型；淋巴浆细胞增多型淋巴瘤(LPL)；以及边缘区淋巴瘤，包括胃粘膜-结合性淋巴组织(MALT)淋巴瘤。

在另一个实施方案中，可利用本发明治疗成熟B细胞恶性肿瘤(即，在细胞表面上表达Ig)，所述恶性肿瘤包括但不限于：滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、多发性骨髓瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，包括生发中心B细胞样(GCB)DLBCL，活化的B细胞样(ABC)DLBCL和3型DLBCL，霍奇金淋巴瘤，包括经典和结节状淋巴细胞优势型，淋巴浆细胞增多性淋巴瘤(LPL)，边缘区淋巴瘤，包括胃粘膜结合性淋巴组织(MALT)淋巴瘤以及慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，包括免疫球蛋白突变的CLL和免疫球蛋白未突变的CLL。

另外，在B细胞发育过程中，CD 19的表达比(例如)CD20早，因此特别适合治疗(例如)骨髓中的前B细胞和未成熟B细胞恶性肿瘤(即，不在细胞表面上表达Ig)。前B细胞和未成熟B细胞恶性肿瘤的例子包括但不限于：急性淋巴细胞性白血病。

在其它具体实施方案中，可实施本发明以治疗节外肿瘤。

【6.19.1.细胞恶性肿瘤的诊断和分期】

能够形成肿瘤的癌症，如B细胞疾病或病症(如非霍奇金淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤和伯基特淋巴瘤)的进程特征通常是该癌症在体内扩散的程度，常常分为以下四个分期以便于预测疗效。I期：该癌症局限在特定组织内，尚未扩散到***。II期：该癌症扩散到附近的***，即转移。III期：在远离组织源的体内区域的***中发现癌症，且可能包括一团或多个肿瘤而非一个。IV期：癌症已扩散到身体远端部位。可通过临床观察和本领域技术人员熟知的检测方法确定癌症分期。上述癌症分期通常与以肿瘤形成为特征的临床癌症诊断联合使用，并且可与本发明组合物和方法联合使用以治疗B细胞疾病和病症。疾病早期通常指该疾病仍然位于患者身体某部分或尚未转移。

对不形成肿瘤的B细胞疾病或病症(例如但不限于多发性骨髓瘤)而言，确定疾病分期有不同标准。DS分期***(Durie-Salmon StagingSystem)已广泛使用。在此分期***中，疾病的临床分期(I、II或III期)是基于以下数种测量值，包括M蛋白水平、溶解性骨损伤的数量、血红蛋白数值和血清钙水平。按照肾功能对其进行进一步分期(分为A或B期)。按照DS分期***，I期(细胞数量少)具有以下所有特征：血红蛋白值＞10g/dL；血清钙值正常或≤12mg/dL；骨x-射线，正常骨结构(0级)或只有骨浆细胞瘤；和M-组分产生速率低：IgG值＜5g/dL，IgA值＜3g/dL，本斯-琼斯蛋白＜4g/24h。I期患者通常没有发生相关的器官或组织损伤或症状。II期(细胞数量中等)的特征是既不符合I期，又不符合III期。III期(细胞数量多)具有以下一种或多种特征：血红蛋白值＜8.5g/dL；血清钙值＞12mg/dL；晚期溶解性骨损伤(3级)；M组分产生速率高：IgG值＞7g/dL，IgA值＞5g/dL，本斯-琼斯蛋白＞12g/24h子类(A或B)，其中A是相对正常的肾功能(血清肌酸酐值＜2.0mg/dL)和B是异常的肾功能(血清肌酸酐值＞2.0mg/dL)。

另一种骨髓瘤分期***是骨髓瘤国际分期***(ISS)。该***能更有效地区别分期类群，其基于容易测定的β2-微球蛋白(β2-M)和白蛋白的血清水平。按照骨髓瘤ISS，I期的特征是β2-M＜3.5和白蛋白≥-3.5，II期的特征是β2-M＜3.5和白蛋白＜3.5或β2-M 3.5-5.5，III期的特征是β2-M＞5.5(康涅狄格州纽卡纳安的多发性骨髓瘤研究基金会(Multiple Myeloma Research Foundation，New Canaan，CT))。

对患者B细胞恶性肿瘤的分期是一种临床决策。如上所述，提到实体瘤，肿瘤的扩散、位置和数量是临床上确定分期的主要因素。在不形成肿瘤的B细胞恶性肿瘤患者中确定分期可能较为复杂，要求测定血清水平，如上所述。

上文中对B细胞疾病和病症的分期的描述并非限制性。本领域已知用于诊断B细胞疾病和病症的其它特征可用作确定患者的B细胞疾病或病症的分期的标准。

【6.19.1.1.多发性骨髓瘤】

多发性骨髓瘤是浆细胞恶性肿瘤。肿瘤细胞位于骨髓中，其特征是溶骨性骨病变。相信免疫球蛋白基因座之一与多种其它基因，如细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白D3、c-MAF、MMSET(多发性骨髓瘤SET-结构域蛋白)或成纤维细胞生长因子受体3之间的染色体相互易位是主要的致癌事件。多发性骨髓瘤的特征是SHM，推定的来源细胞是后-GC B细胞。通常，首先通过症状鉴定多发性骨髓瘤，症状包括例如，反复感染、疲劳、疼痛和肾病，并用临床检测进行验证(参见例如，癌症：肿瘤学原理和实践(Cancer：Principles and Practice of Oncology)，第6版，DeVita，V.T.，Hellman，S.和Rosenberg，S.A.编，2001Lippincott Williams和Wilkins，宾夕法尼亚州费城(Philadelphia，PA)，19106第2465-2499页)。

在某些实施方案中，还可对作为用本发明组合物和方法治疗的候选者的患者进行血液和/或尿液的诊断检测，以确认多发性骨髓瘤的诊断或怀疑，这些检测包括但不限于：全血计数(CBC)检测，以测定CBC中报道的细胞类型是否在本领域公知的正常范围内；血液化学概况检测，以确定各种血液组分，如白蛋白、血液尿素氮(BUN)、钙、肌酸酐和乳酸脱氢酶(LDH)的水平是否偏离标准值。也可检测β2-微球蛋白(β2-M)的血清水平，以及IL-6的替代标记、骨髓瘤细胞的生长因子。可利用尿分析确定尿中的蛋白质水平。可利用电泳测定各种蛋白质水平，这些蛋白质包括血液(称为血清蛋白质电泳或SPEP)或尿(称为尿电泳或UEP)中的M蛋白。也可进行另一种称为免疫固定电泳(IFE)或免疫电泳的测试，以提供有关异常抗体蛋白类型的更具体的信息。可通过评估各种蛋白质，特别是M蛋白的改变和比例，追踪骨髓瘤疾病的进程和对治疗方案的反应。多发性骨髓瘤的特征是骨髓瘤肿瘤细胞分泌的M蛋白大量增加。

也可进行骨诊断检测，以确认多发性骨髓瘤的诊断或怀疑，这些检测包括但不限于：X射线和其它成像检查一包括骨(骨骼)检查、磁共振成像(MRI)和计算机轴向断层成像(CAT)(也称为计算机断层成像(CT)-可评估骨结构改变和确定骨中的肿瘤数量和大小。可利用骨髓抽吸或骨髓活检检测骨髓中的浆细胞数量增加。抽吸需要液体骨髓样品，活检需要固体骨组织样品。在这两项检查中，可从骨盆(髋骨)取得样品。也可利用胸骨抽吸骨髓。

多发性骨髓瘤患者一般分为以下三类，这种分类的目的是帮助确定有效的治疗方案。意义未明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)的典型特征是血清M蛋白水平小于3g/dL、骨髓克隆浆细胞小于10％、没有其它B细胞疾病迹象、且没有相关的器官或组织损伤，如高钙血症(血钙水平升高)、通过血清肌酸酐升高观察到的肾功能受损、贫血或骨损伤。无症状骨髓瘤一般是I期，包括郁积型多发性骨髓瘤(SMM)和无痛性多发性骨髓瘤(IMM)。SMM的特征是血清M蛋白水平大于或等于3g/dL，且IMM的特征是骨髓克隆浆细胞大于或等于10％骨髓细胞。有症状骨髓瘤的特征是血清和/或尿中的M蛋白，包括以存在骨髓克隆浆细胞或浆细胞瘤为特征的II期多发性骨髓瘤和以相关器官或组织损伤为特征的III期多发性骨髓瘤。

骨硬化骨髓瘤是罕见POEMS综合征(多神经病、器官巨大症、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病和皮肤病变)的组成部分。发病峰值出现在40-50岁。全身特征包括骨骼损伤、骨髓浆细胞＜5％、正常CBC、血小板增加和器官巨大症。CSF含有大量蛋白，但不存在细胞。M-蛋白水平低(＜3g/dl，中值＝1.1g/dl)；重链类型-通常为α或γ；轻链类型-通常为γ；尿单克隆罕见，偶见冷球蛋白血症。50％患者发生神经病，包括近端和远端神经衰弱，与小纤维相比较大神经纤维的感觉损失更多；脱髓鞘和远端潜伏期长。

郁积型多发性骨髓瘤患者的疾病状况通常会稳定数月/数年；没有贫血、骨损伤、肾功能不全或高钙血症；骨髓中含有＞10％浆细胞以及单克隆血清蛋白。郁积型多发性骨髓瘤的标准与多发性骨髓瘤的诊断是相容的；然而，没有进行性过程的证据。这些是缓慢进展的情况，肿瘤细胞量在诊断时很低，处于S期的骨髓浆细胞的比例很低(＜0.5％)。特征性临床特征包括：血清M蛋白水平＞3g/dL和/或骨髓浆细胞≥10％；不存在贫血、肾衰竭、高钙血症、溶解性骨损伤。

无痛性(或无症状)多发性骨髓瘤是在没有出现症状的情况下，通常在实验室筛选研究后偶然诊断出的多发性骨髓瘤。无痛性多发性骨髓瘤类似于郁积型骨髓瘤，但骨损伤少且发生中度贫血。大部分无痛性多发性骨髓瘤的病例在3年内发生明显的多发性骨髓瘤。除以下内容外，诊断标准与多发性骨髓瘤基本相同，这些内容是：没有骨损伤或一个无症状溶解性损伤(X射线检查)；IgG的M组分水平＜3g/dL，IgA的M组分水平2g/dL，尿轻链＜4g/24h；血红蛋白＞10g/dl，血清钙正常，血清肌酸醉＜2mg/dL，无感染。

由于体外和体内使MM细胞生长的难度，所以负责引发和维持多发性骨髓瘤(MM)的细胞身份仍未清楚。很多试剂在多发性骨髓瘤中是活性的，但是大部分患者复发。这种临床模式表明大多数癌细胞被消除，但是具有介导肿瘤再生长的克隆生成潜力的细胞有相对化学抵抗性。癌症干细胞假设由以下发现得以支持：人MM细胞系含有少量(＜5％)缺乏CD 138表达的亚群并与相应CD 138+浆细胞相比更大的克隆生成潜力(Matsui等Blood.2004Mar 15；103(6)：2332-6.)。来自临床MM样品的CD138-细胞类似地在体外和不肥胖的糖尿病性/重度联合性免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠中克隆发生，而CD 138+细胞则不。而且，来自细胞系和临床样品两者的CD 138-细胞在表型上类似于后生发中心B细胞，且它们的克隆生成性生长受抗CD20单克隆抗体-利妥昔单抗抑制。另外，来自细胞系和临床样品两者的CD 138-细胞表达CD27和CD 19B细胞标记物。这些数据表明，MM“干细胞”是具有复制并且随后分化成恶性CD 138+浆细胞的能力的CD138-B细胞。支持多发性骨髓瘤中的癌干细胞假设的其它结果综述于Huff &Matsui(J Clin Oncol.(2008)26(17)：2895-900)和Matsui等(CancerRes.(2008)68(1)：190-7)。

本发明提供了在人多发性骨髓瘤患者中有效消耗CD 138-克隆生成B细胞的抗体。在特定的实施方案中，本发明的抗CD-19抗体可在人多发性骨髓瘤患者中实现至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％的CD138-克隆生成B细胞消耗。CD 138-克隆生成B细胞的消耗可持续延长的时间。在一个实施方案中，由本发明的抗CD 19抗体引起的CD138-克隆生成B细胞消耗可持续至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少15天、至少20天、至少25天或至少30天。在另一个实施方案中，由本发明的抗CD 19抗体引起的CD138-克隆生成B细胞消耗可持续至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9 周或至少10周。在另一个实施方案中，由本发明的抗CD 19抗体引起的CD138-克隆生成B细胞消耗至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月或至少12个月。

本发明提供了在人多发性骨髓瘤患者中有效消耗癌干细胞的抗体。在特定的实施方案中，本发明的抗CD-19抗体可在人多发性骨髓瘤患者中实现至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％的癌干细胞消耗。癌干细胞的消耗可持续延长的时间。在一个实施方案中，由本发明的抗CD 19抗体引起的癌干细胞消耗持续至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少15天、至少20天、至少25天或至少30天。在另一个实施方案中，由本发明的抗CD 19抗体引起的癌干细胞消耗持续至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周或至少10周。在又一个实施方案中，由本发明的抗CD 19抗体引起的癌干细胞消耗持续至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月或至少12个月。

本发明还涉及治疗人中的多发性骨髓瘤的方法，所述方法包括向需要其的人施用足以消耗循环B细胞的量的人、人源化或嵌合的抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体可介导人抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)、补体依赖性细胞介导的细胞毒作用(CDC)和/或凋亡。在一个实施方案中，治疗人中的多发性骨髓瘤的方法包括CD138-克隆生成B细胞的消耗。在另一个实施方案中，治疗人中的多发性骨髓瘤的方法包括癌干细胞的消耗。在特定的实施方案中，消耗可实现CD138-克隆生成B细胞或癌干细胞的至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％减少。消耗可持续延长的时间。在一个实施方案中，CD138-克隆生成B细胞或癌干细胞的消耗可持续至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少15天、至少20天、至少25天或至少30天。在另一个实施方案中，消耗可持续至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周或至少10周。在又一个实施方案中，消耗可持续至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月或至少12个月。

【6.20.患者诊断和治疗方案：】

【自身免疫性疾病】

根据本发明的某些方面，本发明的某些方面，根据许多因素选择用于本发明组合物和方法的治疗方案和剂量，这些因素包括但不限于：所治疗的自身免疫性疾病或病症的阶段。本领域技术人员可根据患者或患者群体自身免疫性疾病或病症的特定阶段确定合适的治疗方案。可利用本领域标准方法得到剂量响应曲线，以确定本发明组合物治疗处于自身免疫性疾病或病症不同阶段的患者的有效量。与自身免疫性疾病或病症活性较低的患者相比，所患自身免疫性疾病或病症活性较高的患者通常需要较高的剂量和/或较高的施用频率，且施用周期可能较长。

可实施本文所述的抗CD 19抗体、组合物和方法，以治疗自身免疫性疾病或病症。术语“自身免疫性疾病或病症”指特征是受治疗者对其自身的细胞、组织和/或器官产生免疫反应而引起的细胞、组织和/或器官损伤的受治疗者病症。术语“炎性疾病”可与术语“炎性病症”互换使用，指特征是炎症，包括但不限于慢性炎症的受治疗者病症。自身免疫性疾病可能与炎症相关联或不与炎症相关联。而且，炎症可能是或不是由自身免疫性疾病引起的。因此，某些疾病既可被鉴定为自身免疫性疾病，又可被鉴定为炎性病症。示范性的自身免疫性疾病或病症包括但不限于：斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征 (antiphospholipid syndrome)、自身免疫性艾迪森病、自身免疫性肾上腺病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫肝炎、自身免疫性***和***、自身免疫性血小板减少、贝切特综合征、大疱型类天疱疮、心肌病、口炎性腹泻-皮炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘多神经病、丘-施二氏综合征、疤痕性类天疱疮、CREST综合征、冷凝集素病、克罗恩氏病、盘状狼疮、特发性混合型冷球蛋白血症、糖尿病、嗜酸性细胞型筋膜炎(eosinophilic fascites)、纤维肌痛-纤维肌炎、肾小球肾炎、格拉夫斯病、格-巴二氏综合征、桥本甲状腺炎、亨-含二氏紫瘢、特发性肺纤维化、特发性/自身免疫血小板减少性紫瘢(ITP)、IgA神经病、青少年关节炎、扁平苔藓、红斑狼疮、美尼尔综合征、混合型***病、多发性硬化、1型或免疫介导的糖尿病、重症肌无力、天疱疮相关疾病(如寻常性天疱疮)、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎(polychrondritis)、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发性无γ球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、银屑病性关节炎、雷氏现象(Raynaud′sphenomenon)、莱特尔综合征、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、斯耶格伦综合征、全身肌强直综合征、全身性红斑狼疮(SLE)、斯维特综合征、斯提耳病(Still’s disease)、红斑狼疮、高安动脉炎、暂时性动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎如疱疹样皮炎血管炎、白癜风和韦格纳肉芽肿病。炎性病症的例子包括但不限于：哮喘、脑炎、炎性肠病、慢性阻塞性肺病(COPD)、过敏性疾病、感染性休克、肺纤维化、未分化的脊椎关节病、未分化的关节病、关节炎、炎性骨质溶解、移植物抗宿主病、荨麻疹、VKH综合征(Vogt-Koyanagi-Hareda syndrome)和慢性病毒或细菌感染所致的慢性炎症。

抗CD 19免疫治疗包括以单一药物的形式施用抗CD 19抗体，以治疗自身免疫疾病或病症。在一个实施方案中，本发明的抗CD 19免疫治疗包括施用能够抑制体外刺激的B细胞增殖的抗CD 19抗体。在另一个实施方案中，本发明的抗CD 19免疫治疗包括施用Fc变异抗 CD 19抗体，其中与相应的非变异分子相比，所述Fc变体与一种或多种Fc配体的结合亲和性改变。在特定的实施方案中，本发明抗CD 19免疫治疗包括施用Fc变异抗CD 19抗体，其中与相应的非变异Fc结构域相比，所述Fc变体与Fcγ受体IIB的结合力增强。

抗CD 19免疫治疗还包括以单一药物的形式施用抗CD 19双特异性抗体，以治疗自身免疫疾病或病症。在一个实施方案中，本发明的抗CD 19免疫治疗包括施用能够特异性结合第一种和第二种抗原的抗CD-19双特异性抗体，其中所述第一种抗原是人CD 19，所述第二种抗原是选自下组的Fcγ受体：FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA和/或FcγRIV。在另一个实施方案中，本发明抗CD 19免疫治疗包括施用能够特异性结合人CD 19和FcγRIIB的抗CD 19双特异性抗体。

CD 19在未成熟B细胞上表达，因此抗CD 19mAb可能特别适合消耗前B细胞和未成熟B细胞，例如在骨髓中。

【6.20.1.用于诊断自身免疫性疾病或病症的临床标准】

本领域了解不同自身免疫性疾病或病症的诊断标准。历史上，诊断通常基于各种身体症状的组合。近年来，已利用分子技术如基因表达概况分析来开发自身免疫性疾病或病症的分子定义。下面提供了特定自身免疫性疾病或病症的临床诊断方法的例子。本领域技术人员了解其它合适的方法。

在某些实施方案中，可将自身免疫性疾病活性水平低的患者或患早期自身免疫性疾病(对可分期疾病而言)的患者鉴定为适合用抗CD19抗体组合物和方法进行治疗。因为自身免疫性疾病的症状普遍且自身免疫性疾病间的症状重叠，所以这种疾病难以早期诊断。在这类实施方案中，在早期治疗的或自身免疫性疾病活性水平低的患者具有多种症状，其中包括自身免疫性疾病或病症的至少一种症状。在相关实施方案中，在早期治疗的或自身免疫性疾病活性水平低的患者具有多种症状，其中包括自身免疫性疾病或病症的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种症状。这些症状可以是任何自身免疫性疾病和病症的症状，或其组合。自身免疫性疾病和病症症状的例子见下。

【6.20.2.***性红斑狼疮(SLE)】

***性红斑狼疮(SLE)是影响关节、肌肉和身体其它部分的慢性(长期)风湿性疾病。可通过检查身体症状和/或实验室检测结果鉴定需要治疗SLE的患者或患者群体。不同患者的身体症状有很大不同。例如，在SLE中，如果以下11种症状中出现4种，则该患者被诊断为SLE：1)颊部红疹：脸颊上出现红疹；2)盘状红疹：红色凸起的斑块；3)光敏感性：对日光发生反应，导致发生皮肤红疹或皮肤红疹增加；4)口腔溃疡：鼻腔或口腔溃疡，通常无痛；5)关节炎：涉及两个或多个周围关节的非侵蚀性关节炎(关节周围的骨不被破坏的关节炎)；6)浆膜炎性胸膜炎(serositis pleuritis)或心包炎：肺或心脏衬里的炎症；7)肾病：尿中蛋白质过多(大于0.5克/天或测试棒3+)和/或细胞管型(尿的异常元素，衍生自红细胞和/或白细胞和/或肾小管细胞)；8)神经病：癫痫发作(惊厥)和/或精神病，但不存在可能引起这种作用的药物或代谢紊乱；9)血液病：溶血性贫血或白细胞减少症(白细胞计数低于4,000细胞/立方毫米)或淋巴细胞减少(小于1,500个淋巴细胞/立方毫米)或血小板减少(小于100,000个血小板/立方毫米)(白细胞减少症和淋巴细胞减少必须检测到两次或更多次。血小板减少必须在不存在已知能诱导血小板减少的药物的情况下检测)；10)抗核抗体：在不存在诱导性药物的情况下抗核抗体(ana)测试阳性；和/或11)免疫疾病：抗双链抗-DNA检测阳性、抗-sm检测阳性、抗磷脂抗体如抗心磷脂抗体阳性或梅毒检测(vdrl)假阳性。

可能表明SLE的其它身体症状包括但不限于：贫血、疲劳、发热、皮肤红疹、肌肉痛、恶心、呕吐和腹泻、腺体肿胀、食欲缺乏、对冷敏感(雷氏现象)和体重降低。

还可利用实验室试验鉴定需要治疗的患者或患者群体。例如，可进行血液检查，检测到几乎所有SLE患者的血液中都有自身抗体。这类检查可包括但不限于：在不存在已知诱导性药物的情况下检查抗核抗体(ANA)(Rahman，A.和Hiepe，F.Lupus(2002)，11(12)：770-773)，检查抗双链抗-DNA(Keren，D.F.Clin.Lab.Med.(2002)22(2)：447-474.)，检查抗-Sm，检查抗磷脂抗体如抗心磷脂抗体(Gezer，S.Dis.Mon.2003.49(12)：696-741)，或梅毒假阳性检测(VDRL)。

其它检测可包括补体试验(C3、C4、CH50、CH100)，可用其测量血液中循环的补体蛋白的含量(Manzi等，Lupus 2004.13(5)：298-303)；可利用沉降速率(ESR)或C-反应性蛋白(CRP)测量炎症水平，可利用尿分析检测肾问题，可利用X线照片检测肺损伤，可利用EKG检测心脏问题。

慢性SLE与病变器官(特别是肾)累积的附带损伤有关联。因此，需要早期，即在(例如)肾衰竭之前进行治疗介入。SLE的可用治疗类似于类风湿性关节炎的可用治疗。它们包括利用止痛剂或非甾体抗炎(NSAID)化合物进行初步治疗。随着疾病进展和/或症状严重程度的提高，通过施用类固醇，例如但不限于***和氯***来治疗SLE。

在大多数严重病例中，可施用化疗药，例如但不限于甲氨喋呤或赛多辛(cytoxin)以缓解SLE的症状。然而，如果患者是育龄女性则不优选这种方法。在这种情况下，优选不干扰患者生殖能力的治疗方法。

在某些情况下，可通过施用生物制剂，如抗体或受体(或受体类似物)来治疗SLE。这类治疗性抗体的例子是利妥昔和英利昔(Remicade)。可用来治疗SLE的炎性细胞因子的可溶性受体的说明性例子是依坦西普(Enbrel)。

在本发明方法的某些实施方案中，可以在利用上述任何方法治疗SLE之前、同时或之后，用抗CD 19抗体治疗患者。而且，本发明抗CD 19抗体可与任何上述止痛剂、NSAID、类固醇或化疗药联用，以及与治疗SLE的生物制剂联用。

【6.20.3.***性硬化病(硬皮病)和相关疾病】

***性硬化病也称为硬皮病，包括一大类疾病，包括但不限于：限制性皮肤病、弥散性皮肤病、无皮肤硬化的硬皮病、未分化***病、重叠综合征、局限性硬皮病、硬斑病、线形硬皮病、类军刀伤(En coup de saber)、布施克成人硬化病、苔癣性粘液水肿、慢性移植物抗宿主病、嗜酸细胞性筋膜炎、糖尿病的指状硬化(Digital sclerosis)以及原发性淀粉样变和与多发性骨髓瘤相关的淀粉样变。(综述参见：Harrison的《内科学原理》(Principles of Internal Medicine)，第16版/Dennis L.Kasper等编，MH公司(The McGraw-Hill CompaniesInc.)2005，纽约州纽约)。

与硬皮病有关的临床特征可包括：雷氏现象、皮肤增厚、皮下钙质沉着症、毛细管扩张、关节痛/关节炎、肌病、食道运动功能障碍、肺纤维化、单纯性肺动脉高压、充血性心力衰竭和肾危象。患者出现一种或多种这些疾病表现的程度可影响诊断和可能的治疗计划。

自身抗体包括：抗拓扑异构酶1抗体、抗着丝粒抗体、抗-RNA聚合酶I、II和/或III抗体、抗-Th RNP抗体、抗-U、RNP抗体(抗纤维蛋白抗体)、抗PM/Sci抗体、抗-核抗体(ANA)。

可根据临床病史和身体检查鉴定需要治疗硬皮病的患者和患者群体。可通过检查患者病史、身体症状和/或实验室检测结果鉴定需要治疗硬皮病的患者或患者群体。在没有出现明显皮肤增厚的患者中，诊断可能被延迟。可利用实验室、X射线、肺功能检查以及皮肤或肾活检确定内部器官病变的程度和严重性。

在疾病发病的前几个月或前几年，硬皮病可能类似于许多其它***病，例如但不限于：***性红斑狼疮、多肌炎和类风湿性关节炎。

***性硬化病(硬皮病)的最经典的症状是指端硬化。最初的症状包括手肿胀，有时发展成尖圆形和爪状变形。不是所有硬皮病患者都会发展到此种皮肤硬化程度。其它症状可包括硬斑病、线性指端硬化(手指硬化)、雷氏综合征(Raynaud′s syndrome)、钙质沉着症和毛细管扩张。

可利用血液检查如抗核抗体(ANA)检查来诊断局限性和***性硬皮病。例如，抗着丝粒抗体(ACA)和抗ScI-70抗体表明患者需要治疗***性硬化病(Ho等，2003，Arthritis Res Ther.5：80-93)；抗拓扑异构酶IIa抗体表明患者需要治疗局部硬皮病；抗拓扑异构酶Iα抗体则表明患者需要治疗***性硬皮病。几种硬皮病的类型及诊断这些类型的方法是本领域了解和公知的，包括但不限于：青少年硬皮病(Foeldvari，Curr Opin Rheumatol 14：699-703(2002)；Cefle等，Int JClin Pract.58：635-638(2004))；局限性硬皮病；结节性硬皮病(Cannick，J Rheumatol.30：2500-2502(2003))；和***性硬皮病，包括但不限于：钙质沉着症、雷氏综合征(Raynaud′s)、食道(Esophagus)、指端硬化和毛细管扩张(CRE T)、限制性***性硬皮病和弥散性***性硬皮病。***性硬皮病也称为***性硬化病(SSc)。也称为进行性***性硬化病(PSSc)或家族性进行性***性硬化病(FPSSc)(Nadashkevich等，Med Sci Monit.10：CR615-621(2004)；Frances等，Rev Prat.52：1884-90(2002))。***性硬化病是多***疾病，特征是存在***硬化、与小动脉和微循环有关的血管异常以及自身免疫改变。

称为CREST的***性硬皮病类型没有任何皮肤紧缩的特征。CREST的特征是：钙质沉着(钙沉积)，通常发生于手指；雷氏现象；丧失食道的肌肉控制，可能引起吞咽困难；指端硬化，手指骨头的尖圆形变形；和毛细管扩张，手指、面部或口腔内皮肤上的小红点。通常，出现两种上述症状就足以作出CREST的诊断。CREST可能单独发生，或者与任何其它形式的硬皮病或其它自身免疫病一同发生。

限制性硬皮病的特征是仅限于手指的皮肤紧缩，以及压凹性指状溃疡(雷氏现象的继发性症状)和/或肺纤维化。限制性硬皮病中，面部和颈部的皮肤也可能病变。

出现近端皮肤紧缩时，即可作出弥散性硬皮病的诊断。近端指最接近参考点的位置。近端紧缩皮肤可以是手腕以上或肘部以上的皮肤紧缩。通常，只有肘部和腕部之间的皮肤紧缩的患者将被诊断为弥散性或限制性***性硬皮病，这取决于诊断的临床医生所适用的近端的含义。

目前，硬皮病治疗包括在施用6-甲氧基补骨脂素后进行体外光泳和自体干细胞移植。

目前，硬皮病的治疗包括施用以下药物：青霉胺、秋水仙素、干扰素α、干扰素γ、苯丁酸氮芥、环孢霉素、5-氟尿嘧啶、环磷酰胺、米诺环素、沙利度胺、依那西普或甲氨喋呤。

在本发明方法的某些实施方案中，可以在利用上述任何治疗治疗自身免疫性糖尿病之前、同时或之后，用抗CD 19抗体治疗患者。而且，本发明抗CD 19抗体可与上述任何药物联用。

【6.21.免疫治疗方案】

在本文中称为“抗CD 19免疫治疗”的治疗方案/方法中所用的抗CD 19抗体组合物可以是裸露的抗体、免疫偶联物和/或融合蛋白。本发明组合物可用作单一药物治疗或与其它治疗剂或方案联用。可以在施用一种或多种治疗剂之前、同时或之后施用抗CD 19抗体或免疫偶联物。可与本发明组合物在联合治疗的治疗剂包括能抑制或防止细胞功能和/或引起细胞破坏的任何物质。例子包括但不限于：放射性同位素、化疗药和毒素，如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段。

可利用表达人CD 19抗原而不是天然CD 19抗原的转基因动物模型来检测本文所述治疗方案或任何所需治疗方案的功效。因此，可在施用于人之前，在动物模型中检测抗CD 19抗体治疗方案以确定功效。

可实施抗CD 19抗体、组合物和方法，以治疗B细胞疾病，包括B细胞恶性肿瘤。术语“B细胞恶性肿瘤”包括衍生自B细胞谱系细胞的任何恶性肿瘤。示范性B细胞恶性肿瘤包括但不限于：B细胞亚型非霍奇金淋巴瘤(NHL)，包括低级/滤泡性NHL，小淋巴细胞性(SL)NHL，中级/滤泡性NHL，中级弥散性NHL，高级免疫巴瘤和巨大疾病NHL；伯基特淋巴瘤；多发性骨髓瘤；前B急性淋巴细胞性白血病和早期B细胞前体产生的其它恶性肿瘤；普通急性淋巴细胞性白血病(ALL)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，包括免疫球蛋白-突变的CLL和免疫球蛋白-未突变的CLL；多毛细胞白血病；非急性淋巴细胞性白血病；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，包括生发中心B细胞样(GCB)DLBCL，活化的B细胞样 (ABC)DLBCL和3型DLBCL；前淋巴细胞白血病；轻链疾病；浆细胞瘤；骨硬化性骨髓瘤；浆细胞白血病；意义未明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)；郁积型多发性骨髓瘤(SMM)；无痛性多发性骨髓瘤((IMM)；霍奇金淋巴瘤，包括经典和结节状淋巴细胞优势型；淋巴浆细胞增多型淋巴瘤(LPL)；以及边缘区淋巴瘤，包括胃粘膜-结合性淋巴组织(MALT)淋巴瘤。

在另一个实施方案中，可利用本发明治疗成熟B细胞恶性肿瘤(即，在细胞表面上表达Ig)，所述恶性肿瘤包括但不限于：滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、多发性骨髓瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，包括生发中心B细胞样(GCB)DLBCL，活化的B细胞样(ABC)DLBCL和3型DLBCL，霍奇金淋巴瘤，包括经典和结节状淋巴细胞优势型，淋巴浆细胞增多性淋巴瘤(LPL)，边缘区淋巴瘤，包括胃粘膜结合性淋巴组织(MATL)淋巴瘤以及慢性淋巴细胞性白血病(CLL)包括免疫球蛋白突变的CLL和免疫球蛋白未突变的CLL。

在其它具体实施方案中，可实施本发明以治疗节外肿瘤。

【6.22.抗CD 19免疫治疗】

按照本发明，“抗CD 19免疫治疗”包括按照本文所述的任何治疗方案施用本发明抗CD 19抗体。施用的抗CD 19抗体可以是裸露抗体、免疫偶联物或融合蛋白。

抗CD 19免疫治疗包括以单一药物的形式施用抗CD 19抗体，以治疗B细胞恶性肿瘤。抗CD 19免疫治疗包括治疗B细胞恶性肿瘤产生的早期疾病的方法。抗CD 19免疫治疗包括治疗B细胞恶性肿瘤的方法，其中抗CD 19抗体介导ADCC。抗CD 19免疫治疗包括治疗B细胞恶性肿瘤的方法，其中在患者接受任何恶性肿瘤治疗之前施用抗 CD 19抗体，所述治疗是化疗、放射化学治疗或手术治疗。

在一个实施方案中，可通过施用能够介导人ADCC的人或人源化抗体治疗患有B细胞恶性肿瘤的人受治疗者。在早期疾病或单一药物治疗的情况下，可介导ADCC的任何抗CD 19抗体均可用于人受治疗者(包括鼠和嵌合抗体)；然而，可能优选人和人源化抗体。

在某些情况下，优选用IgG1或IgG3人同种型的抗体治疗。然而，也可使用IgG2或IgG4人同种型，只要它们具有相关效应功能，如人ADCC。可通过测定所研究抗体通过效应细胞在体外或体内介导靶细胞裂解的能力来评估这类效应功能。

在一个实施方案中，所用抗体的剂量应足以消耗循环B细胞。可通过分析血液样品监测该治疗的进程。也可利用其它临床改善迹象监测治疗。

可与本发明的组合物和方法联用的测定B细胞消耗的方法是本领域众所周知的，包括但不限于以下实施方案。在一个实施方案中，可通过流式细胞术，利用除抗CD 19抗体以外结合B细胞以确定B细胞量的试剂来测定循环B细胞的消耗。在其它实施方案中，可利用标准血清分析监测血液B细胞水平。在这种实施方案中，通过确定已知由B细胞产生的抗体量，间接测定B细胞消耗。然后监测抗体水平，以确定B细胞的消耗和/或功能性消耗。在另一个实施方案中，可通过免疫化学染色鉴定B细胞来测定B细胞的消耗。在这类实施方案中，将由患者提取的B细胞或包含B细胞的组织或血清置于显微镜载玻片上，进行标记并检测是否存在。在相关实施方案中，比较治疗前和治疗后提取的B细胞，以确定B细胞的存在的差异。

可检测肿瘤负荷，并与本发明的组合物和方法联合使用。本领域已知测定肿瘤负荷的方法，包括但不限于以下实施方案。在某些实施方案中，可利用PET扫描测定代谢活性，并鉴定活性较高(表明有肿瘤)的区域。还可利用CT扫描和MRI检测软组织中肿瘤的存在和大小。在其它实施方案中，可利用骨扫描测定肿瘤体积和位置。在其它实施方案中，可利用多普勒技术(如超声波)检测流入和流出肿瘤的血液，从而测定肿瘤负荷。在这类实施方案中，可通过血流随时间的改变或与患者适当组织的正常血流的偏差估算肿瘤负荷。可以在实施本发明治疗方法之前或之后利用这种方法测定肿瘤负荷。

在本发明方法的某些实施方案中，在消耗B细胞和/或降低肿瘤负荷的同时维持ADCC功能。

在抗CD 19抗体作为单一药物治疗施用的本发明实施方案中，本发明考虑使用不同的治疗方案。

按照本发明某些方面，本发明的组合物和方法所用的抗CD 19抗体是裸露的抗体。在相关实施方案中，所用的裸露抗CD 19抗体剂量为至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20或20.5患者体重。在某些实施方案中，所用的裸露抗CD 19抗体的剂量为至少约1至10、5至15、10至20或15至25mg/kg患者体重。在某些实施方案中，所用的裸露抗CD 19抗体的剂量为至少约1至20、3至15或5至10mg/kg患者体重。在其它实施方案中，所用的裸露抗CD 19抗体的剂量为至少约5、6、7、8、9或10mg/kg患者体重。

在某些实施方案中，剂量包括每周施用约375mg/m²抗CD 19抗体，连续施用4-8周。在某些实施方案中，剂量是每周施用至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15mg/kg患者体重，连续施用4-8周。

可以如章节6.18.3所述，施用上述抗CD 19抗体的示范性剂量。在一个实施方案中，上述剂量是单次注射剂量。在其它实施方案中，可以在一段时间内施用多个剂量。在其它实施方案中，可以在一段时间内多次施用多个剂量。所述时间可以天、周或月计算。可以能够适合实现疗效、同时能平衡毒副作用的间隔施用多个剂量的抗CD 19抗体。例如，使用多个剂量时，可能优选调整时间间隔，以便在用抗体重复治疗之前恢复患者的单核细胞计数。此种施用方案能优化治疗效率，因为单核细胞群体反映出患者的ADCC功能。

在某些实施方案中，将本发明组合物施用人患者，只要该患者对治疗起反应。在其它实施方案中，将本发明组合物施用于患者，只要该患者的疾病不进展。在相关实施方案中，将本发明组合物施用于患者，直到患者的疾病不进展或已经在一段时间内不进展，然后不施用该患者本发明组合物，除非该疾病复发或重新开始进展。例如，用任何上述剂量治疗患者约4-8周，在此期间监测患者的疾病进展。如果疾病的发展停止或逆转，则不施用该患者本发明组合物，直到该患者复发，即所治疗的疾病复发或进展。发生复发或进展后，可以利用最初使用的相同施用方案或上述其它剂量再次治疗该患者。

在某些实施方案中，可将本发明组合物作为加载剂量施用，然后在一段时间内施用多个较低的剂量(维持剂量)。在这种实施方案中，可定期施用，调节剂量以维持有效的B细胞消耗。在某些实施方案中，加载剂量为约10、11、12、13、14、15、16、17或18mg/kg患者体重，维持剂量为至少约5-10mg/kg患者体重。在其它实施方案中，以每7、10、14或21天的间隔施用维持剂量。维持剂量可无限地持续下去，直到出现毒性，直到血小板计数降低，直到疾病不进展，直到患者出现免疫原性，或者直到疾病进展至终末期。在其它实施方案中，将本发明组合物施用人患者，直到疾病进展至终末期。

在本发明的一些实施方案中，治疗方案的一部分是监测患者的循环单核细胞水平，抗CD 19抗体剂量可间隔施用，以便使单核细胞计数得以恢复。例如，可以每8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天的间隔施用本发明组合物。

在本发明的一些实施方案中，抗CD 19抗体偶联于毒素或与毒素联用时，本领域技术人员应理解，可根据毒素剂量调整抗CD 19抗体的剂量，毒素剂量取决于所用毒素的具体类型。一般地，使用毒素时，抗CD 19抗体剂量小于裸露抗CD 19抗体所用的剂量。可利用本领域熟知技术确定特定毒素的合适剂量。例如，可进行剂量范围研究，以确定与毒素联用或偶联于毒素时抗CD 19抗体的最大耐受剂量。

在本发明实施方案中，抗CD 19抗体偶联于放疗剂或与放疗剂联用时，抗CD 19抗体的剂量取决于所用的放疗剂。在某些实施方案中，使用两步法。首先，施用人患者包含裸露抗CD 19抗体的组合物，约6、7、8、9或10天后，施用少量放疗剂。第二步，一旦测定到低剂量治疗的耐受、分布和清除，则施用患者一剂裸露的抗CD 19抗体，然后施用治疗量的放疗剂。这种治疗方案类似于所批准的用ZEVALIN^TM(铟标记的抗CD20mAb)(百集公司)或BEXXAR^TM(GSK库尔特制药公司(GSK，Coulter Pharmaceutical))治疗非霍奇金淋巴瘤的治疗方案。

【6.23.与化疗药联合用药】

抗CD 19免疫治疗(使用裸露抗体、免疫偶联物或融合蛋白)可与其它治疗联用，这些治疗包括但不限于：单独或组合的化疗、放射性免疫治疗(RIT)、化疗和外束放疗(联合治疗方案，CMT)或联合的放射性免疫治疗方案(CMRIT)等。在某些实施方案中，本发明抗CD 19抗体治疗可与(环磷酰胺-羟基多柔比星-安可平(长春新碱)-***龙)联用，CHOP是最常见的治疗非霍奇金淋巴瘤的化疗方案。本文所用术语“联合施用”指可以在采用其它治疗之前、期间或之后施用抗CD 19免疫治疗。

在某些实施方案中，抗CD 19免疫治疗与细胞毒性放射性核素或放射治疗性同位素联合施用。例如，同位素可以是α-发射性同位素，如²²⁵Ac、²²⁴Ac、²¹¹At、²¹²Bi、²¹³Bi、²¹²Pb、²²⁴Ra或²²³Ra。细胞毒性放射性核素也可以是β-发射性同位素，如¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁹⁰Y、¹³¹I、⁶⁷Cu、 ¹⁷⁷Lu、¹⁵³Sm、¹⁶⁶Ho或⁶⁴Cu。另外，细胞毒性放射性核素可能发射俄歇(Auger)电子和低能电子，包括同位素¹²⁵I、¹²³I或⁷⁷Br。在其它实施方案中，同位素可以是¹⁹⁸Au、³²P等。在某些实施方案中，施用于受治疗者的放射性核素的量为约0.001mCi/kg至约10mCi/kg。

在一些实施方案中，施用于受治疗者的放射性核素的量为约0.1mCi/kg至1.0mCi/kg。在其它实施方案中，施用于受治疗者的放射性核素的量为约0.005mCi/kg至0.1mCi/kg。

在某些实施方案中，抗CD 19免疫治疗与化学毒素或化疗药联合施用。化学毒素或化疗药可选自：烯二炔，如卡奇霉素和埃斯培拉霉素；多卡霉素(duocarmycin)、甲氨蝶呤、多柔比星、美法仑、苯丁酸氮芥、ARA-C、长春地辛、丝裂霉素C、顺铂、依托泊苷、博来霉素或5-氟尿嘧啶。

适合与抗CD 19免疫治疗联用的化学毒素或化疗药包括烯二炔分子亚类成员，如卡奇霉素和埃斯培拉霉素。化学毒素也可选自：多卡霉素(参见例如，美国专利No.5,703,080和美国专利No.4,923,990)、甲氨喋呤、多柔比星、美法仑、苯丁酸氮芥、ARA-C、长春地辛、丝裂霉素C、顺铂、依托泊苷、博来霉素或5-氟尿嘧啶。化疗药的例子也包括阿霉素、多柔比星、5-氟尿嘧啶、胞嘧啶阿糖胞苷(Ara-C)、环磷酰胺、硫替派、泰索帝(多西他赛)、白消安、赛多辛(Cytoxin)、紫杉醇、甲氨蝶呤、顺铂、美法仑、长春碱、博来霉素、依托泊苷、异环磷酰胺、丝裂霉素C、米托蒽醌、长春新碱、长春瑞滨、卡铂、替尼泊苷、道诺霉素、洋红霉素、氨蝶呤、放线菌素D、丝裂霉素、埃斯培拉霉素(参见美国专利No.4,675,187)、美法仑和其它相关氮芥。

在其它实施方案中，例如，“CVB”(1.5g/m²环磷酰胺，200-400mg/m²依托泊苷和150-200mg/m²卡莫司汀)可与本发明治疗联合使用。CVB是用于治疗非霍奇金淋巴瘤的方案。Patti等，Eur.J.Haematol.51：18(1993)。本领域技术人员了解其它合适的联合化疗方案。参见例如Freedman等，“Non-Hodgkin’s Lymphomas(非霍奇金淋巴瘤)”，CANCER MEDICINE(癌症医药)，第2卷，第3版，Holland等(编)，第2028-2068页(Lea和Febiger 1993)。例如，用于治疗中期非霍奇金淋巴瘤的第一代化疗方案包括C-MOPP(环磷酰胺、长春新碱、丙片巴肼和氯***)和CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和氯***)。有用的第二代化疗方案是m-BACOD(甲氨蝶呤、博来霉素、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、***和甲酰四氢叶酸)，而合适的第三代方案是MACOP-B(甲氨蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、氯泼尼松、博来霉素和甲酰四氢叶酸)。其它有用的药物包括丁酸苯酯和草苔虫内酯(brostatin)-1。在多模式治疗中，化疗药和细胞因子与本发明的抗体、免疫偶联物或融合蛋白共施用。细胞因子、化疗药和抗体、免疫偶联物或融合蛋白可以任何顺序施用，或一起施用。

可用于本发明组合物和方法的其它毒素包括有毒的凝集素、植物毒素如蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、蒴莲根毒素、肉毒杆菌毒素和白喉毒素。当然，还可将各种毒素的组合偶联于一个抗体分子，从而获得可变的细胞毒性。适合用于本发明联合治疗的毒素的例子是蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗-病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素。参见例如，Pastan等，Cell，47：641(1986)，Goldenberg等，Cancer Journal for Clinicians，44：43(1994)。可以使用的酶活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自绿脓假单胞菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲菌素、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)蛋白(PAPI、PAPI和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制剂、白树毒素、米托洁林(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯族毒素(tricothecenes)。参见例如，1993年10月28日公开的WO 93/21232。

合适的毒素和化疗药参见REMINGTON′SPHARMACEUTICAL SCIENCES(雷明顿药物科学)，第19版(MackPublishing Co.1995)以及Goodman和Gilman的THEPHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS(治疗的药理学基础)，第7版(MacMillan Publishing Co.1985)。本领域技术人员了解其它合适的毒素和/或化疗药。

本发明的抗CD 19免疫治疗也可与前药激活酶联用，所述前药激活酶能将前药(如肽基化疗药，参见WO81/01145)转变为活性抗癌药。参见例如，WO88/07378和美国专利No.4,975,278。这种联合用药的酶组分包括能够作用于前药并使其转变为更具活性的细胞毒性形式的任何酶。本申请所用的术语“前药”指药学活性物质的前体或衍生物形式，与母体药物相比它对肿瘤细胞的毒性较低，且能够被酶激活或转变为更具活性的母体形式。参见例如，Wilman，“Prodrugs in CancerChemotherapy(癌症化疗中的前药)”，Biochemical SocietyTransactions(生化协会会刊)，14，第375-382页，第615届贝尔法斯特会议(1986)和Stella等，“Prodrugs：A Chemical Approach to TargetedDrug Delivery(前药：靶向药物递送的化学方法)”，Directed DrugDelivery(定向药物递送)，Borchardt等(编)，第247-267页，HumanaPress(1985)。可与抗CD 19抗体联用的前药包括但不限于：含磷酸的前药、含硫代磷酸的前药、含硫酸的前药、含肽前药、D-氨基酸修饰的前药、糖基化的前药、含α-内酰胺的前药、含任选取代的苯氧基乙酰胺的前药或含任选取代的苯基乙酰胺的前药、5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前药，它们可转变为更具活性的细胞毒性游离药物。可衍生为本发明所用前药形式的细胞毒性药物的例子包括但不限于上述化疗药。

在某些实施方案中，施用本发明的组合物和方法能推迟毒性治疗，并且可能帮助避免不必要的副作用和化疗相关并发症的风险并延迟化疗耐受性的发生。在某些实施方案中，在被施用本发明的组合物和方法的患者中，毒性治疗和/或毒性治疗耐受性被延迟最多约6个月，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年。

【6.24.与治疗性抗体联用】

本文所述的抗CD 19免疫治疗可与其它抗体联合施用，这些抗体包括但不限于：抗-CD 20mAb、抗-CD 52mAb、抗-CD 22抗体和抗-CD 20抗体，如RITUXAN^TM(C2B8；利妥昔单抗^TM；IDECPharmaceuticals)。可与本发明抗体联用或用于本发明组合物中的治疗性抗体的其它例子包括但不限于：赫赛汀^TM(曲妥珠单抗；Genentech)、麦罗塔(MYLOTARG)^TM(吉姆单抗奥佐米星；WyethPharmaceuticals)、坎帕斯(CAMPATH)^TM(阿仑单抗；Berlex)、ZEVALIN^TM(Ipritumomab tiuxetan；Biogen Idec)、BEXXAR^TM(托西莫单抗；GlaxoSmithKline Corixa)、艾比特斯(ERBITUX)^TM(西妥昔单抗；Imclone)和阿瓦斯丁(AVASTIN)^TM(贝伐单抗；Genentech)。

本文所述的抗CD 19免疫疗法可与Fc受体的特异性抗体联合施用，所述Fc受体选自FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIII和/或FcγRIV。在特定的实施方案中，本文所述的抗CD 19免疫治疗可与FcγRIIB的特异性抗体联合施用。适用于此种目的的抗-FcγRIIB抗体描述于美国专利申请公布No.2004185045、PCT公开No.WO05051999A、WO05018669和WO04016750。

在某些实施方案中，可任选用同一种药物组合物，以任何合适比例施用抗CD 19和抗CD20和/或抗CD22mAb和/或an抗CD52mAb。为了说明，抗CD 19和抗CD20抗体的比例可以是约1000∶1、500∶1、250∶1、100∶1、90∶1、80∶1、70∶1、60∶l、50∶1、40∶1、30∶1、20∶1、19∶1、18∶1、17∶1、16∶1、15∶1、14∶1、13∶1、12∶1、11∶1、10∶1、9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶11、1∶12、1∶13、1∶14、1∶15、1∶16、1∶17、1∶18、1∶19、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80、1∶90.1∶100、1∶250、1∶500或1∶1000或更高。同样，抗CD 19和抗CD22抗体的比例可以是约1000∶1、500∶1、250∶1、100∶1、90∶1、80∶1、70∶1、60∶1、50∶1、40∶1、30∶1、20∶1、19∶1、18∶1、17∶1、16∶1、15∶1、14∶1、13∶1、12∶1、11∶1、10∶1、9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶11、1∶12、1∶13、1∶14、1∶15、1∶16、1∶17、1∶18、1∶19、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80、1∶90.1∶100、1∶250、1∶500或1∶1000或更高。相似地，抗CD 19和抗CD52抗体的比例可以是约1000∶1、500∶1、250∶1、100∶1、90∶1、80∶1、70∶1、60∶1、50∶1、40∶1、30∶1、20∶1、19∶1、18∶1、17∶1、16∶1、15∶1、14∶1、13∶1、12∶1、11∶1、10∶1、9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶11、1∶12、1∶13、1∶14、1∶15、1∶16、1∶17、1∶18、1∶19、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80、1∶90、1∶100、1∶250、1∶500或1∶1000或更高。

【6.25.增强单核细胞或巨噬细胞功能的化合物组合】

在本发明方法的某些实施方案中，增强单核细胞或巨噬细胞功能(如至少约25％、50％、75％、85％、90％、95％或更多)的化合物可与抗CD 19免疫治疗联用。本领域已知这类化合物，包括但不限于：细胞因子如白介素(如IL-12)和干扰素(如α或γ干扰素)。

增强单核细胞或巨噬细胞功能的化合物可与抗体、免疫偶联物或抗原结合片段配制在同一药物组合物中。分开施用时，抗体/片段和化合物可同时施用(在几个小时内)，可以在同一疗程过程中施用，或者可依次施用(即，患者首先接受一个疗程的抗体/片段治疗，然后接受一个疗程的增强巨噬细胞/单核细胞功能的化合物治疗，反之亦然)。在这种实施方案中，在用本发明的其它治疗方案和/或组合物治疗之前、同时或之后将增强巨噬细胞/单核细胞功能的化合物施用于人受治疗者。在一个实施方案中，人受治疗者的血液中白细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、和/或嗜碱性粒细胞计数属于人体正常范围。人白细胞(全部)的正常范围为约3.5-约10.5(10⁹/L)。人血嗜中性粒细胞的正常范围为约1.7-约7.0(10⁹/L)，单核细胞为约0.3-约0.9(10⁹/L)，淋巴细胞为约0.9-约2.9(10⁹/L)，嗜碱性粒细胞为约0-约0.3(10⁹/L)，嗜酸性粒细胞为约0.05-约0.5(10⁹/L)。在其它实施方案中，人受治疗者血液中的白细胞计数小于人体正常范围，例如至少约0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8(10⁹/L)个白细胞。

可利用本发明的抗体、免疫偶联物或抗体片段，或者用本领域已知的其它抗体实施本发明此种实施方案，该实施方案特别适合对抗CD22、抗CD52和/或抗CD20抗体治疗(例如，用现有抗体如C2B8治疗)产生耐受性的受治疗者、目前正在进行化疗或曾经接受过化疗的受治疗者、B细胞疾病复发的受治疗者、免疫削弱的受治疗者或者巨噬细胞或单核细胞功能受损的受治疗者。对治疗产生耐受性和B细胞疾病复发的患者的普遍存在至少部分归因于巨噬细胞或单核细胞功能受损。因此，本发明提供了与施用抗CD 19抗体和抗原结合片段的方法联用、增强ADCC和/或巨噬细胞和/或单核细胞功能的方法。

【6.26.与免疫调节剂联用】

本发明抗CD19免疫治疗也可与免疫调节剂联合使用。在此种方法中，可采用嵌合、人或人源化抗CD 19抗体。用于联合治疗的本文所用的术语“免疫调节剂”指用于抑制、遮蔽或增强宿主免疫***的物质。这将包括抑制细胞因子产生、下调或抑制自身抗原表达，或遮蔽MHC抗原的物质。这类药物的例子包括：2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(参见美国专利No.4,665,077)、硫唑嘌呤(或环磷酰胺，如果对硫唑嘌呤存在不良反应)；溴隐亭；戊二醛(遮蔽MHC抗原，如美国专利No.4,120,649所述)；MHC抗原和MHC片段的抗-独特型抗体；环孢菌素A；类固醇，如糖皮质类固醇，如氯***、甲泼尼龙和***；细胞因子或细胞因子受体拮抗剂，包括抗干扰素-β或-α抗体；抗-肿瘤坏死因子-α抗体；抗-肿瘤坏死因子-β抗体；抗-白介素-2抗体和抗-IL-2受体抗体；抗-L3T4抗体；异源抗-淋巴细胞球蛋白；泛T抗体，例如抗-CD3或抗-CD4/CD4a抗体；含有LFA-3结合域的可溶性肽(1990年7月26日公开的WO 90/08187)；链激酶；TGF-β；链道酶；来自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；脱氧精胍菌素；雷帕霉素；T-细胞受体(美国专利No.5,114,721)；T细胞受体片段(Offner等，Science 251：430-432(1991)；WO 90/11294；和WO 91/01133)；和T-细胞受体抗体(EP 340,109)如T10B9。细胞因子的例子包括但不限于：淋巴因子、单核因子和传统多肽激素。细胞因子包括：生长激素，如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和***(LH)；肝脏生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-α；苗勒管抑组合物；小鼠促性腺素-相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，如NGF-α；血小板-生长因子；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-α；***-I和-II；红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素；集落刺激因子(CSF)，如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞 -CgP(GM-CSP)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)，如IL-1、IL-1a、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15；肿瘤坏死因子，如TNF-α或TNF-β；以及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。如本文所用，术语细胞因子包括天然来源或重组细胞培养物来源的蛋白质，以及天然序列细胞因子的生物活性等同物。在某些实施方案中，该方法还包括向所述受治疗者施用一种或多种免疫调节剂，例如细胞因子。适合的细胞因子可选自白介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-12、IL-15、IL-18、G-CSF、GM-CSF、血小板生成素或γ干扰素。

这些免疫调节剂与抗CD 19抗体在同一时间或不同时间施用。优选的免疫调节剂将取决于许多因素，包括所治疗疾病的类型以及患者病史，但该药物常常可选自环孢菌素A、糖皮质类固醇(如氯***或甲泼尼龙)、OKT-3单克隆抗体、硫唑嘌呤、溴隐亭、异源抗-淋巴细胞球蛋白或其混合物。

【6.27.与其它治疗剂联用】

作用于肿瘤新生血管的药物也可与抗CD 19免疫治疗联用，这类药物包括微管结合剂，如考布他汀(combrestatin)A4(Griggs等，LancetOncol.2：82，(2001))和血管他丁和内皮他丁(综述参见Rosen，Oncologist 5：20(2000)，通过引用并入本文)。适合与抗CD 19抗体联用的免疫调节剂包括但不限于：α-干扰素、γ-干扰素和肿瘤坏死因子α(TNFα)。在某些实施方案中，与本发明的组合物和方法联合治疗使用的治疗剂是肽。

在某些实施方案中，抗CD 19免疫治疗与一种或多种卡奇霉素分子联用。卡奇霉素抗生素类能够在亚皮摩尔浓度导致双链DNA断裂。可以使用的卡奇霉素结构类似物包括但不限于：γ1^I、γ2^I、γ3^I、N-乙酰基-γ1^I、PSAG或011(Hinman等，Cancer Research53：3336-3342(1993)和Lode等，Cancer Research 58：2925-2928(1998))。

也可通过，例如重组技术或肽合成制备包含抗CD 19抗体和细胞毒剂的融合蛋白。

在再一个实施方案中，抗CD 19抗体可偶联于“受体”(如链霉亲和素)以便预先靶向肿瘤，其中将拮抗剂-受体偶联物施用于患者，然后用清除剂去除循环***中未结合的偶联物，接着施用与治疗剂(如放射性核苷酸)偶联的“配体”(如亲和素)。

在某些实施方案中，治疗方案包括减轻抗CD 19抗体组合物的细胞毒作用的化合物。这类化合物包括：镇痛药(如、对乙酰氨基酚)、二膦酸盐、抗组胺剂(如马来酸氯苯那敏)和类固醇(如***、类视黄醇、类三角醇(deltoids)、倍他米松、氢化可的松、可的松、氯***、去氢睾酮、糖皮质激素类、盐皮质激素、***、睾酮、孕激素)。

在某些实施方案中，与抗CD 19免疫治疗联用的治疗剂是小分子(即，分子量小于约2500道尔顿的无机物或有机物)。例如，可以从Specsand BioSpecs B.V.(Rijswijk，The Netherlands)、ChembridgeCorporation(San Diego，CA)、Comgenex USA Inc.(Princeton，NJ)和Maybridge Chemicals Ltd.(Cornwall PL34 OHW，UnitedKingdom)购得小分子文库。

在某些实施方案中，抗CD 19免疫治疗可与抗菌剂联合施用。抗菌剂的非限制性例子包括能抑制和/或减少细菌感染、抑制和/或减少细菌复制、或者抑制和/或减少细菌向其它细胞或受治疗者传播的蛋白质、多肽、肽、融合蛋白、抗体、核酸分子、有机分子、无机分子和小分子。抗菌剂的具体例子包括但不限于：抗生素，如青霉素、头孢菌素、亚胺培南、奥曲南(axtreonam)、去甲万古霉素、环丝氨酸、杆菌肽、氯霉素、红霉素、克林霉素、四环素、链霉素、妥布拉霉素、庆大霉素、阿米卡星、卡那霉素、新霉素、大观霉素、甲氧苄啶、诺氟沙星、利福平、多粘菌素、两性霉素B、制霉菌素、酮康唑、异烟肼、甲硝唑和喷他脒。

在某些实施方案中，抗CD 19免疫治疗可与抗真菌剂联合施用。抗真菌剂的具体例子包括但不限于：唑类药物(如咪康唑、酮康唑

乙酸卡泊芬净

咪唑、***类化合物(如氟康唑

和伊曲康唑 )、多烯(如制霉菌素、两性霉素

两性霉素B脂质复合物(“ABLC”)

两性霉素B液体分散体(“ABCD”)

脂质体两性霉素B

碘化钾(KI)、嘧啶(如氟胞嘧啶

和伏立康唑

施用抗菌剂和抗真菌剂可减轻感染性疾病的影响或恶化，这在本发明方法中患者的B细胞被明显消耗时可能发生。

在本发明的某些实施方案中，抗CD 19免疫治疗可与一种或多种上述药物联合施用，以减轻施用本发明组合物可能伴有的毒副作用。在其它实施方案中，抗CD 19免疫治疗可与本领域熟知能减轻抗体施用、化疗、毒素或药物的副作用的一种或多种药物联合施用。

在本发明的某些实施方案中，施用抗CD19免疫治疗治疗多发性骨髓瘤时，本发明组合物可与高剂量化疗联合给药或用于包含高剂量化疗的治疗方案，所述化疗是，例如，美法仑、美法仑/氯***(MP)、长春新碱/多柔比星/***(VAD)、脂质体多柔比星/长春新碱、***(DVd)、环磷酰胺、依托泊苷/***/阿糖胞昔、顺铂(EDAP)、干细胞移植物(如自体干细胞移植或同种异体干细胞移植和/或小-同种异体(非骨髓消融性)干细胞移植)、放疗、类固醇(如皮质类固醇、***、沙利度胺/***、氯***、美法仑/氯***)、支持性治疗(如二膦酸盐、生长因子、抗生素、静脉内免疫球蛋白、低剂量放疗和/或矫形介入)、THALOMID^TM(沙利度胺，塞尔基因公司(Celgene))和/或VELCADE^TM(硼替佐米，Millennium)。

在抗CD 19免疫治疗与其它抗体和/或药物联合施用的本发明的实施方案中，其它抗体和/或药物可以相对于本发明抗体施用的任何顺序施用。例如，可以在施用于人受治疗者抗CD 19抗体或免疫偶联物之前、同时和/或之后施用其它抗体。其它抗体可与本发明抗体配制在同一药物组合物中，和/或配制在不同药物组合物中。按照本申请提供的和本领域熟知的关于任何剂量和施用方式的教导，本发明抗体的剂量和施用方式以及其它抗体的剂量和施用方式可能相同或不同。

【6.28.药盒】

本发明提供包含一个或多个容器的药物包装或药盒，所述容器中装有本发明组合物，用于预防、治疗、控制或改善B细胞恶性肿瘤或者B细胞恶性肿瘤导致的或导致B细胞恶性肿瘤的一种或多种症状。

在一个实施方案中，填充有本发明液体制剂的容器是预填充注射器。本领域技术人员已知的任何预填充注射器可与本发明的液体制剂联用。可使用的预填充注射器描述于，例如但不限于，PCT公布WO05032627、WO08094984、WO9945985、WO03077976、美国专利US6792743、US5607400、US5893842、US7081107、US7041087、US5989227、US6807797、US6142976、US5899889、美国专利公布US20070161961A1、US20050075611A1、US20070092487A1、US20040267194A1、US20060129108A1。预填充注射器可由多种材料制成。在一个实施方按照，预填充注射器是玻璃注射器。在另一个实施方案中，预填充注射器是塑料注射器。本领域技术人员理解，用于制造注射器的材料性质和/或质量可能影响注射器中储存的蛋白制剂的稳定性。例如，应理解沉积在注射器室表面内的硅酮基润滑剂可能影响蛋白制剂中的颗粒形成。在一个实施方案中，预填充注射器包含硅酮基润滑剂。在一个实施方案中，预填充注射器包括在硅酮上烘烤。在另一个实施方案中，预填充注射器不含硅酮基润滑剂。本领域技术人员还理解，少量污染元素从注射器筒、注射器尖头帽、塞子或柱塞浸出到制剂中也可能影响制剂稳定性。例如，应理解制造过程中引入的钨可能不利地影响制剂稳定性。在一个实施方案中，预填充注射器包含钨的水平可高于500ppb。在另一个实施方案中，预填充注射器是低钨注射器。在另一个实施方案中，预填充注射器包含钨的水平可为约500ppb至约10ppb、约400ppb至约10ppb、约300ppb至约10ppb、约200ppb至约10ppb、约100ppb至约10ppb、约50ppb至约10ppb、约25ppb至约10ppb。在另一个实施方案中，注射器可以是无钨注射器。在另一个实施方案中，注射器是无钨“ultra-100”注射器。在另一个实施方案中，注射器是Clearject^TM(Geresheimer，AG，Germany)或InJentle^TM(SCHOTT Pharmaceutical Packaging， Germany)注射器。

本发明提供了可用于上述方法的药盒。在一个实施方案中，药盒中所装的一个或多个容器中包含本发明组合物。在另一个实施方案中，药盒中所装的一个或多个容器中包含本发明组合物，以及一种或多种其它预防剂或治疗剂，用于预防、治疗、控制或改善B细胞恶性肿瘤或者B细胞恶性肿瘤导致的或导致B细胞恶性肿瘤的一种或多种症状。该药盒还可包括有关预防、治疗、控制或改善B细胞恶性肿瘤，以及副作用和施用方法剂量信息的说明书。所述容器可以任选粘附有政府机构颁发的管理药品或生物制品的生产、使用或销售的告知书，该告知书反映出生产、使用或销售管理机构批准其用于人体。

【7.实施例】

现在参考下面实施例对本发明进行描述。这些实施例仅为举例说明的目的而提供，并且本发明决不应该被理解为限于这些实施例，而应理解为包括任何和所有变更，这些变更作为本文所提供的教义的结果变得显而易见。

【7.1.制剂开发】

下面部分描述了包含抗-人CD 19抗体的制剂的开发。除另有说明之外，使用16C4抗-人CD 19抗体产生本文提供的实验结果，所述抗-人CD 19抗体包含具有SEQ ID NO：104的氨基酸序列的重链可变区、具有SEQ ID NO：111的氨基酸序列的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不结合于所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖(参见，于2007年9月7日提交的美国专利申请11/852,106，其公开内容为了所有目的整体并入本文)。

【7.1.1.人源化抗CD 19抗体的构造、表达和结合特征】

人源化无岩藻糖化抗CD 19抗体、例如16C4-aFuc(也称为551抗体)的构造、表达和结合特征描述于2007年9月7日提交的美国专利申请No.11/852,106中。

【7.1.2.实验方法】

可以按照本文描述的标准工业规模方案产生纯化的抗-人CD 19抗体。可由280nm的光密度测量评估蛋白质浓度。

利用Planova 20N滤器纳米过滤纯化的抗-人CD 19抗体以去除颗粒物质。使用切线流过滤(TFF)制备抗-人CD 19抗体制剂。在MilliporeLabscale TFF装置上将纳米过滤的抗-人CD 19抗体浓缩到大约25mg/ml。然后将抗-人ICOS抗体5×渗滤到适当缓冲液(例如，10mM组氨酸-HCL(pH 6.0)，75mM NaCl)中。完成缓冲液交换后，将抗体浓缩到大约150mg/ml。通过用适当的浓缩储备液掺加浓缩抗体制品来引入赋形剂。例如，通过向每100ml浓缩抗体制品加入11ml的10mM组氨酸-HCl、75mM NaCl、40％海藻糖(pH 6.0)来实现终浓度4％的海藻糖。可以用连续步骤引入多种赋形剂。例如，在通过用含海藻糖的抗体制品稀释10mM组氨酸-HCl(pH 6.0)、75mM NaCl、4％海藻糖、2％聚山梨醇酯80储备液100倍而加入海藻糖后，引入终浓度0.02％的聚山梨醇酯80。用最终制剂缓冲液(例如10mM组氨酸-HCl(pH 6.0)、75mM NaCl、4％海藻糖)调整最终抗体浓度为100±5mg/ml。

以下部分描述可用于表征液体抗体制剂、例如在无菌水溶液中包含10mM组氨酸(pH 6.0)中的10mg/ml抗CD 19抗体、75mM NaCl、4％海藻糖的制剂的方法。

制剂稳定性通过分析储存长时间段的单剂量等份试样的物理特性来测定。一些等份试样在推荐用于临床储存的温度(5℃)下储存。其它等份试样在高温(25℃或40℃)下储存以模拟超长期储存的影响。测试等份试样可贮存于小瓶(例如，玻璃或塑料小瓶)、注射器或任何其它适宜的容器中。测试等份试样也可经受应激条件，例如但不限于振摇、冻融。可影响制剂稳定性的其它储存条件包括但不限于光强度、光波长、湿度、小瓶组成和柱塞组成。这些参数对制剂稳定性的作用也可利用本文所述方法确定。

反相高效液相色谱(RP-HPLC)也用于确定制剂中抗体片段的量。RP-HPLC利用Agilent 1100系列高效液相色谱(HPLC)***来进行。在Michrom Bioresources的PLRP-S(8μm，4000A，2.0×150mm)柱上分析样品。蛋白洗脱谱通过追踪洗出液在280nm的光密度来确定。数据分析可利用ChemStation(Agilent)自动整合参数进行。

【7.1.2.1.尺寸排阻色谱(SEC)】

可进行尺寸排阻色谱以分析抗体制剂中抗体聚集体和片段的存在。将测试样品注入到高分辨率尺寸排阻柱(如，G3000SW_XL 5μm， 7.8×300mm，Toso Haas)上。流动相是0.1M磷酸二钠、0.1M硫酸钠和0.05％叠氮化钠(pH 6.7)，以0.25-1.0mL/min的流速等梯度运行。洗脱的蛋白可通过在280nm的UV吸光度来检测，并被收集以用于进一步表征。所检测的任何蛋白物种的相对量被报告为产物峰与排除最初排除的体积峰的所有其它检测峰的总面积相比的面积百分比。比抗体单体峰早洗脱的峰以聚集体百分位记录，而比抗体单体峰晚洗脱但比缓冲液峰早洗脱的峰以片段百分位记录。单独峰的流体动力学半径和分子量可用偶联的多角度光散射检测器获得。

可使用SEC来监测储存长时间段的制剂中的抗体聚集体形成和抗体片段化(例如在9个月内进行的多次测量)。制剂可在不同温度范围(如，2-8℃、20-24℃和38-42℃)储存。高于所建议的临床储存温度(2-8℃)的温度范围用于应激制剂，目的是模拟储存超过9个月的影响。预计片段和聚集体的比例随时间增加；这种增加可能在高温时加速。片段化和聚集速率在每个温度范围中恒定的发现将显示，更高的储存温度准确模拟加速的时标。

还可确定片段化/聚集的估计速率的对数(log(速率))。log(速率)显示与储存温度倒数(1/T(K^-1)的线性依赖的发现将允许研究者预测制剂在任何温度下聚集/片段化的速率，或更重要地，在给定温度下任何时间的制剂特征。

在对应聚集体和片段的色谱峰不能彼此或与单体峰(如，在低的聚集体/片段的相对水平)充分区分的情况下，SEC不能用作片段化/聚集的准确量度。

可选地，SEC可如下使用Agilent 1100Series高效液相色谱法 (HPLC)***来进行。将样品稀释至10mg/ml。将含有250μg蛋白的25μl经稀释的样品注射到TSK-GeI 3000柱(大小7.8mm×30.0cm.；Tosoh Biosciences Corporation)上。蛋白质洗脱谱依据洗脱物在280nm的光密度来测定。数据分析可使用ChemStation(Agilent)自动整合参数来进行。

【7.1.2.2.分析超离心】

分析超离心(AUC)也可用于表征抗体制剂中抗体聚集体和片段的存在。AUC是确定大分子在液体样品中的沉降系数(在Svedberg，S中报道)的正交技术。类似SEC，AUC能够分离和检测抗体片段/聚集体与单体，进一步能够提供关于分子质量的信息。与SEC相比，AUC消除了由于固相相互作用而损失聚集体的可能性，能够更好地分辨给定大分子的不同种类。

沉降速度实验可利用分析超离心进行，例如，Beckman OptimaXL-A。用参考缓冲液(如，20mM柠檬酸、100mM NaCl、1.5％甘露醇、50μM二乙撑三胺五乙酸、0.02％聚山梨醇酯80、pH 6.0)将测试样品稀释至抗体浓度为0.5mg/ml。将415μl稀释的抗体样品和412μl参考缓冲液分别装载到样品槽和参考槽中的12mm离心小室。将装载的细胞放置到AN-50Ti分析转子中，并平衡到25℃。在全真空下以42000rpm的转子转速在280nm扫描样品。收集对每一室进行的总共80次扫描用于分析。排除每种样品的首次扫描不进行下游数据处理以避免弯液面造成的假象。

利用Peter Shuck在N.I.H.开发的c(s)方法和执行c(s)的SEDFIT(8.8版)程序来分析数据。利用c(s)方法，将原始数据扫描直接拟合于S的Lamm函数以推出沉降系数的分布。用于拟合方案的参数是分辨率，400；置信区间，0.75；网格大小，1000；微分比容，0.7245；缓冲液密度，1.000；和缓冲液粘度，0.1002。设定摩擦比、弯液面和底位置设置为拟合参数。还拟合了时间非依赖性噪音。将检测到的峰积分并归纳如下：0至6S，片段；6至9S，单体；9至20S，聚集体。

可使用AUC表征聚集和片段化相对水平低的抗体制剂。在超出 SEC峰的分辨能力的情况下，AUC可更好地分辨抗体片段和聚集体与单体物质。聚集体峰分子量的AUC估计值还可用作其组成的指标(如，二聚体vs.更高聚体)。

与SEC相比，AUC也能够更好地分辨给定大分子的不同种类。然而，首先必须确立适当的样品稀释率，因为AUC的信噪比取决于于样品中的抗体浓度。

【7.1.2.3.浊度测量：】

抗体制剂中的蛋白聚集还可通过浊度测量表征。浊度是溶液中的颗粒引起光散射的量度，因而可用作蛋白聚集或变性的通用指示。浊度升高可表明聚集水平升高或颗粒数目增加/大小增加。

浊度测量可用浊度计(如，2100AN或2100N，Hatch)按照制造商的说明进行。将大约3至4ml制剂样品转移到玻璃试管中，利用内嵌真空***脱气2分钟。然后在室温将脱气的样品放置到浊度计(如，2100AN或2100N，Hatch)样品室中用于分析。用稳定Formazin浊度标准品(Hatch)在40、200、1000和4000NTU(浊度分析单位)校准浊度计，并通过分析在3、6、18、30和60NTU的Formazin的对照悬液进行验证。

【7.1.2.4.颗粒计数】

按照制造商的说明，具体制剂中颗粒的数目和大小可利用颗粒计数器(如，Beckman Coulter Multisizer 3)确定。

【7.1.2.5.粘度概况】

抗体制剂的粘度可利用粘度计(如，装有ViscoLab活塞(0.3055″，1-20cP)的ViscoLab 4000粘度计***，来自Cambridge AppliedSystems)测量。使用前用适当标准品(如，来自Koehler InstrumentCompany，Inc.的S6S参考标准品)校准粘度计。将粘度计连接于水浴，平衡***到20℃。活塞利用S6S粘度参考标准品(8.530cP20.00℃)检查。活塞还利用RODI H2O(1.00cP20.0℃)检查。在每种不同溶液类型之间测量时，清洁活塞并用肥皂和水充分冲洗。随后将***冷却到≤2℃。***温度在2℃或低于2℃时，将样品装载到小室中，并使活塞浸入样品。将样品平衡到小室温度后，开始测量。以每7-10分钟1℃的增量将温度增至最终温度为≥25℃。在增加温度之前立即记录粘度结果。测量期间活塞保持运动以使重新平衡的需要最小。可使用流变计测量制剂的粘度。

【7.1.2.6.差示扫描量热法】

差示扫描量热法(DSC)可用于确定具体制剂中抗体的热稳定性随时间的变化。按照制造商的说明，热熔温度(T_m)用差示扫描量热计(如，来自MicroCal，LLC的VP-DSC)确定。在一个例子中，VP-DSC以1.0℃/min的扫描速度和25-120℃的温度范围使用。使用8秒的滤过期和5分钟预扫描的恒温。通过利用Pierce透析杯透析到25mM组氨酸-HCl(pH 6)来准备样品(3.5kD)。平均Mab浓度由A₂₈₀确定为500μg/mL。按照制造商的说明，熔解温度利用随***提供的软件确定。

【7.1.2.7.液相色谱法质谱法(LC-MS)】

液相色谱法质谱法(LC-MS)可用于表征抗体制剂中由SEC或AUC检测到的降解片段。

收集含降解片段的峰SEC柱级分并用N-糖苷酶F(也称为PNGaseF)在37℃消化过夜。PNGase F是用于使蛋白样品脱糖基化的酰胺酶。该酶在N-连接糖蛋白的高甘露糖、杂合和符合寡糖最内侧的GlcNAc与天冬酰胺残基之间进行切割。将脱糖基化的样品与还原缓冲液(如，2.5mg/mL DTT、6.0M盐酸胍、pH 8.2)混合并在水浴中保持在56℃达60分钟。然后向样品加入纯的4-乙烯基吡啶(如，Aldrich Chem.Co.，WI)，在室温保持反应混合物30分钟。立即将脱糖基化、还原和烷基化的样品装载到反相柱上以分离修饰的样品与反应物。

脱糖基化、还原和烷基化的样品利用带有二元梯度HPLC***(Agilent 1100)的反相柱(如，Jupiter 5μm C4，

250×2.00mm，Phenomenex)分级。流动相A由含0.1％三氟乙酸的30％乙腈水溶液组成，流动相B由含0.1％三氟乙酸的50％乙腈水溶液组成。利用30-50％线性梯度的乙腈水溶液经16min分离样品，流速为约200μL/min。将柱流出液导向UV探测器，然后1∶1分开，一半通过离子阱质谱仪(如，LTQ，ThermoElectro，San Jose，CA)上的切换阀，剩余的一半弃去。

离子阱质谱仪在实验运行前利用咖啡因、L-甲硫氨酰基-精氨酰基-苯丙氨酰基-丙氨酸(SEQ ID NO：239)乙酸盐H₂O和Ultramark 162的混合物校准。以阳性ESI完全扫描模式获取电喷射电离质谱法(ESI-MS)数据。BioWork重叠合法程序(ThermoFinnigan)可用于重构质谱并从肽/蛋白质的原始质谱获得其分子质量。随后质量数据用于确定降解片段的身份。

【7.1.2.8.结合亲和性表征】

长期储存(如，在40℃储存1个月或在5℃储存6个月)后从制剂回收的单克隆抗体的结合亲和性可通过任何本领域已知的测定(例如但不限于ELISA测定、流式细胞术测定)来确定。抗体的功能性质也可使用体外和体内测定(例如，ADCC测定，体内消耗测定)来分析。适用抗CD 19抗体的功能表征的测定以于2007年9月7日提交的美国专利申请No.11/852,106提供。

【7.1.3.制剂开发】

551抗体的物理化学特性如下表征。551抗体的DSC谱图如上所述确定。DSC测量在0.25mM抗体浓度的20mM组氨酸(pH 6.0)缓冲液中进行。551抗体的DSC谱示于图2中。

pH对551抗体稳定性的作用通过在不同pH测定作为温度函数的胶体稳定性(图3)和色氨酸荧光(图4)而确定。胶体稳定性数据表明，551可在pH 4-5最稳定。在所测试的范围内，pH 7时551最胶体不稳定。

评价551在不同温度的胶体去稳定化速率以选择高通量赋形剂筛选的最佳温度。通过测量作为时间函数的551制剂在不同温度下的浊度(A350nm)评价胶体去稳定化速率。实验结果的代表性样品示于图5。基于这些结果，选择68℃作为高通量赋形剂筛选的温度。

高通量筛选用于鉴定具有稳定551抗体的潜力的赋形剂。基于551抗体的pH敏感性，选择亚稳的对照缓冲液(20mM组氨酸，pH 7.0) 用于筛选。通过比较551在对照缓冲液中的胶体稳定性与胶体稳定性在含有单独的或组合的其它赋形剂的缓冲液中的551，来筛选赋形剂。胶体稳定性变化后，评价各种测试制剂的胶体去稳定化速率。稳定赋形剂降低去稳定化速率，而去稳定赋形剂提高去稳定化速率。代表性结果示于图6中。去稳定化速率通过加入NaCl、赖氨酸、精氨酸或甘氨酸而降低，如由浊度曲线转换为不含盐或氨基酸的制剂的浊度曲线所示。来自高通量赋形剂筛选的其它样品示于图7-9。高通量筛选鉴定甘氨酸、精氨酸、赖氨酸、NaCl和海藻糖作为551抗体的稳定赋形剂。筛选也证明可用离子强度等于150mM NaCl的制剂实现最佳稳定化。进行其它实验以确定这些赋形剂的组合对551稳定性的作用(图9)。在所测试的组合中，当150mM NaCl与4％或8％海藻糖组合时观察到最显著的稳定作用。

基于高通量筛选的结果，选择6制剂用于40℃的实时加速稳定性研究：

A：20mM组氨酸，pH 6

B：20mM组氨酸，150mM甘氨酸，pH 6.0

C：20mM组氨酸，4％海藻糖，pH 6.0

D：20mM组氨酸，150mM NaCl，pH 6.0

E：20mM组氨酸，150mM NaCl，4％海藻糖，pH 6.0

F：20mM组氨酸、150mM ArgHCl，pH 6.0

每种制剂包含15mg/ml 551抗体。使用SEC评价抗体聚集和片段化。样品的实验结果示于图10-12。在所有测试制剂中观察到较高阶聚集体随时间具有少量增加。

进行其它实时稳定性研究以确认抗体浓度对抗体聚集的作用。将包含10mg/ml、20mg/ml、40mg/ml或60mg/ml 551和10mM组氨酸pH 6.0的制剂储存于5℃或40℃。通过SEC测定长期储存后的抗体聚集。样品的实验结果示于图13-16中。在5℃储存30天期间未观察到单体浓度变化。在40℃单体损失的速率随着增加的抗体浓度而增加。在40℃的二聚体形成比在5℃高，并且也随着增加的抗体浓度而增加。多聚体浓度在5℃经30天发生变化。多聚体形成速率在40℃随着较高抗体浓度而增加。在40℃的抗体片段化比在5℃高；片段化也随着增加的抗体浓度而增加。

进行其它短期研究以研究pH对551制剂稳定性的作用。在不同pH(图17和18)测量的DSC谱图显示除pH 7.5之外Tm没有pH依赖性变化。20mM组氨酸缓冲液中的0.25mg/ml蛋白浓度测定DSC谱图。涉及具有不同pH(pH 4.0-7.5)的制剂的聚集研究显示除pH 6.5之外的在所有pH中的多聚体形成。在5℃和40℃捕获在pH 6.5制剂中的多聚体形成。在其它研究中，pH 6.0也显示类似于pH 6.5的有关聚集和多聚体形成的效应。在pH 4和7.5观察到最高多聚体形成。使用包含在20mM组氨酸中的2.4mg/ml 551的制剂研究抗体聚集的pH依赖性。因此基于此，考虑下一组pH 6.0和pH 6.5研究以用于进一步评价。

在5℃、25℃和40℃进行包含10mg/mL 551抗体的7制剂的稳定性研究：

制剂1.10mM His，140mM NaCl，pH 6.0

制剂2.10mM His，75mM NaCl，4％海藻糖，pH 6.0

制剂3.10mM His，100mM NaCl，2％海藻糖、pH 6.0

制剂4.10mM His，9％海藻糖，pH 6.0

制剂5.10mM His，75mM NaCl，4％海藻糖，pH 6.5

制剂6.10mM His，140mM NaCl，9％海藻糖，pH 6.0

制剂7.10mM His，150mM LysHCl，4％海藻糖，pH 6.0

使用SEC随着时间推移记录单体、多聚体和总聚集体浓度。结果的实施例示于图19-21中。所有制剂显示类似的稳定性。在制剂4和5中观察两种最高的单体损失率。

在5℃、25℃和40℃进行包含10mM组氨酸、75mM NaCl、4％海藻糖、pH 6.0和10mg/ml或50mg/ml 551抗体的制剂的稳定性研究。使用SEC记录聚集和片段化。结果示于图22-24中。概述制剂中的聚集和片段化的表示于图25。

使用多个冻融循环使包含10mM组氨酸、75mM NaCl、4％海藻糖、pH 6.0和10mg/ml 551抗体的制剂经受剪切应激。填充有1.7ml制剂的Nunc 2.0mL冷冻低温保存瓶(Cryo vial)用于应激研究。使样品经受5个冻融循环(-80℃至25℃)，每个循环包括冷冻2小时，然后在室温2小时)。通过肉眼检查、SEC和在280nm和340nm的吸光度测量分析样品。原料含有若干多聚体；在研究过程中监控多聚体浓度。在冻融研究过程中未检测到视觉现象或多聚体水平的变化。结果概述于表3中。

表3.5个冻融循环后的聚集

通过振摇使包含10mM组氨酸、75mM NaCl、4％海藻糖、pH 6.0和10mg/ml 551抗体的制剂经受机械应激。研究还包括包含0.002％、0.01％和0.05％聚山梨醇酯80的制剂。含有1ml制剂的具有4432/50血清塞子的3ml小瓶用于机械应激研究。通过以速度设置1在涡旋器(VWR Mini Vortexer#945300)中振摇样品4小时使它们经受机械应激4小时。通过肉眼检查、SEC和在280nm和340nm的吸光度测量分析样品。原料含有若干多聚体；在研究过程中监控多聚体浓度。结果示于图26和27。在研究过程中未观察到视觉现象、二聚体水平、多聚体水平或回收率的变化。结果概述于表3中。不论存在聚山梨醇酯80与否，551均对小瓶中振摇引起的聚集不敏感。

通过在10ml terumo注射器中振摇使包含10mM组氨酸、75mMNaCl、4％海藻糖、pH 6.0和10mg/ml 551抗体的制剂经受机械应激。研究还包括包含0.002％、0.01％和0.05％聚山梨醇酯80的制剂。10mlterumo注射器填充有0.7ml制剂，总活塞延伸为7ml，留下7ml气隙。将样品在章动器上轻轻振摇24小时。在15分钟和6小时时肉眼检查样品中乳光或微粒的任何变化。振摇24小时后，通过肉眼检查、SEC和在280nm的吸光度测量分析样品。在注射器中以及转移至小瓶后均使制剂经受肉眼检查。结果示于图28中。不含聚山梨醇酯80的制剂在6小时时视觉上没有变化，但是在24小时结束时变成乳色。在包含少于0.01％聚山梨醇酯80的样品中观察到多聚体％的增加。在包含0.01％或更多的聚山梨醇酯80的样品中观察到多聚体％的变化。

在25℃和40℃进行包含10mg/ml 551抗体、10mM组氨酸、75mMNaCl、4％海藻糖、pH 6.0和0％或0.02％聚山梨醇酯80的制剂的稳定性研究。使用SEC记录聚集和多聚体形成。结果示于图29和30中。

【6.1.4.制剂稳定化发展】

制备具有在含有或不含0.02％(w/v)聚山梨醇酯80(PS-80)的制剂缓冲液(FB)：10mM组氨酸、75mM氯化钠、4％(w/v)二水合海藻糖(pH 6.0)中的不同的抗CD 19抗体551浓度(10、25、50和100mg/mL)的制剂。根据上述的方法制备制剂，储存于推荐的储存温度下，并且通过肉眼检查。如示于表4中，未在任何掺入PS-80的制剂(包括具有较高浓度的抗CD 19抗体的制剂)中观察到颗粒。然而，在不含PS-80的制剂中观察到颗粒。

表4.颗粒观察

551浓度(mg/ml)	含有0.02％PS-80	储存时间(月)	观察到颗粒
				10	否	13	是
10	是	13	否
				10	否	3	是
25	否	3	是
				25	是	3	否
50	否	3	是
				50	是	3	否
100	否	3	是
				100	是	3	否
10	否	9	是
				10	是	9	否

使用FlowCAM仪器和HIAC液体颗粒计数器进一步分析颗粒的数量和大小以确定颗粒的性质。Flow CAM数据和关于颗粒的HIAC数据的结果分别示于表5和6中。

表5.Flow CAM数据

表6.关于颗粒的HIAC数据

将10mg/ml 551抗体、10mM组氨酸、75mM NaCl、4％海藻糖、pH 6.0和0％或0.02％聚山梨醇酯80的制剂进一步进行分析。发现，经受冻融循环的样品在5×F/T后未显示纯度的变化。而且，在VI后未观察到微粒。使样品进一步经受小瓶中的振摇引起的聚集，其揭示不论存在聚山梨醇酯80与否，551均对振摇引起的聚集不敏感。在Terrumo注射器中振摇揭示AUC的变化，而未含PS-80的对照样品在24小时结束时变成乳色。在不含PS-80和PS-80＜0.01％的样品中观察到多聚体％的增加，而在PS-80＞0.01％的样品中未观察到变化。

【6.1.5.过滤研究】

进行过滤研究以评价过滤是否提高显微颗粒计数，而不影响其它质量属性。来自批量的样品小瓶用于此研究，所述批量呈示含有在10mM组氨酸、75mM氯化钠和4％(w/v)二水合海藻糖(pH 6.0)中的10mg/mL抗CD 19抗体551的制剂中的颗粒。将PS-80(2％储备液)加入到这些小瓶中以得到0.02％的最终浓度。然后使用0.22μm注射器PVDF或PEF过滤器在PS-80添加之前或之后过滤样品。进行测定(过滤前和过滤后)包括初始的A280蛋白浓度、高效尺寸排阻色谱法(HPSEC)、VI和HIAC测试。

在有限的粒度范围内，颗粒悬液经常呈示幂律大小分布(Kavanaugh等人，1980)，其中较大颗粒的数目(N)称为粒度(L)的幂(β) 函数。

dN/dL＝A×(L)^β

这些***的颗粒计数vs.大小的双对数图显示具有负斜率β的线性关系，β等于函数的指数(通常，对于液体悬液为1.6-4.6，对于气溶胶为3.2-4.0)。

制剂的小瓶显示过滤前的粒度分布，这由具有～2.5的指数的幂律函数充分描述(表7和图36)。对于1μm颗粒而言，通过PVDF膜的过滤使颗粒计数减至近两个量级。优先的较小颗粒的清除率幂律指数分布减至～1.6。

两步治疗过滤、随后PS-80添加导致颗粒清除率为通过单独过滤实现的颗粒清除率的2-3倍(图37和表7)。在处理结束时双对数图中的斜率由～2.5减至～1.2(与通过单独过滤的-1.6相比)表明添加表面活性剂、PS80可将颗粒分解成较小尺寸的聚集体。

为了更好地解决各种处理步骤的作用，制剂样品的粒度分布经受随后的过滤，并且表征了表面活性剂添加步骤(图38和表7)。第一过滤步骤导致颗粒计数(1μm)下降～30倍，斜率由～2.5减至～1.2，如先前所示(图36)。用PS-80的进一步处理显示颗粒计数(1μm)下降4倍，另外幂律分布平坦，类似于图37中所述。最终过滤步骤并未显著影响较小颗粒的数量，但是多少使较大的显微颗粒计数下降；如果样品中此大小范围的颗粒数较低，那么对总颗粒计数的作用将是边缘性的。

表7.过滤数据-0.22μm PVDF滤器

发现，初始A280和纯度结果在预期的范围之内。而且，观察到 HIAC的显微颗粒计数的小瓶之间的差异性，表7中反映该结果。发现在一轮过滤时PVDF滤器进行得比PES滤器好(数据未示出)，同时两种滤器的减少显微颗粒计数的两轮过滤是可比较的。样品小瓶中的颗粒遵循指数关系(线性双-对数图)，如图36(仅PVDF过滤)、37(PVDF过滤，然后PS80添加)和38(PVDF过滤+PS80添加+PVDF过滤)所示。通过0.22μm PVDF膜过滤使颗粒计数(1μm)下降＞～100倍。而且，较小的颗粒更容易去除，尤其是利用添加0.02％PS-80。显示第一PVDF过滤步骤表现出颗粒计数(1μm)下降～30倍，而S-80添加清楚地使颗粒去除增加额外的～4倍。此外，显示最终PVDF过滤步骤仅使较大的显微颗粒和可见颗粒减少。结论为，使用0.22μm PVDF滤器的过滤使显微颗粒的数目减少。

【7.2.抗CD 19抗体在多发性骨髓瘤治疗中的应用】

多发性骨髓瘤是浆细胞的恶性肿瘤。通常应理解，多发性骨髓瘤细胞CD 19-CD138+。然而，应注意到，小部分的多发性骨髓瘤细胞具有CD 19+CD138-表型。已经提出，CD 19+CD138-细胞起着癌干细胞的作用，癌干细胞的后代成熟为CD 19-CD 138+细胞。

使用标准方案通过流式细胞术分析各种多发性骨髓瘤细胞的CD19和CD 138表达谱。代表性样品的结果示于图31中。H929和RPMI8226细胞系包含大部分均质的细胞种群，分别为CD 19+CD138-和CD 19-CD138+。另一方面，ANBL6细胞系包含两个不同的细胞种群，一个为CD 19+CD 138-，而另一个为CD 19-CD138+。两个种群的比率随时间变化。如图32所示，以CD 19-CD 138+细胞为代价，CD 19+CD 138-的比率随时间增加。

CD 19+CD 138-和CD 19-CD 138+细胞从ANBL6培养物纯化。流式细胞术数据表明，分离细胞的表型和纯度示于图33中。将纯化的细胞接种在含有0.4％琼脂的培养基中，在适当的条件下孵育培养物4-5周。如图33所示，在该测定中仅CD 19+CD138-细胞能形成菌落。

抗CD 19-aFuc抗体从未分选的多发性骨髓瘤细胞培养物特异性消耗CD 19+细胞。未分选的ANBL6、KAS和MDA8226细胞的种群用作体外抗CD 19抗体介导的ADCC测定的靶标。进行ADCC测定基本上如于2007年9月7日提交的美国专利申请11/852,106所述。CD 19+CD 138-和CD 19-CD 138+细胞在未分选的种群中的比率示于图34底部的表中。16C4-aFuc抗CD 19抗体介导的ADCC从该种群特异性消除CD 19+细胞。CD 19+细胞的减少％作为抗体浓度的函数示于图34中。CD 138+细胞的总数并不减少该测定的过程。

在scid小鼠的体外皮下异种移植物模型中确定551抗体控制多发性骨髓瘤细胞增殖的能力。用5个剂量的551、抗CD20或3mg/kg的对照抗体处理携带肿瘤的小鼠(10组)。每周两次施用抗体处理。肿瘤生长之后进行标准测量。使用ANBL-6细胞系所得的结果示于图35中。与任何对照动物相比，551处理的动物中的肿瘤生长显著更低。551处理导致ANBL-6细胞引起的肿瘤形成减少80％。使用RPMI8226和H929细胞获得类似的结果。在551处理的动物中RPMI8226和H929细胞引起的肿瘤形成分别减少75％和67％。抗CD20抗体处理的动物中的肿瘤形成也减少；具有RPMI8226、ANBL-6和H929细胞的小鼠中观察到肿瘤尺寸分别减少44％、20％和83％。

本领域技术人员使用不超过常规实验就可认识到或能够确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同形式。以下权利要求旨在包括此类等同形式。

本文引用了各种出版物，其全部内容为了所有目的通过引用整体并入。此外，于2007年9月7日提交的美国专利申请11/852,106为了所有目的由此通过引用整体并入本文。

序列表

SEQ ID NO：2

EVQLQESGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGY

FNPYNDGTDYYEKFKGKATLTSDKSSSTAYMALSSLTSEDSAVYYCARGT

YYYGSSYPFDYWGQTTLTVSS

SEQ ID NO：4

DVGMTQTPLTLSVTIGQPASFSCKSSQSLLYSNGKTYLNWLLQRPGQSPK

RLIHLVSKLDSVPDRFTGSGSGTDFTLKIGRVEAEDLGVYYCVQGTHFPY

TFGGGTKLEIK

SEQ D NO：6

SYVMH

SEQ ID NO：8

YFNPYNDGTDYYEKFKG

SEQ ID NO：10

GTYYYGSSYPFDY

SEQ ID NO：12

KSSQSLLYSNGKTYLN

SEQ ID NO：14

LVSKLDS

SEQ ID NO：16

VQGTHFPYT

SEQ ID NO：18

QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYAFSSSWMNWVIQRPGQGLEWIGRIYPGDGDTNYNGKFKGKATL

TADKSSSTAYMQLSSLTSVDSAVYFCARSGFITTVLDFDYWGHGTTLTVSS

SEQ ID NO：20

DIVLTQSPTSLAVSLGQRATISCRASESVDTFGISFMNWFQQKPGQPPKLLIHAASNQGSGVPARFSGSG

SGTDFSLNIHPMEEDDSAMYFCQQSKEVPFTFGSGTKLEIK

SEQ ID NO：22

SSWMN

SEQ ID NO：24

RIYPGDGDTNYNGKFKG

SEQ ID NO：26

SGFITTVLDFDY

SEQ ID NO：28

RASESVDTFGISFMN

SEQ ID NO：30

AASNQGS

SEQ ID NO：32

QQSKEVPFT

SEQ ID NO：34

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSWMNWVRQAPGKGLEWVGRIYPGDGDTNYNGKFKGRFTI

SRDDSKNSLYIQMNSLKTEDTAVYYCARSGFITTVLDFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO：36

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS

SEQ TD NO：38

WVRQAPGKGLEWVG

SEQ ID NO：40

RFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCAR

SEQ ID NO：42

WGQGTLVTVSS

SEQ ID NO：44

EVQLVESGGGLVQPGGSLRISCAASGYAFSSSWMNWVIQAPGKGLEWIGRIYPGDGDTNYNGKFKGRATI

SADDSKNSLYMQMNSLKTEDTAVYICARSGFITTVLDFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO：52

EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASESVDTFGISFMNWYQQKPDQSPKLLIKAASNQGSGVPSRFSGSG

SGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSKEVPFTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO：54

EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITC

SEQ ID NO：56

WYQQKPDQSPKLLIK

SEQ ID NO：58

GVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYC

SEQ ID NO：60

FGGGTKVEIK

SEQ ID NO：62

EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASESVDTFGISFMNWFQQKPDQSPKLLIHAASNQGSGVPSRFSGSG

SGTDFTLTINSLEAEDAATYFCQQSKEVPFTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO：64

WFQQKPDQSPKLLIH

SEQ ID NO：66

GVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYFC

SEQ ID NO：68

EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASESVDTFGISFMNWFQQKPDQSPKLLIHAASNQGSGVPSRFSGSG

SGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSKEVPFTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO：70

EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASESVDTFGISFMNWFQQKPDQSPKLLIKAASNQGSGVPSRFSGSG

SGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSKEVPFTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO：72

WFQQKPDQSPKLLIK

SEQ ID NO：82

WYQQKPQSPKLLIH

SEQ ID NO：83

MGDNDIHFAFLSTGVHS

SEQ ID NO：84

MDMRVPAQLLGLLLLWLPGAKC

SEQ ID NO：102

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSTWMNWVRQAPGKGLEWVGRIYPGDGDTNYNGKFKGRFTI

SRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARSGFITTVYDFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO：103

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSWMNWVRQAPGKGLEWVGRIYPGDGDTNYNGKFKGRFTI

SRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARSGFITTVRDFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO：104-amino acid sequece of 15D1 VH region

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSWMNWVRQAPGKGLEWVGRIYPGDGDTNYNAKFKGRFTI

SRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARSGFITTVRDFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO：105

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSWMNWVRQAPGKGLEWVGRIYPGDGDTNYNGKFKGRFTI

SRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARSGFITTVHDFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO：106

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSWMNWVRQAPGKGLEWVGRIYPGDGDTNYNVKFKGRFTI

SRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARSGFITTVRDFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO：107

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSWMNWVRQAPGKGLEWVGRIYPGDGDTNYYGKFKGRFTI

SRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARSGFITTVRDFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO：108

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSWMNWVRQAPGKGLEWVGRIYPGDGDTNYDGKFKGRFTI

SRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARSGFITTVRDFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO：109

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSWMNWVRQAPGKGLEWVGRIYPGDGDTNYLGKFKGRFTI

SRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARSGFITTVRDFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO：110

EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASESVDTFGISFINWFQQKPDQSPKLLIHEASNQGSGVPSRFSGSG

SGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQTKEVPFTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO：111

EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASESVDTFGISFMNWFQQKPDQSPKLLIHEASNQGSGVPSRFSGSG

SGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSKEVPFTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO：112

EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASESVDHFGISFMNWFQQKPDQSPKLLIHEASNQGSGVPSRFSGSG

SGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSKEVPITFGGGTKVEIK

SEQ ID NO：113

EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASESVDTFGISFMNWFQQKPDQSPKLLIHAASNQGSGVPSRFSGSG

SGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSKEVPITFGGGTKVEIK

SEQ ID NO：114

STWMN

SEQ ID NO：115

RIYPGDGDTNYNAKFKG

SEQ ID NO：116

RIYPGDGDTNYNVKFKG

SEQ ID NO：117

RIYPGDGDTNYYGKFKG

SEQ ID NO：118

RIYPGDGDTNYDGKFKG

SEQ ID NO：119

RIYPGDGDTNYLGKFKG

SEQ ID NO：120

SGFITTVYDFDY

SEQ ID NO：121

SGFITTVRDFDY

SEQ ID NO：122

SGFITTVHDFDY

SEQ ID NO：123

RASESVDTFGISFIN

SEQ ID NO：124

RASESVDHFGISFMN

SEQ ID NO：125

EASNQGS

SEQ ID NO：126

QQTKEVPFT

SEQ ID NO：127

QQSKEVPIT

SEQ ID NO：191

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSVWMNWVRQAPGKGLEWVGRIYPGDGDTNYNVKFKGRFTI

SRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARSGFITTVRDFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO：192

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSVWMNWVRQAPGKGLEWVGRIYLGDGDTNYNVKFKGRFTI

SRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARSGFITTVRDFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO：193

EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASESVDHFGISFINWFQQKPDQSPKLLIHEASNPYSGVPSRFSGSG

SGTDFTLTINSLEAEDAATYYCAQSKEVPITFGGGTKVEIK

SEQ ID NO：194

EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASESVDTFGISFMNWFQQKPDQSPKLLIHEASNQGSGVPSRFSGSG

SGTDFTLTINSLEAEDAATYYCAQSKEVPFTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO：195

EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASESVDTFGISFMNWFQQKPDQSPKLLIHEASNQGSGVPSRFSGSG

SGTDFTLTINSLEAEDAATYYCAQSKRVPFTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO：196

EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASESVITFGISFMNWFQQKPDQSPKLLIHEASNQGSGVPSRFSGSG

SGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSKEVPFTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO：197

EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASESVDTFGISFMNWFQQKPDQSPKLLIHEASNQGSGVPSRFSGSG

SGTDFTLTINSLEAEDAATYYCAQTKRVPFTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO：198

EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASESVDTFGISFMNWFQQKPDQSPKLLIHEASNQGSGVPSRFSGSG

SGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSKEVPITFGGGTKVEIK

SEQ ID NO：199

EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASESVDTFGISFINWFQQKPDQSPKLLIHEASNPYSGVPSRFSGSG

SGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSKEVPFTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO：200

EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASESVDTFGISFMNWFQQKPDQSPKLLIHEASNQGSGVPSRFSGSG

SGTDFTLTINSLEAEDAATYYCAQTKEVPFTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO：201

EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASESVDTFGISFMNWFQQKPDQSPKLLIHEASNQGSGVPSRFSGSG

SGTDFTLTINSLEAEDAATYYCAQTKEVPNTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO：202

EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASESVITFGISFMNWFQQKPDQSPKLLIHEASNTYSGVPSRFSGSG

SGTDFTLTINSLEAEDAATYYCAQSKRVPFTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO：203

EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASESVDTFGISFRNWFQQKPDQSPKLLIHEASNQSSGVPSRFSGSG

SGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSKEVPFTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO：204

EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASESVDTFGISFMNWFQQKPDQSPKLLIHEASNPGSGVPSRFSGSG

SGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQTKRVPFTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO：205

EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASESVIHFGISFMNWFQQKPDQSPKLLIHEASNRGSGVPSRFSGSG

SGTDFTLTINSLEAEDAATYYCAQSKEVPITFGGGTKVEIK

SEQ ID NO：206

EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASESVDTFGLSFMNWFQQKPDQSPKLLIHEASNPYSGVPSRFSGSG

SGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSKEVPFTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO：207

EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASESVITFGISFINWFQQKPDQSPKLLIHEASNPYSGVPSRFSGSG

SGTDFTLTINSLEAEDAATYYCAQTKRVPFTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO：208

SVWMN

SEQ ID NO：209

STWMN

SEQ ID NO：210

RIYLGDGDTNYNVKFKG

SEQ ID NO：211

RASESVDHFGISFIN

SEQ ID NO：212

RASESVITFGISFMN

SEQ ID NO：213

RASESVDTFGISFIN

SEQ ID NO：214

RASESVDTFGISFRN

SEQ ID NO：215

RASESVIHFGISFMN

SEQ ID NO：216

RASESVDTFGLSFMN

SEQ ID NO：217

RASESVITFGISFIN

SEQ ID NO：218

EASNPYS

SEQ ID NO：219

EASNTYS

SEQ ID NO：220

EASNPGS

SEQ ID NO：221

EASNRGS

SEQ ID NO：222

AQSKEVPIT

SEQ ID NO：223

AQSKEVPFT

SEQ ID NO：224

AQSKRVPFT

SEQ ID NO：225

AQTKRVPFT

SEQ ID NO：226

QQSKEVPIT

SEQ ID NO：227

AQTKEVPFT

SEQ ID NO：228

AQTKEVPNT

SEQ ID NO：229

QQTKRVPFT

SEQ ID NO：230

S(S/T/V)WMN

SEQ ID NO：231

RIY(P/L)GDGDTNY(N/Y/D/L)(G/A/V)KFKG

SEQ ID NO：232

SGFITTV(L/R/Y/H)DFDY

SEQ ID NO：233

RASESV(D/I)(T/H)FG(I/L)SF(M/I/R)N

SEQ ID NO：234

(A/E)ASN(Q/P/T)(G/Y)S

SEQ ID NO：235

(Q/A)Q(S/T)K(E/R)VP(F/I/N)T

SEQ ID NO：236

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSTWMNWVRQAPGKGLEWVGRIYPGDGDTNYNVKFKGRFTI

SRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARSGFITTVRDFDYWGQGTLVTVSSSEQ ID NO：237

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSWMNWVRQAPGKGLEWVGRIYPGDGDTNYNGKFKGRFTI

SRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARSGFITTVLDFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO：238

EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASESVDTFGISFMNWFQQKPDQSPKLLIHAASNQGSGVPSRFSGSG

SGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSKEVPFTFGGGTKVEIK

Claims

1.一种无菌、稳定含水制剂，其包含嵌合、人源化或人抗CD 19抗体。

2.权利要求1的制剂，其中所述抗体未曾经受冻干。

3.权利要求1的制剂，其中所述抗体来自选自IgA、IgE、IgM、IgD、IgY和IgG的免疫球蛋白类型。

4.权利要求1的制剂，其中所述抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4人同种型。

5.权利要求1的制剂，其中所述抗体包含具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不结合于所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖。

6.权利要求1-5任一项的制剂，其中所述抗体包括包含SEQ IDNO：104的序列的重链可变区。

7.权利要求1-5任一项的制剂，其中所述抗体包括包含SEQ IDNO：111的序列的轻链的可变区。

8.权利要求1-5任一项的制剂，其中所述抗体包括包含SEQ IDNO：104的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO：111的序列的轻链可变区。

9.权利要求1-5任一项的制剂，其中所述抗体包括包含SEQ IDNO：104的序列的重链可变区、包含SEQ ID NO：111的序列的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不结合于所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖。

10.权利要求1-9任一项的制剂，其中所述抗体的浓度为至少约5mg/ml、至少约10mg/ml、至少约15mg/ml、至少约20mg/ml、至少约50mg/ml、至少约100mg/ml、至少约120mg/ml、至少约150mg/ml、至少约160mg/ml、至少约180mg/ml、至少约200mg/ml、至少约250mg/ml或至少约300mg/ml。

11.权利要求1-9任一项的制剂，其中所述抗体的浓度为至少约5mg/ml。

12.权利要求1-9任一项的制剂，其中所述抗体的浓度为至少约10mg/ml。

13.权利要求1-9任一项的制剂，其中所述抗体的浓度为至少约15mg/ml。

14.权利要求1-9任一项的制剂，其中所述抗体的浓度为至少约50mg/ml。

15.权利要求1-9任一项的制剂，其中所述抗体的浓度为至少约100mg/ml。

16.权利要求1-9任一项的制剂，其中所述抗体的浓度为约5mg/ml至约100mg/ml。

17.权利要求1-9任一项的制剂，其中所述抗体的浓度为约5mg/ml至约25mg/ml。

18.权利要求1-17任一项的制剂，其中所述制剂还包含至少约一种缓冲组分。

19.权利要求1-18任一项的制剂，其中所述制剂还包含至少约一种赋形剂。

20.权利要求18或19的制剂，其中所述缓冲组分选自组氨酸、柠檬酸盐、磷酸盐、甘氨酸和乙酸盐。

21.权利要求18或19的制剂，其中所述缓冲组分是组氨酸。

22.权利要求21的制剂，其中所述组氨酸为约1nM至约200nM的浓度。

23.权利要求21的制剂，其中所述组氨酸为约1nM至约50nM的浓度。

24.权利要求21的制剂，其中所述组氨酸为约5nM至约20nM的浓度。

25.权利要求21的制剂，其中所述组氨酸为约10nM、约15nM或约20nM的浓度。

26.权利要求19的制剂，其中所述赋形剂为糖类。

27.权利要求26的制剂，其中所述糖类为二糖。

28.权利要求27的制剂，其中所述二糖为海藻糖或蔗糖。

29.权利要求27的制剂，其中所述二糖为海藻糖。

30.权利要求29的制剂，其中所述海藻糖为约1％至约40％的浓度。

31.权利要求29的制剂，其中所述海藻糖为约2％至约20％的浓度。

32.权利要求29的制剂，其中所述海藻糖为约2％至约10％的浓度。

33.权利要求29的制剂，其中所述海藻糖为约2％、约4％或约8％的浓度。

34.权利要求19的制剂，其中所述赋形剂为盐。

35.权利要求34的制剂，其中所述盐为氯化钠。

36.权利要求35的制剂，其中所述氯化钠为约50mM至约200mM的浓度。

37.权利要求35的制剂，其中所述氯化钠为约70mM、约75mM、约80mM、约100mM、约120mM或约150mM的浓度。

38.权利要求19的制剂，其中所述赋形剂为表面活性剂。

39.权利要求38的制剂，其中所述表面活性剂为聚山梨醇酯。

40.权利要求39的制剂，其中所述聚山梨醇酯为聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。

41.权利要求39的制剂，其中所述聚山梨醇酯为聚山梨醇酯80。

42.权利要求41的制剂，其中所述聚山梨醇酯80为约0.001％至约2％的浓度。

43.权利要求41的制剂，其中所述聚山梨醇酯80为约0.01％、约0.02％、约0.04％或约0.08％的浓度。

44.权利要求1-43任一项的制剂，其中所述制剂具有约5.5至约6.5的pH。

45.权利要求1-43任一项的制剂，其中所述制剂具有约6.0的pH。

46.权利要求1-45任一项的制剂，其中所述制剂是等渗的。

47.权利要求1-46任一项的制剂，其中所述制剂经在40℃储存至少约4周后是稳定的。

48.权利要求1-46任一项的制剂，其中所述制剂经在5℃储存至少约3个月后是稳定的。

49.权利要求1-46任一项的制剂，其中所述制剂经在5℃储存至少约12个月后是稳定的。

50.权利要求1-46任一项的制剂，其中所述抗体在所述制剂在40℃储存至少约4周的期间损失至多20％的其CD 19结合活性。

51.权利要求1-46任一项的制剂，其中所述抗体在所述制剂在5℃储存至少约3个月的期间损失至多20％的其CD 19结合活性。

52.权利要求1-46任一项的制剂，其中所述抗体在所述制剂在5℃储存至少约12个月的期间损失至多20％的其CD 19结合活性。

53.权利要求1-46任一项的制剂，其中所述抗体在所述制剂在40℃储存至少约4周的期间损失至多10％的其CD 19结合活性。

54.权利要求1-46任一项的制剂，其中所述抗体在所述制剂在5℃储存至少约3个月的期间损失至多10％的其CD 19结合活性。

55.权利要求1-46任一项的制剂，其中所述抗体在所述制剂在5℃储存至少约12个月的期间损失至多10％的其CD 19结合活性。

56.权利要求1-46任一项的制剂，其中所述抗体在所述制剂在40℃储存至少约4周的期间损失至多5％的其CD 19结合活性。

57.权利要求1-46任一项的制剂，其中所述抗体在所述制剂在5℃储存至少约3个月的期间损失至多5％的其CD 19结合活性。

58.权利要求1-46任一项的制剂，其中所述抗体在所述制剂在5℃储存至少约12个月的期间损失至多5％的其CD 19结合活性。

59.权利要求1-46任一项的制剂，其中所述抗体对聚集或片段化敏感。

60.权利要求1-46任一项的制剂，其中经在约40℃储存至少约4周后，通过HPSEC确定少于约2％的所述抗体形成聚集体。

61.权利要求1-46任一项的制剂，其中经在约5℃储存至少约3个月后，通过HPSEC确定少于约2％的所述抗体形成聚集体。

62.权利要求1-46任一项的制剂，其中经在约5℃储存至少约12个月后，通过HPSEC确定少于约2％的所述抗体形成聚集体。

63.权利要求1-46任一项的制剂，其中经在约40℃储存至少约4周后，通过SEC确定少于约5％的所述抗体被片段化。

64.权利要求1-46任一项的制剂，其中经在约5℃储存至少约3个月后，通过SEC确定少于约5％的所述抗体被片段化。

65.权利要求1-46任一项的制剂，其中经在约5℃储存至少约12个月后，通过SEC确定少于约5％的所述抗体被片段化。

66.权利要求1-65任一项的制剂，其中所述制剂是注射制剂。

67.权利要求66的制剂，其中所述制剂适用于静脉内、皮下或肌内施用。

68.权利要求67的制剂，其中所述制剂适用于皮下施用，且所述抗体或抗体片段浓度是约5mg/ml至约60mg/ml。

69.权利要求67的制剂，其中所述制剂适用于皮下施用，且所述抗体或抗体片段浓度是约5mg/ml至约250mg/ml。

70.权利要求1-65任一项的制剂，其中所述制剂适用于适于气溶胶施用。

71.一种适用于向人胃肠外施用的药物单元剂型，其包含在适当容器中的权利要求1-65任一项所述的抗体制剂。

72.权利要求71的药物单元剂型，其中所述抗体制剂被静脉内、皮下或肌内施用。

73.一种适用于向人气溶胶施用的药物单元剂型，其包含在适当容器中的权利要求1-65任一项所述的抗体制剂。

74.权利要求73的药物单元剂型，其中所述抗体制剂被鼻内施用。

75.一种密封容器，其包含权利要求1-74任一项所述的制剂。

76.一种药盒，其包含权利要求1-74任一项所述的制剂。

77.一种治疗人的B细胞疾病或病症的方法，所述方法包括向需要其的人施用治疗有效量的权利要求1-74任一项所述的制剂。

78.权利要求77的方法，其中所述B细胞疾病或病症选自：B细胞恶性肿瘤、自身免疫性疾病、自身免疫性病症、人移植患者的体液排斥、移植物对宿主疾病(GVHD)和人移植物接受者的移植后淋巴增殖性病症。

79.权利要求77的方法，其中所述B细胞疾病或病症是B细胞恶性肿瘤。

80.权利要求77的方法，其中所述B细胞疾病或病症是硬皮病。

81.一种消耗人患者中的表达CD 19的B细胞的方法，包括向需要其的人施用治疗有效量的权利要求1-74任一项所述的制剂。

82.权利要求81的方法，其中所述消耗持续的时间段选自：至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月和至少12个月。

83.权利要求81的方法，其中所述消耗使B细胞水平下降至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％。

84.权利要求81的方法，其中所述表达CD 19的B细胞是循环B细胞、血液B细胞、脾B细胞、边缘区B细胞、滤泡B细胞、腹膜B细胞、骨髓B细胞或癌干细胞。

85.一种无菌、稳定含水制剂，其包含嵌合、人源化或人抗CD 19抗体，且还包含组氨酸、氯化钠和海藻糖，其中所述抗体包括包含SEQID NO：104的序列的重链可变区、包含SEQ ID NO：111的序列的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不结合于所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖。

86.权利要求85的方法，其中所述制剂包含约5mg/ml至约50mg/ml的所述抗CD 19抗体、约1mM至约50mM组氨酸和约1％至约10％海藻糖，且其中所述制剂的pH为约5至约7。

87.权利要求85的方法，其中所述制剂包含约5mg/ml至约20mg/ml的所述抗CD 19抗体、约5mM至约20mM组氨酸和约2％至约8％海藻糖，且其中所述制剂的pH为约5.5至约6.5。

88.权利要求85的方法，其中所述制剂包含约10mg/ml的所述抗CD 19抗体、约10mM组氨酸和约4％海藻糖，且其中所述制剂的pH为约6。

89.权利要求85-88任一项的制剂，其中所述制剂是等渗的。

90.权利要求85-88任一项的制剂，其中所述制剂经在40℃储存至少约4周后是稳定的。

91.权利要求85-88任一项的制剂，其中所述制剂经在5℃储存至少约3个月后是稳定的。

92.权利要求85-88任一项的制剂，其中所述制剂经在5℃储存至少约12个月后是稳定的。

93.权利要求85-88任一项的制剂，其中所述抗体在所述制剂在40℃储存至少约4周的期间损失至多20％的其CD 19结合活性。

94.权利要求85-88任一项的制剂，其中所述抗体在所述制剂在5℃储存至少约3个月的期间损失至多20％的其CD 19结合活性。

95.权利要求85-88任一项的制剂，其中所述抗体在所述制剂在5℃储存至少约12个月的期间损失至多20％的其CD 19结合活性。

96.权利要求85-88任一项的制剂，其中所述抗体在所述制剂在40℃储存至少约4周的期间损失至多10％的其CD 19结合活性。

97.权利要求85-88任一项的制剂，其中所述抗体在所述制剂在5℃储存至少约3个月的期间损失至多10％的其CD 19结合活性。

98.权利要求85-88任一项的制剂，其中所述抗体在所述制剂在5℃储存至少约12个月的期间损失至多10％的其CD 19结合活性。

99.权利要求85-88任一项的制剂，其中所述抗体在所述制剂在40℃储存至少约4周的期间损失至多5％的其CD 19结合活性。

100.权利要求85-88任一项的制剂，其中所述抗体在所述制剂在5℃储存至少约3个月的期间损失至多5％的其CD 19结合活性。

101.权利要求85-88任一项的制剂，其中所述抗体在所述制剂在5℃储存至少约12个月的期间损失至多5％的其CD 19结合活性。

102.权利要求85-88任一项的制剂，其中所述抗体对聚集或片段化敏感。

103.权利要求85-88任一项的制剂，其中经在约40℃储存至少约4周后，通过HPSEC确定少于约2％的所述抗体形成聚集体。

104.权利要求85-88任一项的制剂，其中经在约5℃储存至少约3个月后，通过HPSEC确定少于约2％的所述抗体形成聚集体。

105.权利要求85-88任一项的制剂，其中经在约5℃储存至少约12个月后，通过HPSEC确定少于约2％的所述抗体形成聚集体。

106.权利要求85-88任一项的制剂，其中经在约40℃储存至少约4周后，通过SEC确定少于约5％的所述抗体被片段化。

107.权利要求85-88任一项的制剂，其中经在约5℃储存至少约3个月后，通过SEC确定少于约5％的所述抗体被片段化。

108.权利要求85-88任一项的制剂，其中经在约5℃储存至少约12个月后，通过SEC确定少于约5％的所述抗体被片段化。

109.权利要求85-88任一项的制剂，其中所述制剂经在约5℃储存至少约3个月后，通过肉眼检查确定是澄清的和无色的。

110.权利要求85-88任一项的制剂，其中所述制剂经在约5℃储存至少约12个月后，通过肉眼检查确定是澄清的和无色的。

111.权利要求85-110任一项的制剂，其中所述制剂是注射制剂。

112.权利要求111的制剂，其中所述制剂适用于静脉内、皮下或肌内施用。

113.权利要求112的制剂，其中所述制剂适用于静脉内施用。

114.权利要求112的制剂，其中所述制剂适用于皮下施用。

115.权利要求85-110任一项的制剂，其中所述制剂适用于气溶胶施用。

116.一种用于制备根据权利要求85-110任一项的制剂的方法，其包括：

将抗-人CD 19抗体溶液浓缩至约5mg/ml至约50mg/ml；和

用包含组氨酸的溶液渗滤所述浓缩的抗体。

117.权利要求116的方法，其还包括：将所述浓缩的抗体溶液与包含至少约一种赋形剂的至少约一种溶液混合。

118.一种适用于向人胃肠外施用的药物单元剂型，其包含在适当容器中的权利要求85-115任一项所述的抗体制剂。

119.权利要求118的药物单元剂型，其中所述抗体制剂被静脉内、皮下或肌内施用。

120.一种适用于向人气溶胶施用的药物单元剂型，其包含在适当容器中的权利要求85-115任一项所述的抗体制剂。

121.一种密封容器，其包含权利要求85-115任一项所述的制剂。

122.一种药盒，其包含权利要求85-115任一项所述的制剂。

123.一种治疗人的B细胞疾病或病症的方法，所述方法包括向需要其的人施用治疗有效量的权利要求85-115任一项所述的制剂。

124.权利要求123的方法，其中所述B细胞疾病或病症选自：B细胞恶性肿瘤、自身免疫性疾病、自身免疫性病症、人移植患者的体液排斥、移植物对宿主疾病(GVHD)和人移植物接受者的移植后淋巴增殖性病症。

125.权利要求123的方法，其中所述B细胞疾病或病症是B细胞恶性肿瘤。

126.权利要求123的方法，其中所述B细胞疾病或病症是硬皮病。

127.一种消耗人患者中的表达CD 19的B细胞的方法，包括向需要其的人施用治疗有效量的权利要求85-115任一项所述的制剂。

128.权利要求127的方法，其中所述消耗持续的时间段选自：至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月和至少12个月。

129.权利要求127的方法，其中所述消耗使B细胞水平下降至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％。

130.权利要求127的方法，其中所述表达CD 19的B细胞是循环B细胞、血液B细胞、脾B细胞、边缘区B细胞、滤泡B细胞、腹膜B细胞、骨髓B细胞或癌干细胞。

131.一种无菌、稳定含水制剂，其包含10mg/ml人源化抗CD 19抗体、约10mM组氨酸和约4％海藻糖，其中所述制剂的pH为约6，且其中所述人源化抗CD 19抗体包含具有SEQ ID NO：104的序列的重链可变区、具有SEQ ID NO：111的序列的轻链可变区和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不结合于所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖。

132.权利要求131的制剂，其中所述制剂是等渗的。

133.权利要求131-132任一项的制剂，其中所述制剂经在40℃储存至少约4周后是稳定的。

134.权利要求131-133任一项的制剂，其中所述制剂经在5℃储存至少约3个月后是稳定的。

135.权利要求131-134任一项的制剂，其中所述制剂经在5℃储存至少约12个月后是稳定的。

136.权利要求131-135任一项的制剂，其中所述抗体在所述制剂在40℃储存至少约4周的期间损失至多20％的其CD 19结合活性。

137.权利要求131-136任一项的制剂，其中所述抗体在所述制剂在5℃储存至少约3个月的期间损失至多20％的其CD 19结合活性。

138.权利要求131-137任一项的制剂，其中所述抗体在所述制剂在5℃储存至少约12个月的期间损失至多20％的其CD 19结合活性。

139.权利要求131-138任一项的制剂，其中所述抗体在所述制剂在40℃储存至少约4周的期间损失至多10％的其CD 19结合活性。

140.权利要求131-139任一项的制剂，其中所述抗体在所述制剂在5℃储存至少约3个月的期间损失至多10％的其CD 19结合活性。

141.权利要求131-140任一项的制剂，其中所述抗体在所述制剂在5℃储存至少约12个月的期间损失至多10％的其CD 19结合活性。

142.权利要求131-141任一项的制剂，其中所述抗体在所述制剂在40℃储存至少约4周的期间损失至多5％的其CD 19结合活性。

143.权利要求131-142任一项的制剂，其中所述抗体在所述制剂在5℃储存至少约3个月的期间损失至多5％的其CD 19结合活性。

144.权利要求131-143任一项的制剂。其中所述抗体在所述制剂在5℃储存至少约12个月的期间损失至多5％的其CD 19结合活性。

145.权利要求131-144任一项的制剂，其中所述抗体对聚集或片段化敏感。

146.权利要求131-145任一项的制剂，其中经在约40℃储存至少约4周后，通过HPSEC确定少于约2％的所述抗体形成聚集体。

147.权利要求131-146任一项的制剂，其中经在约5℃储存至少约3个月后，通过HPSEC确定少于约2％的所述抗体形成聚集体。

148.权利要求131-147任一项的制剂，其中经在约5℃储存至少约12个月后，通过HPSEC确定少于约2％的所述抗体形成聚集体。

149.权利要求131-148任一项的制剂，其中经在约40℃储存至少约4周后，通过SEC确定少于约5％的所述抗体被片段化。

150.权利要求131-149任一项的制剂，其中经在约5℃储存至少约3个月后，通过SEC确定少于约5％的所述抗体被片段化。

151.权利要求131-150任一项的制剂，其中经在约5℃储存至少约12个月后，通过SEC确定少于约5％的所述抗体被片段化。

152.权利要求131-151任一项的制剂，其中所述制剂经在约5℃储存至少3个月后，通过肉眼检查确定是澄清的和无色的。

153.权利要求131-152任一项的制剂，其中所述制剂经在约5℃储存至少12个月后，通过肉眼检查确定是澄清的和无色的。

154.权利要求131-153任一项的制剂，其中所述制剂是注射制剂。

155.权利要求154的制剂，其中所述制剂适用于静脉内、皮下或肌内施用。

156.权利要求154的制剂，其中所述制剂适用于静脉内施用。

157.权利要求155的制剂，其中所述制剂适用于皮下施用.

158.权利要求131的制剂，其中所述制剂适用于气溶胶施用。

159.一种适用于向人胃肠外施用的药物单元剂型，其包含在适当容器中的权利要求131所述的抗体制剂。

160.权利要求159的药物单元剂型，其中所述抗体制剂被静脉内、皮下或肌内施用。

161.一种适用于向人气溶胶施用的药物单元剂型，其包含在适当容器中的权利要求131所述的抗体制剂。

162.一种密封容器，其包含权利要求131所述的制剂。

163.一种药盒，其包含权利要求131所述的制剂。

164.一种治疗人的B细胞疾病或病症的方法，所述方法包括向需要其的人施用治疗有效量的权利要求131所述的制剂。

165.权利要求164的方法，其中所述B细胞疾病或病症选自：B细胞恶性肿瘤、自身免疫性疾病、自身免疫性病症、人移植患者的体液排斥、移植物对宿主疾病(GVHD)和人移植物接受者的移植后淋巴增殖性病症。

166.权利要求165的方法，其中所述B细胞疾病或病症是B细胞恶性肿瘤。

167.权利要求164的方法，其中所述B细胞疾病或病症是硬皮病。

168.一种消耗人患者中的表达CD 19的B细胞的方法，包括向需要其的人施用治疗有效量的权利要求131所述的制剂。

169.权利要求168的方法，其中所述消耗持续的时间段选自：至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月或至少12个月。

170.权利要求168的方法，其中所述消耗使B细胞水平下降至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％。

171.权利要求168的方法，其中所述表达CD 19的B细胞是循环B细胞、血液B细胞、脾B细胞、边缘区B细胞、滤泡B细胞、腹膜B细胞、骨髓B细胞或癌干细胞。

172.权利要求1-70、85-115或131-158任一项的制剂，其中所述制剂是药学上可接受的制剂。

173.一种无菌、稳定含水制剂，其包含嵌合、人源化或人抗CD19抗体，其中所述抗体包含：

(a)包含VH CDR1(SEQ ID NO：22)、VH CDR2(SEQ ID NO：115)和VH CDR3(SEQ ID NO：121)的重链可变区；

(b)包含VK CDR1(SEQ ID NO：28)、VK CDR2(SEQ ID NO：125)和VK CDR3(SEQ ID NO：32)的轻链可变区；

(c)具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不结合于所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖；和

(d)缓冲剂、盐、糖类赋形剂和表面活性剂。

174.权利要求173的制剂，其中所述缓冲剂是组氨酸。

175.权利要求174的制剂，其中所述组氨酸以约1mM至约200mM的浓度存在。

176.权利要求174的制剂，其中所述组氨酸以约10mM至约50mM的浓度存在。

177.权利要求174的制剂，其中所述组氨酸以约10mM至约30mM的浓度存在。

178.权利要求174的制剂，其中所述组氨酸以约10mM的浓度存在。

179.权利要求174的制剂，其中所述组氨酸以约20mM的浓度存在。

180.权利要求174的制剂，其中所述组氨酸以至少约10mM的浓度存在。

181.权利要求173的制剂，其中所述盐为氯化钠。

182.权利要求181的制剂，其中所述氯化钠以约10mM至约300mM的浓度存在。

183.权利要求181的制剂，其中所述氯化钠以约60mM至约175mM的浓度存在。

184.权利要求181的制剂，其中所述氯化钠以约50mM的浓度存在。

185.权利要求181的制剂，其中所述氯化钠以约75mM的浓度存在。

186.权利要求181的制剂，其中所述氯化钠以至少50mM的浓度存在。

187.权利要求173的制剂，其中所述糖类赋形剂是海藻糖。

188.权利要求187的制剂，其中所述海藻糖以约1％至约10％的浓度存在。

189.权利要求187的制剂，其中所述海藻糖以约2％至约8％的浓度存在。

190.权利要求187的制剂，其中所述海藻糖以约3％mM的浓度存在。

191.权利要求187的制剂，其中所述海藻糖以约4％的浓度存在。

192.权利要求187的制剂，其中所述海藻糖以至少约3％的浓度存在。

193.权利要求173的制剂，其中所述表面活性剂是聚山梨醇酯80。

194.权利要求193的制剂，其中所述聚山梨醇酯80以约0.001％至约2％的浓度存在。

195.权利要求193的制剂，其中所述聚山梨醇酯80以约0.01％的浓度存在。

196.权利要求193的制剂，其中所述聚山梨醇酯80以约0.02％的浓度存在。

197.权利要求193的制剂，其中所述聚山梨醇酯80以约0.04％的浓度存在。

198.权利要求193的制剂，其中所述聚山梨醇酯80以约0.05％的浓度存在。

199.权利要求193的制剂，其中所述聚山梨醇酯80以约0.08％的浓度存在。

200.权利要求193的制剂，其中所述聚山梨醇酯80以约0.01％至约0.2％的浓度存在。

201.权利要求173的制剂，其具有约5.5至约6.5的pH。

202.权利要求173的制剂，其具有约6.0的pH。

203.权利要求173的制剂，其中所述制剂存在于无钨注射器中。

204.权利要求173的制剂，其中所述制剂被过滤。

205.权利要求173的制剂，其中所述制剂通过22μm滤器被过滤。

206.权利要求205的制剂，其中所述制剂在添加表面活性剂之前和之后被过滤。

207.权利要求173的制剂，其中所述抗体的浓度为至少约10mg/ml。

208.权利要求173的制剂，其中所述抗体的浓度为至少约15mg/ml。

209.权利要求173的制剂，其中所述抗体的浓度为至少约50mg/ml。

210.权利要求173的制剂，其中所述抗体的浓度为至少约100mg/ml。

211.权利要求173的制剂，其中所述抗体的浓度为至少约120mg/ml。

212.权利要求173的制剂，其中所述抗体的浓度为至少约150mg/ml。

213.权利要求173的制剂，其中所述抗体的浓度为约5mg/ml。

214.权利要求173的制剂，其中所述抗体的浓度为约10mg/ml。

215.权利要求173的制剂，其中所述抗体的浓度为约20mg/ml。

216.权利要求173的制剂，其中所述抗体的浓度为约25mg/ml。

217.权利要求173的制剂，其中所述抗体的浓度为约30mg/ml。

218.权利要求173的制剂，其中所述抗体的浓度为约40mg/ml。

219.权利要求173的制剂，其中所述抗体的浓度为约50mg/ml。

220.权利要求173的制剂，其中所述抗体的浓度为约60mg/ml。

221.权利要求173的制剂，其中所述抗体的浓度为约70mg/ml。

222.权利要求173的制剂，其中所述抗体的浓度为至少约80mg/ml。

223.权利要求173的制剂，其中所述抗体的浓度为至少约90mg/ml。

224.权利要求173的制剂，其中所述抗体的浓度为至少约110mg/ml。

225.权利要求173的制剂，其中所述抗体的浓度为至少约120mg/ml。

226.权利要求173的制剂，其中所述抗体的浓度为至少约130mg/ml。

227.权利要求173的制剂，其中所述抗体的浓度为至少约140mg/ml。

228.权利要求173的制剂，其中所述抗体的浓度为约5mg/ml至约100mg/ml。

229.权利要求173的制剂，其中所述制剂在-20℃储存。

230.权利要求173的制剂，其中所述制剂在-40℃储存。

231.权利要求173的制剂，其中所述制剂在-70℃储存。

232.权利要求173的制剂，其中所述制剂在-80℃储存。

233.一种增强含水制剂的贮存稳定性的方法，其中所述制剂包含嵌合、人源化或人抗CD 19抗体，所述抗CD 19抗体包含：

a.包含SEQ ID NO：104的序列的重链可变区；

b.包含SEQ ID NO：111的序列的轻链可变区；

c.和具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖不结合于所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖；并且

其中所述方法包括向所述制剂添加有效增强制剂贮存稳定性的量的表面活性剂。

234.权利要求232的方法，其中所述表面活性剂是聚山梨醇酯80。

235.权利要求233的方法，其中所述聚山梨醇酯80以约0.001％至约2％的浓度存在。

236.权利要求233的方法，其中所述聚山梨醇酯80以约0.01％的浓度存在。

237.权利要求233的方法，其中所述聚山梨醇酯80以约0.02％的浓度存在。

238.权利要求233的方法，其中所述聚山梨醇酯80以约0.04％的浓度存在。

239.权利要求233的方法，其中所述聚山梨醇酯80以约0.05％的浓度存在。

240.权利要求233的方法，其中所述聚山梨醇酯80以约0.08％的浓度存在。

241.权利要求233的方法，其中所述聚山梨醇酯80以约0.01％至约0.2％的浓度存在。

242.权利要求233的方法，还包括在添加表面活性剂之前过滤组合物的步骤。

243.权利要求233的方法，还包括在添加表面活性剂之后过滤组合物的步骤。

244.权利要求233的方法，还包括在添加表面活性剂之前和之后过滤组合物的步骤。

245.权利要求233的方法，其中所述抗CD 19抗体保留其活性。

246.权利要求233的方法，其中所述抗CD 19抗体保留其纯度。