CN102408495A - 具有抗炎症活性的香菇β-葡聚糖及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种香菇β-葡聚糖,其主链为β-(1→3)-D-葡聚糖,平均每7~10个主链葡萄糖残基含2~3个(1→6)键接的葡萄糖侧基,它在水中呈棒状链。其制法是,将香菇子实体粉碎,脱脂,用生理盐水浸泡,离心,收集残渣;取残渣在100~130℃沸水下提取,离心,收集残渣在纯水中进行超声提取,离心得提取液;提取液脱色后,除去游离的蛋白质,用水透析,浓缩,冷冻干燥得到香菇β-葡聚糖。本发明香菇β-葡聚糖具有显著的激活巨噬细胞作用,以及较高的抑制炎症调节因子NO和TNF-α释放的效应,可用于制备提高免疫机能和抗炎症的药物或保健品。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有抗炎症活性的棒状香菇β-葡聚糖及其制备方法。它属于高分子物理领域,也属于生物学领域。
背景技术
炎症是宿主对内在或外在环境刺激的一种响应。该响应过程严格受控于生理条件,短时间内的急性炎症具有治疗效果,然而由于生理失控导致炎症持续时间过长或转变成慢性炎症时,它就会对机体产生伤害作用,甚至导致一些重大疾病出现,如心脑血管疾病、糖尿病、关节炎、老年痴呆症、自身免疫性疾病和癌症等。近年来,很多研究者致力于抗炎症药物的研究和开发。在众多抗炎症药物中,有机化合物类居多,不可避免地会产生不同程度的毒副作用。
香菇(Lentinus edodes)是一种兼食用和药用为一体的大型真菌,香菇中最重要的香菇多糖有很明显的抗肿瘤活性,增强宿主对细菌、真菌、病毒和寄生虫感染的抵抗能力,增强自然杀伤细胞和细胞毒性T细胞活性等多种生物学和免疫学活性。香菇多糖有多种类型,目前研究表明,香菇多糖中存在四种杂多糖(L-FI_L-FIVn)和两种葡聚糖(L-FV和L-FVIn)。但对香菇多糖的进一步研究相对较少,尤其是新多糖的发现和研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抗炎症活性的棒状香菇β-葡聚糖,该葡聚糖具有显著的抑制LPS(革兰氏阴性菌)诱导的炎症调节因子一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素IL-1α和IL-1γα等的释放。
本发明的另一个目的在于还提供上述香菇β-葡聚糖的制备方法,该制备方法简单易行、成本较低廉。
本发明目的还在于提供上述香菇β-葡聚糖在制备抗炎症或提高免疫机能的药物或保健品中的用途。
为实现上述目的,本发明首先提供一种具有抗炎症活性的棒状香菇β-葡聚糖,其主链为β-(1→3)-葡聚糖,平均每7~10个主链葡萄糖残基含2~3个(1→6)键接的葡萄糖侧基,它在水中呈棒状链。研究表明,该葡聚糖具有显著的抑制LPS(革兰氏阴性菌)诱导的炎症调节因子一氧化氮(NO)和肿瘤坏死因子(TNF-α)释放的作用。
本发明还提供了上述棒状香菇β-葡聚糖的制备方法,其包括如下步骤:将香菇子实体粉碎,脱脂,用生理盐水浸泡,离心,收集残渣;取残渣在100~130℃沸水下提取,离心,收集残渣在纯水中进行超声提取,离心得提取液;提取液脱色后,除去游离的蛋白质,用水透析,浓缩,冷冻干燥得到白色香菇β-葡聚糖纯品。
对于香菇子实体,采用干燥子实体,更易于粉碎,优选可以粉碎至3~7目,使其提取效率更高。
其中所述脱脂的方法可以采用索氏提取法提取去除脂肪,具体可以依次用乙酸乙酯、丙酮作为提取溶剂进行,提取6~10小时。
生理盐水浸泡可以去除细胞壁外的水溶性小分子,浸泡时间为8~24小时,重复1~4次。
其中所述沸水提取方法是用残渣3~5倍体积的水煮20~40分钟,重复1~4次。
其中所述超声提取的条件为温度20~30℃,频率18~30KHz,功率400~600W,时间16~20min。
其中所述脱色可以用H2O2进行脱色。
其中所述游离蛋白的去除采用Sevag法除去游离的蛋白质,一般6~10次。
本发明香菇β-葡聚糖具有显著的抑制LPS(革兰氏阴性菌)诱导的炎症调节因子一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素IL-1α和IL-1γα等的释放。因而本发明香菇β-葡聚糖可以用于抗炎症或提高免疫机能的药物或保健品中。进而,本发明还提供含有上述香菇β-葡聚糖的抗炎症或提高免疫机能的药物或保健品。
本发明具有如下优点:
1、该β-葡聚糖来源于我国特产资源,产量丰富、成本低廉;
2、该β-葡聚糖提取工艺简单,提取过程容易控制;
3、该β-葡聚糖抑制NO和TNF-α效率高,可达70%以上;抑制IL-1α和IL-1γα可达100%。
4、该β-葡聚糖无毒副作用,生物相容性好。
附图说明
图1.香菇β-葡聚糖LNT-S的13CNMR,IR,和GC图谱。
图2.香菇β-葡聚糖LNT-S对LPS体外诱导的炎症因子--NO(图2A)和TNF-α(图2B)的抑制率。
图3.LNT-S对炎症因子合成酶iNOS(图3A)、炎症基因iNOSmRNA(图3B)和TNF-αmRNA(图3C)表达的抑制。
图4.LNT-S对LPS诱导的炎症因子IL-1α和IL-1γα的抑制率。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明,实施例中所用的生化试剂为市售试剂,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
购买市售的湖北随州产香菇子实体,取香菇子实体200g,粉碎至5目,依次用乙酸乙酯600ml、丙酮600ml进行索氏提取各8小时。然后用0.9%NaCl水溶液在室温下搅拌过夜,离心,收集残渣,重复三次。残渣用4倍体积的热水(100℃)浸提三次,每次半小时,离心,收集残渣;残渣在纯水中进行超声波提取(25℃,20KHz,600W,16min)离心得提取液;上清提取液用H2O2脱色,6次Sevag法除去游离的蛋白质后,分别用清水和二次蒸馏水透析(cutoff Mw=8,000),浓缩,冷冻干燥得到香菇β-葡聚糖(LNT-S)。用NMR,IR,GC-MS等证明LNT-S为β-(1→3)-D-葡聚糖,平均每10个主链葡萄糖残基含3个(1→6)键接的葡萄糖侧基。用粘度计、光散射及其与尺寸排除色谱联用仪检测各多糖试样的特性粘数、重均分子量和均方旋转半径,按照高分子溶液理论和方法及计算机模拟,计算出表征高分子在溶液中链的分子参数,由此推断出LNT-S在水溶液中呈现棒状链构象。
香菇β-葡聚糖LNT-S对LPS诱导的炎症因子——NO和TNF-α的抑制率见图2。(NO用Griess试剂检测,TNF-α用Elisa Kit检测)
显然,该多糖对LPS诱导的炎症因子具有抑制率具有剂量依赖性。高剂量时显示较高抗炎症活性,NO和TNF-α抑制率分别达70%以上。同时,LNT-S显著抑制了LPS诱导的炎症调节酶iNOS和炎症基因iNOSmRNA、TNF-αmRNA的表达,抑制率达70%以上,结果见图3。
实施例2
购买市售的湖北随州产香菇子实体,取香菇子实体200g,粉碎至3目,依次用乙酸乙酯500ml、丙酮500ml进行索氏提取各6小时。然后用生理盐水在室温下搅拌8小时,离心,收集残渣,重复4次。残渣用5倍量的热水(120℃)浸提4次,每次20min,离心,收集残渣;残渣在纯水中进行超声波提取(30℃,18KHz,500W,20min)离心得提取液;上清提取液用H2O2脱色,5次Sevag法除去游离的蛋白质后,分别用清水和二次蒸馏水透析(cutoff Mw=8,000),浓缩,冷冻干燥得到香菇β-葡聚糖(LNT-S)。经鉴定,其与实施例1制得的香菇β-葡聚糖(LNT-S)相同。
实施例3
购买市售的湖北随州产香菇子实体,取香菇子实体200g,粉碎至3目,依次用乙酸乙酯500ml、丙酮500ml进行索氏提取各10小时。然后用生理盐水在室温下搅拌24小时,离心,收集残渣,重复2次。残渣用5倍量的热水(120℃)浸提2次,每次40min,离心,收集残渣;残渣在纯水中进行超声波提取(20℃,30KHz,500W,18min)离心得提取液;上清提取液用H2O2脱色,10次Sevag法除去游离的蛋白质后,分别用清水和二次蒸馏水透析(cutoff Mw=8,000),浓缩,冷冻干燥得到香菇β-葡聚糖(LNT-S)。经鉴定,其与实施例1制得的香菇β-葡聚糖(LNT-S)相同。
实施例4
所用香菇子实体为福建产。将香菇子实体200g粉碎至7目依次用乙酸乙酯500mL、丙酮700mL进行索氏提取各8小时。然后用0.9%NaCl水溶液在室温下提取三次:浸泡在0.9%NaCl水溶液中过夜,离心,收集残渣。残渣用热水(130℃)提取三次,每次半小时,离心,收集残渣;残渣在纯水中进行超声波提取(25℃,30KHz,400W,20min),离心得提取液;上清提取液用H2O2脱色,8次Sevag法除去游离的蛋白质后,分别用清水和二次蒸馏水透析,浓缩,冷冻干燥得到香菇β-葡聚糖(LNT-S)。用NMR、IR、GC-MS等证明LNT-S为β-(1→3)-D-葡聚糖,平均每7个主链葡萄糖残基含2个(1→6)键接的葡萄糖侧基。多糖构象表征方法同实施例1。结果表明该多糖在水溶液中呈现棒状链构象,而在DMSO中均呈现单股无规线团构象。LNT-S对LPS诱导的炎症调节因子的抑制作用见图4。
由图4可知,LNT-S完全抑制了LPS诱导的炎症因子IL-1α和IL-1γα的释放,即抑制率达到100%。
因此,香菇β-葡聚糖可用于制备抗炎症药物和提高机体免疫功能的保健品,具有极大的推广和应用前景。
Claims (10)
1.一种具有抗炎症活性的香菇β-葡聚糖,主链为β-(1→3)-葡聚糖,平均每7~10个主链葡萄糖残基含2~3个(1→6)键接的葡萄糖侧基。
2.权利要求1所述香菇β-葡聚糖的制备方法,其包括如下步骤:将香菇子实体粉碎,脱脂,用生理盐水浸泡,离心,收集残渣;取残渣在100~130℃沸水下提取,离心,收集残渣在纯水中进行超声提取,离心得提取液;提取液脱色后,除去游离的蛋白质,用水透析,浓缩,冷冻干燥得到香菇β-葡聚糖。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述脱脂的方法是依次用乙酸乙酯、丙酮进行索氏提取去除脂肪。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,生理盐水浸泡时间为8~24小时,重复1~4次。
5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述沸水提取方法是用残渣3~5倍体积的水煮20~40分钟,重复1~4次。
6.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,超声提取的条件为20~30℃,频率18~30KHz,功率400~600W,时间16~20min。
7.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述脱色是用H2O2脱色。
8.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,采用Sevag法除去游离的蛋白质。
9.权利要求1所述的香菇β-葡聚糖在制备抗炎症或提高免疫机能的药物或保健品中的应用。
10.含有权利要求1所述香菇β-葡聚糖的抗炎症或提高免疫机能的药物或保健品。
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