CN102406941B

CN102406941B - 含有改性明胶肽的纳米化难溶性活性组分及其制备方法

Info

Publication number: CN102406941B
Application number: CN201110364983.3A
Authority: CN
Inventors: 石凯; 毕洪书; 崔福德
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2011-07-29
Filing date: 2011-11-17
Publication date: 2015-03-11
Anticipated expiration: 2031-11-17
Also published as: CN102406941A

Abstract

本发明公开了一种含有改性明胶肽的纳米化难溶性活性组分及其制备方法。该制剂由1重量份的难溶性活性组分与0.1～50重量份的改性明胶肽组成，粒径10～400nm，水溶性好且不含任何表面活性剂和化学交联剂，静脉注射前可直接用0.9%氯化钠或5%葡萄糖稀释，滴注过程中能保持长时间稳定性，且药效优于市售注射液。本发明采用安全易得的改性明胶肽作为纳米化难溶性活性组分的稳定材料，生物相容且易从体内***，反复应用无蓄积毒性；载药量高，冻干制剂中无需加入支撑剂或保护剂；工艺简单，适合工业规模生产。

Description

含有改性明胶肽的纳米化难溶性活性组分及其制备方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，确切地说它是一种含有改性明胶肽的纳米化难溶性活性组分及其制备方法。

背景技术

近年来，组合化学和高通量筛选技术在新药研发过程中得到了广泛应用，但筛选出的活性组分大多为脂溶性化合物，水溶性差。据统计，目前至少有40％以上的在研药物因溶解度问题而在临床使用上受到限制。传统的共溶剂增溶手段因使用有机溶剂而毒性很大，临床使用易发生溶血和过敏反应；而新的载体型纳米制剂如脂质体、乳剂、聚合物胶束等虽可在一定程度上改善药物溶解度，但均存在载药量低、制备工艺复杂及稳定性较差等问题。新近研究活跃的纳米混悬剂无需载体材料，是“纯”的药物粒子分散在水中形成的一种亚微米胶体分散体系，但仍需使用一定量的溶血性表面活性剂（如吐温、胆酸盐等）或生物不可降解的高分子材料（如聚乙烯醇、聚乙烯砒咯烷酮等）以维持稳定，故目前仅适用于口服胃肠道给药。US 5916596和CN1911446公开了一种紫杉醇人血白蛋白纳米粒，该制剂不含任何有机溶剂和表面活性剂，但其主要辅料人血白蛋白为人体血液制品，价格昂贵且对来源的安全性有非常严格的要求和限制；另外该制剂不可热压灭菌，整个生产过程需要无菌操作。

传统的明胶纳米粒制剂均以未经降解的大分子明胶（平均分子量100～1000kDa）作为载体材料，且制备中需要使用甲醛、戊二醛等有害化学交联剂，故目前尚未有相关产品用于临床。改性明胶肽是哺乳动物胶原经部分水解并适当修饰（如琥珀酰明胶肽、脲联明胶肽）后得到的多肽产物，其平均分子量小于40kDa，静脉输注后可从肾小球滤过***而无体内蓄积毒性。改性明胶肽作为血浆代用品已广泛应用于临床，可有效维持血浆的胶体渗透压、扩充血容量并改善微循环；而且改性明胶肽的过敏反应发生率低（<0.1%）且各项指标与人体血液相似，对人体内环境影响轻微，大剂量使用时对凝血功能无明显影响。作为天然的生物可降解高分子型稳定剂，一方面改性明胶肽经血管内给药具有极高的安全性；另一方面其分子结构中含有高达15%的羟脯氨酸，大量的水溶性羟基可在纳米药物颗粒周围形成一层稳定的水化膜，防止粒子聚集和合并。另外，经过改性的明胶肽（如琥珀酰化）带有大量的负电荷，可增加纳米化药物颗粒的表面电位，稳定性进一步提高。

发明内容

本发明的目的是为了克服上述已有技术存在的若干缺陷，提供一种以改性明胶肽稳定的纳米化难溶性活性组分，其具有良好的水溶性，血管内给药过程稳定性大于12小时。

本发明的另一个目的是提供一种含有改性明胶肽的纳米化难溶性活性组分的制备方法。该方法制备工艺简单、易于工业化生产，且不涉及任何表面活性剂和化学交联剂的使用。

为实现上述目的，本发明的技术方案是一种以改性明胶肽稳定的纳米化难溶性活性组分，其特征是由1重量份的难溶性活性组分与0.1～50重量份的改性明胶肽组成，平均粒径10～400nm。

所述难溶性活性组分包括下列化合物之一：紫杉醇、多烯紫杉醇、长春碱、长春新碱、羟基喜树碱、依托泊苷、两性霉素B、伊曲康唑、伏立康唑、前列地尔、尼莫地平、环孢素。

所述改性明胶肽是平均分子量为2～40kDa的水解明胶肽、琥珀酰明胶肽或聚明胶肽（即脲联明胶肽）。

本发明的技术方案还涉及含有改性明胶肽的纳米化难溶性活性组分的制备方法，该方法可以为高压乳匀法或液相研磨法。其中高压乳匀法为：

（1）将难溶性活性组分溶于有机溶剂，并与改性明胶肽水溶液混合，低速匀浆制成初乳液。所述有机溶剂选自氯仿、二氯甲烷、乙醇、甲醇或它们的混合物；水相体积为有机相体积的3～60倍。

（2）对所述初乳进行高压匀质处理，匀质液减压蒸发除去溶剂，得到药物胶体溶液。所述匀质压力为9000～40000 psi，所述除去溶剂的温度为30～60℃。

（4）将胶体溶液灭菌后，冷冻干燥48小时，得到无菌冻干粉末。

液相研磨法为：

（1）将难溶性活性组分分散于改性明胶肽水溶液中；

（2）将所述混合溶液置于球磨机中研磨至要求粒径400nm以下，得到药物胶体溶液；

（3）将胶体溶液灭菌后，冷冻干燥48小时，得到无菌冻干粉末。

本发明提供的改性明胶肽稳定的纳米化难溶性活性组分，不含有任何助溶有机溶剂，具有良好的水溶性，静脉注射前可直接用0.9%氯化钠或5%葡萄糖稀释，且稳定性明显提高；与普通的纳米药物混悬剂相比，不含有任何表面活性剂，改性明胶肽生物相容且易从体内***，静脉注射安全性高；与脂质体、乳剂、聚合物胶束等载体型纳米制剂相比，无需载体材料，药物含量高，且冻干制剂无需加入支撑剂或保护剂；与白蛋白纳米粒相比，改性明胶肽安全易得，而且可耐受高温灭菌。

具体实施方式

实施例1

称取药用明胶20g, 加入注射用水100mL使其充分溶胀后，加温至60-80℃完全溶解。用10mol/L盐酸调节pH至5.0-6.0左右，于90-100℃水解1h，使其平均分子量在35kDa左右。然后蒸发浓缩，丙酮沉降，烘干，粉碎，制得水解明胶肽。

实施例2

称取药用明胶20g, 加入注射用水100mL使其充分溶胀后，加温至40-70℃充分溶解。用10mol/L氢氧化钠调节pH至9-10，将5g琥珀酸酐在强烈搅拌下逐步加入明胶溶液中，并不断加入氢氧化钠溶液维持体系pH 值反应2h。用10mol/L盐酸调节pH至6.0左右，降温使反应产物胶凝，用纯化水透析2-3天，然后蒸发浓缩，丙酮沉降，烘干，粉碎，制得琥珀酰明胶肽。

实施例3

称取药用明胶20g, 加入注射用水100mL使其充分溶胀后，加温至60-80℃完全溶解。用10mol/L盐酸调节pH至5.0-6.0左右，于90-100℃水解4h。加入明胶蛋白含量1%的环己烷二异氰酸酯，继续反应3h。降温使反应产物胶凝，用纯化水透析2-3天，然后蒸发浓缩，丙酮沉降，烘干，粉碎，制得聚明胶肽（即脲联明胶肽）。

实施例4

将720.0mg紫杉醇溶于14.5ml无菌氯仿，加入120.0ml 2%（w/v）不同改性明胶肽溶液，低速匀浆5min制成初乳液；然后将其转移至高压匀质机内，在9000～40000psi下循环6次，匀质液40℃减压蒸发除去溶剂，得到药物胶体溶液；用微孔滤膜（0.22μm）过滤除菌后，冷冻干燥48小时，得到无菌冻干粉末。

表1. 含有不同改性明胶肽的纳米化紫杉醇冻干粉5%葡萄糖重分散后的物理稳定性

改性明胶肽	平均粒径	稳定时间
			水解明胶肽	210 nm	>8h
琥珀酰明胶肽	135 nm	>12h
			聚明胶肽（即脲联明胶肽）	160 nm	>12h

实施例5

将450.0mg多烯紫杉醇溶于19.5ml无菌二氯甲烷和0.5 ml无水乙醇，加入120.0ml 2%（w/v）琥珀酰明胶肽溶液，低速匀浆5min制成初乳液；然后将其转移至高压匀质机内，在9000～40000psi下循环6次，匀质液40℃减压蒸发除去溶剂，得到药物胶体溶液；用微孔滤膜（0.22μm）过滤除菌后，冷冻干燥48小时，得到无菌冻干粉末。

得到的含有15.8%（w/w）多烯紫杉醇固体粉末，用5%葡萄糖注射液重分散成浓度为2mg/ml纳米化多烯紫杉醇胶体溶液，平均粒径140nm，物理稳定性>12小时。

实施例6

将160.0mg长春碱溶于4.0ml无菌氯仿，加入80.0ml 2%（w/v）聚明胶肽溶液，低速匀浆5min制成初乳液；然后将其转移至高压匀质机内，在9000～40000psi下循环6次，匀质液40℃减压蒸发除去溶剂，得到药物胶体溶液；用微孔滤膜（0.22μm）过滤除菌后，冷冻干燥48小时，得到无菌冻干粉末。

得到的含有10.0%（w/w）长春碱固体粉末，用0.9%NaCl注射液重分散成浓度为1mg/ml纳米长春碱胶体溶液，平均粒径115nm，物理稳定性>12小时。

实施例7

将240.0mg长春新碱溶于5.0ml无菌氯仿，加入80.0ml 2%（w/v）聚明胶肽溶液，低速匀浆5min制成初乳液；然后将其转移至高压匀质机内，在9000～40000psi下循环6次，匀质液40℃减压蒸发除去溶剂，得到药物胶体溶液；用微孔滤膜（0.22μm）过滤除菌后，冷冻干燥48小时，得到无菌冻干粉末。

得到的含有15.0%（w/w）长春新碱固体粉末，用0.9%NaCl注射液重分散成浓度为1mg/ml纳米长春新碱胶体溶液，平均粒径130nm，物理稳定性>12小时。

实施例8

将500.0mg伊曲康唑溶于6.0ml无菌氯仿，加入70.0ml 4%（w/v）水解明胶肽溶液，低速匀浆5min制成初乳液；然后将其转移至高压匀质机内，在9000～40000psi下循环6次，匀质液40℃减压蒸发除去溶剂，得到药物胶体溶液；用微孔滤膜（0.22μm）过滤除菌后，冷冻干燥48小时，得到无菌冻干粉末。

得到的含有17.8%（w/w）伊曲康唑固体粉末，用0.9%NaCl注射液重分散成浓度为2mg/ml纳米伊曲康唑胶体溶液，平均粒径175nm，物理稳定性>12小时。

实施例9

将250.0mg伏立康唑溶于3.0ml无菌氯仿，加入50.0ml 4%（w/v）水解明胶肽溶液，低速匀浆5min制成初乳液；然后将其转移至高压匀质机内，在9000～40000psi下循环6次，匀质液40℃减压蒸发除去溶剂，得到药物胶体溶液；用微孔滤膜（0.22μm）过滤除菌后，冷冻干燥48小时，得到无菌冻干粉末。

得到的含有12.5%（w/w）伏立康唑固体粉末，用0.9%NaCl注射液重分散成浓度为2mg/ml纳米伏立康唑胶体溶液，平均粒径145nm，物理稳定性>12小时。

实施例10

将450.0mg两性霉素B溶于3.5ml无菌氯仿和0.5ml甲醇，加入60.0ml 4%（w/v）琥珀酰明胶肽溶液，低速匀浆5min制成初乳液；然后将其转移至高压匀质机内，在9000～40000psi下循环6次，匀质液40℃减压蒸发除去溶剂，得到药物胶体溶液；用微孔滤膜（0.22μm）过滤除菌后，冷冻干燥48小时，得到无菌冻干粉末。

得到的含有18.7%（w/w）两性霉素B固体粉末，用0.9%NaCl注射液重分散成浓度为1mg/ml纳米两性霉素B胶体溶液，平均粒径145nm，物理稳定性>12小时。

实施例11

将120.0mg尼莫地平溶于2.0ml无菌二氯甲烷，加入120.0ml 2%（w/v）琥珀酰明胶肽溶液，低速匀浆5min制成初乳液；然后将其转移至高压匀质机内，在9000～40000psi下循环6次，匀质液40℃减压蒸发除去溶剂，得到药物胶体溶液；用微孔滤膜（0.22μm）过滤除菌后，冷冻干燥48小时，得到无菌冻干粉末。

得到的含有5%（w/w）尼莫地平固体粉末，用0.9%NaCl注射液重分散成浓度为0.5mg/ml纳米尼莫地平胶体溶液，平均粒径105nm，物理稳定性>12小时。

实施例12

将450.0mg环孢素溶于5.0ml无菌二氯甲烷，加入120.0ml 2%（w/v）水解明胶肽溶液，低速匀浆5min制成初乳液；然后将其转移至高压匀质机内，在9000～40000psi下循环6次，匀质液40℃减压蒸发除去溶剂，得到药物胶体溶液；用微孔滤膜（0.22μm）过滤除菌后，冷冻干燥48小时，得到无菌冻干粉末。

得到的含有18.7%（w/w）环孢菌素固体粉末，用0.9%NaCl注射液重分散成浓度为5mg/ml纳米环孢菌素胶体溶液，平均粒径120nm，物理稳定性>12小时。

实施例13

将160.0mg羟基喜树碱分散于50.0ml 3%（w/v）聚明胶肽溶液，置于球磨机中600rpm研磨10h，得到药物胶体溶液；用微孔滤膜（0.22μm）过滤除菌后，冷冻干燥48小时，得到无菌冻干粉末。

得到的含有10.6%（w/w）羟基喜树碱固体粉末，用0.9%NaCl注射液重分散成浓度为0.5mg/ml纳米羟基喜树碱胶体溶液，平均粒径160nm，物理稳定性>12小时。

实施例14

将500.0mg依托泊苷分散于60.0ml 4%（w/v）聚明胶肽溶液，置于球磨机中600rpm研磨12h，得到药物胶体溶液；用微孔滤膜（0.22μm）过滤除菌后，冷冻干燥48小时，得到无菌冻干粉末。

得到的含有20.8%（w/w）依托泊苷固体粉末，用0.9%NaCl注射液重分散成浓度为2mg/ml纳米依托泊苷胶体溶液，平均粒径170nm，物理稳定性>12小时。

实施例15

将2.0mg前列地尔分散于20.0ml 2%（w/v）琥珀酰明胶肽溶液，置于球磨机中600rpm研磨8h，得到药物胶体溶液；用微孔滤膜（0.22μm）过滤除菌后，冷冻干燥48小时，得到无菌冻干粉末。

得到的含有0.5%（w/w）前列地尔固体粉末，用0.9%NaCl注射液重分散成浓度为10μg/ml纳米前列地尔胶体溶液，平均粒径70nm，物理稳定性>12小时。

实施例16 琥珀酰明胶肽稳定的纳米紫杉醇对肿瘤动物模型的治疗作用

肿瘤移植模型建立：60只雌性昆明小鼠，体重18~22g，自由进食，抽取昆明种小鼠体内传代（第7-9天）状态良好的U14肿瘤细胞（腹水），用无菌生理盐水稀释，调整细胞数为4.6×108个/mL，于每只小鼠右前肢腋下注射0.2ml细胞悬液，注射局部出现明显皮丘，3~4天后能摸到肿瘤小块。

分组与剂量：小鼠于接种***U14细胞株后第3天，将动物按瘤径及体重差最小原则均衡随机分为6组，每组10只。分组情况为：空白对照组（2%琥珀酰明胶水溶液）；市售Taxol注射液和按实施例1制备的琥珀酰明胶肽稳定的纳米紫杉醇组（各设5mg/kg、10mg/kg 2个剂量组）

给药方案：小鼠于接种***U14细胞株后第3天开始，每3天尾静脉注射给药1次，连续给药4次后处死动物，解剖剥离瘤块，称瘤重，计算肿瘤生长抑制率（TIR）。

试验统计结果：琥珀酰明胶肽稳定的纳米紫杉醇组高、中剂量（10、5mg/kg）平均瘤重均显著低于空白对照组（P<0.001），且对U14实体瘤的生长抑制作用强于市售Taxol注射液组（P<0.05）。另外，琥珀酰明胶肽稳定的纳米紫杉醇对试验小鼠的体重影响较市售Taxol注射液组小。

表2 琥珀酰明胶肽稳定的纳米紫杉醇与市售Taxol注射液对***U14的抑制作用比较

注：与空白对照组比较***P<0.001

Claims

1. 一种含有改性明胶肽和纳米化难溶性活性组分的组合物，其特征在于，由1重量份的难溶性活性组分与0.1～50重量份的改性明胶肽组成，平均粒径10～400nm，所述改性明胶肽为水解明胶肽、琥珀酰明胶肽或聚明胶肽，所述改性明胶肽的平均分子量为2～40kDa。

2. 根据权利要求1所述的含有改性明胶肽和纳米化难溶性活性组分的组合物，其特征在于，所述难溶性活性组分选自下列化合物之一：紫杉醇、多烯紫杉醇、长春碱、长春新碱、羟基喜树碱、依托泊苷、两性霉素B、伊曲康唑、伏立康唑、前列地尔、尼莫地平、环孢素。

3. 一种如权利要求1所述的含有改性明胶肽和纳米化难溶性活性组分的组合物的制备方法，其特征在于该制备方法为高压乳匀法或液相研磨法。

4. 根据权利要求3所述的含有改性明胶肽和纳米化难溶性活性组分的组合物的制备方法，其特征在于所述高压乳匀法为：将难溶性活性组分溶于有机溶剂，并与改性明胶肽水溶液混合，低速匀浆制成初乳液，所述水相体积为有机相体积的3～60倍；将初乳液转移至高压匀质机内处理至粒径400nm以下，匀质液减压蒸发除去有机溶剂，灭菌后冷冻干燥。

5. 根据权利要求3所述的含有改性明胶肽和纳米化难溶性活性组分的组合物的制备方法，其特征在于所述液相研磨法为：将难溶性活性组分分散于改性明胶肽水溶液中，混合物置于球磨机中研磨至粒径400nm以下，灭菌后冷冻干燥。

6. 根据权利要求4所述的含有改性明胶肽和纳米化难溶性活性组分的组合物的制备方法，其特征在于所述有机溶剂可以是氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、甲醇或它们的混合物。

7. 根据权利要求4所述的含有改性明胶肽和纳米化难溶性活性组分的组合物的制备方法，其特征在于所述匀质压力为9000～40000psi，所述除去溶剂的温度为30～60℃。